2024

HEMATOLOGÍA BÁSICA
Guía de trabajos prácticos

TM Angélica Opazo F
Escuela Tecnología Médica UST

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 CONTENIDO

BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE HEMATOLOGÍA ................................................................................ 2

CONDUCTAS FRENTES ACCIDENTES EN EL LABORATORIO ............................................................................ 4
REACTIVO QUÍMICO PELIGROSO ......................................................................................................................... 6
HEMOGRAMA .......................................................................................................................................................... 7
HEMATOPOYESIS ................................................................................................................................................. 10
TOMA DE MUESTRA DE SANGRE........................................................................................................................ 11
ANTICOAGULANTES EN TECNICAS HEMATOLOGICAS .................................................................................... 15
ESTABILIDAD DE LAS MUESTRAS DE SANGRE ANTICOAGULADA PARA ESTUDIO HEMATOLÓGICO ....... 20
GLOSARIO DE TÉRMINOS USADOS EN HEMATOLOGÍA ................................................................................... 22
HEMATOCRITO ...................................................................................................................................................... 27
HEMOGLOBINA...................................................................................................................................................... 30
INDICES ERITROCITARIOS .................................................................................................................................. 32
TECNOLOGÍA DE LOS CONTADORES HEMATOLOGICOS ................................................................................ 33
MORFOLOGÍA ERITROIDE.................................................................................................................................... 50
PROGENITORES ERITROIDES ............................................................................................................................. 53
VELOCIDAD DE SEDIMENTACION ERITROCITARIA .......................................................................................... 54
RETICULOCITOS ................................................................................................................................................... 56
RECUENTO DE LEUCOCITOS EN CAMARA DE NEUBAUER. ............................... ¡Error! Marcador no definido.
FROTIS SANGUINEO ............................................................................................................................................. 59
TINCION MAY GRUNWALD GIEMSA .................................................................................................................... 62
TINCIÓN AUTOMATIZADA DE FROTIS SANGUÍNEO. ......................................................................................... 63
EXAMEN MORFOLOGICO DE CELULAS SANGUINEAS ..................................................................................... 64
MORFOLOGIA DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS ................................................................................................. 65
MIELOGRAMA ........................................................................................................................................................ 57
RECUENTO DE PLAQUETAS EN CAMARA DE NEUBAHUER. .............................. ¡Error! Marcador no definido.
INTERVALOS DE REFERENCIA EN HEMOSTASIA ............................................................................................. 71
TIEMPO DE SANGRÍA............................................................................................................................................ 72
VARIABLES PREANALITICAS EN PRUEBAS DE COAGULACION ...................................................................... 73
TIEMPO DE PROTROMBINA ................................................................................................................................. 75
TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA ........................................................................................ 77
TIEMPO DE TROMBINA ............................................................................................ ¡Error! Marcador no definido.
TEST DE MEZCLA ..................................................................................................... ¡Error! Marcador no definido.
FIBRINÓGENO ....................................................................................................................................................... 81
FUNDAMENTOS DE LOS EQUIPOS AUTOMATIZADOS EN COAGULACIÓN .................................................... 82

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 BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE HEMATOLOGÍA

Bioseguridad es el conjunto de medidas preventivas destinadas a reducir o eliminar los riesgos por
exposición a agentes biológicos, físicos o químicos por parte del personal del laboratorio clínico.

El riesgo de infección está referido primariamente a la contaminación de las manos o mucosas (bucal,
ocular y nasal) con sangre o fluidos corporales de personas infectadas mediante punción con objetos
filosos, salpicaduras o aerosoles. Los riesgos de infección subsiguiente a un accidente por punción
percutánea con una aguja con sangre contaminada varía entre microorganismos, así se ha reportado para
VIH un estimado entre 0.13-0.50% mientras que para el virus de hepatitis B está aumentado al 26%.

Virus hepatitis B es estable a las condiciones ambientales y puede permanecer viable por más de 7 días
en superficies a T° ambiente. Se inactiva al estar en contacto con cloro, alcohol, fenol, glutaraldehido,
peróxidos y al mantenerlo a 100°C por 2 minutos, es 50 a 100 veces más contagioso que el VIH.

Las prácticas seguras de trabajo son la única protección prevenible con que se cuenta por el momento
contra el riesgo de infecciones con enfermedades transmitidas por la sangre. Por lo tanto se hace
indispensable la implementación de las Precauciones Universales

Precauciones Universales: conjunto de técnicas y procedimientos destinados a proteger al personal que

conforma el equipo de salud de la posible infección con agentes, principalmente Virus de la
Inmunodeficiencia Humana, Virus de la Hepatitis B, Virus de la Hepatitis C, entre otros, durante las
actividades de atención a pacientes o durante el trabajo con sus fluidos o tejidos corporales.

Las precauciones universales parten del siguiente principio:

"Todos los pacientes y sus fluidos corporales independientemente del diagnóstico de ingreso o
motivo por el cual haya entrado al hospital o clínica, deberán ser considerados como
potencialmente infectantes y se debe tomar las precauciones necesarias para prevenir que ocurra
transmisión."

¿Cómo nos protegemos de los riesgos?

o Acceso limitado
o Señales de riesgo
o Indicar nivel de bioseguridad en puerta de ingreso
o Lavado de manos
o Aplicación de precauciones estándar
▪ Lavado de manos
▪ Uso de guantes
▪ Uso de equipos de protección personal(delantal/pechera plástica/lentes/mascarillas/respirador
particulado)
o Delimitación de áreas( limpias/contaminadas)
o Evitar generación de aerosoles(centrifuga-vortex/destapar tubos)
o Limpieza y orden de Laboratorio
o Uso gabinete de bioseguridad de acuerdo al nivel asignado

2
 Eliminación de desechos

o
o
o
o
o
o
o
o

Residuos
Especiales:
▪ Tubos primarios y todas las muestras de: sangre, suero, líquidos, deposición, expectoración, orina,
▪ Desechos cortopunzante contaminados ( safebox)
• Agujas toma muestras
• Pipetas Pasteur de vidrio
• Vidrios rotos de capilares y portaobjetos usados
• Laminillas usadas
• Desechos cortopunzante no contaminado (safebox o caja de cartón grueso)
• Agujas nuevas
• Tubos de vidrio
• Frascos de reactivos de vidrio
• Capilares y laminillas nuevas
• Porta-objetos nuevos
• Desechos patológicos
• Restos de tejidos
• Anatomía patológica principalmente

Residuos Sólidos Asimilables

• Guantes sin sangre visible
• Pecheras
• Pipetas plásticas
• Papel
• Toalla nova
• Cubetas de equipos
• Puntas de Micropipetas sin sangre

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 CONDUCTAS FRENTES ACCIDENTES EN EL LABORATORIO

1. DERRAME O QUIEBRE DE TUBOS EN SUPERFICIES

• Con sangre o material biológico
• Con material contaminado con microorganismos que se transmiten por contacto con piel no indemne
• Cubrir la superficie con toalla nova
• Agregar cloro 0.5% sobre la toalla nova
• Reposar 10-15 minutos
• En caso de la presencia de vidrios, recogerlos con pala o cartón y eliminarlos en caja corto punzante contaminado
si aplica
• Limpiar la superficie con cloro 0.5%
• Eliminar los desechos
• Quitarse los guantes y lavarse las manos.

2. DERRAME O QUIEBRE DE TUBOS EN EQUIPOS BIOMÉDICOS

• Con sangre o material biológico
• Con material contaminado con microorganismos que se transmiten por contacto.
Quiebre de tubos al interior de centrífuga
• Se debe detener la centrifuga o equipo
• Esperar 15 minutos antes de abrir el equipo
• Con precaución destapar el equipo y limpiar con alcohol 70% y papel absorbente.
• Eliminar el desecho según sea el caso.

4
5
 REACTIVO QUÍMICO PELIGROSO
Es el que presenta un riesgo para la seguridad y salud del personal o el medio ambiente, debido a sus propiedades
fisicoquímicas, químicas o toxicológicas
• ¿Cómo comunican los peligros?
o Etiquetas con pictogramas/símbolos
▪ Corrosivos
▪ Toxico
▪ Nocivo
▪ Inflamable
▪ Comburente
▪ Explosivos
▪ Biológicos
▪ Radioactivos
▪ Eléctrico

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UNIVERSIDAD SANTO TOMAS
Escuela de Tecnología Médica
Laboratorio de Hematología

HEMOGRAMA

Nombre: _ Edad: ______ Sexo: _____ _____Fecha nacimiento: _________ RUT: _____ _____ _____ __
Numero atención: ______________ _ Fecha atención_____________________ Fecha egreso: _____ _____ _____ _____ _____
Médico Solicitante: ______Diagnóstico: ________________________Muestra: _____ _____ _____ _____ _____ _

SERIE ROJA Intervalo Referencia SERIE BLANCA Intervalo Referencia

Rec. Eritrocitos : _____________ ( ) Recuento Leucocitos : ________ ( )
Hematocrito : ( ) R. A. Neutrófilos (RAN) : ________ ( )
Hemoglobina : ( ) R. A. Linfocitos (RAL) : ________ ( )
VCM : ( ) A. Monocitos (RAM) : ________ ( )
HCM : ( ) R. A. Eosinófilos (RAE) : ________ ( )
CHCM : ( ) R. A. Basófilos (RAB) : ________ ( )

SERIE PLAQUETARIA
Recuento Plaquetas: ( )

V.H.S : ( )

FORMULA DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS (%)

Basófilos Eosinófilos Promielocitos Mielocitos Juvenil Baciliforme Segmentado Linfocitos Monocitos

CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS

ERITROCITOS:

LEUCOCITOS:

PLAQUETAS:

_________________________ _____________________
Nombre y Firma Profesional que realiza el examen Nombre y Firma Director Médico

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 INTERVALOS DE REFERENCIA DE PARAMETROS HEMATOLOGICOS

REC.DE GLÓBULOS ROJOS HEMATOCRITO HEMOGLOBINA

Recién Nacido 4.3 – 6.3 x 106/ul 45 - 67% 15.2 – 23.6 g / dl
1 mes a 12 meses 3.1 – 5.1 x 106/ul 31 – 43% 10.5 – 12.9 g / dl
1 año a 4 años 3.6 – 5.2 x 106/ul 35 – 43% 10.8 – 12.8 g / dl
5 años a 16 años 3.7 – 5.7 x 106/ul 31 – 43% 10.7 – 14.7 g / dl
Adultos Hombres 4.5 – 5.9 x 106/ul 40 -50% 13.0 – 17.5 g / dl
Adultos Mujeres 4.1 – 5.1 x 106/ul 36 -46% 12.0 – 15.0 g / dl

INDICES ERITROCITARIOS
Volumen corpuscular Hemoglobina corpuscular Concentración de hemoglobina
medio (VCM) media (HCM) corpuscular media (CHCM)
Recién nacido 95 – 121 fL 33 – 41 pg 32 – 36 gr/dl
1 mes a 12 meses 73 – 101 fL 21 – 33 pg 32 – 36 gr/dl
1 año a 4 años 75 – 87 fL 22 – 33 pg 32 – 36 gr/dl
5 años a 16 años 78 – 93 fL 23 – 34 pg 32 – 36 gr/dl
Adultos 82 – 96 fL 28 – 33 pg 32 – 36 gr/dl
Red Distribution Width (RDW): 12 -14 %; 39 - 46 DE

RETICULOCITOS
Relativo Absoluto Corregido IPR
Recién Nacido 3 – 6% 110.000–330.000/ul
Adultos 0.5 – 2.0% 50.000 -100.0000/ul 0.5 – 1.5% 2-3

RECUENTO DE GLÓBULOS BLANCOS

Recién Nacido 9 – 35 x 103 /ul
1 a 12 meses 6 – 17.5 x 103 /ul
1 a 4 años 5.5 – 15.5 x 103 /ul
5 a 16 años 4.5 – 13.5 x 103 /ul
Adultos 4.4 – 11.3 x 103 /ul

FORMULA DIFERENCIAL
Recién Nacido 1 m a 12 meses 1 a 4 años 5 a 16 años ADULTOS Absoluto
Segmentados 40 - 70 % 21 – 39 % 21 – 39 % 40 – 60 % 50 – 70% 2.000-7.000/ul
Linfocitos 30 - 60% 45 – 65 % 50 – 69 % 31 – 50 % 25 – 40% 1.000– 4.000/ul
Monocitos 2 – 12% 2 – 11% 1 – 10 % 1–8% 4 – 12% 200–1000/ul
Eosinófilos 0–5% 0–7% 0–5% 0–5% 1 – 4% 20 -500/ul
Basófilos 0 – 1% 0 – 3% 0 – 3% 0 – 3% 0 – 1% 0-100/ul
Baciliformes 0–6% 0–5% 0–7% 0–7% 0 – 6%
Juveniles 0 – 0%
Mielocitos 0
Plasmocitos 0 - 1%

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 RECUENTO DE PLAQUETAS
Recién Nacido 140 - 475 /103ul
1 mes a 12 meses 140 - 497 /103ul
1 año a 4 años 140 - 450 /103ul
5 años a 16 años 140 – 400 /103ul
Adultos 140 - 400 /103ul

VELOCIDAD HEMÁTICA DE SEDIMENTACIÓN (VHS) (mm/hora)

PEDIATRÍA EMBARAZADA ADULTOS
1 día a 2 años 3-11 años 1º trim. 2º trim. 3º trim. Hombres Mujeres
1 a 10 mm/hora 1 a 7 mm/hora 19 a 29 mm/hora 20 a 70 mm/hora 34 a 70 1 a 13 mm/hora 1 a 20 mm/hora
mm/hora

Referencias:
• J.Van den Bossche, K. 2002. Reference Intervals for a Complete Blood Count on diferrent Automated
Haematology Analysers: Abx Pentra 120 Retic, Coulter Gen’s, Sysmex SE 9500, Abbot Cell Dyn 4000 and Bayer
Advia 120. Clin Chem Lab Med 40(1):69-73.
• Schnell Z., Leeuwen A., Kranpitz T. (2.000). Reference Ranges for Adults and Children. Pre-Analytical
considerations.2008. Roche Diagnostics.
• Davis’s Comprehensive Laboratory and Diagnostic Test Handbook-with Nursing Implications. F.A. Davis
Company.
• Dacie and Lewis. (2006). Practical Haematology, 10th ed., Copyright © Churchill Livingstone, An Imprint of Elsevier

VALORES DE ALERTA EN HEMATOLOGÍA

Parámetro Valor Crítico

Hematocrito <20% y >60% en adultos y niños
<30 y > 70% en recién nacidos
Hemoglobina <7 gr/dl y >23gr/dl
Plaquetas <20.000/ul y >1.000.000/ul
Leucocitos <2.000 y >50.000/ul
Microscopía Blastos
Plasmodium sp
INR >5

Referencia: M.Van Leeuwen, Schnell Z. A. (2006). Davis’s Comprehensive Handbook of Laboratory and Diagnostic Tests—with
Nursing Implication. Second Edition, Davis Company

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 HEMATOPOYESIS

Las células sanguíneas se forman en la médula ósea a partir de la stem cell.

.
Blood cell formation from stem cells to mature cells. Notice the differentiation and maturation path from stem cells,
through the CFU-GEMM to the LSC, terminating in mature cells into the peripheral circulation. IL, interleukin; CFU,
colony-forming unit, GEMM, granulocyte, erythrocyte, monocyte, macrophage; LSC, lymphoid stem cell Ciesla B. 2007.
Hematology in practice. Copyright ©

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 TOMA DE MUESTRA DE SANGRE

Para el estudio de la sangre, esta debe extraerse del organismo y en ocasiones fraccionarse en sus componentes:
plasma o suero y células. La extracción sanguínea más utilizada es la punción venosa y capilar. De la misma manera
que cualquier otra práctica médica la extracción sanguínea debe realizarse bajo los estándares de un adecuado control
de calidad ya que los resultados de los análisis en muchas ocasiones dependen de esta práctica.
Todas las muestras deben ser tratadas como potencialmente infecciosas, por lo tanto es indispensable aplicar todas las
técnicas y precauciones universales.
Antes de iniciar el procedimiento de toma de muestra debe contar con todos los materiales necesarios.

PUNCIÓN VENOSA.
Constituye el tipo de extracción más comúnmente empleado y se obtiene preferentemente de las venas cefálicas o
mediana cubital, cercanas al pliegue del antebrazo.

MATERIALES:
• Jeringa desechable estéril o sistema Venoject, Agujas estériles:
o Niños: 22 G
o Adultos: 19G- 21G
• Mesa Killian o sistema de extracción con una superficie para apoyar el brazo extendido.
• Ligadura o torniquete
• Alcohol etílico al 70% o o clorhexidina 0.5%
• Tórulas de algodón, parches.

PROCEDIMIENTO:
1. Rotular la etiqueta del tubo con los datos del paciente que vienen en la Solicitud de Examen (Nombre
paciente, Número Ficha, Fecha etc.) o emitir etiqueta electrónica y pegar al tubo.
2. Ubicar al paciente siempre en una misma posición, puede ser sentado o decúbito dorsal.
3. Lavarse las manos y ponerse guantes.
4. Localizar la vena adecuada para la punción, que sea fácilmente palpable y en lo posible visible. Figura 1.
Habitualmente se usan las ubicadas en la fosa antecubital (mediana cubital o cefálica).
Pedir al paciente que cierre la mano.
Palpar y seguir el trayecto de la vena con el dedo índice.
En caso de fracaso, linfoedema o de tratamiento endovenoso intentar en el otro brazo.
5. Limpiar el sitio de punción usando algodón con alcohol 70%. Se limpia con movimientos circulares desde el
interior a exterior una vez, se cambia el algodón en caso de que se necesite mayor limpieza. Esperar a que
la piel este se seque, antes de realizar la punción, porque si introduce alcohol en la guja puede producir
hemólisis.
6. Revisar que no haya filtración de aire entre la guja y la jeringa. Con sistema Venoject se conecta la aguja
en el adaptador.
7. Aplicar un torniquete 7 – 10 cm más arriba del sitio de punción para favorecer la estasis venosa, como
alternativa se usar un esfigmomanómetro a una presión de 60 mmHg. Un torniquete por más de un minuto
produce un aumento de hematocrito. En caso de excederse en el tiempo debe esperar un mínimo de 2
minutos antes de aplicarlo nuevamente.
8. Indicar al paciente que cierre la mano.
9. Sujetar el brazo del paciente usando el pulgar para estirar la piel.
10. Puncionar la piel del paciente con el bisel hacia arriba en el sitio elegido y canalizar la vena con la aguja
(Fig. 2). Extraer la cantidad de sangre necesaria a un flujo continuo, sin ejercer aspiración excesiva para

11
 evitar hemólisis. Con sistema Venoject se conecta directamente el tubo al vaco al sistema de extracción.

Fig 1. Venas superficiales del Brazo Fig 2. Técnica Venopunción

11. Indicar al paciente que abra la mano.

12. Soltar el torniquete antes de retirar la aguja
13. Colocar un algodón seco sobre el sitio de veno punción y retirar la guja aplicando suave presión sobre el
algodón. Dejar el algodón e instruir al paciente que mantenga la presión por un par de minutos.
14. Separar la aguja de la jeringa en forma segura depositando la aguja en un safebox y depositar la sangre en
los frascos en la cantidad necesaria, en el caso de sistemas al vacío no aplica.
15. Si los frascos contienen anticoagulante, homogeneizar suavemente por a lo menos 5 veces manualmente
o en agitador mecánico.
16. Retírese los guantes y lávese las manos.

Recomendaciones para la extracción de sangre:

a) La hemolisis de previene usando aguja 21G, evitando la presión de aspiración excesiva durante la
extracción. Evitar extraer de un sitio con equimosis, hematomas y durante la homogenización de la
agitación del tubo debe ser suave
b) El hematoma se previene removiendo el torniquete antes de retira la aguja, puncionando solo la pared
anterior de la vena.

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 MUESTRA CAPILAR
El propósito es obtener muestras sanguíneas para distintos parámetros del hemograma. Aunque se prefiere la
muestra venosa, su obtención por esta vía se justifica en pacientes pediátricos (menores de 1 año),
oncológicos, obesos mórbidos y para determinaciones de point of care.
Materiales:
• Lanceta estéril
• Tubos capilares
• Alcohol 70% o clorhexidina 0.5%

Procedimiento:
1. Ubicar el punto de extracción, puede ser el pulpejo del dedo, el lóbulo de la oreja o la región lateral de la
falange terminal. (Fig 3). En un lactante puede ser la planta del pie en las regiones laterales.
2. Asegurarse que la piel este tibia e hiperhémica. En el caso de piel fría, es conveniente la irrigación
sanguínea en forma mecánica.
3. Limpiar el sitio de punción usando algodón con etanol 70% y dejar secar espontáneamente.
4. Tomando firmemente el dedo, lóbulo o talón se punciona con una lanceta estéril. La incisión debe ser de 2
mm de profundidad.
5. Se elimina la primera gota de sangre con un algodón seco.
6. La sangre debe fluir libremente. En caso de ejercer presión no debe producirse cianosis del dedo.
7. Mediante el uso de tubos capilares se saca la sangre necesaria. Las muestras para hematocritos se toman
directamente en capilares heparinizados llenado por lo menos 2/3 del tubo. Y deben ser sellados con
plasticina introduciendo el tubo unos 3 a 4 mm y girándolos entre los dedos índice y pulgar.
8. Se pueden realizar preparados de extensiones sanguíneas o frotis sanguíneos directamente para estudio
morfológico sobre el portaobjeto limpio y seco.

Fuentes de error:
• El hematocrito puede estar falsamente aumentado por una presión exagerada o mantenida durante un
tiempo excesivo en el proceso de extracción.
• Recuento de plaquetas falsamente disminuido por la liberación de tromboplastina consecutiva al daño
tisular por la punción.
• En el caso de edema la punción capilar dará una falsa disminución de todos los elementos sanguíneos.

Región de punción capilar en el dedo Región de punción capilar en la planta

del pie de un lactante

13
DIFERENCIAS ENTRE SANGRE VENOSA Y CAPILAR.
La sangre venosa y la sangre capilar no son exactamente lo mismo. La sangre capilar es una mezcla de
sangre de las arteriolas, venas, y capilares, y que contiene un poco de líquido intersticial e intracelular. A pesar
de que algunos estudios han sugerido que existen diferencias insignificantes cuando se ha obtenido un flujo
libre de sangre, otros han demostrado claras diferencias en la composición entre la punción capilar y las
muestras de sangre venosa en neonatos, niños y los adultos. Las diferencias pueden ser exageradas por el
frío con el consiguiente flujo de sangre capilar lento.

El hematocrito, glóbulos rojos, y la concentración de hemoglobina (Hb) de sangre capilar son ligeramente
mayores que en la sangre venosa. Los recuentos totales de leucocitos y neutrófilos son mayores en un 8%; el
recuento de monocitos es mayor en aproximadamente un 12%, y en algunos casos hasta en un 100%,
especialmente en niños. Por el contrario, el recuento de plaquetas parece ser mayor en venosa que en la
sangre capilar; esto es, en promedio, alrededor de un 9%, y en algunos casos hasta en un 32%. Esto puede
ser el resultado de la adhesión de las plaquetas al sitio de la punción de la piel.

14
 CODIGO DE COLORES DE TUBOS TOMA DE MUESTRA

Para asegurar que no se genere confusión por parte del flebotomista en la identificación del
tubo apropiado, las tapas de los tubos que contienen anticoagulante o que contienen o no aditivos están
codificadas por colores. Estos códigos por colores están descritos en la norma ISO 6710.

ORDEN DE TOMA DE MUESTRA PARA RECOLECCION DE SANGRE VENOSA.

ANTICOAGULANTES EN TECNICAS HEMATOLOGICAS

15
La coagulación de la sangre es un proceso que aparece espontáneamente pasado los 5 a 10 minutos de
realizada la extracción. En una primera etapa, la sangre se transforma en una masa semisólida de color rojo,
llamada coágulo y luego aparecen dos fases bien diferenciadas: el coagulo retraído (constituido por una red de
fibrina que engloba las células sanguíneas) y el suero, líquido de composición similar al plasma, pero del que se
diferencia, por carecer de fibrinógeno y de la mayoría de los factores de la coagulación.

Para el estudio citológico o cuantitativo de la sangre periférica, médula ósea o citología de líquidos biológicos,
luego de la extracción de la muestra es necesario mantenerla anticoagulada, esto se realiza mediante procesos
físicos o químicos, algunos de ellos específicos para determinadas técnicas, por lo que la elección del
anticoagulante en cuanto a tipo, concentración y su relación anticoagulante/sangre, es un proceso fundamental.
Así mediante distintos procesos podemos obtener:

1. Sangre desfibrinada

Permite obtener simultáneamente suero y células sin contaminación plaquetaria. La sangre debe someterse a una
agitación en un matraz Erlenmeyer que contengan perlas de vidrio, a razón de 1 perla por cada 1 ml de sangre.
Se agita por rotación permanente hasta obtener la fibrina adherida a las perlas.
Mediante este método también es posible obtener suero y el coagulo sanguíneo. El suero, se emplea en casi
todos los estudios bioquímicos habituales y el coágulo en hematología suele utilizarse principalmente para la
determinación de células LE o también llamadas células de lupus, poco utilizado en la actualidad.

2. Sangre anticoagulada
Si se necesita obtener plasma o estudiar algunas de las propiedades de la sangre total o de alguno de
sus componentes celulares, en especial plaquetas, es necesario añadir un anticoagulante a la sangre recién
extraída. Para ello debe elegir el anticoagulante idóneo y en la concentración adecuada, procurando que
exista una proporción adecuada entre éste y el volumen de sangre extraída.

Excepto la heparina, que actúa inhibiendo la acción de la trombina, los restantes anticoagulantes empleados
habitualmente actúan fijando el calcio (Ca++) y evitando con ello la coagulación sanguínea. En hematología,
el anticoagulante idóneo debe cumplir los siguientes requisitos:
• No alterar el tamaño de los glóbulos rojos
• No producir hemólisis
• Evitar al máximo la agregación de las plaquetas
• No alterar la morfología de los leucocitos

1. Anticoagulantes sólidos
a) Acido Etilendiaminotetraacético (EDTA)
El mecanismo de acción es la la quelación del Ca++ necesario para la coagulación sanguínea, de forma tal
que al fijarlo, sin llegar a producir su precipitación impide su actuación y en consecuencia la coagulación
sanguínea.
El EDTA existe en forma de Sal di-sódica, di-potásica y tri-potásica.
La sal tripotásica dispensado en forma líquida ha sido recomendada en los Estados Unidos por Clinical and
Laboratory Standards Institute, sin embargo, la sangre entregada en esta solución está ligeramente diluida, y
la sal de tri-potásica produce cierta contracción de los eritrocitos, lo que resulta en una disminución de 2-3%
del hematocrito en las 4 primeras horas de la recogida la muestra, seguido de una disminución gradual en el
volumen corpuscular medio (MCV). Por el contrario, hay cambios insignificantes cuando se utiliza la sal de
di-potásica. En consecuencia el Consejo Internacional para la Normalización en Hematología (ICSH) ha

16
 recomendado K2EDTA como el anticoagulante de elección para la recolección de muestras de sangre
destinadas a la medida de la cantidad de células de la sangre, así como para su clasificación según tamaño.

El EDTA constituye actualmente un anticoagulante de elección en hematología debido a que:

• Mantiene la morfología eritrocitaria y leucocitaria 3 horas en la realización del frotis sanguíneo, después de
la extracción.
• Asegura la conservación de los elementos formes sanguíneos durante 24 horas si la sangre se mantiene a
4°C.
• Al inhibir la aglutinación de las plaquetas, facilita el recuento de las mismas o su apreciación
semicuantitativa a partir del frotis.
• Se administra de forma seca, por lo tanto no produce hemodilución.

La concentración recomendada de
EDTA es de 1,5 ± 0,25 mg/ml de
sangre. Esta proporción debe cumplirse
siempre, ya que un exceso de
anticoagulante 2 mg/ml de sangre,
puede producir importantes
modificaciones leucocitarias o de la
morfología de los glóbulos rojos como:
• cambios degenerativos
• retracción celular con disminución del
valor del hematocrito
• aumento de la concentración de
hemoglobina corpuscular media
• disminución del volumen corpuscular Esquema de la estructura tridimensional
medio de la molécula del EDTA. Vives J. 2014.
Manual de técnicas de laboratorio en
hematología. Pág. 17.
Por el contrario, un exceso de sangre en relación con la cantidad de anticoagulante conduce a una
insuficiente coagulación sanguínea y, con ello, la eventual formación de microcoágulos, que pueden
alterar las diversas pruebas diagnósticas. En este sentido, el empleo de tubos al vacío con una cantidad
constante de EDTA para un volumen determinado de sangre, tiene hoy en día gran utilidad práctica
puesto que simplifica y normaliza la toma de muestras hematológicas.
En el mercado existen tubos para hemogramas, preparados con EDTA incluido, para pacientes adultos de 3 y 5
ml, pediátricos de 1,5 ml y para recién nacidos de 0,5 ml. pueden ser identificados fácilmente por la tapa de color lila.
También es posible encontrar EDTA líquido o su sal para preparar Triplex III p.a. C10H14N2Na2O8 X 2 H2O P.M. 372,24
g/mol.

Ejercicio:
Preparar una solución al 2% de K2EDTA. Agregar 0,2 ml en un tubo khan y secar a 60-700 C.
¿Qué cantidad de sangre debe agregar al tubo preparado anteriormente para la muestra de
sangre se mantenga anticoagulada sin producir alteraciones en la morfología ni en los
recuentos celulares?

17
 b) Mezcla de oxalato amónico y potásico mezcla de Wintrobe.
Este anticoagulante fue muy empleado en hematología hace mucho tiempo atrás, pero en la actualidad ha sido
prácticamente substituido por el EDTA. Actúa, a diferencia del EDTA, por precipitación del Ca++ con lo que inhibe el
proceso de la coagulación sanguínea. Es fácil de preparar, pero tiene el inconveniente que altera sensiblemente la
morfología eritrocitaria, produciendo variaciones imprevisibles del volumen corpuscular medio VCM.
Se emplea en forma seca a partir de una mezcla de oxalato de amonio y oxalato potásico en proporción 3:2
respectivamente. La cantidad recomendada es de 2 mg de mezcla por cada ml de sangre.

c) Heparina
Es un anticoagulante fisiológico heparienoide natural y, por tanto ideal para evitar la coagulación sanguínea in vivo.
El nombre heparina proviene del griego HEpar que significa hígado, ya que fue aislada por primera vez en
hepatocitos y estructuralmente es un mucopolisacárido ácido. Presenta el inconveniente que si no se agita rápida y
uniformemente con la sangre inmediatamente después de extraída, pueden formarse micro coágulos. Aunque tiene
la ventaja de no alterar el volumen eritrocitario, causa menos hemólisis que el EDTA y no altera la morfología de los
leucocitos, la heparina altera el recuento de leucocitos por causar agregación leucocitaria. Su empleo no es
recomendable para la realización del frotis sanguíneo, porque con los colorantes habituales usados en hematología
produce una coloración de fondo excesivamente azul-rosada. Este fenómeno se intensifica sensiblemente cuando
en el plasma existen proteínas anormales debido al consiguiente cambio de pH.
Se utiliza en la actualidad para la técnica de fragilidad osmótica, citogenética, gasometría sanguínea y es el único
anticoagulante que además de usarse para recolectar sangre, se utiliza como tratamiento anticoagulante.
La síntesis de heparina se obtiene a partir de tejido bovino o porcino y corresponde a polímetros de ácido L-
idurónico y glucosamina, altamente sustituidos por grupos N-sulfato y O-sulfato. Su estructura es similar al heparán
sulfato un glucosaminoglicano presente en la superficie de las células endoteliales. La inhibición de la coagulación la
realiza aumentando significativamente la velocidad de acción de la antitrombina III, Inhibidor natural de las serino
proteasas de la coagulación.
La heparina de sodio o de litio, puede usarse en forma seca o líquida. La proporción aconsejable es de 15-20 UI/ml
de sangre. 1 mg de heparina en polvo equivale aproximadamente a 125 UI. Comercialmente existen tubos de
heparina al vacío que pueden ser identificados fácilmente por la tapa de color verde.

Estructura química de la molécula de heparina. Vives J. 2014. Manual de técnicas de

laboratorio en hematología. Pag 18.

Anticoagulantes líquidos
a) Citrato sódico
Es el anticoagulante de elección, para realizar las pruebas de hemostasia y la determinación de la velocidad de
sedimentación (VHS). Al igual que la mezcla de Wintrobe, actúa a través de la precipitación del Ca++. Se emplea
en forma de solución de citrato trisódico porque preserva muy bien los factores de la coagulación la concentración
sugerida es de 3,2% o 109 mM de C6H5O7Na3 X 2 H2O o alternativamente C6H5O7Na3 X 11 H2O, la proporción de
anticoagulante y sangre depende de la prueba que hay que realizar

• Para pruebas de hemostasia o coagulación, se emplea en proporción 1/9, 1 volumen de

solución de citrato sódico y 9 volúmenes de sangre a una concentración de citrato de sodio
3.2%.

18
 • Para la determinación de VHS, la proporción utilizada es de 1/4, 1 volumen de solución
de citrato y 4 volúmenes de sangre, a una concentración de citrato de sodio 3.2%.
Debido a la gran automatización en los medianos y grandes laboratorios, existe en el mercado tubos especiales para
cada tipo de equipo de coagulación y VHS, preparados y listos para su uso, donde además se utilizan diversos
volúmenes de muestras, para pacientes adultos, pediátricos y recién nacidos. Los tubos de VHS pueden ser
identificados por la tapa de color negro, mientras que los de coagulación se identifican por su tapa color celeste.
Estos últimos se pueden encontrar en dos concentraciones 3,2% recomendada y 3,8%.

b) Oxalato sódico
Recomendado al igual que el citrato de sodio, para pruebas de hemostasia se emplea en forma de solución
de oxalato sódico 0.1 M. en la proporción 1/4 1 volumen de solución por 4 Vol. De sangre. Pero no se utiliza
mayormente en la actualidad.

c) Anticoagulantes líquidos en banco de sangre (ACD-A, ACD-B y CDP-A)

CPD es utilizado para la mantención de células progenitoras hematopoyéticas de cordón umbilical, que
pueden ser utilizadas para trasplante. Uno de los métodos de obtención es la aspiración de la vena umbilical
mediante jeringas de 60 ml con 5 ml de CPD.

d) CTAD
Utilizado para evaluar la activación in vivo de plaquetas, por la medida de componentes de los gránulos α de
las plaquetas, tales como PF-IV, β-tromboglobulina, fibronectina y factor de crecimiento derivado de
plaquetas, se debe minimizar la activación de las plaquetas después de la extracción de la sangre. Esto
puede realizarse previniendo la formación de Tromboxano-A2 o por mantenimiento de concentraciones altas
de AMPc dentro de las plaquetas. Una mezcla aditiva utilizada para este fin está compuesta por: 0.11 mol/L
de ácido cítrico, 15 mmol/L de teofilina, 3.7 mmol/L de adenosina y 0.198 mmol/L de dipiridamol. El pH final
se ajusta a 5,0.

19
 ESTABILIDAD DE LAS MUESTRAS DE SANGRE ANTICOAGULADA PARA ESTUDIO HEMATOLÓGICO

A diferencia de lo que sucede con el suero, cuyo análisis puede realizarse mucho tiempo después de la extracción
debido a la posibilidad de congelación o liofilización, la sangre tratada con anticoagulante debe procesarse lo
antes posible, incluso mantenida bajo refrigeración 4-8°C se deteriora con facilidad. El tiempo máximo que puede
transcurrir entre la extracción y la realización de las diferentes pruebas o técnicas hematológicas, depende de la
naturaleza de las mismas, pero nunca es excesivamente prolongado. Tabla 1

Tabla 1. Tiempo de conservación máximo de la muestra de acuerdo a la temperatura,

anticoagulante y tipo de prueba.
Tiempo de
Prueba Temperatura Anticoagulante
Estabilidad
4°C
Recuento de Eritrocitos 24 horas EDTA
25°C
4°C
Hemoglobina 24 horas EDTA
25°C
48 horas 4°C
Hematocrito EDTA
24 horas 25°C
24 horas 4° C
Indices eritrocitarios EDTA
8 horas 25°C
24 horas 4° C
Recuento de leucocitos EDTA
8 horas 25°C
12 horas 4° C
Fórmula leucocitaria EDTA
4 horas 25° C
4 horas 4° C
Recuento de Eosinófilos EDTA
2 horas 25° C
5 horas 4°C
Recuento de plaquetas EDTA
8 horas 25° C
Recuento de 24 hrs 25° C EDTA
Reticulocitos 48 hrs 4 C
° EDTA
VHS 4-5 horas 25° C Citrato
Resistencia osmótica 2 hora 25° C Heparina
Vives J. 2014. Manual de técnicas de laboratorio en hematología. Pag 15.

Efectos adversos de los anticoagulantes sobre las células sanguíneas.

Eritrocitos
Crenación
Plaquetas
Hidratación (aumento del tamaño)
Leucocitos
Citoplasma
Vacuolización (neutrófilos y monocitos)
Aumento de la granulación azurófila
Núcleo
Apoptosis y cariorrexis (neutrófilos)
Hidratación (linfocitos y monocitos)
Desestructuración de la cromatina (todas las células)

20
Effect of storage on blood cell morphology. Photomicrographs from films made from ethylenediaminetetra-acetic acid
(EDTA) blood after 24 hours at 20°C. A and B: Polymorphnuclear neutrophil; C: Monocytes; D, E, and F: Lymphocytes. Red
cell crenation is prominent in B and E. Dacie and Lewis Practical hematology10° edition

21
 GLOSARIO DE TÉRMINOS USADOS EN HEMATOLOGÍA

TERMINO SIGNIFICADO CARACTER

Citos Célula Sufijo
Osis Aumento Sufijo
Penia Reducción Sufijo
Filia afinidad Sufijo
Cromia Color Sufijo
hipo Reducción Reducción
Hiper Aumento Reducción
Megalo Muy grande Reducción
Macro Grande Reducción
Micro Pequeño Reducción
Aniso Heterogéneo Reducción
Poiquilo Variado Reducción
Sidero De hierro Reducción

Definición de la estructura:
Eritrocitos = rojo
Blasto = primitivo

La combinación de estos términos determinan otros como: anisocitosis, megaloblastosis,

hipocromía.

Anemia: disminución por bajos los valores aceptados como normales de la concentración de
Hemoglobina y el porcentaje de hematocrito.

Policromatofilia o policromasia: presencia en el frotis sanguíneo de eritrocitos de mayor

tamaño de color azul grisáceo (basofilia) que indica eritrocitos inmaduros con restos de ácido
ribonucleico. Son equivalentes a reticulocitos observados con tinciones especiales.

Anemia Hipocroma: es la anemia caracterizada por la presencia de eritrocitos hipocromos.

Anemia Normocroma: es aquella en donde los eritrocitos son de cromía normal.

Anemia Macrocitica: anemia caracterizada por la presencia de eritrocitos macrociticos en

cantidad leve o marcada.

Anemia microcitica: es aquella donde predominan eritrocitos microciticos.

Anemia Arregenerativa: aquella caracterizada por reticulocitos normales o disminuidos y

ausencia de policromasia o policromatofilia.

Anemia Regenerativa: aquella caracterizada por aumento de reticulocitos y policromasia o

policromatofilia.

Acantocito: eritrocitos con proyecciones irregulares en su superficie.

Aneosinofilia: ausencia de eosinofilos en el frotis de sangre.

Anillos de Cabot: filamento de membrana nuclear, circulares o en ocho de color purpura.

Anisocitosis: en el frotis sanguíneo de eritrocitos de diferente tamaño que puede ser leve,
moderada o intensa y de predominio microcitico o macrocitico.

22
Anisocromia: presencia en el frotis sanguíneo de eritrocitos de diferente cromía, es decir, de
cromía normal y cromía disminuida.

Basófilo: granulocitos cuyos gránulos se tiñen con colorantes básicos de color oscuro.

Basofilia: aumento del basofilos sobre 5% en el recuento diferencia.

Basopenia: disminución de basófilos bajo 0,02x109 /L

Células falciformes, drepanocitos, sickle cell: eritrocitos en forma de hoz o en semiluna.

Codocito, target cell, dianocito: eritrocitos con reborde periférico nítido que rodea una zona
angular de hemoglobina más clara y por su parte central más clara.

Concentración de hemoglobina corpuscular media: indica la concentración media de

hemoglobina por litro de una masa de hematíes, se expresa en gr/dL

Crenocito, equinocito: eritrocito espiculado con proyecciones cortas que cubren su

superficie.

Cuerpos de Döhle: aéreas basofilas circunscritas en el citoplasma de los neutrofilos.

Aparecen especialmente en infecciones graves.

Cuerpos de Howell Jolly: granulo grueso, esférico, generalmente excéntrico, se tiñe de

color azulado (basofilo) ubicado en el interior de un eritrocito, corresponde a restos de núcleo.

Dacriocito: eritrocito con extremo elongado en forma de gota o lagrima

Desviación a la derecha: aparición de neutrofilos con un número de segmentos más de lo

normal.

Desviación a la izquierda: aumento en el recuento diferencial de baciliformes (>6%) y a

veces también presencia de juveniles y mielocitos.

Distribución por anchura de eritrocitos (red cell volumen distribution width) (RDW):
medición de anisocitosis, se expresa en porcentaje.

Eliptocito u ovalocito: eritrocito en forma ovalada y elongada.

Eosinofilo: granulocito cuyos gránulos se tiñen de color café oro con colorantes ácidos.

Eosinofilia: aumento de los eosinofilos sobre 0,45x109/L

Eosinopenia: disminución de los eosinofilos bajo 0,05x109/L

Eritroblasto: célula de la serie roja inmadura, presenta núcleo.

Esferocito: eritrocitos esféricos que han perdido su forma bicóncava, sin centro claro

Esquistocito, esquizocito: eritrocito fragmentado con aspecto cuneiforme, irregular

espiculado, con proyecciones cortas que cubren la superficie.

Estomatocito: eritrocito con depresión central en forma de boca.

Granulación Tóxica Degenerativa de los leucocitos, RTD, GPN o Granulación

patológica: presencia de neutrófilos con granulas hiperteñidos y vacuolas en el citoplasma.

23
Hemoglobina corpuscular media (HCM): indica la hemoglobina contenida en el glóbulo rojo
y se expresa en picogramos (pg/Célula)

Hematocrito: relación entre el volumen de eritrocitos y volumen sanguíneo de una columna

de sangre centrifugada (microhematocrito)

Hipocromía: disminución de la comía del eritrocitos, por disminución del contenido de

hemoglobina.

Linfocito Reactivo: linfocito con alteraciones morfológicas caracterizadas por la abundancia

de citoplasma, borde irregular, basofilia citoplasmática, núcleo maduro o joven de forma
irregular y cromatina más fina.

Índice ictérico: mide la intensidad de color amarillo del plasma.

Inmunoblasto: célula de gran tamaño 20 – 30 ul con un amplio núcleo central, cromatina

laxa con numerosos nucléolos. Su citoplasma moderadamente extenso presenta intensa
basofilia y pironinofilia

Linfocitosis absoluta: aumento absoluto de los linfocitos circulantes sobre 4x109/L en

adultos. 9x109/ en niños menores y 7x109/L en niños mayores.

Linfocitosis relativa: aumento porcentual de los linfocitos en el recuento diferencial sin que
este aumentado en forma absoluta.

Linfopenia: disminución de las cifras absolutas de linfocitos menor a 1,4x10 9/L en niños y
1x109/L en adultos.

Leucocitos: incluye todos los glóbulos blancos, tanto granulocitos como agranulocitos

Leucocitosis: aumento del número de leucocitos sobre valores normales mayor de 11x109/L

Leucopenia: disminución del número de leucocitos bajo valores normales (menos de

4x109/L)

Macrocitosis: presencia en el frotis sanguíneo de eritrocitos grandes en cantidad leve o

marcada

Microcitosis: presencia en el frotis sanguíneo de eritrocitos pequeños en cantidad leve o

marcada

Megaloblastos: eritroblastos con alteraciones madurativas. Se encuentran en medula ósea.

Megalocito: eritrocitos grandes ovalados y con escaso o nulo centro claro

Monocitosis: aumento del número de monocitos sobre 0,8x109/L

Monocitopenia: recuento absoluto de monocitos inferior a 0,2x109/L

Neutrófilos: granulocitos, cuyo citoplasma se tiñe de forma neutra.

Neutrófilo hipersegmentado: Neutrofilos cuyo núcleo se ha segmentado en más de 5

lóbulos.

Neutofilia: aumento de los granulocitos neutrofilos sobre 7,5x109/L

24
Neutropenia: disminución de los granulocitos neutrofilos bajo 1,5x109/L

Normocitosis: eritrocitos de tamaño normal

Normocromia: eritrocitos de color rosado con coloración normal.

Pancitopenia: trastorno de la formación de las tres series que se caracteriza por anemia,
leucopenia y trombocitopenia.

Pelger Hüet: anomalía constitucional de los granulocitos en done los neutrofilos solo
maduran hasta la forma de baciliforme y presentan núcleo bilobulado “lentes de sol”

Macroplaqueta: plaqueta de gran tamaño

Plasmocitosis: aumento de los plasmocitos sobre 0,01x109/L

Poiquilocitosis: presencia en el frotis sanguíneo de eritrocitos de diferentes formas que

puede ser leve moderada o marcada.

Policitemia o poliglobulia: aumento del número de hematíes por unidad de volumen

sanguíneo.

Punteado basofilo: presencia de eritrocitos con punteado múltiple en su interior que se tiñe
con colorantes básicos, son eritrocitos jóvenes con restos de ribosomas.

Reacción leucemoide: cambios hematológicos que asemejan una leucemia. El patrón puede
ser mieloide o linfoide y raramente monocitoide.

Reticulocitos: eritrocitos jóvenes en los cuales persiste restos de ácido ribonucleico en

forma de retículo. Solo es posible observarlos con tinciones especiales.

Rouleaux: eritrocitos observados en el frotis sanguíneo en donde se disponen en formación

de pilas de monedas

Síndrome leucoeritroblastico: presencia en el frotis de eritroblastos y reacción leucemoide

de los granulocitos.

Restos de Gümprecht: restos nucleares de linfocitos frágiles.

Trombocitosis: aumento del número de plaquetas sobre 400.000/uL

Trombopenia, trombocitopenia, plaquetopenia: disminución del número de plaquetas bajo

el rango normal.

VHS, velocidad de sedimentación globular o eritrosedimentacion: mide la distancia en

mm de la caída de los eritrocitos en una hora.

Volumen corpuscular Medio (VCM): señala el volumen promedio de cada eritrocito y se

expresa en femtolitro (fL)

Ref. Hematología y procedimientos de laboratorio Guido Osorio.

25
 HEMATOCRITO

El hematocrito es el volumen relativo ocupado por los glóbulos rojos con respecto a la sangre total, después de
su separación por centrifugación.
Se expresa por una fracción decimal o porcentaje. Como se trata de una relación entre 2 magnitudes volumétricas
(L/L), la unidad es igual a 1 y se omite o se expresa en %.
El hematocrito es uno de los valores básicos para calcular los Índices Eritrocitarios, como volumen corpuscular
medio (VCM) y en conjunto con la hemoglobina permite calcular la concentración de hemoglobina corpuscular
media (CHCM).
Es usado como test de screenig para detectar anemia (su valor está relacionado con la concentración de
hemoglobina).
El hematocrito es 3 veces el valor de la hemoglobina en condiciones de nomocromía.
Existen métodos de determinación de hematocrito manual y automatizado. Pero el método de referencia para para
determinar el hematocrito es la centrifugación de sangre total en un tubo capilar (micrométodo).
Métodos Manuales
• Microhematocrito
• Macrohematocrito (no utilizado en la actualidad)

MICROHEMATOCRITO. Método recomendado por el NCCLS.

MUESTRA
• Capilar: recolectada directamente desde el sitio de punción, usando tubos capilares con
heparina. Cada capilar requiere aprox. 50 ul de sangre.
• Venosa: recolectada con EDTA

MATERIALES:
• Micro centrifuga
• Tubos capilares de 75 mm y 1 mm de diámetro interno.
• Sin anticoagulantes (borde azul) o heparinizados (borde rojo).
• Lector de microhematocrito
• Plasticina u otro sellador

PROCEDIMIENTO PARA DETERMINACIÓN DE MICROHEMATOCRITO

1) Homogeneizar la muestra. La determinación debe hacerse en duplicado.
2) Llenar el tubo de microhematocrito por capilaridad hasta llenar el tubo en 3/4 del largo total, limpiar
superficie externa.
3) Sellar el extremo vacío, colocando el capilar en un ángulo de 90º con el sellador, rotar y retirar. El tapón
debe tener 4 a 6 mm de longitud.
4) Centrifugar 5 minutos a 10.000 g (12.000 a 15.000 r.p.m)
5) Si el hematocrito es superior a 50% centrifugar por 5 minutos más, para eliminar el máximo de plasma
atrapado.
6) Retirar los tubos de la centrifuga y leer en un lector de microhematocrito, colocando la base de la columna
de sangre en el 0 de la escala y el menisco del plasma en el 100. El valor del hematocrito es el que
corresponde al límite superior de la columna de glóbulos rojos.
7) Mantener en posición vertical los tubos que no son leídos inmediatamente.
En el caso de no contar con un lector de microhematocrito, se puede leer con una regla
milimetrada el largo total de la columna de sangre (LT) y el de la columna de los eritrocitos
(LE). Para el hematocrito= (LE/LT) X 100.

27
 PLASMA

BUFFY COAT

HEMATOCRITO
(Eritrocitos empaquetados)

Separación de los Eritrocitos post Centrifugación. Observe el efecto del plasma atrapado entre
los eritrocitos que falsea el valor del hematocrito real. Vives J. 2014. Manual de técnicas de
laboratorio en hematología. Pag 20.

Proceso de sellado del capilar. .Medición de hematocrito por técnica de Microhematocrito

Precisión del método de microhematocrito.

El método de micro hematocrito tiene una adecuada precisión y exactitud para su utilidad clínica, pero se debe
tener cuidado en evitar los factores que inducen a error y a obtener resultados incorrectos.

Fuentes de error en método microhematocrito:

• El EDTA debe tener una concentración de 1,5 mg/ml de sangre. Si la concentración esta
aumentada se produce una disminución del tamaño de los eritrocitos, lo que provoca un valor
de hematocrito más bajo.
• En la muestra capilar se puede producir una hemodilución por los líquidos intersticiales si la
presión ejercida en la toma de muestra es exagerada.
• Mezcla inadecuada de la muestra venosa antes de llenar los capilares
• Muestra con microcoágulos
• Centrifuga con velocidad y tiempos inadecuados.

28
 • Aumento del nivel de plasma atrapado como en las esferocitosis, policitemias, deficiencia de
hierro.
• Estasis aumentada durante la venopunción, se puede producir un aumento de 2.5 a 5%.
• En la lectura de la columna de los eritrocitos se debe excluir a los leucocitos y plaquetas
• Deterioro del capilar heparinizado por malas condiciones de almacenamiento.
• Lisis producida por aumento de la temperatura de la centrifuga al ser usada por un tiempo
prolongado.

INFORME
Se recomienda expresar el resultado en una fracción decimal, en lugar de porcentaje, aunque
esta última es la forma de expresión más generalizada.

Ej: Hematocrito: 0,25 o 25%

VARIABILIDAD BIOLOGICA
- Intraindividuo: 2.7%
- Interindividuo: 6.41%

29
 HEMOGLOBINA

La hemoglobina es el pigmento rojo que da color a la

sangre y constituye el 95% del peso seco eritrocitario. La
molécula es una proteína conjugada de 64.400 Da. Cada
molécula está formada por 4 cadenas de globinas y 4
grupos hemo unidos a cada una de las cadenas de
globina. La unión entre el grupo hemo y la globina la
realiza a través del hierro (quinta valencia de
coordinación) y uniones covalentes entre las cadenas Esquema de la estructura de la
laterales de los grupos pirrol y los aminoácidos de la Hemoglobina. Vives J. 2014. Manual de
globina. técnicas de laboratorio en hematología.
Pag 1.

La medición de la concentración de la Hemoglobina es un examen esencial para el diagnóstico de

Anemia y de la poliglobulia.
El método recomendado por el Comité Internacional de Estandarización de Hematología (ICSH) y el CLSI
es el de Cian metahemoglobina. Es una determinación que puede realizarse con gran precisión y
exactitud y los resultados son trazables frente al patrón de referencia internacional.
A continuación se describe el método de Cian metahemoglobina de manera referencial, pero actualmente
lo más utilizado es la medición en contador hematológico mediante método óptico.

Principio del método Cian metahemoglobina:

El método se basa en la dilución de la sangre en una solución que contiene cianuro de potasio y
ferricianuro de potasio. En donde la hemoglobina y sus derivados (carboxihemoglobina,
metahemoglobina), con excepción de sulfohemoglobina, por acción de K3Fe (CN)6 se oxida y convierte en
hemiglobina (Hi), la que en contacto con KCN se transforma en cianuro de hemoglobina.

Muestra
• Sangre venosa recolectada con anticoagulante EDTA o sangre capilar

Materiales y reactivos
• Espectrofotómetro o fotómetro con filtro para leer a 540 nm
• Tubos de 5ml
• Calibrador de hemoglobina
• Micropipetas y pipetas volumétricas de 5 ml
• Dispensador o pipetas para 5 ml
• Solución de Drabkin modificada pH 7.0 – 7.4
K3Fe (CN)6 200 mg
KCN 50 mg
KH2PO4 140 mg
Detergente no iónico * 0.5 ml
Agua destilada c.s.p 1000 ml
*Extran neutro
Características del Reactivo de Drabkin
• Color amarillo
• Aspecto transparente
• Absorbancia cero a 540 nm contra blanco de agua

30
 • Estabilidad: varios meses a 4ºC y frasco oscuro, si se congela debe ser descartada.

Curva de calibración Hemoglobina

La relación de la intensidad de color de un soluto y su concentración se rigen por la Ley de Lambert-Beer que
establece una correlación directa de la sustancia y la intensidad de color leída como densidad óptica.
Al graficar las intensidades ópticas en función de las concentraciones conocidas de un soluto (Estándar o
Calibrador), obtenemos una línea recta, lo que nos confirma el cumplimiento de la ley. Los valores obtenidos nos
permiten calcular la concentración de muestras problemas en el grafico o a través del Factor de Calibración.

Procedimiento
1) Dilución del calibrador: se recomienda preparar diluciones 1/2, 1/3, 1/4, 1/5 etc.
2) Colocar 2,5 ml de rectivo de Drabkin en un tubo.
3) Colocar 20 ul de estándar diluido a cada tubo con los 2.5 ml de reactivo.
4) Dejar en reposo por 5 minutos.
5) Leer densidad óptica (DO) a 540 nm frente a un blanco de reactivo.
6) Graficar en papel milimetrado las DO obtenidas en función de las
concentraciones de Hemoglobina. En la abscisa se coloca la variable
independiente (g/dl) y en la ordenada la variable dependiente (DO).
7) Calculo de la concentración de Hemoglobina mediante factor de
calibración o mediante ecuación.

Análisis de muestras
1) Coloca 2,5 ml de rectico de Drabkin en un tubo.
2) Mezclar la muestra de sangre
3) Colocar 20 ul de muestra en el tubo con los 2,5 ml de reactivo
4) Dejar en reposo por 5 minutos.
5) Leer densidad óptica a 540 nm frente a un blanco de reactivo.
6) Convertir la densidad óptica en g/dL utilizando una curva de calibración.

INFORME:
Hemoglobina en g/dL con una cifra decimal. Unidad Internacional g/L

VARIABILIDAD BIOLOGICA
- Intraindividuo: 2.85%
- Interindividuo: 6.8%

Tarea
Investigue las causas de error en la determinación de Hemoglobina.

31
 INDICES ERITROCITARIOS

En el año 1930 WINTROBE diseñó un sistema matemático para obtener información útil que relacionaba la
concentración de hemoglobina, recuento de eritrocitos y el hematocrito. Estos son los Índices Eritrocitarios o
Constantes de Wintrobe y los que más se utilizan son CHCM, HCM, VCM y RDW. Tienen una gran importancia en
la orientación diagnostica del tipo morfológico de anemia.

• Volumen Corpuscular Medio (VCM).

Valor medio del tamaño de cada eritrocito

VCM= Hematocrito L/L)

Número de eritrocitos (x1012/L)

Ejemplo: si el HTO es 0.35 y el recuento de eritrocitos 4x1012/L, el volumen ocupado por ellos será:
VCM= 0.35 (L/L) = 87,5 x 10-15 87,5 Femtolitros
4x1012/L

• Hemoglobina Corpuscular Media (HCM)

Es el valor medio del contenido de Hemoglobina por eritrocito. Se determina mediante el cociente entre la
concentración de Hb en g/dL y la de eritrocitos

HCM= Hemoglobina (g/L)

Número de eritrocitos (x1012/L)

Ejemplo: si la Hb es 116 g/L y el recuento de eritrocitos 4x1012/L, la Hb de cada eritrocito será:

HCM= 116 g/dl = 29 x 10-12 grs (29 picogramos)

4 x1012/L

• Concentración de Hemoglobina Corpuscular Media (CHCM)

Corresponde a la concentración de hemoglobina por cada litro de masa eritrocitaria y se calcula a partir de la
concentración de hemoglobina y el hematocrito.

CHCM= Hemoglobina (g/l)

Hematocrito (L/L)

Ejemplo: si la muestra de sangre tiene Hb de 116 g/L y el HTO 0,35 L/L

CHCM= 116 g/dl = 331 g/L o 33.1gr/dl (33g %)
0,35 L/L

Tarea:
Investigue en qué consiste, forma de calcularlo y aplicación del RDW CV - SD y VPM.

32
 TECNOLOGÍA DE LOS CONTADORES HEMATOLOGICOS

Los contadores hematológicos son equipos automatizados que poseen tecnología informática, física y
química que permite analizar muestras de sangre, los cuales permite hacer recuentos de eritrocitos,
leucocitos y plaquetas, así como diferentes índices de cada uno y formula diferencial.
La medición del número de células suele realizarse simultáneamente con el tamaño y para ello
aprovechan las variaciones que se presentan en un campo electromagnético en el cual se suspenden
las células objeto del estudio. Desde el punto de vista tecnológico, la mayoría de los recuentos
electrónicos de eritrocitos, así como el recuento total de leucocitos y de plaquetas se hace utilizando
la impedancia eléctrica y otras tecnologías que se describen a continuación.

1. Impedancia eléctrica También conocida como principio Coulter, en honor al ingeniero Wallece Henry
Coulter quien lo describió en 1956, no sólo revolucionó la hematología sino que inició la era de los
autoanalizadores de hematología, con excelente eficiencia analítica (precisión y exactitud), y ha aportado
nuevos parámetros de utilidad clínica. El método se basa en la resistencia que presentan las células, que no
son conductoras eléctricas, al paso de la corriente eléctrica cuando atraviesan un pequeño orificio, conocido
como apertura, que separa dos medios con diferente potencial. El número de pulsos eléctricos indica la
cantidad de partículas que pasan a través de la apertura y el tamaño de los pulsos es proporcional al
volumen de las partículas.

Recuento de Eritrocitos y Plaquetas

RBC = 36 - 250 ft
PLT = 2 - 30 ft

33
Radiofrecuencia.
La RF o conductividad es una onda electromagnética de alta frecuencia que suele
usarse asociada a la impedancia. De esta forma, mientras que la impedancia
(resistencia) guarda una relación directa al volumen celular, la radiofrecuencia
(conductividad) lo hace con la densidad de los componentes intracelulares (núcleo
y organelos). Esto permite además de obtener el recuento, ofrecer un valor del
tamaño celular y una separación de los leucocitos en 5 poblaciones.
Dispersión lumínica. Un rayo de luz láser incide sobre las células, el cual modifica
su trayectoria pero no la longitud de onda, lo que da origen a la dispersión en todas
las direcciones. Esta luz dispersada esmedida fotomultplicadores. La cantidad de
luz dispersada es proporcional al volumen celular. La dispersión de luz se mide
frontal y lateralmente.
Side scatter o dispersión lateral: es producida por la refracción y reflexión de la luz
sobre la superficie de las células y las estructuras intacelulares. Se mide en un
angulo de 90°. Da información de la complejidad de la célula.
Forward scatter o dispersión lateral. Se mide la luz dispersada en un ángulo
pequeño a 2-3° y a 5-15°. Da información del tamaño celular.

34
 Dispersión frontal de luz: tamaño celular.

Dispersión frontal de luz: tamaño celular. Dispersión lateral de luz: complejidad

celular.

Recuento diferencial de leucocitos Scattergrama diferencial de Leucocitos

47
Estos instrumentos automatizados totalmente producen una pantalla gráfica de gran parte de los datos
producidos (datos numéricos, histogramas, citogramas o scatergramas). Esto se visualiza en un monitor y se
pueden imprimir, ya sea en blanco y negro o en color. La inspección de la pantalla gráfica puede dar más
información de lo que está disponible en la evaluación de los datos numéricos. Muestra lo general en
histogramas de tamaño de glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas y algunos muestran histogramas de
concentración y dispersión de los eritrocitos frente a la concentración de hemoglobina. Los recuentos
diferenciales se representan gráficamente como gráficos de dispersión de dos variables, side scatter y forward
scatter.

En la siguiente tabla se muestran diferentes equipos y la tecnología que utilizan para realizar los recuentos
Automated full blood counters with a five-part or more differential counting capaciti

Instrument and Technology used for differential count

manufacturer
Coulter STKS, GEN-S, Impedance with low-frequency electromagnetic current
LH 700 series Impedance with high-frequency electromagnetic current
Laser light scattering
Sysmex SE series, Impedance with low-frequency direct current
XE2100 Impedance with radiofrequency current
Bayer H series, Advia Light scattering and absorbance following peroxidase reaction
Two-angle light scatter following differential cytoplasmic stripping
Abbott Cell-Dyn 3500 Four light-scattering parameters: forward light scatter, orthogonal light scatter,
narrow-angle light scatter, and depolarized orthogonal light scatter
Cobas Argos 5 Electrical impedance with intact cells and following differential cytoplasmic
stripping
Light absorbance

48
RESULTADOS DE UN HEMOGRAMA AUTOMATIZADO

49
 MORFOLOGÍA ERITROIDE

ICSH Recommendations for Peripheral Blood Cell Morphology Standardization and Grading

Eritrocitos normales

Acantocitos

J. Burthem, M. Brereton

Queratocitos

J. Burthem, M. Brereton

Equinocitos

J. Burthem, M. Brereton
2

50
Eliptocitos

J. Burthem, M. Brereton

Eritrocito Policromatofilico.

Esquistocitos

J. Burthem, M. Brereton

Drepanocitos

Image S9: Esferocitos

J. Burthem, M. Brereton

Image S10: Estomatocitos

J. Burthem, M. Brereton

51
Image S11: Codocitos

J. Burthem, M. Brereton

Image S12: Dacriocitos

Image S13: Punteado basófilo

J. Burthem, M. Brereton

Cuerpos de Howell-Jolly

J. Burthem, M. Brereton

Cuerpos Pappenheimer bodies

52
 PROGENITORES ERITROIDES

Pro Eritroblasto

Eritroblasto Basófilo

Eritroblasto Policromático

Eritroblasto Ortocromático

Patterns of blood count print out of some automated systems. Sysmex XE 2100

53
 VELOCIDAD DE SEDIMENTACION ERITROCITARIA

La Velocidad de Sedimentación eritrocitaria o eritrosedimentación mide la propiedad física de la sangre. El

método de referencia es el de Westergreen y mide la velocidad de sedimentación de los eritrocitos en el plasma
en un periodo de tiempo de 60 minutos cuando la sangre anticoagulada se ha puesto en una varilla de
dimensiones preestablecidas y estandarizadas. El valor numérico informado corresponde a la altura de la
columna de plasma que se ha separado por la sedimentación celular. La rapidez con la que sedimentan los
eritrocitos se llama Velocidad de Hemática de Sedimentación o VHS.
El proceso ocurre en 3 etapas: aglutinación, sedimentación y depósito de eritrocitos.
Actualmente este proceso se encuentra automatizado y las determinaciones dependiendo del equipo se obtienen
a los 30 minutos, entregando además la cinética de caída de los glóbulos rojos.
La utilidad clínica es inespecífica, pero indica la presencia de reactantes de fase aguda (infección o inflamación)
y se correlaciona con el aumento de citoquina como IL 1 y 6, y proteína C reactiva.

Etapas en el desarrollo de la eritrosedimentación. Vives J. 2014. Manual de técnicas de

laboratorio en hematología. Pag 180,

MUESTRA
• Sangre venosa obtenida con EDTA
• O tubos especialmente preparados con citrato de sodio (4 volúmenes de sangre y 1
volumen de anticoagulante) de tapa negra.
Estabilidad de la muestra: ………………….

MATERIALES
• Pipetas de Westergreen de una longitud suficiente (200mm) de vidrio o plástico, graduada
de 0 a 140 mm cada 1 mm. Calibre 2,55mm (±0.15mm)
• Gradillas y copas para pipetas de Westrgreen
• Cronómetro, Pipetas automáticas y puntas

PROCEDIMIENTO
1. Diluir la muestra, con citrato de sodio (3,8%) o con suero fisiológico (8.5g/L) en proporción
de 4 volúmenes de sangre y 1 volumen de citrato de sodio. Mezclar 10 veces.
2. Llenar la pipeta de sedimentación hasta la marca “0” cuidando que no queden burbujas
atrapadas.
3. Colocar la columna en gradilla de sedimentación en posición vertical perfecta (<1º
inclinación) a Tº ambiente (20 -25ºC), sin vibraciones ni corrientes de aire y evitando la
radiación solar directa.
4. Dejar en reposos durante 60 minutos (±1 min) y leer la distancia entre la parte superior del
menisco formado por el plasma (marca 0) y el límite formado con la columna de células
sedimentadas sin incluir los leucocitos.

54
 Pipeta de Westergren.
Control de calidad: procesar en cada corrida analítica controles comerciales para VHS.
Fuentes de error
• Tubos con diámetro menor a 2,55mm dan resultados más bajos.
• Vibraciones o calor aceleran el proceso y se obtienen valores más altos.
• Falta de homogenización de la muestra antes de llenar la pipeta.
INFORME
El resultado de la velocidad de sedimentación se expresa en mm/hora

Tarea: Investigue que factores físicos, técnicos y fisiopatológicos influyen en la VHS

Equipo automatizado para determinación de VHS. Vives J. 2014. Manual de técnicas de

laboratorio en hematología. Pag 184.

55
 RETICULOCITOS

El reticulocito es un glóbulo rojo inmaduro anucleado, que contiene 2 o más partículas de ácido ribonucleico
(RNA) ribosomal en el citoplasma que se tiñen con colorantes supravitales y da lugar a una imagen reticulada de
color azul violeta muy característico.
El recuento manual de reticulocitos es el método de referencia por la ICSH y el CLSI y constituye un método
directo y sencillo que sirve para evaluar la efectividad de la eritropoyesis. El método consiste en contar los
reticulocitos mediante microscopia óptica convencional en un frotis teñido con colorante supravital.
Según el número de reticulocitos las anemias se pueden clasificar como Regenerativas o Arregenerativas.

RETICULOCITO

ERITROCITO MADURO

Frotis de sangre teñido con Tinción Supraviral Azul Cresil Brillante

MUESTRA
• Sangre venosa con EDTA o capilar

MATERIALES
• Microscopio
• Portaobjeto 25x75mm
• Tubos 12x75mm
• Pipetas Pasteur
• Tinción azul cresil brillante
• Baño termo-regulado o estufa a 37ªC

Reactivo
Solución Azul Cresil Brillante Solución Nuevo Azul de Metileno
Nuevo azul de metileno 1gr
Azul cresil brillante 1gr Buffer fosfato pH 7,4 100ml
NaCl 0,9% 100ml Sol. A: Na H2PO4* 2H2O (150mmol/L) 23,4 g/L
Citrato de Na (NaC6H5O7x2H2O) 0,4 gr Sol. B: Na2 HPO4 (150mmol/L) 21,3
gr/L
Disolver el azul cresil brillante en el NaCl, Mezclar solución A 18ml + solución B 82 ml,
agregar el Citrato de Na y filtrar. Guardar pH 7,4
protegido de la luz. Estable 1 año. Disolver el azul de metileno en buffer
fosfato y filtrar. Guardar protegido de la luz.
Estable 1 año.

PROCEDIMIENTO PARA TINCIÓN SUPRAVIRAL CON AZUL CRESIL BRILLANTE.

1. En un tubo de ensayo de 75 x 10mm agregar 2 gotas de solución azul cresil brillante.
2. Agregar 2 gotas de sangre-EDTA del paciente.
3. Mezclar e incubar 15 min a 37ºC
4. Mezclar y preparar un frotis. Secar a Tº ambiente.
5. Examinar al microscopio con objetivo de inmersión. Contar los reticulocitos presentes en
1000 eritrocitos maduros en la zona en que los eritrocitos no se superponen y calcular el %
de reticulocitos observados.

56
 Nota:
- En pacientes anémicos se debe agregar una mayor proporción de sangre y en pacientes policitémicos
una menor cantidad.
- En una preparación correcta se observa un material reticulofilamentoso coloreado de azul profundo y las
células no reticuladas (eritrocitos maduros) se ven como sombras difusas de color verdoso pálido.

INFORME DE RESULTADOS
• % de reticulocitos.
• Recuento absoluto de reticulocitos
• Recuento de Reticulocitos Corregido
• Índice de producción reticlulocitaria

CALCULO DE RESULTADOS
• Recuento Relativo de Reticulocitos: Se expresa en %

% Reticulocitos = Nº Reticulocitos Contados X 100 Intervalo de Referencia: 0,5 – 2%

Nº de Eritrocitos Contados

• Recuento Absoluto de Reticulocitos: Se expresa en número de reticulocitos/uL de sangre

Reticulocitos/uL = % Reticulocitos x Recuento de Eritrocitos (106/ul)
100 Intervalo de Referencia: 50x103-100 x103/ul

Recuento de Reticulocitos Corregido

El recuento de reticulocitos puede estar aumentado porque hay más reticulocitos en la circulación o porque hay
un menor número de eritrocitos maduros. Por lo tanto el recuento observado de reticulocitos debe ser corregido
a un hematocrito normal de 0,45 (45%).

Rec. Reticulocitos Corregido (%) = (%)Reticulocitos x HTO paciente% Intervalo de Referencia: 0,5 – 1,5%

HTO
Normal (45%)

Índice de Producción Reticulocitaria (IPR)

Es la corrección que se hace en relación a tiempo de maduración de los reticulocitos en circulación. El
Recuento Reticulocitos puede ser alterado por la entrega prematura de células desde medula ósea
(desciacion reticulocitaria o fenómeno de shift). Si se detecta policromatofilia en el frotis de sangre se
debe aplicar la segunda corrección de acuerdo al tiempo de maduración del reticulocito en la sangre
periférica.
Tiempo de maduración de reticulocitos en circulación
• Para Hematocrito de 45% es de 1,0 día
• Para Hematocrito de 35% es de 1,5 días
• Para Hematocrito de 25% es de 2,0 días
• Para Hematocrito de 15% es de 3 días

Para el cálculo se debe aplicar la fórmula:

HTO paciente Intervalo de Referencia: 2 – 3 %
(IPR) = Rec Reticulocitos (%) x HTO Normal (45%) ___ IPR<2 Anemia arregenerativa
Tiempo de maduración en periferia (días) IPR>3 Anemia regenerativa

57
 CAUSAS DE ERROR EN EL RECUENO VISUAL DE RETICULOCITOS
- Relación insuficiente entre sangre/colorante
- Realizar el recuento sobre un número reducido de eritrocitos
- Realizar el recuento en una zona con mala distribución de los eritrocitos
- Interferentes como cuerpos de Heinz, cuerpos de Howel jolly, cuerpos de
Pappenheimer o precipitado del colorante

Variaciones de la concentración de reticulocitos en sangre

Disminución (reticulocitopenia) Aumento (reticulocitosis)
Aplasia medular Periodo neonatal
Anemias carenciales intensas Embarazo
(megaloblasticas y ferropenica)
Anemias diseritropoyeticas congénitas y Anemias hemolíticas
adquiridas
Anemias secundarias a inflamación crónica Anemias post hemorrágicas
Anemias carenciales en fase inicial de
tratamiento
Mieloptisis
Mielofibrosis

Tarea: ¿Cómo se realiza el recuento automatizado de reticulocitos y por citometría de flujo?

58
 FROTIS SANGUINEO

El frotis sanguíneo se emplea para el estudio morfológico y estimación cuantitativa de los elementos
figurados de la sangre.
Pueden ser preparados de una muestra directa (sin previo contacto con anticoagulante) o de una
muestra obtenida con anticoagulante.
El método usado para la confección puede ser manual o con sistema automatizado.
Materiales:
• Lanceta estéril
• Jeringa y aguja (muestra venosa)
• Cubreobjetos
• Portaobjetos

PREPARACION DEL FROTIS SANGUINEO: método manual.

1. Usar láminas limpias, libres de polvo y grasas de dimensión 75x25 mm
2. Se coloca una gota de sangre recién extraída (aproximadamente 8 ul) a 1cm de uno de los
extremos del portaobjetos (Fig 5) y se debe extender lo antes posible para evitar la
formación de fibrina. Alternativamente se puede usar sangre con EDTA hasta 3 horas
después de la extracción.

Fig. 5 Aplicación de la muestra

3. Sostener firmemente entre el dedo índice y pulgar el portaobjeto con la otra mano se coloca
la lámina extensora (cubreobjetos u otro portaobjeto), en un ángulo de 45º tocando la gota
de sangre. (Fig 6)

Fig 6. Extensión de la muestra parte 1

4. La sangre difunde por capilaridad entre el portaobjetos y la lámina extensora.

5. Una vez extendida la gota en el diámetro transversal del portaobjeto se desplaza el
cubreobjetos a una velocidad uniforme sin perder el contacto con el portaobjeto. (Fig 7).

59
 Fig 7. Extensión de la muestra parte 2
6. Luego se deja secar espontáneamente.
7. Anotar los datos del paciente en la parte gruesa del extendido utilizando lápiz grafito.

Esquema para llevar a cabo una extensión sanguínea por el método de los dos portaobjetos.
La flecha indica la dirección en que debe deslizarse el portaobjetos esmerilado.. Vives J. 2014. Manual de
técnicas de laboratorio en hematología. Pag 62

Tarea:
Investigue sobre el método automatizado para la confección de frotis sanguíneo.

Características del Frotis Sanguíneo.

1. El grosor de la extensión depende de la velocidad y del ángulo. Experimentar para adquirir

destreza.
2. Un buen frotis debe ser:
a. Más angosto y más corto que el portaobjetos, (longitud de 3 cm aproximadamente)
b. Sin escotaduras ni agujeros
c. De regular grosor, en frotis muy grueso los elementos aparecen muy juntos y a
menudo alterados (extensiones muy rápidas con ángulos mayores a 45º). En frotis

60
 muy delgados los elementos aparecen destruidos (extensiones lentas y con
ángulos menores a 45º).
3. El extremo final debe ser neto, sin flecos.
4. En un buen frotis se deben distinguir 3 partes:
a. Cabeza: al comienzo del frotis donde se aplica la muestra, lugar para identificación.
b. Cuerpo: es la zona media del frotis, las células se encuentran muy agrupadas, no es posible
su observación. A medida que se acerca a la cola la celularidad es óptima.
c. Cola: es la zona terminal del frotis, demasiado delgada, la celularidad está alterada. La
observación microscópica a este nivel tampoco está recomendada.
5. Se recomienda la observación microscópica en donde termina el cuerpo y comienza la cola,
es decir donde los glóbulos rojos se encuentran uno al lado del otro, con el halo central
visible claramente

Esquema de una extensión sanguínea con indicación de las diferentes áreas que la componen y la
distribución celular de las mismas. En la línea de puntos se indica la dirección que hay que seguir
en el recuento diferencial leucocitario. Vives J. 2014. Manual de técnicas de laboratorio en hematología.
Pag 63

Figura 8. Frotis
sanguíneos bien y
mal
confeccionados.
A. Frotis bien hecho.
B. Frotis hecho sobre
una lámina sucia.
C. Una extensión muy
fina y sin
continuidad.
D. Frotis realizado con
una velocidad y
presión de
extensión
irregular.
E. Frotis hecho sobre
una lámina muy
sucia (con grasa)
61
 TINCION MAY GRUNWALD GIEMSA

Las células sanguíneas se tiñen para realizar el recuento diferencial y para observar
sus características morfológicas.
La tinción de elección en la mayoría de los laboratorios es la tinción May-Grünwald Gimsa.
Como técnica de rutina se usa para tinción de:
• Hemograma
• Mielograma
• Adenograma
• Frotis de líquidos orgánicos
La tinción May-Grünwald Gimsa usa 2 colorantes.
1. May-Grünwald: solución alcohólica que precipita las proteínas y fija la preparación al
portaobjeto. Diferencia y tiñe las sustancias acidófilas (color rojo) y las basófilas (color azul)
2. Gimsa: tiñe la cromatina y gránulos azurófilos.

MATERIALES:
• Solución de May-Grünwald comercial
• Solución de Gimsa comercial
• Solución de Buffer Fosfato pH 6.8 – 7.2
o Fosfato de K monobásico (KH2 PO4) 6,63 grs.
o Fosfato de Na dibásico (Na2 HPO4 ·2 H2O) 3,20 grs.
o Agua destilada c.s.p 1000 ml
a) Al momento de usar preparar una solución de Gimsa al 5% en buffer fosfato o agua neutra
desionizada y filtrar. Ej Solución madre de Gimsa (2 gotas y 1 ml buffer fosfato)

Ejercicio:
Preparar 1000 ml de Buffer Fosfato 66mM a pH 6,8, cuyo pK es 7,21, a partir de:
KH2 PO4 cuyo PM: 136,09gr/mol
Na2 HPO4 cuyo PM: 143gr/mol.

PROCEDIMIENTO PARA LA TINCIÓN MAY-GRÜNWALD GIMSA

• El frotis debe estar seco y rotulado con el nombre del paciente.
• Cubrir o sumergir el frotis con May-Grünwald por 5 minutos
• Agregar un volumen igual al anterior de Solución buffer (o agua neutra desionizada) por 2
minuto
• Sumergir o cubrir el frotis con la solución de Gimsa por 5% por 10 minutos
• Enjuagar con agua corriente por 2 minutos
• Dejar secar al aire inclinando la lámina para que escurra el agua.
• Limpiar el portaobjetos por el reverso.
Tarea:
Investigue otras tinciones usadas en hematología.

62
 TINCIÓN AUTOMATIZADA DE FROTIS SANGUÍNEO.

Actualmente existen en el mercado sistemas de tinción automatizada las cuales permiten la tinción de
un gran número de láminas. Pueden ser máquinas de tinción independiente o formar parte de un
contador hematológico automatizado.
En sistemas el equipo realiza la extensión sanguínea en una lámina, la fija y la tiñe. Los equipos se
pueden programar para que prepare una extensión por muestra o en forma simultánea varias
preparaciones de una única muestra.
Las tinciones que utilizan estos equipos son las mismas que se usan para el método de tinción
manual.
Algunos sistemas se aplican las soluciones de tinción de portaobjetos situadas horizontalmente (flat-
bed staining), mientras que otros sumergen la o las láminas en un baño que contiene la tinción (“dip-
and-dunk” técnica)
Los inconvenientes de esta metodología incluyen el aumento de la tinción de fondo de la lámina,
tinción inadecuada, de los gránulos de los neutrófilos, la de granulación de los basófilos y tinción de
los eritrocitos con tonalidades azul o verde más que rosada. Estos problemas suelen estar
relacionados con tinciones específicas y protocolos de tinción utilizados más que al tipo de
instrumento. Sin embargo se puede obtener una tinción satisfactoria si se utilizan marcas de tinciones
fiables y se controle el tiempo de ciclo de tinción cuidadosamente.

Extensor de teñido automático acoplado a un analizador hematológico.

Equipos de digitalización de imágenes que permiten los exámenes automatizados del

frotis sanguíneo.

63
 EXAMEN MORFOLOGICO DE CELULAS SANGUINEAS

El examen morfológico de la sangre periférica es una prueba de gran valor diagnóstico, debido a que existe un
gran número de condiciones en las cuales los eritrocitos, leucocitos y plaquetas se alteran en número y morfología
(anemias, estados inflamatorios, infecciones, neoplasias hematológicas y no hematológicas, etc).
Para realizar este análisis es necesario contar con un extendido o frotis sanguíneo, correctamente teñido con
tinciones hematológicas (May Grunwald Giemsa o Wright Giemsa) y la observación se realiza por microscopía
óptica convencional, aunque en la actualidad existen contadores hematológicos que realizan fórmula diferencial en
5 poblaciones y lectores automatizados de frotis sanguíneo. Sin embargo estos equipos poseen muchas
limitaciones cuando se trata de muestras con alteraciones celulares, por lo cual el método de lectura manual o
microscópica realizada por una persona especializada, sigue siendo el método de referencia.

En la práctica de rutina, revisión manual consiste en un recuento microscópico 100-200 leucocitos y clasificación
morfológica de los diferentes tipos de leucocitos presentes. El frotis de sangre normal presenta cinco tipos de
leucocitos principales: neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfocitos y monocitos, pero en condiciones anormales
pueden estar presentes otras células, tales como linfocitos reactivos, granulocitos inmaduros, eritroblastos,
blastos, etc.
La manera de informar cada población de leucocitos es en Porcentaje (%). Por lo tanto, el análisis diferencial de
glóbulos blancos mide la cantidad relativa de diferentes tipos de glóbulos blancos en la sangre.

Ejemplo
Leucocitos 9.500/ul
Formula diferencial
Basófilos Eosinófilos Baciliformes Segmentados Linfocitos Monocitos
1% 2% 1% 58% 30% 8%

Además de informar el recuento relativo de las subpoblaciones leucocitarias, se debe informar el recuento
absoluto. Para realizar el cálculo, se realiza con respecto al porcentaje de cada población en relación al recuento
total de leucocitos. Para el ejemplo anterior los recuentos absolutos son:

SERIE BLANCA Intervalo Referencia

Recuento Leucocitos : 9.500/ul _( )
R. A. Neutrófilos (RAN) :5.605/ul ________ ( )
R. A. Linfocitos (RAL) : 2.850/ul ( )
A. Monocitos (RAM) : 760/ul ________ ( )
R. A. Eosinófilos (RAE) : 190/ul ________ ( )
R. A. Basófilos (RAB) : 95/ul ________ ( )

64
 MORFOLOGIA DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS

Basófilo Es un leucocito cuyo diámetro oscila entre 10 -16 um,

con citoplasma celeste pálido que contiene múltiples
gránulos secundarios de color morado oscuro que varían
en número, tamaño y forma. Estos gránulos son
hidrosolubles y pueden disolverse dejando áreas claras
en el citoplasma.
El núcleo es segmentado de 2 o 3 lóbulos, pero
frecuente mente está tapado por las granulaciones
Eosinófilo Es un leucocito cuyo diámetro oscila entre 12 -17um. El
núcleo usualmente tiene 2 lóbulos de cromatina
condensada. Abundante citoplasma con granulación
secundaria eosinofilica (anaranjada) que son más
grandes y uniformes que los neutrófilos.

Segmentado Es un granulocito de 12 -17um diámetro con núcleo

lobulado (usualmente 3 a 4) conectados por un puente
de cromatina. La cromatina es compacta. El citoplasma
es abundante con muchos gránulos secundarios
puntiformes de color violeta.

Baciliforme Es un granulocito de 10 -10um diámetro que poseen un

núcleo que no es segmentado o que poseen lóbulos
rudimentarios que están conectados por una banda
gruesa de cromatina en vez de un hilo. El núcleo se
caracteriza por tener forma de S, C o U y la cromatina es
condensada. El citoplasma es abundante, rosado y
cubierto por finas granulaciones violetas distribuidos
uniformemente.

Linfocito Los linfocitos vistos en sangre periférica son

principalmente pequeños de 10-12um y menos
frecuentemente grandes 12-16um.
Los linfocitos pequeños poseen un núcleo redondo de
cromatina condensada y escaso citoplasma basófilo y no
presenta granulaciones.

El linfocito grande es de 9-15 um, el núcleo es algo

menos condensado que el linfocito pequeño y el
citoplasma es más abundante y celeste; puede contener
algunos gránulos azurófilos.
Monocito Son las células más grandes que normalmente se ven en
sangre periférica. El diámetro es de 15 -22um pero
puede variar en tamaño. El núcleo es contorno irregular y
con pliegues, frecuentemente arriñonado. La cromatina
está dispuesta en finas hebras y menos condensado que
el linfocito. El citoplasma es abundante, azul-grisáceo y
algunas células pueden contener granulaciones
azurófilas muy finas. La vacuolización del citoplasma
puede estar presente.

65
Palmer L. 2015. ICSH recommendations for the standardization of nomenclature and grading of peripheral blood cell
morphological features. International Journal of Laboratory Hematology num 37, pag: 287–303
CAP. 2008. Color Atlas of Hematology. CAP hematology and clinical microscopy Resource committee.

NEUTRÓFILOS INMADUROS

Metamielocito o juvenil: tamaño 10 – 15 u de diámetro, el núcleo inicia el proceso de segmentación

mostrándose hendido o arriñonado. Citoplasma con gránulos específicos.

Mielocito: tamaño 15 – 18 u de diámetro, núcleo menor, redondeado, aparece por primera vez la granulación
específica o secundaria a partir de la cual se diferencian en neutrófilos, esosinófilos o basófilos. No se observa el
nucléolo.

Promielocito: tamaño 18 – 24 um de diámetro, con abundante granulación primaria o azurófila que también
cubre el núcleo. Este a veces levemente indentado con nucléolo.

Blasto: tamaño 14 – 18 um de diámetro con alta relación núcleo/citoplasma. Cromatina laxa, posee dos a tres
nucleólos, citoplasma basófilo sin gránulos.

Segmentado Baciliforme Juvenil Mielocito Promielocito Blasto

66
 MIELOGRAMA

Para estudiar la citología de la medula ósea (MO) se practica la técnica de aspirado de medula ósea
(PAM) y el examen citológico llamado mielograma.
El lugar de la de la punción es variable. Se dispone de varios territorios: en niño menor de 2 años es
preferible la espina iliaca posterosuperior o el superior de la cara interna de la tibia. En adultos y niños
mayores de 2 años se prefiere el esternón, espinas iliacas posteriores o anterosuperiores o apófisis
espinosas de las vértebras lumbares 1° a 4°. Ver figura 13. Otros territorios de punción son cresta
iliaca anterior y posterior.
En adultos el lugar de elección es el esternón, en el centro de una zona que limita por encima con el
ángulo de Louis. La punción en la tuberosidad iliaca posterior es, a veces, mejor tolerada por el
enfermo.
El mielograma permite apreciar la riqueza de la medula en células nucleares, su riqueza en
megacariocitos, elementos voluminosos, fácilmente identificables con bajo aumento, y buscar la
presencia de acúmulos de células cancerosas. Después, el frotis se observa a gran aumento. Según
la riqueza medular, se cuentan de 200 a 500 células. Y se establecen los porcentajes respectivos de
sus elementos.
Existen grandes variaciones según los diferentes autores. En la siguiente tabla se dan las variaciones
y los porcentajes medios de las diferentes poblaciones celulares.

Fig.13. Aspiración de medula Ósea.

57
 MELOGRAMA SEGÚN WINTROBE
CELULARIDAD: Aumentada, disminuida, normal

MEGACARIOCITOS: Aumentados, ausentes, disminuidos o normales.

Inactivos o funcionalmente activos
SERIE ERITROIDE Rango % Promedio %
Proeritroblasto Basófilo 1– 8 4
Eritroblasto Basófilo 1– 4 2
Eritroblasto Policromático 5 – 15 10
Eritroblasto Ortocromático 3 – 12 6

TOTAL SERIE ERITROIDE 25%

SERIE MIELOIDE Rango % Promedio %

Mieloblasto 0.3 – 5 2
Promielocito 1–8 5
Mielocito Neutrófilo 5 – 19 12
Juvenil Neutrófilo 10 – 20 15
Baciliforme Neutrófilo 10 – 25 18
Segmentado Neutrófilo 7 – 30 20
Mielocito Eosinófilo 0.5 – 3 1.5
Juvenil Eosinófilo 0.5 – 2 2
Baciliforme Eosinófilo 0.5 – 2 2
Segmento Eosinófilo 0.5 – 4 2
Basófilo 0.5 – 2 2
Linfocitos 3 – 17 10
Monocitos 0.5 – 5 3
Cél. Plasmáticas 0–2 1
Cel. Reticulares 0.5 – 2 1
Megacariocitos 0 – 1.5 0.5

TOTAL SERIE MIELOIDE 75%

COMENTARIO
Relación Mieloide / Eritroide: 3 / 1
Tipo de maduración: Normoblástica o Megaloblástica

CONCLUSIÓN:

58
 ESTIMACION DE RECUENTOS CELULARES AL FROTIS

Esta estimación al frotis permite confirmar los recuentos hematimétricos reportados por los contadores
hematológicos, por lo tanto esta estimación debe realizarse cuando los parámetros estén disminuidos o
aumentados.

Materiales: los mismos que para confección de un frotis.

Procedimiento:
1. Preparar un frotis.
2. Teñir el frotis con May Grünwald Giemsa
3. Observar el frotis con lente de inmersión en una zona en que los eritrocitos no se superpongan y
lejos de los márgenes del frotis. Contar el número de plaquetas existes en 10 CAMPOS.

RECUENTO INDIRECTO DE LEUCOCITOS

Con aumento de 40X se busca un área del frotis donde los eritrocitos se encuentren uniformemente
distribuidos y en la que apenas se toquen unos con otros. Se examinan 10 campos en esa área del frotis
y se determina el número promedio de leucocitos por campo. Se multiplica el número promedio de
leucocitos por 2000, para obtener una aproximación del número total de leucocitos contados por mm3.
Este factor puede variar microscopio a microscopio. Por lo tanto es necesario calcular el factor de cada
microscopio. Para ello seguir el siguiente protocolo.

Calculo factor leucocitos:

1. Contar con muestras (3 o 4 muestras) que se hallan analizado por contador hematológico calibrado y controlado.
ej Coulter muestra z: 6.000 leucocitos/uL
2. Realizar un frotis de cada muestra y teñirlo
3. Enfocar con aumento 40X y ubicar zona de lectura.
4. En 20 campos sucesivos contar todos los leucocitos que se encuentren
5. obtener el promedio de leucocitos por campo
6. Supongamos que el promedio es 3,2
7. Entonces se hace una regla de 3 simple
Rec. 6.000 glóbulos blancos equivalen a 3,2 leucocitos por campo
X equivale 1 leucocito por campo
X= 1875
8. Este ejercicio lo hacemos con cada muestra escogida
9. Luego se saca un promedio de los factores para cada muestra.
10. Por ejemplo si el promedio es 2000, para el microscopio en que se realizó el conteo el factor es 2000.
11. Significa que por cada leucocito encontrado en un campo de 40X en las nuevas muestras corresponde a 2000
leucocitos /uL.
12. Si en un hemograma en 20 campos encuentra un promedio de 5.6 leucocitos. Lo debe multiplicar por 2000 y
tendría un recuento de blancos de 11.200 leucocitos por uL.

Estimación de leucocitos al frotis (lente 40x)

N° de células Estimación
2–4 4 – 7 x 10³ céls / ul
4–6 7 - 10x10³ céls / ul
6 – 10 10 – 13x10³ céls / ul
10 – 20 13 – 18x10³ céls / ul

59
 RECUENTO ESTIMATIVO DE PLAQUETAS AL FROTIS (METODO DE FONIO).

Si se usan oculares estándar (100X) se cuentan 10 campos de inmersión y se multiplica por 2000, da una
apreciación del número de plaquetas.

Ejemplo: si en 10 campos se contaron 90 plaquetas= 180.000xmm

El rango normal por campo de inmersión es de 7 a 21 plaquetas.

Fuentes de error:
a) Este método requiere de un frotis muy bien extendido. La muestra capilar tiene un 24% de
variación, por lo que es muy poco fiable.
b) El recuento puede estar falsamente disminuidos por aglutinación de plaquetas (acumulo en la cola
del frotis) o por mala técnica de extracción.
c) Para una evaluación del número de plaquetas debe realizarse un recuento en cámara. Si el
resultado indica franca disminución en pacientes sin antecedentes de trombocitopenia, debe repetirse el
examen.

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Médico Solicitante: ______Diagnóstico: ________________________Muestra: _____ _____ _____ _____ __

SERIE ROJA Intervalo Referencia SERIE BLANCA Intervalo Referencia

Rec. Eritrocitos : ____________ ___ ( ) Recuento Leucocitos : ( )
Hematocrito : ( ) R. A. Neutrófilos (RAN) : _________ ( )
Hemoglobina : ( ) R. A. Linfocitos (RAL) : ( )
VCM : ( ) R. A. Monocitos (RAM) : _______ ( )
HCM : ( ) R. A. Eosinófilos (RAE) : ________ ( )
CHCM : ( ) R. A. Basófilos (RAB) : ( )

SERIE PLAQUETARIA
Recuento Plaquetas: ( )

V.H.S : ( )

FORMULA DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS (%)

Basófilos Eosinófilos Promielocitos Mielocitos Juvenil Baciliforme Segmentado Linfocitos Monocitos

CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS

ERITROCITOS:

LEUCOCITOS:

PLAQUETAS:

_________________________ ____________________________
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SERIE ROJA Intervalo Referencia SERIE BLANCA Intervalo Referencia

Rec. Eritrocitos : ____________ ___ ( ) Recuento Leucocitos : ( )
Hematocrito : ( ) R. A. Neutrófilos (RAN) : _________ ( )
Hemoglobina : ( ) R. A. Linfocitos (RAL) : ( )
VCM : ( ) R. A. Monocitos (RAM) : _______ ( )
HCM : ( ) R. A. Eosinófilos (RAE) : ________ ( )
CHCM : ( ) R. A. Basófilos (RAB) : ( )

SERIE PLAQUETARIA
Recuento Plaquetas: ( )

V.H.S : ( )

FORMULA DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS (%)

Basófilos Eosinófilos Promielocitos Mielocitos Juvenil Baciliforme Segmentado Linfocitos Monocitos

CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS

ERITROCITOS:

LEUCOCITOS:

PLAQUETAS:

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SERIE ROJA Intervalo Referencia SERIE BLANCA Intervalo Referencia

Rec. Eritrocitos : ____________ ___ ( ) Recuento Leucocitos : ( )
Hematocrito : ( ) R. A. Neutrófilos (RAN) : _________ ( )
Hemoglobina : ( ) R. A. Linfocitos (RAL) : ( )
VCM : ( ) R. A. Monocitos (RAM) : _______ ( )
HCM : ( ) R. A. Eosinófilos (RAE) : ________ ( )
CHCM : ( ) R. A. Basófilos (RAB) : ( )

SERIE PLAQUETARIA
Recuento Plaquetas: ( )

V.H.S : ( )

FORMULA DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS (%)

Basófilos Eosinófilos Promielocitos Mielocitos Juvenil Baciliforme Segmentado Linfocitos Monocitos

CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS

ERITROCITOS:

LEUCOCITOS:

PLAQUETAS:

_________________________ ____________________________
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SERIE ROJA Intervalo Referencia SERIE BLANCA Intervalo Referencia

Rec. Eritrocitos : ____________ ___ ( ) Recuento Leucocitos : ( )
Hematocrito : ( ) R. A. Neutrófilos (RAN) : _________ ( )
Hemoglobina : ( ) R. A. Linfocitos (RAL) : ( )
VCM : ( ) R. A. Monocitos (RAM) : _______ ( )
HCM : ( ) R. A. Eosinófilos (RAE) : ________ ( )
CHCM : ( ) R. A. Basófilos (RAB) : ( )

SERIE PLAQUETARIA
Recuento Plaquetas: ( )

V.H.S : ( )

FORMULA DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS (%)

Basófilos Eosinófilos Promielocitos Mielocitos Juvenil Baciliforme Segmentado Linfocitos Monocitos

CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS

ERITROCITOS:

LEUCOCITOS:

PLAQUETAS:

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SERIE ROJA Intervalo Referencia SERIE BLANCA Intervalo Referencia

Rec. Eritrocitos : ____________ ___ ( ) Recuento Leucocitos : ( )
Hematocrito : ( ) R. A. Neutrófilos (RAN) : _________ ( )
Hemoglobina : ( ) R. A. Linfocitos (RAL) : ( )
VCM : ( ) R. A. Monocitos (RAM) : _______ ( )
HCM : ( ) R. A. Eosinófilos (RAE) : ________ ( )
CHCM : ( ) R. A. Basófilos (RAB) : ( )

SERIE PLAQUETARIA
Recuento Plaquetas: ( )

V.H.S : ( )

FORMULA DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS (%)

Basófilos Eosinófilos Promielocitos Mielocitos Juvenil Baciliforme Segmentado Linfocitos Monocitos

CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS

ERITROCITOS:

LEUCOCITOS:

PLAQUETAS:

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SERIE ROJA Intervalo Referencia SERIE BLANCA Intervalo Referencia

Rec. Eritrocitos : ____________ ___ ( ) Recuento Leucocitos : ( )
Hematocrito : ( ) R. A. Neutrófilos (RAN) : _________ ( )
Hemoglobina : ( ) R. A. Linfocitos (RAL) : ( )
VCM : ( ) R. A. Monocitos (RAM) : _______ ( )
HCM : ( ) R. A. Eosinófilos (RAE) : ________ ( )
CHCM : ( ) R. A. Basófilos (RAB) : ( )

SERIE PLAQUETARIA
Recuento Plaquetas: ( )

V.H.S : ( )

FORMULA DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS (%)

Basófilos Eosinófilos Promielocitos Mielocitos Juvenil Baciliforme Segmentado Linfocitos Monocitos

CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS

ERITROCITOS:

LEUCOCITOS:

PLAQUETAS:

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SERIE ROJA Intervalo Referencia SERIE BLANCA Intervalo Referencia

Rec. Eritrocitos : ____________ ___ ( ) Recuento Leucocitos : ( )
Hematocrito : ( ) R. A. Neutrófilos (RAN) : _________ ( )
Hemoglobina : ( ) R. A. Linfocitos (RAL) : ( )
VCM : ( ) R. A. Monocitos (RAM) : _______ ( )
HCM : ( ) R. A. Eosinófilos (RAE) : ________ ( )
CHCM : ( ) R. A. Basófilos (RAB) : ( )

SERIE PLAQUETARIA
Recuento Plaquetas: ( )

V.H.S : ( )

FORMULA DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS (%)

Basófilos Eosinófilos Promielocitos Mielocitos Juvenil Baciliforme Segmentado Linfocitos Monocitos

CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS

ERITROCITOS:

LEUCOCITOS:

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SERIE ROJA Intervalo Referencia SERIE BLANCA Intervalo Referencia

Rec. Eritrocitos : ____________ ___ ( ) Recuento Leucocitos : ( )
Hematocrito : ( ) R. A. Neutrófilos (RAN) : _________ ( )
Hemoglobina : ( ) R. A. Linfocitos (RAL) : ( )
VCM : ( ) R. A. Monocitos (RAM) : _______ ( )
HCM : ( ) R. A. Eosinófilos (RAE) : ________ ( )
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SERIE PLAQUETARIA
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V.H.S : ( )

FORMULA DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS (%)

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CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS

ERITROCITOS:

LEUCOCITOS:

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SERIE ROJA Intervalo Referencia SERIE BLANCA Intervalo Referencia

Rec. Eritrocitos : ____________ ___ ( ) Recuento Leucocitos : ( )
Hematocrito : ( ) R. A. Neutrófilos (RAN) : _________ ( )
Hemoglobina : ( ) R. A. Linfocitos (RAL) : ( )
VCM : ( ) R. A. Monocitos (RAM) : _______ ( )
HCM : ( ) R. A. Eosinófilos (RAE) : ________ ( )
CHCM : ( ) R. A. Basófilos (RAB) : ( )

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Recuento Plaquetas: ( )

V.H.S : ( )

FORMULA DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS (%)

Basófilos Eosinófilos Promielocitos Mielocitos Juvenil Baciliforme Segmentado Linfocitos Monocitos

CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS

ERITROCITOS:

LEUCOCITOS:

PLAQUETAS:

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TÉCNICAS PARA EVALUACIÓN DE LA HEMOSTASIA

70
 INTERVALOS DE REFERENCIA EN HEMOSTASIA

Cada laboratorio debe establecer sus intervalos de referencia, pero de acuerdo a la literatura los intervalos para adultos son:
Tiempo de Sangría
Método de Ivy 2–8 min

Tiempo de Protrombina (TP)

Tiempo 10–14 seg.
Actividad 70-120%
INR 0.8-1.2

Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada (TTPA) 25–37 seg.

Tiempo de Trombina (TT) 15–20 s
Fibrinógeno
Método de Clauss 200-400 mg/dl
Factor VIII 60-150%
Factor IX 60-150%
Plasminógeno 1.2-3.3 mg/dl
Antitrombina III 20-40 mg/dl
Proteína C
Functional 0.70–1.40 u/ml
Antígeno 0.61–1.32 u/ml
Proteina S
Total 0.78–1.37 u/ml
Libre 0.68–1.52 u/ml
Dímero D <0.5 mg/L
< 500 ng/ml

Cofactor II Heparina 0.55–1.45 u/ml

Referencias:
• Dacie and Lewis. (2006). Practical Haematology, 10th ed., Copyright © Churchill Livingstone, An Imprint of
Elsevier
• Kottke-Marchant K. 2008. An Algorithmic Approach to Hemostasis Testing.. College of American pathologist.
Cap Press.
• Sinfex TTPA y Dimero D UCChristus health

VALORES DE ALERTA EN HEMOSTASIA

INR >3 en pacientes con TAO

TP >20 seg en personas sin TAO

71
 TIEMPO DE SANGRÍA

Este método permite evaluar la hemostasia primaria. Mide el tiempo que dura la hemorragia provocada por la incisión
de pequeños capilares cutáneos, lo que permite evaluar la acción de la pared del vaso sanguíneo, la interacción de
las plaquetas y su funcionalidad.

Valores de referencia
Entre 2 - 8 minutos

Materiales
• Algodón , alcohol 70% y tela adhesiva
• Aparato de Ivy o Simplate I-IIR
• Cronómetro
• Esfigmomanómetro
• Papel filtro

Procedimiento Método de Ivy

1) Entrevistar al paciente (Actividad, enfermedades hematológicas, medicamentos, examen de piel etc.)
2) Preparación de materiales
3) Siente al paciente con el brazo descubierto y desinfectado en Posición supina sobre una superficie firme
4) Escoja un área lateral en la parte muscular del antebrazo, evitando venas superficiales, cicatrices o
lesiones.
5) Limpie el área con algodón y alcohol. Si es necesario afeitar la zona.
6) Ponga el manguillo del esfigmomanómetro de acuerdo al tamaño del paciente e infle hasta 40 mm de Hg.
7) Inmediatamente ponga el simplate firme en el área desinfectada de forma que el corte se realice en forma
perpendicular al pliegue del codo.
8) Oprima el disparador del simplate y ponga en marcha el cronómetro.
9) Cada 30 segundos absorber las gotas de sangre con papel filtro, cuidando de no apoyarlo directamente
sobre la herida.
10) Esperar hasta que se detenga el sangramiento, una vez detenido el sangramiento quite el manguillo.
Realice una pequeña curación dándole indicaciones sobre el cuidado de la herida.

Informe e interpretación
El resultado se informa en tiempo que se necesitó para que se detuviera el sangramiento.
ej. Tiempo de Sangría Método de Ivy 4 minutos 30 segundos.

Factores de error
• Alteraciones de la presión del esfigmomanómetro.
• Presión excesiva del aparato de Ivy o Simplate.

Tarea:
Investigue el fundamento del equipo Platelet Analizer Function PFA-100

72
 VARIABLES PREANALITICAS EN PRUEBAS DE COAGULACION

Muchos resultados alterados en las pruebas de coagulación se deben a errores en la fase pre-
analítica, especialmente relacionados con la toma de muestra. Idealmente los resultados de la pruebas de
sangre deben reflejar precisamente los valores in vivo.
Cuando las muestras de sangre se toman de una vena ocurren cambios en los componentes de la
coagulación, algunos ocurren casi inmediatamente, mientras que la activación de las plaquetas y el inicio
de los mecanismos de activación de la coagulación dependen de la superficie de contacto. Por lo tanto es
necesario toma las precauciones necesarias para minimizar al máximo los cambios in vitro que ocurren
durante la toma de muestra y el almacenamiento.
La Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) ha establecido los criterios de toma y
almacenamiento de las muestras para estudios de coagulación.

Toma de muestra
La muestra de elección es la venosa, incluso en recién nacidos y deben ser colectadas por personal
capacitado y entrenado en la técnica.
Los pacientes deben estar relajados y en un ambiente acogedor, el estrés y el ejercicio físico causa
cambios en los niveles de fibrinógeno y factores de la coagulación
Si se usan tubos venoject, el tubo de coagulación se debe dejar en segundo o tercer lugar.
El tubo se debe identificar con el nombre del paciente
El momento del día en que se tome la muestra también es importante para la interpretación de los
resultados, la actividad fibrinolítica tiene ritmo circadiano y disminuye alrededor de las 6 de la mañana.
También se debe registrar si el paciente está siendo medicado con algún tratamiento anticoagulante y si el
paciente fue medicado con concentrado de factores se debe esperar a lo menos 30 minutos.

Anticoagulante
El anticoagulante internacionalmente recomendado es el citrato de sodio al 3.2%, usando 1 parte de
anticoagulante y 9 partes de sangre total. Cuando el hematocrito esta alterado (anemias severas o
Policitemias) la cantidad de anticoagulante: sangre debe ser ajustado. Para 5 ml de muestra la cantidad de
citrato recomendada es la siguiente:

HEMATOCRITO (%) VOLUMEN DE

CITRATO (ml)
20 0.70
25 0.65
30 0.61
55 0.39
60 0.36
65 0.31
70 0.27

Centrifugación de las muestras

Para el análisis se requiere un plasma pobre en plaquetas (recuento de plaquetas <10x103/ul),
esto se obtiene centrifugando la muestra a 1500 g (3500r.p.m) por 15 minutos a Tº ambiente.
La muestra se debe mantener a Tº ambiente si se va a realizar Tiempo de Protrombina, Anticoagulante
Lúpico o ensayos de determinación de Factor VII y se debe mantener a 4ºC para otros ensayos.
Se recomienda realizar las pruebas antes de 4 hrs post extracción. Ver tabla 2

73
 Tiempo de estabilidad de muestras para pruebas de coagulación

Fuente: Sterling T. Bennett, M.D. M.S; Laboratory Hemostasis a Practical Guide for Pathologists; 2007;
Springer Science

74
 TIEMPO DE PROTROMBINA

El tiempo de protrombina (TP) o test de Quick es el tiempo que tarda en coagular el plasma de un paciente
al añadirle un reactivo que contiene tromboplastina y fosfolípidos. Este reactivo se une al factor VII del
plasma y activa la vía extrínseca de la coagulación, que comprende los factores VII, X, V y II. El factor II es
la protrombina que, una vez activado se convierte en trombina que actúa sobre el fibrinogéno para formar
la fibrina.
El TP está alargado en el déficit de los factores de coagulación II, V, VII y X. Como la mayoría de estos
factores son vitamina K dependientes y de síntesis hepática, su estudio es útil para valorar función
hepática y para controlar el tratamiento con anticoagulantes orales de tipo cumarínico.

Valor de referencia
Depende de: edad del paciente, método de determinación y tromboplastina utilizada, pero en
general respecto de la actividad de la tromboplastina puede considerarse como valor de referencia entre
70-120% de actividad.

MUESTRA
• Sangre venosa o arterial anticoagulada con citrato de sodio 3,2% tubo tapa celeste.

Informe de Resultados del Tiempo de Protrombina

• Tiempo del Paciente
• Tiempo del pool Normal
• % Actividad
• INR

Intervalos de referencia:
• Tiempo del Paciente : 10 - 14 segundos
• % Actividad : 70 – 120%
• INR : 0.8 – 1.2

Reactivos y equipos
• Tromboplastina liofilizada
• Suero Fisiológico
• Coagulómetro mecánico u óptico
• Control normal y anormal
• Pool de plasmas normales
• Cronómetro

Procedimiento
Antes de procesar muestras se debe realizar una curva de calibración de tiempo de protrombina, para
calcular el % actividad.
Esta curva debe cambiarse cada vez que se cambie el lote de tromboplastina

CURVA CALIBRACIÓN DE TIEMPO DE PROTROMBINA

1. Preparar un pool de plasmas normales frescos o estándar a partir de personas sanas, sin tratamiento
anticonceptivo ni anticoagulante.
2. Realizar diluciones seriadas por ejemplo:
Reactivo Tubo1 Tubo2 Tubo3 Tubo4
Suero Fisiológico ------- 1ml 1ml 1ml
Mezclar y transferir 2 ml 1ml 1ml 1ml
pool (tubo1) (tubo2 (tubo3)
% de actividad 100 % 50 % 25 % 12,5 %
3. Realizar una determinación en duplicado de tiempo de protrombina (ver punto de Determinación de Tiempo
de Protrombina) a cada dilución, y calcular el promedio en segundos de cada dilución.

75
4. Grafique la curva de calibración anotando para cada dilución la actividad de protrombina y el promedio en
segundos para ese mismo tubo. (grafico en papel gráfico recíproco-lineal)
5. Unir los puntos con una línea recta y calcular r, A, B, C discutir la correlación obtenida y compárela con los
valores propuestos por el fabricante.
6. Si se tiene un terminal de datos en el equipo ingresarlos en él considerando: el valor 100% el promedio en
segundos del tubo 1 y el ISI de la tromboplastina.

DETERMINACIÓN DEL TIEMPO DE PROTROMBINA DE MUESTRAS Y CONTROLES

1. Llevar los reactivos a temperatura ambiente, reconstituirlos y homogenizarlos bien antes de usar evitando
la formación de espuma.
2. Llevar los reactivos reconstituidos a 37°C o a los incubadores del equipo.
3. Dependiendo del método empleado y equipo tome una cubeta de coagulómetro e introduzca si no la tiene
una esfera o cilindro de acero agregue 100 ul. de plasma citratado y encube por 2 minutos exactos a 37°C.
4. Agregar 200 ul. de tromboplastina y activar el cronómetro.
5. Al formarse el coágulo de fibrina, se detiene el cronómetro.
6. Los equipos actuales con que se trabaja en los laboratorios clínicos indican el tiempo de incubación, el
punto final de la reacción y emiten un informe.
7. Anotar y calcular tiempo en segundos del paciente, tiempo en segundos del pool de plasmas normales, la
actividad en porcentaje calculada por la calibración realizada y el INR si es necesario.

CALCULO
% de actividad: Es obtenida al ubicar en la curva de calibración el tiempo en segundos obtenido y
extrapolarlo en el eje de actividad.
El INR (Razón Internacional Normalizada) Se usa en el tratamiento con anticoagulantes orales, y
se hizo necesario debido a la distinta sensibilidad de las tromboplastinas comerciales usadas como
reactivo y se calcula de la siguiente forma:
I
SI
Tiempo en segundos del paciente
INR =
Tiempo en segundos del pool normal

ISI está indicado en cada lote de reactivo de tromboplastina.

En 1985 el Comité de Estandarización en Hematología (ICSH) y el Comité Internacional de Trombosis y

Hemostasia (ICTH) introdujeron el INR como método para reportar los resultados del TP. A partir de esta
fecha se recomendó a todos los fabricantes de Tromboplastinas la determinación del ISI para cada lote de
reactivo producido. Para ello se utiliza el modelo matemático de Kirkwood.

ISI 1 ISI 2
TP 1 del paciente TP 2 del paciente
TP 1 standard = TP 2 standard

Tarea:
Investigue como se establece el ISI de cada lote de Tromboplastina

Control de Calidad
En cada corrida analítica procesar 2 niveles de control.

76
 TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA

El tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA), mide el tiempo que tarda en coagular una muestra de
plasma del paciente con un reactivo que contiene fosfolípidos y un activador de sílice que proporciona una
superficie que participa en un cambio conformacional del factor XII plasmático, lo que produce su
activación. El factor XIIa forma un complejo con otros dos componentes plasmáticos, el cininógeno de alto
peso molecular (factor Fitzgerald) y la precalicreína (factor Fletcher). Estas tres glucoproteínas plasmáticas
denominadas factores de activación por contacto, inician la formación del coágulo in vitro.
Las deficiencias de factores que causan resultados prolongados del TTPA son, por orden de reacción, el
XI, IX, VIII, X, V, protrombina y fibrinógeno, cuando éste es inferior a 100 mg/dl. El TTPA también está
prolongado en presencia de anticoagulante lúpico, anticuerpo antifactor VIII y heparina no fraccionada. Las
deficiencias de los factores VII y XIII no tienen efecto sobre el TTPA.
El TTPA se utiliza para el estudio de los factores de la vía intrínseca de la coagulación, monitorización del
tratamiento con heparina no fraccionada o presencia de anticoagulante lúpico u otros inhibidores.

Intervalos de referencia
25 a 37 segundos

MUESTRA
• Sangre venosa o arterial anticoagulada con citrato de sodio 3,2% tubo tapa celeste

REACTIVOS
• Cefalina
• Cloruro de calcio 0,025 M
• Coagulómetro mecánico u óptico
• Control normal y anormal
• Cronómetro, Pipetas y puntas automáticas

PROCEDIMIENTO
1. Esta técnica no requiere de calibración
2. Llevar los reactivos a temperatura ambiente y homogenizarlos bien antes de usar sobre todo si el activador
es Kaolín.
3. Llevar los reactivos mezclados a 37°C o a los incubadores del equipo.
4. Dependiendo del método empleado y equipo tome una cubeta de coagulómetro e introduzca si no la tiene
una esfera o cilindro de acero agregue 100 ul. de plasma citratado y 100 ul. de cefalina, encube por 3
minutos exactos a 37°C.
5. Agregar 100 ul. de cloruro de calcio 0,025 M y activar el cronómetro.
6. El cronómetro se detiene al aparecer la malla de fibrina.

Interpretación
Esta técnica no tiene calibración y el valor informado es solamente el valor en segundos reportado al
formarse la malla de fibrina. El TTPA prolongado puede evidenciar déficit de factores VIII, IX, XI, XII en
concentración menores a un 40% , ser consecuencia del tratamiento del paciente con heparina o por la
presencia de un anticoagulante lúpico.

Tarea:
Investigue la utilidad, procedimiento técnico y fundamentos de la Curva de Heparina

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 TEST DE MEZCLA

El test de mezcla es útil para determinar si la prolongación de TP o TTP se debe a deficiencia de factores
o a la presencia de inhibidores circulantes. Los inhibidores pueden ser específicos contra factor de la
coagulación o inhibidores no específicos como el anticoagulante lúpico o incluso drogas inhibitorias como
heparina o inhibidores directo de trombina.
Algunas condiciones clínicas en las cuales puede haber inhibidores circulantes son: cáncer, linfoma,
enfermedades autoinmunes, gamapatías autoinmunes, reacciones a drogas, edad avanzada y en el
periodo postparto. En otras condiciones la causa subyacente puede ser desconocida y y el inhibidor
circulante puede desarrollarse repentinamente sin una enfermedad anterior.
Previo a realizar un estudio de mezcla para evaluar TP y/o TTPA prolongados se deben excluir algunas
variables pre analíticas, como hebras de fibrina las que pueden pre-activar la muestra; hematocritos altos
que pueden prolongar falsamente el TP y TTPA debido al exceso de citrato; y contaminación con heparina.

Muestra
• Sangre anticoagulada con citrato de sodio 3,2%

Materiales y Reactivos
• Coagulómetro
• Baño termorregulado a 37ºC
• Pool de plasma normal
• Reactivos para determinación de TP y/o TTPA.

Procedimiento
1. Realice una mezcla de plasma a estudiar estudio (TP o TTPA prolongado) y Pool Plasma Normal
en proporción 1:1.
2. Debe realizar un TP y/o TTPA a la muestra a estudiar y a la mezcla realizada con pool normal,
según los protocolos de determinación de cada uno.

Informe
Existen diferentes métodos para determinar la corrección, pero no hay consenso general para interpretar
los resultados de mezclas. Los normalmente usados incluyen:
• Corrección al rango de referencia
• Corrección del10% del valor del pool de plasma normal.
• Índice de Rosner: Corregido si es <12%, no corregido si es >15 (sugiere presencia de inhibidor)

Índice de Rosner : Tiempo coagulación mezcla 1:1 – Tiempo coagulación del Pool plasma normal X 100
____________________________________________________________
Tiempo coagulación del paciente

Tarea:
Investigue el fundamento de pruebas para detectar inhibidores específicos de la coagulación.

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 ALGORITMOS DE PRUEBAS BASICAS DE LA COAGULACION

TP Anormal Prolongado

TP con mezcla de pool de plasma normal 1:1

No corrige el tiempo Corrige el tiempo

Inhibidor de factor VII Cuantificación de FVII

Déficit de F VII

TTPA Anormal Prolongado

TTPA con mezcla de pool de plasma normal 1:1

No corrige el tiempo Corrige el tiempo

Presencia de inhibidor

A. Lúpico Ac Anti Factor Déficit de:

▪ Precalicreina
▪ Kininógeno de alto peso molecular
▪ F VIII, FIX, FXII
▪ Cuantificar el factor

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 TP y TTPA Anormal Prolongado

TP y TTPA con mezcla de pool de plasma normal 1:1

No corrige el tiempo Corrige el tiempo

Presencia de inhibidor

B. Lúpico Ac Anti Factor Déficit de:

• F II, FV, FX o FI
• Vitamina K, hepatopatía o CID

TT Anormal Prolongado

TT con mezcla de pool de plasma normal 1:1

No corrige el tiempo Corrige el tiempo

TTO con Heparina fibrinólisis aumentada

Hipofibrinógenemia
Afibrinogenemia
Disfibrinogenemia

Ensayos funcionales y/o antigénicos

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 FIBRINÓGENO

Uno de los métodos para medir fibrinógeno es el método de Claus. Que usa trombina como activador, este
método permite cuantificar la concentración de fibrinógeno solo en los casos en que la actividad del
fibrinógeno es normal por lo que es una prueba fundamentalmente para medir fibrinógeno funcional.

Intervalos de referencia
• Recién Nacidos: 125 – 300 mg/dL
• Adultos: 200 – 400 mg/dL

Muestras
• Muestra de sangre anticoagulada con citrato de sodio 3,2%.

Equipos y Reactivo
• Baño termorregulado 37ºC
• Buffer Owren
• Estándar de calibración
• Trombina

Procedimiento
1. Realizar una curva de calibración con estándar de fibrinógeno (diluir estándar 1/5 hasta 1/40 con buffen
Owren). La dilución 1/10 representa el valor 100% del calibrador.
• Se incuban dos volúmenes* (200 ul) de plasma diluido de cada dilución de la curva a 37°C por 4 minutos.
• A cada dilución se agrega u volumen (100ul) de Trombina bobina (100 NIH/ml). No pre incubar la trombina.
• Detectar la aparición de fibrina por método tubo inclinado o automatizado. Medir en segundos.
2. Realizar las determinaciones de cada punto de la curva de calibración y graficar cada dilución en papel
milimetrado tiempo versus concentración de fibrinógeno.
3. La curva de calibración debe hacerse nuevamente frente a cualquier cambio de lote de reactivo, equipo o
controles fuera de los límites de tolerancia establecidos en el control de calidad.
*Volúmenes depende del kit que se utilice.
Muestra del paciente
a. Diluir el plasma 1:10.
b. Tomar 200 ul de la dilución
c. Incubar 4 minutos a 37ºc
d. Agregar 100ul de Trombina
e. Medir el tiempo de la formación del coagulo. Extrapolar en la gráfica de la calibración y obtener la
concentración funcional de fibrinógeno

Informe
Informar la concentración de fibrinógeno en mg/dl, intervalo de referencia y el método usado.

Factores de error
Pacientes con heparinoterapia
Actividad y dilución de la trombina en el caso de usar trombina de uso clínico
Comentarios
Concentraciones de fibrinógeno menores a 100 mg/dl se realiza dilución 1:5 de la muestra y para mayores
a 400 se recomienda 1:20.

Interpretación
Hipofibrinogenemias: CID, fibrinólisis sistémica y enfermedad hepática grave.
Hiperfibrinogenemia: enfermedad hepática grave, embarazo, hiperfibrinogenemias transitorias,
traumatismos, IAM, infecciones (proteína de fase aguda).
La afibrinogenemia congénita presenta tiempos de coagulación prolongados y se asocia a un trastorno
hemorrágico con presentación clínica variable.

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 FUNDAMENTOS DE LOS EQUIPOS AUTOMATIZADOS EN COAGULACIÓN

El análisis de una muestra se puede hacer estudiando: el tiempo que tarda en coagular cuando se le añade un
activador de la coagulación, estudiando la actividad enzimática de algunos de sus factores (pruebas
cromogénicas ópticas) o analizando la concentración de algunos de sus elementos mediante pruebas
inmunológicas (Dímero-D).

DETECCIÓN MANUAL DE LOS TIEMPOS DE COAGULACIÓN

A principios del siglo XX, los desórdenes asociados a la coagulación se detectaban con un simple tiempo de
sangría realizado al paciente a pie de cama. Los primeros ensayos de coagulación realizados en el laboratorio,
se realizaban empleando sangre total obtenida por medio de punción venosa. La sangre se añadía a un tubo, el
cual se iba agitando y decantando con suavidad, hasta detectar la formación de coagulo visualmente, a esto se
le denomina método de Quick.

Método de Quick

COAGULÓMETRO
Es un instrumento, capaz de detectar el tiempo que tarda una muestra en coagular, existen de tipo manual, semi
manual o automáticos. Los manuales, son aquellos en que los procesos de dispensación de muestras, de
reactivos y puesta en marcha del cronómetro se realizan manualmente. Por el contrario, los automáticos son
aquellos en que todo el proceso esta robotizado, en algunos casos se habla de coagulómetros semiautomáticos,
para referirse a aquellos en los que alguna parte del proceso se realiza automáticamente, en este caso mediante
una pipeta conectada al coagulómetro.
Es importante tener en cuenta que independiente del sistema de detección empleado, que se pueden clasificar
los coagulómetros en función de la cantidad de volumen muestra-reactivo, que requieren para detectar.
Inicialmente, en los métodos tradicionales de medición en tubo, se requería un mínimo de muestra-reactivo de
500 ul, los primeros coagulómetros necesitaban la mitad 300 ul. Posteriormente nuevos diseños de cubetas
redujeron esta cantidad hasta sistemas de nominados super-microvolumen de 75ul.
Algunos coagulómetros poseen actividad Walk away que en terminología anglosajona se refiere a capacidades
de autogestionarse en temas tales como: controlar el desecho, identificar las muestras código de barras,
comunicación informática Host, niveles de reactivos, autolimpieza, autocalibraciones, incubaciones, diluciones y
prediluciones.

ESTANDARIZACIÓN
Para estandarizar la medida de los tiempos de coagulación, se desarrollaron los primeros test de coagulación
empleando muestras de sangre citratada:

• Tiempo de protrombina TP, desarrollado por Quick en 1930 como medida general de la actividad de los factores
implicados en la vía extrínseca de la coagulación.

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 • Tiempo de tromboplastina parcialmente activada TTPA desarrollado por Proctor y Rapapor t en 1960 como
screening de la vía intrínseca.
Para estandarizar en lo posible estas nuevas pruebas de coagulación se desarrollaron sistemas de detección
automáticos, en los que se prescindiera del factor humano (error humano). A estos primitivos analizadores se les
denominó fibrómetros y no eran nada más que la automatización del método de Gancho de Koller.

El primer coagulómetro semiautomático basado en el método de Gancho fue desarrollado por Schnitger y Gross y
permitía detectar hasta 4 muestras simultáneamente. Para la detección se empleaban dos electrodos, uno se mantenía
sumergido en la muestra y el otro móvil con movimiento de arriba hacia abajo. Antes de detectar el coágulo, el circuito
eléctrico que se producía entre ambos electrodos se interrumpía cada vez que el electrodo móvil se levantaba por encima
de la muestra. Al coagular la muestra y arrastrar el electrodo móvil el coágulo, este mantenía la conductividad y detenía el
cronómetro.
El gran cambio en el diseño de los coagulómetros dio la posibilidad de realizar pruebas de coagulación, en cubetas
individuales de reacción, que reemplazaron a los tradicionales tubos de decantación. La aparición de los primeros
coagulómetros semiautomáticos conllevó al desarrollo de pequeños procesadores capaces de almacenar curvas de
calibración, imprimir resultados, calcular razones y establecer controles de calidad.

Los sistemas de detección de referencia y validados que se encuentren en los coagulómetros existentes en el mercado se
dividen en dos principales familias:

Sistemas de detección mecánicos por bola:

• Electromecánicos: Sistema de bola fija por gravedad
• Electromagnéticos: Sistema de bola movida por medio de un electroimán.
• Sistemas de detección ópticos
• Opto-mecánicos: medición del voltaje necesario para mantener constante la transmitancia.
• Óptico-nefelométrico: medición de la cantidad de luz dispersada por la muestra.
• Foto-ópticos: medición de la cantidad de luz transmitida (fotométrico) o absorbida (turbidimétrico) por la muestra.
Los coagulómetros mecánicos de bola son los únicos que detectan coágulos a tiempo final, es decir que cuando se
detiene el cronómetro se ha detectado la presencia física de una malla de fibrina. Es un sistema de detección fisiológico,
en el sentido que no intervienen cálculos adicionales sobre múltiples mediciones puntuales (sistemas ópticos).

Inicialmente en los primeros sistemas mecánicos creados, la bola se mantenía fija en una posición por gravedad.
Posteriormente estos mismos fabricantes desarrollaron sensores donde la bola se mantenía y atraía por un electroimán.
Estos sistemas mecánicos de bola presentan dos problemas:

• Prolongación de los tiempos de coagulación causada por la rotura de los débiles coágulos de fibrina por la propia inercia
de la bola. Este fenómeno se detecta en la técnica de fibrinógeno método de Clauss.
• Acortamiento anómalo de los tiempos de coagulación debido a la detección de falsos coágulos producidos por el propio
giro del sensor sobre una bola de muy pequeñas dimensiones y dependencia de la viscosidad del medio.

Los sistemas de detección opto-mecánicos se pueden considerar como una variación primitiva de los sistemas foto-
ópticos, pero que tienen algunas ventajas de los sistemas mecánicos como:
• Agitación por medio de una bola a barrita de acero
• Posibilidad de trabajar con sangre total
• No es afectado por la turbidez de la muestra (muestras hemolizadas o lipémicas o del reactivo caolín)

En la detección opto-mecánica, una lámpara transmisora de tungsteno está continuamente ajustada para dar un voltaje
constante en los fotodiodos. A su vez un pequeño agitador (en forma de barrita o bola de acero) es movido por un imán

83
 rotatorio situado en el plano inferior del sensor. La función del agitador es la de homogeneizar la mezcla muestra/reactivo
y la de mantener la malla de fibrina estable en el centro de la cubeta.

Diafragma

Sensor
Detector

Bola de acero
Lámpara Pantalla Lente Diafragma
transmisora difusora
deEltungsteno
Cronómetro se pone en marcha justo cuando se dispensa el reactivo con la pipeta dentro de la cubeta de reacción.
Entonces el sensor ajusta el voltaje de la lámpara para la mezcla muestra/reactivo, realizándose elImán
correspondiente cero o
blanco. El agitador mecánico varita o bola de acero se encarga de mantener homogénea la mezcla muestra/reactivo,
Motor
mientras que a la vez genera una turbulencia que provoca que la malla de fibrina vaya tomando consistencia en el centro de
Sistema de detección óptico-mecánico
la cubeta. En el momento en que se forma el coágulo aumenta la turbidez de la muestra, entonces el fotoreceptor recibe
menos luz y aumenta el voltaje de la lámpara para que pueda recibir la misma cantidad de luz, es en este momento cuando
se detiene el cronómetro.

El sistema de detección opto-mecánico es de tipo punto final como el mecánico, aunque a desventaja de los foto-ópticos
no puede realizar pruebas cromogénicas. Uno de los principales problemas que presenta la detección opto-mecánica es en las
84
técnicas donde la densidad óptica es muy débil (Ej.: la detección de fibrinógenos débiles o < de 60 mg/dl.). En estos casos la
dilución 1:10 que propone la técnica de Clauss es excesiva y debe variarse o bien añadir caolín al reactivo para mejorar la
densidad del coágulo.

TIPOS DE DETECCIÓN ÓPTICA DE COÁGULOS

De la interacción de la luz con la muestra coágulo se derivan tres tipos de fenómenos fisicoquímicos diferentes: la
reflexión, emisión y absorción. Cada uno de ellos está regido por leyes diferentes, que han sido estudiadas, diseñadas,
perfeccionadas y reducidas con la finalidad de relacionar el fenómeno lumínico con la cuantificación del tiempo de coagulación
y características cualitativas de dicho coágulo. La detección óptica puede realizarse simplemente con un fotómetro a 450 nm. o
con un diodo láser en el espectro rojo o verde. En función del tipo de luz medida se pueden dividir en:

• Turbidimetría-Nefelometría: Se mide la cantidad de luz rebotada por la muestra antes y después de coagular.
• Turbidimetría-Transmitancia: Se mide los cambios en la turbidez de la muestra (transmitancia) al coagular,
comparados con los valores anteriores a la coagulación.
• Fotometría: Se mide la interrupción del paso de luz (absorbancia) por la muestra a medida que esta coagula.

Estos sistemas ópticos de un modo u otro detectan una diferencia entre la luz emitida y la detectada después de pasar a
través de la muestra antes y después de coagular. Pero el cálculo del tiempo de coagulación se realiza por medio de un
algoritmo matemático de cálculo que varía en función del fabricante. Independientemente del tipo de medición óptico empleado,
el tiempo de coagulación puede calcularse de dos maneras distintas:

• El tiempo en que la primera derivada o segunda derivada, de la señal recibida por el sensor óptico excede
unos niveles predeterminados.
• El tiempo en el que la pendiente de cambio es mínima, son estos algoritmos de cálculo los que diferencian
coagulómetros que teóricamente llevan sensores muy parecidos.

Los sensores miden la absorbancia inicial y monitorizan durante todo el tiempo de lectura los cambios de absorbancia de
la muestra. Al realizarse un blanco con el valor inicial, y tener en cuenta que el valor final, el efecto de muestras lipémicas y/o
hemolizadas es mínimo. Un haz de luz a 405 nm pasa a través de la cubeta y es continuamente monitorizado por un sensor
que registra los cambios en la muestra. Cuando la coagulación ocurre, causa un cambio en el valor de absorbancia. Tan pronto
como se supera un umbral de incremento de absorbancia se detiene la lectura y se registra el tiempo de coagulación. Si
representamos absorbancia detectada, versus tiempo transcurrido obtenemos el siguiente gráfico:

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 Se establece un tiempo denominado Lag-Fase en el que se da tiempo a que la mezcla muestra-reactivo se estabilice de
las turbulencias creadas en la dispensación. Los parámetros representados en la gráfica se definen como:

• A0 = Densidad óptica después de la fase inicial de estabilización del reactivo (Lag-Fase) o después de
un punto flexible debido a que la mezcla inicial muestra + reactivo provoca un ruido fotométrico ajeno al proceso de
coagulación, debe considerar además que la absorbancia de la mezcla no siempre es igual a la de la muestra sola.
• A1 = A0 + ΔA medido. Se define como la cantidad total de absorbancia medida.
• T1 = Tiempo transcurrido desde la adición del reactivo hasta A0.
• T2 = Tiempo transcurrido desde A0 hasta alcanzar un Δapredefinido.
• T1+ T2 = Tiempo de coagulación.
• A2 = Densidad óptica al final de la lectura.
• A2-A0 = en mE es el fibrinógeno derivado

PRINCIPALES DEFECTOS DE LOS SISTEMAS ÓPTICOS:

El hecho de calcular el tiempo de coagulación en base a incrementos de luz absorbida, transmitida o reflejada presenta
los siguientes problemas:

• Cualquier subida anómala de absorbancia, a partir de T1 podría registrarse como un falso coágulo.
• Si el ruido fotométrico es alto, interferirá en la interpretación de los parámetros medidos.
• Para medir el fibrinógeno derivado debe leerse hasta el final pese a haber coagulado la muestra, con lo cual
el lector queda bloqueado un tiempo prolongado
• En general cuánto más patológica, menos fibrinógeno y más tarde en coagular una muestra, más evidentes
son los problemas anteriores.
• La detección se ve afectada por la turbidez de la muestra por Ej. muestras lipémicas, hemolizadas o con
niveles altos de bilirrubina.

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 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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