UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD BIOANALISIS
REGIÓN VERACRUZ

BIOLOGIA MOLECULAR

PRACTICA 3
Extracción de DNA de sangre.

LIZETTE GUADALUPE MORALES CRUZ

07/03/24

VERACRUZ.
 PRÁCTICA 3

Extracción de DNA de sangre

1. Introducción

La extracción y purificación de los ácidos nucleicos es el primer paso en la mayoría

de los estudios de Biología Molecular.
Para manipular o amplificar el DNA es necesario eliminar otros componentes
celulares que pueden interferir con los experimentos, como proteínas, RNA y lípidos,
sin dañar al DNA. El primero en aislar y purificar el DNA fue el químico suizo Johann
Friedrich Miescher (1844-1895). En 1869, Miescher aisló a partir del núcleo de los
glóbulos blancos varias moléculas ricas en fosfatos, a las cuales les llamó nucleínas
(ácidos nucleicos). El protocolo original de Miescher era burdo y el DNA obtenido
no era puro. La contaminación con proteínas era una de sus preocupaciones, por
lo que modificó su protocolo agregando pepsina, una proteasa, para digerir las
proteínas presentes.

Actualmente existen varios métodos para la extracción y purificación de los ácidos

nucleicos, los cuales son seleccionados según:
 El tipo de ácido nucleico a extraer (DNA genómico, DNA plasmídico, RNA
total, RNA mensajero, etc.)
 El organismo de donde se extraerá (células animales, plantas, levaduras,
bacterias, virus, etc.)
 El material de extracción (órganos completos, tejidos, cultivos celulares,
sangre, muestras ambientales, etc.)
 Los resultados deseados (rendimientos, pureza, tiempo de purificación, etc.)
 La aplicación posterior (amplificación, clonación, expresión, transcripción
reversa, etc.)

Introducción a la extracción de ADN genómico de sangre

La extracción de ADN genómico de sangre es una técnica bioquímica que se

utiliza para aislar el ADN de las células sanguíneas.

El ADN es una molécula importante que contiene la información genética de un

organismo.
La extracción de ADN genómico de sangre es un procedimiento importante
para una variedad de aplicaciones, como la genética forense, la investigación
médica y la medicina clínica.

El proceso de extracción de ADN genómico de sangre se puede dividir en los

siguientes pasos generales:

1. Preparación de la muestra: La sangre se recolecta en un tubo de ensayo

con anticoagulante. (lila con EDTA)

2. Homogeneización de la muestra: La sangre se homogeneiza para romper

las células sanguíneas y liberar el ADN.
3. Lisis de la muestra: La muestra se trata con una solución que rompe las
membranas celulares y libera el ADN.
4. Precipitación del ADN: El ADN se precipita de la solución utilizando un
solvente orgánico, como el etanol o el isopropanol.
5. Rehidratación del ADN: El ADN precipitado se rehidrata en una solución
tampón.

Los reactivos y soluciones utilizados en la extracción de ADN genómico de

sangre incluyen:

• Solventes orgánicos: El etanol y el isopropanol son los solventes orgánicos

más comunes utilizados para precipitar el ADN.
 • Soluciones de lisis: Las soluciones de lisis son
soluciones que rompen las membranas celulares y
liberan el ADN. Las soluciones de lisis comunes
incluyen soluciones de sales, detergentes y
enzimas.

• Soluciones tampón: Las soluciones tampón son

soluciones que mantienen el pH de la solución a
un nivel constante. Las soluciones tampón
comunes utilizadas en la extracción de ADN
genómico de sangre incluyen soluciones de Tris-
HCl y EDTA.

La calidad del ADN extraído se puede evaluar mediante una variedad de

métodos, como:

• Espectrofotometría: La espectrofotometría se utiliza para medir la

concentración y la pureza del ADN.
• Electroforesis en gel: La electroforesis en gel se utiliza para separar el ADN
según su tamaño.
• PCR: La PCR se utiliza para amplificar el ADN.

2.- PRINCIPIO Y METODOLOGÍA DE LA DETERMINACIÓN

Extracción de los ácidos nucleicos

La extracción de los ácidos nucleicos a partir de materiales biológicos requiere
la homogeneización de los tejidos, en su caso, el lisado de las células y la
inactivación de las nucleasas celulares que podrían digerir el DNA. Esto asegura
que la cantidad de DNA intacto obtenido sea la máxima. La homogeneización
y la lisis celular deben ser lo suficientemente fuertes para romper el tejido, la
pared y las membranas celulares, pero ser suave para preservar los ácidos
nucleicos. Los procesos más comunes son:
• Disrupciónmecánica, por ejemplo la molienda, ruptura hipotónica, o
congelación- descongelación.

• Tratamiento químico, por ejemplo la lisis con detergentes o agentes

caotrópicos.
• Digestión enzimática, p.e. con proteasas, lisozima o mutanolisina.
La ruptura celular y la inactivación de nucleasas intracelulares deben de ser
combinadas. Se puede utilizar una solución con detergentes para solubilizar las
membranas celulares y sales caotrópicas fuertes para inactivar las nucleasas. El
DNA y otros componentes celulares como lípidos, azúcares y proteínas, se
disuelven en la solución de lisis. El DNA tiene carga negativa debido a los grupos
fosfato de su estructura, y esta carga eléctrica es lo que hace soluble a esta
molécula.

Purificación de los ácidos nucleicos

Los protocolos de purificación de los ácidos nucleicos a partir de los extractos
celulares frecuentemente son combinaciones de métodos.

Extracción/precipitación
• Extracción con solventes para eliminar contaminantes, un ejemplo es la
combinación de fenol y cloroformo para eliminar proteínas.
• Precipitación selectiva mediante la utilización de altas concentraciones de sal
o cambios
en el pH para precipitar las proteínas.

• Precipitación de los ácidos nucleicos con isopropanol o etanol, dado que el

DNA es insoluble en altas concentraciones de sal y alcohol. El DNA precipitado
forma unas finas hebras blancas, mientras que el resto de las sustancias
permanecen disueltas. Cromatografía
• Filtración en gel, separando las moléculas por su tamaño molecular.
• Intercambio iónico, permite la separación y concentración de las moléculas
por interacciones electrostáticas con la matriz de la columna.
Adsorción, los ácidos nucleicos son retenidos selectivamente sobre membranas
de sílica en presencia de altas concentraciones de ciertas sales, mientras que
otras moléculas no lo son. Los ácidos nucleicos posteriormente son eluidos con
agua o un buffer (amortiguador).

• Afinidad, los ácidos nucleicos se unen a un ligando particular, el resto de

moléculas se elimina con lavados, posteriormente se agrega una molécula que
compite por el ligando dejando libre a los ácidos nucleicos. Centrifugación

• La centrifugación es un método de purificación importante utilizado

frecuentemente en combinación con otros métodos, como la filtración en gel
y la cromatografía de adsorción. Electroforesis

• La electroforesis se utiliza frecuentemente para determinar el tamaño y la

integridad del DNA extraído.
 • Los ácidos nucleicos pueden ser separados por electroforesis con base en su
peso molecular. Esta separación se realiza más comúnmente en geles de
agarosa.

Objetivo

Que el alumno conozca los fundamentos de la extracción y purificación de DNA

genómico, usando sangre periférica como modelo, y que sea capaz de describir
y explicar cada una de las etapas del protocolo.

Se logró cumplir el objetivo ya que la práctica se realizó correctamente

3.- Materiales Requeridos

3.- LISTA DE REQUERIMIENTOS

3.1 Reactivos

Preparación de reactivos

TTS: Tris-HCl 10 mM pH 8

Triton X-100 1%

Sacarosa 11%

NaCl 5 mM: 0.2925 gr en 1 ml DE H2O

SDS al 10%: 10 g en 80 ml de ddH2O

Etanol absoluto

H2O tratada con DEPC (agua libre de nucleasas)

Material

1. Tubos cónicos de 15ml

2. Microtubos

3. Agitador “vórtex”

4. Microcentrífuga (preferentemente refrigerada, pero no se cuenta con esta)

 5. Micropipetas de volumen variable (570, 200, 50 y 30 µl)

6. Puntas para micropipetas

7. Gradillas para microtubos y para tubos cónicos de 15 ml

8. Gasa estéril o papel absorbente

Utilice bata, cubrebocas y guantes en todo momento.

NOTA: Mantener todos los reactivos a 4°C. El área de extracción, cabinas,

equipos, etc. Deben ser cuidadosamente limpiados antes de su utilización.
Las cabinas y superficies de trabajo deben ser limpiadas con hipoclorito de
sodio al 10%.

4.- Procedimiento

Antes de iniciar la Práctica, consulte las recomendaciones de seguridad

especificadas para cada sustancia utilizada (ver “Seguridad en el laboratorio de
Biología Molecular” al final del Manual).

Utilice bata y guantes en todo momento. El día anterior a la práctica:

1. Verificar que se cuenta con todas las soluciones necesarias.

2. Extraer la muestra de sangre (de 2 a 5 ml con tubos con EDTA o citratos)
Consultar
http://www.proveedormedico.com/Vacutainer/PMHyLVacutainer.pdf
3. Elaborar un diagrama de flujo en la bitácora, con el método completo
a seguir, paso a paso.

El día de la Práctica:

Utilice bata y guantes en todo momento, verifique que se cuenta con todas
las soluciones necesarias. Extraer una muestra de sangre (de 2 a 5 ml con
tubos con EDTA o citratos)

1. Tomar de 1 a 3 ml de la muestra de sangre con anticoagulante (EDTA) y

colocarlo en un tubo cónico de 15 ml .
2. Cada una de estas alícuotas será tratada con una solución de lisis de glóbulos
rojos (TTS) volumen a volumen, posteriormente agitar 10 minutos en vórtex.
3. Centrifugar a 3,000 rpm durante 6 min.
4. Descartar el sobrenadante y conservar la fase densa (botón). IMPORTANTE
ASEGURARSE DE NO DESECHAR ESTA FASE.
 5. Realizar nuevamente los pasos 1 al 4, este procedimiento permite la
eliminación de los eritrocitos, 2 o 3 veces, hasta que el botón esté libre de
eritrocitos.
6. Transferir el botón aun microtubotubo y añadir 570 µl de NaCl 0.5 mM y agitar
manualmente o en vórtex por 10 minutos.
7. Agregar 30 µl de SDS 10% y agitar durante 5 minutos. Los pasos 6 y 7 son con
la finalidad de lisar los leucocitos.
8. Observar si existe consistencia viscosa y añadir 200 µl NaCl saturado, agitar
nuevamente durante 10 minutos y centrifugar a 11,500 rpm durante 15
minutos.
9. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y agregar etanol absoluto (Dos
volúmenes de etanol por volumen de muestra) o Isopropanol (volumen a
volumen). ES RECOMENDABLE DEJAR A -20°C DURANTE TODA LA NOCHE
PARA FAVORECER LA PRECIPITACIÓN, mas no lo haremos por tiempo.
10. Centrifugar a 12,000 rpm durante 10 minutos.
11. Decante el sobrenadante y quitar el exceso con papel absorbente y dejar
secar con tapa abierta pero fuera de corrientes externas de aire.
12. Adicionar de 50 a 200 µl de agua libre de nucleasas (Agua tratada con DEPC)
o buffer TE 1X.
13. Almacenar su DNA a 4°C.
NOTA:
14. Si la muestra se requiere para otros estudios se recomienda realizar alícuotas.

5.- PROCESAMIENTO Y REPORTE DE RESULTADOS

5.1 Reporte de resultados
Se reportará la respuesta al cuestionario y el desarrollo de la
práctica.
5.2 Discusión.

¿Para que se realiza una extracción de DNA?

La extracción de ADN es un procedimiento bioquímico que se utiliza para aislar el

ácido desoxirribonucleico (ADN) de las células o tejidos. El ADN es una molécula
importante que contiene la información genética de un organismo.

La extracción de ADN se realiza para una variedad de aplicaciones, incluyendo:

• Genética forense: La extracción de ADN se utiliza

para identificar a las personas a partir de
muestras de ADN, como la sangre, la saliva o el
pelo.

• Investigación médica: La extracción de ADN

se utiliza para estudiar la genética de las
enfermedades y para desarrollar nuevos
tratamientos.

• Medicina clínica: La extracción de ADN se utiliza

para diagnosticar enfermedades y para realizar
pruebas de paternidad.
 En base al libro:
La extracción de ácidos nucleicos es el primer paso para la
mayoría de los estudios en biología molecular y para las técnicas
del ADN recombinante. En la actualidad, se dispone de múltiples
metodologías de extracción, lo que permite que los biólogos
moleculares puedan seleccionar la técnica que más se ajuste a
sus necesidades. La elección del método de extracción suele
realizarse en función de los siguientes criterios:

• Tipo de ácido nucleico que se va a extraer: ADN de cadena

sencilla (ADNss), DNAds, ARN total, ARN mensajero (ARNm) o
ARN ribosomal (ARNr).

• Organismo origen del ácido nucleico: mamíferos, plan tas,

procariotes o virus.

• Fuente del ácido nucleico: cultivo celular, tejido

(generalmente biopsia), sangre (leucocitos), expectoración,
suero, orina, líquido cefalorraquídeo, etcétera.

• Técnica en que se utilizará el ácido nucleico extraído: según

el uso que vaya a tener el ácido nucleico los requerimientos
de rendimiento, pureza y tiempo de extracción variarán
acorde a la metodología que se vaya a aplicar, como
retrotranscripción, PCR, clonación, Northern blot, Southern
blot, etcétera).

5.3 Conclusiones.

La extracción de ADN genómico de sangre es un procedimiento bioquímico

fundamental para una variedad de aplicaciones, incluyendo la genética forense,
la investigación médica y la medicina clínica.

El proceso de extracción de ADN genómico de sangre se puede dividir en los

siguientes pasos generales:

1. Preparación de la muestra: La sangre se recolecta en un tubo de ensayo

con anticoagulante.
2. Homogeneización de la muestra: La sangre se homogeneiza para romper
las células sanguíneas y liberar el ADN.
3. Lisis de la muestra: La muestra se trata con una solución que rompe las
membranas celulares y libera el ADN.
 4. Precipitación del ADN: El ADN se precipita de la solución utilizando un
solvente orgánico, como el etanol o el isopropanol.
5. Rehidratación del ADN: El ADN precipitado se rehidrata en una solución
tampón.

La calidad del ADN extraído se puede evaluar mediante una variedad de

métodos, como la espectrofotometría, la electroforesis en gel o la PCR.

La extracción de ADN genómico de sangre es un procedimiento relativamente

sencillo, pero requiere precisión y atención al detalle para obtener ADN de alta
calidad. El uso de reactivos y soluciones de calidad, así como la realización
correcta de los pasos del procedimiento, son esenciales para garantizar un
resultado exitoso.

5.4 Bibliografía consultada por el estudiante.

Salazar M.A (2013) Biología Molecular Fundamentos y

aplicaciones en las Ciencias de la Salud. México.
Universidad de Guadalajara.