1.

CITOPATOLOGÍA
En un inicio, la patología quirúrgica se desarrolló como una rama diagnóstica. Esta
se fundamentaba en aplicar los conocimientos sobre la morfología de las células para
el diagnóstico de la enfermedad en el material de biopsia.
Posteriormente surge un interés por obtener muestras celulares mediante técnicas
diferentes a la biopsia, aquí surge la Citología Diagnóstica Básica.

Definición: Es la técnica que se dedica a interpretar las células que se exfolian

(descaman) de forma espontánea de las superficies epiteliales; o que pueden
obtenerse de diversos órganos mediante procedimientos clínicos.

Funciones (Aplicaciones) (8): “HACER UN CUADRO RESUMEN”

➔ Diagnóstico y tratamiento del cáncer.- el diagnóstico patológico basado en
evidencias microscópicas de malignidad es fundamental para el manejo
apropiado de un paciente con cáncer.
A su vez, también es un auxiliar valioso de la histopatología porque permite
un diagnóstico preliminar del cáncer.
Sustituyó a la histopatología como método primario para el diagnóstico.
Es importante en la detección y diagnóstico del cáncer temprano
asintomático.
Ayuda a evaluar la respuesta al tratamiento y realizar un seguimiento de
casos.
➔ Identificación de las neoplasias benignas.- porque permite la capacidad de
distinguir lo benigno de lo maligno.
➔ Diagnóstico patológico intraoperatorio.- ya que es un complemento del
diagnóstico histopatológico.
➔ Diagnóstico de trastornos no neoplásicos e inflamatorios.- porque permite
reconocer trastornos específicos.
➔ Diagnóstico de infecciones específicas.- ya que los métodos permiten
identificar diversos microorganismos.
➔ Citogenética.- ya que las técnicas se emplean para los estudios cromosómicos,
demostración de la cromatina sexual.
➔ Evaluación del estado hormonal en la mujer.- a través de la citología vaginal,
esta refleja los cambios en los niveles hormonales.
➔ Identificación del origen celular.-

Ramas de la Citopatología (2):

Citología Exfoliativa.- es el estudio de las células descamadas de forma espontánea
desde las superficies epiteliales hacia las cavidades o líquidos corporales.
- El procedimiento es más fácil en la enfermedad porque la velocidad de
exfoliación aumenta.
- Las muestras se obtienen por raspado, cepillado o lavado de mucosas.
 - El médico prepara y envía la muestra al patólogo.
Citología Intervencionista.- las muestras se obtienen por procedimientos clínicos o
quirúrgicos. Encontramos a la Punción Aspiración con Aguja Fina (PAAF).
- El citopatólogo realiza el procedimiento.
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CITOLOGÍA EXFOLIATIVA: “GUÍA EN EL CUADRO 11.3 DEL MOHAN”
- Aparato Genital Femenino.-
Las muestras que se obtienen se conocen como “muestras de Pap”. Se pueden
preparar con diferentes métodos según el objetivo que se desea:
Citología de la cara lateral de la vagina. Raspado del tercio superior de la
pared lateral. Sirve para realizar evaluación hormonal.
Citología del “fondo de saco” o de la “cúpula” vaginal. Mediante el raspado
del fondo del saco posterior. Permite la detección de cáncer de endometrio y
cáncer ovárico.
Citología cervical. Se emplea la espátula Ayre y se coloca en el orificio cervical
externo. Detección del carcinoma de cuello uterino.
Citología combinada (rápida). Fusiona la citología del fondo de saco vaginal y
la citología cervical. Permite la evaluación sistemática y sobre todo detecta el
97% de casos de cáncer en cuello uterino y el 90% de casos de cáncer
endometrial.
Citología cervical triple (cervical - vaginal - endocervical). Reúne muestras
de la exocervix, vagina, endocérvix. También permite la evaluación
sistemática.
Citología endocervical y endometrial. Mediante la aspiración endocervical y
endometrial, respectivamente.
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APLICACIONES DE LA MUESTRA DE PAP
1. Evaluación Citohormonal: Obtener tres días alternados y determinar el
índice citológico. Índice acidófilo (mide la proporción entre células
ácidofilas y basófilos). Índice pignótico (es el porcentaje de células
con núcleos pequeños, oscuros y encogidos). Índice de maduración
(se cuentan 100 células pavimentosas y se agrupan según su tipo).
2. Citología combinada anormal: Cambios celulares no neoplásicos y
neoplásicas.
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CAMBIOS CELULARES NO NEOPLÁSICOS (BENIGNOS):
Cambios inflamatorios inespecíficos
Cambios inflamatorios específicos
ANOMALÍAS EN LAS CÉLULAS EPITELIALES NEOPLÁSICAS:
(NO SE ABARCARA PORQUE SE SALE DEL TEMA).
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- Vías Respiratorias.- el material celular puede obtenerse por expectoración
espontánea (esputo), aspiración o cepillado durante procedimientos
broncoscópicos.
 EXAMEN DE ESPUTO → tos espontánea y profunda, es fácil y representa
el aparato completo.
ASPIRACIÓN (LAVADO) BRONQUIAL Y CEPILLADO BRONQUIAL
→ durante broncoscopia, identificar lesiones en áreas específicas.

- Aparato Digestivo.-
Si las lesiones son en la cavidad oral → empleamos raspado de la superficie
bucal con depresores linguales de madera y de metal.
Para muestras del esófago y del estómago → por visión directa mediante el
cepillado o lavado a través del endoscopio.
Muestras del estómago → observación directa a cargo del endoscopista y
recolección de muestra por biopsia.
Muestras del colón → a través del cepillado durante la colonoscopia o del
lavado posterior al enema para limpiar el colón.

- Aparato Urinario.-
CITOLOGÍA DEL SEDIMENTO URINARIO. muestra de orina por micción
espontánea (en varones) y cateterismo (en mujeres)
IRRIGACIÓN VESICAL (LAVADOS).De la vejiga,en la cistoscopia,ante
sospecha de tumores vesicales.
CATETERISMO RETRÓGRADO. Sospecha de lesiones en vías urinarias altas
MASAJE PROSTÁTICO. Secreciones, muestra de portaobjetos. Actualmente:
biopsia directa por PAAF.

Utilidad diagnóstica →
Los tumores papilares de bajo grado.
Los tumores papilares de alto grado.
los tumores uroteliales.
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Lo que corresponde aquí se explica en el estudio de Líquidos, que está al final del
temario
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- Muestras bucales.- tiene por finalidad evaluar los cuerpos de cromatina en el
cromosoma sexual, durante la interfase.
DEMOSTRACIÓN DEL CUERPO DE BARR (CROMATINA X). Se visualiza
como una masa plano-convexa, de 1 um de diámetro y se apoya en la cara
interna de la membrana nuclear.
DEMOSTRACIÓN DEL CUERPO F (CROMATINA Y). El cual requiere tinción
con mostaza de quinacrina.
RECUENTO DE APÉNDICES CON FORMA DE PALILLOS DE TAMBOR. Se
emplea para determinar el sexo. En mujeres (3-6%) y en varones (0.3%)
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Técnicas de la Citología Exfoliativa (4):
A. Recolección de las muestras
 -Preparado de las muestras combinadas (rápidas) = NO durante
menstruación, NO ducharse 24 horas, bajo visión directa (espéculo cusco), NO
usar lubricante-humedecer solución ; se aspira con pipeta de vidrio con
extremo romo. Exocervix con Ayre, la rama más larga se ubica en el orificio
externo y se rota 360°. El extendido debe ser delgado y uniforme, sumergir en
fijador. La muestra debe transportarse en fijador en recipiente de coplin.
- Preparados citológicos líquidos (THIN PREPS) = permite dispersión
uniforme en 1 capa, sin superposición.
- Preparación de las muestras del fondo de saco lateral de la vagina. = por
raspado, dispersión directa sobre portaobjeto.
- Recolección de esputo.= obtenidas temprano mañana, 3 muestras en
sucesivos días.
B. Fijación y fijadores: para asegurar conservación de detalles morfológicos.
Ideal para PAP = solución éter/etanol al 95% tiempo 10’-15’
Fijadores Tipo Envoltura = forma aerosol sobre superficies, ideales para
transportar largas distancias.
Fijadores con objetivos especiales = formalina neutra, líquido de bouin y ácido
pícrico.
Preservación de las muestras de líquido = el mejor es el etanol al 50%.
C. Procesamiento de las muestras en el laboratorio
Muestras preparadas = si son fijadas en etanol requieren procesamiento
adicional.
Esputo = muestra va a la placa petri, analiza con fondo oscuro, las partículas
hemáticas se eliminan junto a hebras de moco, 4 muestras y fijar en etanol al
95%.
Muestras de líquido = si son volúmenes elevados al refrigerador media hora,
se descarta líquido salvo 200 ml fondo.
D. Tinción de las muestras.
-Tinción de Papanicolau → es el mejor método, 3 soluciones (para teñir el
núcleo y 2 contratinciones citoplasmáticas) Hematoxilina Harris (núcleo),
Naranja G y la Eosina alcohólica
-Tinción de H&E → Hematoxilina para el núcleo y Eosina para el citoplasma
-Tinciones de Romanowsky → en preparados hematológicos = citológicos,
tenemos May-Grunwald-Giemsa (MGC) y la de Wright
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CÉLULAS EN LAS CITOLOGÍAS COMBINADAS NORMALES.
(SE TOCARÁ ESTE PUNTO PORQUE LO VEREMOS EN PRÁCTICA).
En condiciones normales, se obtienen 02 tipos celulares:
● Células epiteliales → encontramos 4 tipos de células pavimentosas:
superficiales, intermedias, parabasales y basales. “GUÍA EN EL
CUADRO 11.4 DEL MOHAN”
● Variedades morfológicas epiteliales.
 Células naviculares: son de tipo intermedio punto tienen los bordes
plegados. Se encuentran en la segunda mitad del ciclo menstrual,
embarazo y menopausia.
Células de la lactancia. Son del tipo parabasal, son acidófilas. Están
presentes en el periodo de lactancia.
Células endocervicales. Se caracterizan por semejar núcleos dispersos o
en grupos dando la apariencia de un panal de abeja.
Células endometriales. Se encuentran durante el décimo segundo día
del ciclo menstrual, se disponen en grupos apretados y son células
redondas.
Células trofoblásticas. Este tipo de células se identifican después de
haber sufrido un aborto o del parto.
● Otras células → encontramos 2 tipos con mayor frecuencia.
Leucocitos. Sobre todo encontramos a los polimorfonucleares,
linfocitos, plasmocitos, macrófagos y células multinucleadas.
Bacilos de Döderlein (Bacillus vaginalis). Forma parte de la flora
vaginal normal, es un bacilo delgado y gram (+), se tiñen de color azul
pálido con la técnica de papanicolau.
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CITOLOGÍA INTERVENCIONISTA: las muestras (aspiración o biopsia qx)
- Citología por Aspiración con Aguja Fina = esta técnica resalta porque se puede
acceder con la aguja fina en casi todos los órganos.
APLICACIONES= para el diagnóstico de masas palpables y los biopsiados
son (masas mamarias, adenomegalias).
VENTAJAS
-No requiere internación (es ambulatorio) -No requiere anestesia
-Es rápido, seguro e indoloro -Se puede hacer múltiples intentos
-Resultados de forma rápida -Es de bajo costo y eficaz
-El citopatólogo realiza el procedimiento y obtiene datos de primera mano.
PROCEDIMIENTO GENERAL
● Materiales: jeringa con aguja adecuada + portajeringa (el de Franzen) +
portaobjeto + fijador (Coplin con OH 95%)
● Método de aspiración: masas palpables (vía transcutánea)
.El px se acuesta dejando expuesta el área a evaluar.
.El área se palpa y se delimita.
.Se limpia con OH
.Se fija la masa con la mano (guantes)
.Se inserta la aguja, alcanza la lesión, se retrae el émbolo
de la aguja y se aplica 10ml de aspiración mientras se
mueve la jeringa. La aspiración se detiene una vez
obtenido el material o sangre en la base o eje de la aguja
para el dx el material dentro de la aguja es suficiente, la
jeringa se descarta.
 completado el procedimiento, se libera la aspiración y
espera a equilibrar la presión.
retirar la aguja, aplicar presión de 2-3 minutos para evitar
hematoma.
.El material aspirado se recoge por la separación de la
aguja de la jeringa y el llenado de la jeringa con aire, luego
se vuelve a conectar la jeringa con la aguja y el material
aspirado se coloca sobre un extremo del portaobjeto.

● Preparación de las muestras

. El material depositado en el portaobjeto se INSPECCIONA a simple
vista.
.Las partículas semisólidas se APLASTAN por compresión, las gotas se
reúnen y dispersan como un extendido.
.Los frotis se FIJAN HÚMEDOS o se SECAN AL AIRE, se sumerge en
etanol al 95%, se transporta al laboratorio y se tiñen, la otra mitad se
seca al aire y se envuelve en papel.
COMPLICACIONES
● Hematomas → debido al sangrado. Es la complicación más frecuente,
sobre todo en mamas y tiroides. Para evitarlo se aplica compresión.
● Infección → no es frecuente; pero la aspiración transrectal puede
generar bacteriemia o septicemia.
● Neumotórax → en la aspiración transcutánea del pulmón, se resuelve
solo.
● Diseminación del tumor → las células malignas se pueden diseminar a
través de vasos sanguíneos y linfáticos, es algo teórico.
PRECAUCIONES Y CONTRAINDICACIONES DE LA PAAF
● Trastornos hemorragíparos, en pacientes con coagulopatías (como
hemofilia)
● Hígado, se debe conocer el tiempo de protrombina (NO → <80%)
● Pulmón, en pacientes mayores con enfisema o hipertensión pulmonar
● Páncreas, en pancreatitis aguda porque agrava la inflamación
● Próstata, puede causar prostatitis aguda en pacientes con bacteriemia
● Testículos, es muy dolorosa en pacientes con epididimo-orquitis aguda
● Glándula Suprarrenal, en pacientes con feocromocitoma porque
provoca fluctuaciones de la Presión Arterial.
DIAGNÓSTICO CITOLÓGICO
Se puede realizar un diagnóstico preliminar una hora después del
procedimiento de la PAAF si se necesita con urgencia.
Se debe analizar el patrón o disposición de las células, en las características
nucleares y citoplasmáticas de las células individuales o de los grupos
celulares y en la morfología del fondo.
LIMITACIONES:
→ Solo puede biopsiar una pequeña población de células.
 → Si la PAAF resulta negativa, a pesar de una importante sospecha clínica de
malignidad, el paciente se debe someter a otras pruebas.
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- Citología por Impronta → se examinan preparados por contacto de la
superficies de corte de masas extirpadas de forma quirúrgica en fresco no
fijadas.
En las piezas quirúrgicas se secciona la pieza en láminas y el contacto delicado
o la compresión de la superficie expuesta no fijada contra el portaobjetos.
VENTAJA → la distribución de las células refleja la arquitectura tisular, lo que
ayuda a su interpretación.
Se utiliza para el diagnóstico intraoperatorio de neoplasias malignas (como
complemento)
Auxiliar de la histopatología en la tipificación de los linfomas.
- Citología por Aplastamiento → a través de los extendidos de partículas
tisulares que se obtienen por craneotomía, para diagnosticar tumores
cerebrales.
- Citología del Sedimento → es el examen del sedimento que se obtiene por
centrifugación de los fijadores y de los líquidos en los cuales la pieza de
biopsia quirúrgica se transportó al laboratorio. Diagnóstico rápido de tumores
óseos, ya que los cortes histológicos requieren días para su descalcificación

2. HISTOQUÍMICA
Tinción H&E:
- Hematoxilina: tiñe los núcleos.
- Eosina: se usa contratinción del citoplasma y varios materiales extracelulares.
- Se emplea de forma habitual para diagnosticar mediante microscopía la gran
mayoría de piezas quirúrgicas.
Tinciones Histoquímicas:
- Cuando se desea demostrar sustancias o componentes específicos de las
células para confirmar constituyentes etiológicos, histogénicos o patogénicos
se pueden emplear tinciones especiales o “tinciones histoquímicas”.
- La tinción depende de:
➔ Las características físicas o químicas o de la solubilidad diferencial
entre la tinción y los tejidos.
- Sustancias para las cuales existen estas tinciones histoquímicas:
➔ Amiloide.
➔ Hidratos de carbono.
➔ Lípidos.
➔ Proteínas.
➔ Ácidos nucleicos.
➔ Tejido conectivo.
 ➔ Microorganismos.
➔ Tejidos nerviosos.
➔ Pigmentos.
➔ Minerales.

3. HISTOQUÍMICA DE ENZIMAS
Técnica que se basa en la capacidad que tienen algunas enzimas del tejido
de mantener funcional su centro activo tras un proceso de fijación.
También las técnicas histoquímicas para enzimas requieren tejido no
fijado para poder cortarlo con criostato y no se pueden aplicar en piezas
fijadas en parafina o en formalina dado que las enzimas se dañan con
rapidez.
Esta técnicas en la actualidad tiene la utilidad diagnóstica limitada y no es
tan popular; en parte, debido al requerimiento de tejidos frescos y a la
técnica compleja y en parte, a causa de la escasez relativa de la
especificidad de la reacción en muchos casos. Es por eso que esta
técnica histoquímica de enzimas es reemplazada por procedimientos
inmunohistoquímicos y técnicas de patología molecular.
Aplicaciones más frecuentes para la identificación:
- Acetilcolinesterasa (diagnóstico de la enfermedad de hirschsprung)
- Cloroacetato esterasa (Detectar células mieloides y mastocitos)
- Reacción DOPA (Actividad de la tirosinasa en los melanocito)
- Deshidrogenasa endógena (Requiere de nitroazul de tetrazolio o NBT)
para establecer la viabilidad del músculo cardiaco
- Fosfatasas ácida y alcalina

Unidad_Didáctica_4-hirscprung_-_Dra._Davila.pdf (patologia.org.ar)
Técnicas Hitológicas. 4. Corte. Criotomos. Atlas de Histología Vegetal y
Animal (uvigo.es)
Y Mohan

4. INMUNOHISTOQUÍMICA
CONCEPTO:
- La inmunohistoquímica (IHC) es el proceso de detección de antígenos, ya sea
su estado o localización en la célula.
- Combina la histología con la inmunología en la determinación de anti
antígenos celulares
- Contribuye en el diagnóstico específico de las enfermedades, en particular las
neoplásicas; permite una adecuada clasificación en función de linaje u origen
(tales como carcinoma, melanoma, linfoma, etc.)
 - A la inmunohistoquímica se le llama “La revolución marrón”, por el uso de
aminobencidina como cromogeno.
- Imagen 1: Coloración inmunohistoquímica para CD137 realizada en cortes
de tejido incluidos en parafina (citoplásmicos y membranosos) utilizando el
clon monoclonal BBK-2 (aumento original × 400)
- Imagen (derecha):
- Preparación de la muestra
- Desparafinado y deshidratación
- Se realiza la recuperación antigénica (recuperando los epitopos
enmascarados por el formol). Mediante técnicas enzimáticas o
térmicas.
- Bloqueo (La solución de bloqueo se une a lugares de unión que no son
específicos dentro del tejido con el fin de prevenir la unión no
específica de los anticuerpos primario y/o secundario).
- Escoger el anticuerpo primario
Para escoger qué anticuerpo se adapta mejor a nuestra muestra
tendremos que tener en cuenta factores como: los niveles de expresión
de la proteína de interés en ese tejido y que otros anticuerpos se pueden
utilizar en ese tejido para realizar la co-localización.
- Detección mediante los métodos de conjugación o puente o del
complejo peroxidasa antiperoxidasa o el método de fosfatasa alcalina
antifosfatasa alcalina o avidina-biotina o polímeros o amplificación.
GENERALIDADES:
- Surge de los métodos de inmunofluorescencia, debido a los anticuerpos
marcados que presentaban compuestos fluorescentes, localizaban los
antígenos específicos.
- Los cromógenos más utilizados son:
- Tetracloruro de diaminobencidina (DAB en ingles)
- Aminoetil carbazol (AEC en ingles)
- Se asocian a controles positivos apropiados, porque es un tejido que expresa
un antígeno específico y actúa como control, en la cual puede ser un control
interno o externo.
- Los controles de tejido se usan para mostrar que la técnica de IHC fue
exitosa y útil para demostrar el objetivo de interés.
- No se llega a distinguir lesiones neoplásicas de las no neoplásicas, tambien de
los tumores malignos de los benignos. Es necesario de otros métodos
tradicionales.
- Los anticuerpos se producen por técnicas: Monoclonales y Policlonales.
- A. Monoclonales: Son el producto de un clon único de células
plasmáticas, de manera que las moléculas de anticuerpos son todas
inmunohistoquímicamente idénticas con una sola especificidad y una
sola afinidad.
 - B. Policlonales: Son una mezcla de Ig sintetizadas por diferentes
clones de células plasmáticas y que reaccionan con distintos epítopes
sobre el antígeno para el cual fueron creados.
- Los procedimientos más usados:
- Método Peroxidasa antiperoxidasa (PAP): Genera el reactivo
Peroxidasa Antiperoxidasa que reacciona con el anticuerpo primario,
interviniendo un anticuerpo intermediario.
- Técnica de inmunoenzimática con avidina-biotina (ABC): Usa
un anticuerpo secundario biotilinado, va a combinar el anticuerpo
primario con un complejo de avidina-biotina

APLICACIONES:
Las tinciones inmunohistoquímicas se emplean para:
1. Tumores de histogénesis incierta:
● La inmunohistoquímica generó una gran revolución en el diagnóstico de los
tumores de origen incierto, tanto primarios como metastásicos de un tumor
primario desconocido.
● La importantancia de los colorantes de inmunohistoquímica son para teñir los
filamentos intermedios expresados por las células tumorales (queratina,
vimentina, desmina, neurofilamentos y proteínas ácidas fibrilares gliales).

2. Marcadores de pronóstico para el cáncer:

● La predicción del pronóstico de los tumores a través de la identificación de las

micrometástasis, las metástasis ocultas y ciertas características adquiridas de
productos elaborados o genes expresados en exceso por las células malignas
para establecer el comportamiento biológico del tumor, son la segunda
aplicación de la inmunohistoquímica

3. Predicción de la respuesta al tratamiento:

● La inmunohistoquímica se usa para predecir la respuesta terapéutica en 2
tumores importantes: carcinoma de mama y de próstata.
● El crecimiento de ambos tumores está regulado por hormonas: estrógenos y
andrógenos.
● Se administra tratamiento hormonal para reducir sus niveles:
estrogenoterapia, para el cáncer de próstata, y androgenoterapia, para el
cáncer de mama.
● Los resultados de los receptores de estrógenos y progesterona en el cáncer de
mama presentan una correlación pronóstica significativa, pero la utilidad
pronóstica de los niveles de receptores de andrógenos en el cáncer de próstata
es limitada.

4. Infecciones:
- Las técnicas inmunohistoquímicas también se emplean para confirmar
agentes infecciosos en los tejidos mediante el uso de anticuerpos específicos
contra el ADN o el ARN microbiano, como la detección de virus -HBV, CMV,
HPV, herpes virus
 5. CITOMETRÍA DE FLUJO
CITOMETRÍA DE FLUJO

Uso para el estudio de las propiedades de las células suspendidas en una corriente en
movimiento

Componentes de un citómetro

Compuesto por tres componentes básicos

Sistema de fluidos

Este sistema dirige y conduce las células en una corriente hidrodinámica hacia un
punto de interrogación del láser, este sistema consiste en un canal central donde se
inyecta la muestra rodeada por el fluido y una serie de tanques que contienen
soluciones, el fluido rodea a la suspensión y por una diferencia de presión entre
ambos fluidos el enfoque hidrodinámico que alinea las células de una en una para
pasar por el punto de interrogación del láser, esa presión puede variar ya sea baja,
alta o media de formar que su aumento incrementa la velocidad y el área de paso del
flujo haciendo que la cantidad de células por segundo que se procesa sea mayor

Sistema óptico

● El sistema óptico está integrado por los láseres, la cámara de flujo, los espejos
dicroicos
● Existen diferentes tipos de láser y los que más se utilizan son el violeta, el azul
y el diodo rojo, con longitudes de onda de excitación de 405, 488 y 635 mm,
respectivamente.
● Los espejos dicroicos tienen la propiedad de reflejar la luz de una determinada
longitud de onda y dejar pasar el resto.
● Existen tres tipos de espejos dicroicos: paso banda (band pass), que reflejan
un intervalo estrecho de longitudes de onda; paso corto (short pass) y paso
largo (long pass), que reflejan longitudes de onda por encima o por debajo de
un valor, respectivamente.

Sistema electrónico

● Los impulsos electrónicos captados se amplifican y se transforman en

información digital que es procesada en un ordenador.

Parámetros de dispersión de la luz

 ● Al proyectar el haz de láser sobre la célula se produce un cambio de dirección
de la luz que incide sobre ella que depende fundamentalmente de las
propiedades físicas y estructurales de la célula. El tamaño celular y la
complejidad de la membrana, los gránulos citoplasmáticos y el núcleo son las
principales estructuras que intervienen en los parámetros de dispersión de la
luz. El detector mide la cantidad de luz dispersada por la célula que depende
de su densidad y granularidad.

Intensidad de fluorescencia

El haz de láser incide sobre los fluorocromos conjugados con los AcMo que están
unidos a los antígenos celulares. Los compuestos fluorescentes absorben energía
luminosa con una longitud de onda propia del fluorocromo. La absorción desprende
más energía que la emisión de fluorescencia y por ello las longitudes de onda que se
emiten son mayores que las de absorción.

OBTENCIÓN DE UNA SUSPENSIÓN CELULAR

● Las técnicas de citometría para la identificación de poblaciones celulares

requieren que las células se encuentren en suspensión para realizar el
procedimiento, esto implica que en algunas de las muestras sea necesario
incluir pasos previos al marcado con AcMo.
● Las muestras que se procesan para el análisis celular las más comunes son la
sangre periférica y médula ósea
● La temperatura, la conservación y el tiempo que transcurre desde la
extracción hasta el momento de realizar la técnica modifican la viabilidad y la
expresión de antígenos de las células.
● Pasado el tiempo, la viabilidad de la prueba disminuye significativamente, las
células modifican su morfología y pueden determinar falsos positivos o falsos
negativos para algunos marcadores
● Es importante tener en cuenta en el momento de la extracción cuál es el
anticoagulante. El que más se emplea es el ácido etilendiaminotetracético
(EDTA), anticoagulante de elección para sangre periférica y médula ósea.
● Es importante cuantificar las células presentes en la muestra realizando un
recuento previo para ajustar el número de células en la suspensión respecto al
volumen de AcMo, sobre todo en sangre periférica, médula ósea y productos
celulares de selección para trasplante.

ACMO

● Los AcMo son una herramienta imprescindible en las técnicas de citometría.

Las células se marcan con AcMo, que se dirigen específicamente contra una
molécula con carácter antigénico.
 ● En la actualidad existe una gran disponibilidad de AcMo que reconocen
antígenos leucocitarios y se designan con el nombre CD o grupo de
diferenciación
● Los paneles de AcMo de caracterización leucocitaria incluyen antígenos de
línea, de diferenciación y de función, que facilitan la identificación de
poblaciones celulares de sangre periférica y médula ósea.
● Cada AcMo está conjugado con un fluorocromo distinto. El desarrollo de
nuevos citómetros provistos de mayor número de dispositivos de láser ha
permitido el empleo de combinaciones con múltiples AcMo, lo que ha
posibilitado la inclusión de paneles de 6 a 8 marcadores, con lo que se obtiene
la información de más antígenos.

FLUOROCROMOS

● Los fluorocromos conjugados a los AcMo son moléculas capaces de absorber

luz de una determinada longitud de onda al ser excitados por un láser y de
emitir fluorescencia a una longitud de onda mayor. Si el antígeno que se
quiere determinar está presente en la célula, el AcMo se une al antígeno, el
fluorocromo se excita y emite entonces una fluorescencia que permite detectar
la presencia del antígeno.

Análisis de resultados

Gráficos de densidad:

Estos gráficos, además de representar a las poblaciones con base en la expresión de

dos marcadores, muestran la frecuencia relativa de las poblaciones; por ejemplo, las
poblaciones con mayor número de eventos se representan mediante tonos de gris
más intenso mediante colores cercanos al naranja o mediante líneas

Histogramas:

Los histogramas muestran la intensidad de expresión de un marcador versus el

número de eventos. El desplazamiento de la curva hacia la derecha indica mayor
expresión del marcador, mientras que la altura del pico indica la frecuencia de las
células capturadas. En este sentido, es importante recalcar que el área bajo la curva
contiene a las células que se están analizando

Gráficos 3D:

Este tipo de gráficos permite comparar a las poblaciones con respecto a la expresión
de tres marcadores diferentes y la frecuencia relativa. Los histogramas también
pueden ser representados en gráficos de 3D, lo que permite la comparación de la
expresión de dos marcadores diferentes versus el número de eventos

https://www.medigraphic.com/pdfs/veracruzana/muv-2018/muv182d.pdf
Aplicaciones:

Inmunofenotipo (artículo:
https://revhematologia.sld.cu/index.php/hih/article/view/313/183#:~:t
ext=La%20citometr%C3%ADa%20de%20flujo%20(CMF)%20constituye
%20una%20t%C3%A9cnica%20de%20avanzada,las%20c%C3%A9lulas%
20normales%20y%20anormales).
En el análisis de inmunofenotipo, se utilizan anticuerpos fluorescentes que
reconocen proteínas de superficie celular. Cada anticuerpo se etiqueta con un color
diferente, lo que permite identificar varias proteínas al mismo tiempo. Esto es útil
para clasificar diferentes tipos de células del sistema inmunitario, como linfocitos T,
linfocitos B y linfocitos NK (natural killer).

Medición del contenido del ácido nucleico

https://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0034-988719990011000
14#:~:text=La%20citometr%C3%ADa%20de%20flujo%20es,y%20pH%20entre%20
otros1.
En este proceso, las células se marcan con fluorocromos que se unen
estequiométricamente al ADN y al ARN dentro de las células. Estos fluorocromos se
intercalan en la doble hélice de los ácidos nucleicos y emiten fluorescencia en una
longitud de onda mayor cuando son excitados por un láser.

Para diagnosticar la causa del rechazo del aloinjerto

https://www.nefrologiaaldia.org/es-articulo-diagnostico-tratamiento-del-rechazo-m
ediado-283
La citometría de flujo puede ser utilizada para analizar las características de las
células inmunes presentes en la muestra de biopsia del injerto renal. Esta técnica
permite la identificación y cuantificación de diferentes subpoblaciones de células
inmunes, como linfocitos, monocitos, células dendríticas, entre otras.

Medición de los antígenos asociados con la proliferación

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100007

En citometría de flujo, se pueden medir los antígenos asociados con la proliferación

celular mediante la incorporación de BrdU o la detección de la proteína Ki-67. El
BrdU se incorpora al ADN en replicación y se detecta con un anticuerpo específico.
La proteína Ki-67 se expresa en células en fase de proliferación y se detecta con
anticuerpos específicos. Ambos métodos permiten cuantificar la proliferación celular
mediante citometría de flujo.
Diagnóstico y pronóstico de la inmunodeficiencia
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Para el diagnóstico de inmunodeficiencias, la citometría de flujo se utiliza para
evaluar la presencia y función de diferentes tipos de células inmunes, como los
linfocitos T, linfocitos B, células natural killer (NK) y células dendríticas. Se pueden
analizar marcadores de superficie celular, como los antígenos CD3, CD4, CD8, CD19,
CD20, CD16/56, entre otros, para identificar y cuantificar las diferentes
subpoblaciones de células inmunitarias. Además, se pueden evaluar la producción de
citocinas por parte de las células, la expresión de moléculas de adhesión y otros
marcadores que indican la función y activación celular.

Diagnóstico de anticuerpos
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La citometría de flujo se utiliza para el diagnóstico de anticuerpos mediante
diferentes enfoques. En la inmunofluorescencia directa, los anticuerpos específicos
se marcan con fluorocromos y se utilizan para detectar y cuantificar la presencia de
antígenos en las células. La fluorescencia emitida por las células se mide y analiza
para determinar la presencia o ausencia de anticuerpos dirigidos contra esos
antígenos. Además, se utiliza la inmunofluorescencia indirecta, donde se usan
anticuerpos secundarios marcados con fluorocromos para detectar los anticuerpos
primarios. Esto amplía las posibilidades de detección y cuantificación de anticuerpos
específicos. La citometría de flujo de células vivas, como la citometría de flujo de
células B, se emplea para analizar y clasificar subpoblaciones de células B según
marcadores de superficie y la detección de anticuerpos específicos. Esto es útil en el
diagnóstico de enfermedades autoinmunes y trastornos de la respuesta inmunitaria.

Libro usado para clasificarlo: Mohan

Para explayarse se usó los diferentes artículos que hay en la parte
inferior de cada aplicación de citometría de flujo.

6. HIBRIDACIÓN
La hibridación explica la capacidad de las moléculas monocatenarias de
ARN o ADN para interactuar (hibridar) con secuencias
complementarias
En el laboratorio:
● La hibridación requiere el aislamiento del ADN o ARN, que se mezcla
a continuación con una secuencia de nucleótidos complementaria
llamado sonda
 ● Los híbridos se detectan más a menudo usando un marcador
radiactivo unido a un componente del híbrido.
● La unión de la sonda y la secuencia puede darse en una solución o en
una membrana de nitrocelulosa
INFORMACIÓN RECOLECTADA DEL ROSS DE HISTOLOGÍA

EXTRA:Patología diagnóstica molecular

● Sirve para detectar anomalías en el ARN y ADN y generalmente las técnicas
basadas en ADN y ARN emplean la hibridación en la tecnología
recombinante
MÉTODOS MOLECULARES :
● Son métodos Disponible como herramienta de diagnóstico en la patología
quirúrgica:HIBRIDACIÓN IN SITU ,CON FILTRO Y PCR

Hibridación in situ :
•Es un tipo de técnica de hibridación molecular que permite la
localización de una secuencia de ácido nucleico en forma directa en la
célula intacta ( es decir in situ) sin la extracción del ADN .
•Esta técnica consiste en la hibridación específica de una sola cadena de
una sonda (es una cadena de nucleótidos formada por número conocido de pares de bases)
marcada de ácido nucleico con una sola cadena de un ADN o un ARN
complementario a un tejido que se desea detectar
•El producto final se detecta con una sonda radiactiva (32P ,125I) o no
radiactiva (biotina ,digoxigenina)
APLICACIONES: La hibridación in situ se usa en las siguientes aplicaciones:

➔ En infecciones virales: En caso de diagnóstico de virus del papiloma

humano (HPV), dx virus de Epstein-Barr (EBV), dx citomegalovirus (CMV),
dx VIH (HIV), dx virus de la hepatitis C (HCV).
➔ En tumores humanos: Para la detección de expresión de genes y
oncogenes.
➔ En trastornos cromosómicos: En particular mediante el uso de
hibridación in situ por fluorescencia (FISH).

7. HIBRIDACIÓN CON FILTRO

- Es una técnica molecular disponible para diagnosticar en la patología
quirúrgica.
- El método consiste en extraer ADN o ARN de un tejido fresco, congelado no
fijado o fijado en formalina (incluído en parafina).
- Inmovilización: Filtro de nitrocelulosa o nylon.
- Métodos:
➔ Ensayos de transferencia por manchas (dot) y por ranuras
(slot)
◆ Se muestra el ADN.
◆ El ADN se une sin la reducción del tamaño de ácido nucleico.
◆ No se realiza electroforesis.
◆ Se fija con vacío.
◆ Hace detecciones cualitativas y cuantitativas.
➔ Southern blot
◆ Llamado: Electroinmunotransferencia o inmunotransferencia
◆ Se fracciona previamente el ADN mediante electroforesis en gel.
◆ Técnica: Se extrae ADN, se digiere con enzimas de restricción y
los fragmentos se separan por electroforesis en gel de agarosa,
posteriormente los fragmentos de ADN se visualizan al teñir con
bromuro de etidio.
◆ PASOS:
● Se aísla el ADN, esto se realiza a través de la
homogeneización del tejido, separando los núcleos por
centrifugación y se obtienen los ácidos nucleicos.
● El sobrenadante se somete a ciclos de tratamiento con
fenol y centrifugación.
● El ARN se digiere con la ARNasa.
● El ADN aislado se digiere mediante enzimas de
restricción.
● Los fragmentos son separados por electroforesis en gel de
agarosa y se transfieren a una membrana de nitrocelulosa
o nylon.
● Cuando ocurre la transferencia se desnaturaliza el ADN,
la membrana con fragmentos se incuba con una sonda
marcada complementaria al fragmento y se da la
hibridación.

➔ Northern blot
◆ Se fracciona el ARN.
◆ No se usan enzimas de restricción (por el tamaño de las
moléculas del ARN).
◆ PASOS:
● Las sondas se marcan radiactivamente.
● Se extrae mediante el mismo procedimiento para obtener
ADN, pero usando ADNasa.
● Se separa por electroforesis en gel de formaldehído -
agarosa, se desnaturaliza el ARN.
● Se transfiere a una membrana de nitrocelulosa o nylon,
que posteriormente se incuba con la sonda marcada.
 ➔ Western blot
◆ Llamado: Electroinmunotransferencia de proteínas.
◆ Se fraccionan las proteínas.
◆ Se usan anticuerpos como sondas.

APLICACIONES: Por su especificidad y sensibilidad de las técnicas de hibridación

molecular, se aplican en la patología diagnóstica. Entonces podemos ver que se
puede aplicar en:

➔ En neoplasias: Tanto en las hematológicas como en las no hematológicas.

➔ Enfermedades infecciosas: Para el diagnóstico del agente causal, en
estudios epidemiológicos y para la identificación de nuevos agentes
infecciosos.
➔ Enfermedades genéticas hereditarias: Para detectar a portadores de
mutaciones, para el diagnóstico prenatal y para el diagnóstico directo de las
enfermedades genéticas.
➔ Determinación de la identidad: Para el trasplante de tejidos, en patología
forense y para evaluación del parentesco.

8. PCR
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

➔ Fue desarrollada en 1986 por el Dr. Kary Mullis.

Su fundamentación se da en la necesidad de obtener un gran número de copias de
fragmentos específicos de ADN de manera rápida y económica.
Esta técnica se basa en una replicación exponencial in vitro de una molécula de ADN
genómico (ADNg) o ADN complementario (ADNc), mediante ciclos repetitivos, que
constan de tres temperaturas.
La longitud del producto amplificado la delimitan los iniciadores, también llamados
primers.

Componentes de la reacción de PCR:

Para que se lleve a cabo la reacción en cadena de la polimerasa se requiere una

cadena de ADNg o ADNc que sirva de molde, una enzima ADN polimerasa, Mn+2 o
Mg+2 necesarios como cofactores para la enzima, nucleótidos y primers para el inicio
de la síntesis. Estos reactivos se mezclan y se someten en el termociclador a los ciclos
de amplificación.

Pasos del PCR:

a) Desnaturalización: La reacción se calienta (94 °C por 60 – 90 min) para
separar o desnaturalizar la cadena de ADN, lo que permite el acceso de los
“primers” a la cadena molde en sus secuencias complementarias.
b) Alienación o hibridación: La temperatura se reduce (55 - 60 °C) para que la
mayoría de los iniciadores (primers) se puedan aparear, es decir, que se genera la
energía cinética necesaria para que los iniciadores busquen en las cadenas de
ADN su secuencia complementaria y formen los puentes de hidrógeno con la
cadena molde.
c) Extensión o elongación: Se produce a la temperatura óptima (72°C por 1 – 3
min) para el funcionamiento de la ADN polimerasa empleada, en este caso la Taq
polimerasa, la cual empieza a tomar los dNTPs (desoxinucleótidos trifosfato) que
se encuentran en medio y los van emparejando dependiendo de la hebra que esté
funcionando como molde.

Aplicaciones

● Detección de enfermedades hereditarias.

● Identificación de huellas genéticas, en el ámbito forense.
● Clonado de genes.
● Pruebas de paternidad.
● Diagnóstico de enfermedades infecciosas como el Covid - 19.

9. ESTUDIO DE LÍQUIDOS CORPORALES

- Líquidos Corporales.- para mejor entendimiento, se distribuyen en dos
grupos
DERRAMES EN CAVIDADES CORPORALES.son acumulaciones de
líquido en alguna de 3 cavidades (PIeural, Pericárdica, Peritoneal). Se
clasifican en trasudados o exudados(los malignos y tienen proteínas >3 g/dl)
Se obtiene por paracentesis ,permite identificar neoplasia maligna y establecer
clasificación.

Componentes Celulares.- 2 tipos : mesotelio y macrofago.El derrame altera la

cubierta mesotelial y se agrupa en forma editaria,los histiocitos son células
mononucleares ,bordes indefinidos y pueden presentar vacuolas
citoplasmáticas, núcleos excéntricos y reniformes)

PEQUEÑOS VOLÚMENES DE LÍQUIDO. Las muestras de mayor

frecuencia corresponden a las del LCR y líquido seminal.
Líquido Cefalorraquídeo (LCR). La muestra se obtiene por punción
lumbar.
Factores: velocidad de transporte y procesamiento inmediato. Procesamiento
y técnica correctos.
Resultado Normal → 150 mL, contenido celular bajo, sobretodo linfocitos o
monocitos.
Líquido Seminal (SEMEN)
Se emplea para evaluar la fertilidad y si tuvo éxito la vasectomía. La muestra
se obtiene por masturbación o coito interrumpido.
Se evalúa: el volumen (2.5 y 5 mL), viscosidad (al inicio, luego de 10-30 min se
licua), pH (8), motilidad (+2h = 60% movible), recuento (+60 mill.),
Morfología (<20% normal) y [Fructosa] (150 - 600 mg/dL)