PRACTICA Aislamiento de ADN Bacteriano (Fundamento Teorico) .En - Es
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PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA
AISLAMIENTO DE ADN BACTERIANO
PRÁCTICA
1.pH
• Los enlaces de hidrógeno entre las hebras complementarias son
estables entre pH 4 y 10.
• Los enlaces fosfodiéster en la estructura del ADN son estables entre pH
3 y 12.
• Los enlaces N-glucósidos con bases purínicas (adenina y guanina) se
hidrolizan a valores de pH de 3 y menos.
2. Temperatura
• Existe una variación considerable en la estabilidad térmica de los
enlaces de hidrógeno en la doble hélice, pero la mayor parte del ADN
comenzará a desenrollarse en el rango de 80 a 90 °C.
PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR
3. Fuerza iónica
• El ADN es más estable y soluble en soluciones salinas. Las
concentraciones de sal inferiores a 0,1 M debilitan los enlaces de
hidrógeno entre hebras complementarias.
4. Condiciones celulares
• Antes de que se pueda liberar el ADN, se debe lisar la pared celular
bacteriana. La facilidad con la que se rompe la pared celular varía de un
organismo a otro. En algunos casos (levadura), se requiere una trituración
extensa o un tratamiento sónico, mientras que en otros (B. subtilis), es
posible la hidrólisis enzimática de la pared celular.
• Una fase acuosa superior, una capa orgánica inferior y una banda
compacta de proteína desnaturalizada en la interfaz entre las fases
acuosa y orgánica. El cloroformo provoca la desnaturalización
superficial de las proteínas. El alcohol isoamílico reduce la formación de
espuma y estabiliza la interfaz entre la fase acuosa y las fases
orgánicas donde se acumula la proteína.
El ARN normalmente no precipita como el ADN, pero aun así podría ser un
contaminante menor. El ARN puede degradarse durante el procedimiento
mediante tratamiento con ribonucleasa después del primer o segundo paso
de desproteinización. Alternativamente, el ADN se puede precipitar con
isopropanol, lo que deja
PROTOCOLO
12. Retire con cuidado la fase no acuosa superior, junto con el material
blanco esponjoso en la interfaz (esto es principalmente proteína
desnaturalizada).
13. El paso de extracción con cloroformo y alcohol isoamílico se puede
realizar 2 o 3 veces más, si se desea, hasta que la interfaz blanca ya no
se vea.
14. Repita el paso de precipitación con etanol, descrito anteriormente, en la
fase acuosa final, incluida la resuspensión del ADN en tampón TE.
Fondo
Una vez logrado esto, el ADN puede precipitarse a partir de una solución
con alcohol y disolverse en un tampón apropiado.
PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR
El procedimiento utilizado aquí es útil para aislar ADN de una gran variedad
de bacterias gramnegativas. Produce ADN parcialmente purificado de
calidad suficiente para la mayoría de las técnicas, como la restricción.
DISCUSIÓN Y PREGUNTAS
Calcule la cantidad máxima de ADN que se espera de este protocolo. Supongamos que el
cultivo inicial tenía una densidad celular de 5x109 células/ml. El genoma de E. coli tiene
una longitud de 4,7 Mb y el peso molecular de un par de nucleótidos es de
aproximadamente 600 daltons: