PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA
AISLAMIENTO DE ADN BACTERIANO

PRÁCTICA

AISLAMIENTO DE ADN GENÓMICO DE BACTERIAS

Debido al gran tamaño y la naturaleza frágil del ADN cromosómico, es poco

probable que alguien lo haya aislado alguna vez en forma intacta y sin
daños. Se han desarrollado varios procedimientos de aislamiento que
proporcionan ADN en una forma biológicamente activa, pero esto no
significa que esté completamente intacto. Estas preparaciones de ADN son
estables, de alto peso molecular y relativamente libres de ARN y proteínas.
Aquí se describirá un método general para el aislamiento de ADN en una
forma estable y biológicamente activa a partir de microorganismos. El
procedimiento descrito es aplicable a muchos microorganismos y puede
modificarse según sea necesario.

El diseño de un procedimiento de aislamiento de ADN requiere un amplio

conocimiento de la estabilidad química del ADN, así como de su condición
en el entorno celular. Varios enlaces químicos pueden ser susceptibles de
romperse durante el proceso de extracción. A continuación, se describen
los factores experimentales que deben considerarse y sus efectos sobre
diversos aspectos estructurales del ADN intacto.

1.pH
• Los enlaces de hidrógeno entre las hebras complementarias son
estables entre pH 4 y 10.
• Los enlaces fosfodiéster en la estructura del ADN son estables entre pH
3 y 12.
• Los enlaces N-glucósidos con bases purínicas (adenina y guanina) se
hidrolizan a valores de pH de 3 y menos.

2. Temperatura
• Existe una variación considerable en la estabilidad térmica de los
enlaces de hidrógeno en la doble hélice, pero la mayor parte del ADN
comenzará a desenrollarse en el rango de 80 a 90 °C.
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3. Fuerza iónica
• El ADN es más estable y soluble en soluciones salinas. Las
concentraciones de sal inferiores a 0,1 M debilitan los enlaces de
hidrógeno entre hebras complementarias.

4. Condiciones celulares
• Antes de que se pueda liberar el ADN, se debe lisar la pared celular
bacteriana. La facilidad con la que se rompe la pared celular varía de un
organismo a otro. En algunos casos (levadura), se requiere una trituración
extensa o un tratamiento sónico, mientras que en otros (B. subtilis), es
posible la hidrólisis enzimática de la pared celular.

• En la célula hay varias enzimas que pueden actuar para degradar el

ADN, pero el daño más grave lo causan las desoxirribonucleasas. Estas
enzimas catalizan la hidrólisis de enlaces fosfodiéster.
• El ADN nativo está presente en la célula como complejos ADN-
proteína. Las proteínas (proteínas básicas llamadas histonas) deben
disociarse durante el proceso de extracción.

5. Estrés mecánico en el ADN

• Es posible que no siempre sea posible realizar manipulaciones
suaves durante el proceso de aislamiento. Moler, agitar, agitar y otros
procedimientos disruptivos pueden provocar la escisión (cizallamiento o
escisión) de las cadenas de ADN. Por lo general, esto no causa daño a la
estructura secundaria del ADN, pero sí reduce la longitud de las moléculas.

Ahora que se comprenden estos factores, se puede delinear un

procedimiento general de extracción de ADN:

Paso 1. Rotura de la membrana celular y liberación del ADN en un

medio en el que sea soluble y esté protegido de la degradación.

El procedimiento de aislamiento que se describe aquí requiere el uso de

una enzima, la lisozima, para alterar la membrana celular. La lisozima
cataliza la hidrólisis de los enlaces glicosídicos en los carbohidratos de la
pared celular, provocando así la destrucción de la membrana externa y la
liberación de ADN y otros componentes celulares. El medio para la solución
de ADN es una solución salina tamponada que contiene EDTA. El ADN, al
ser iónico, es más soluble y estable en solución salina que en agua
destilada. El EDTA tiene al menos dos propósitos. Primero, se une a iones
metálicos divalentes (Cd, Mg2+, manganeso2+) que podrían formar sales con
los grupos fosfato aniónicos del ADN. En segundo lugar, inhibe las
desoxirribonucleasas que necesitan Mg.2+o manganeso2+. Ocasionalmente
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se ha utilizado citrato como agente quelante para la extracción de ADN; sin

embargo, no es un agente eficaz para unir Mn. 2+. El medio ligeramente
alcalino (pH 8) actúa para reducir la interacción electrostática entre el ADN
y las histonas básicas y las aminas policatiónicas, espermina y
espermidina. El pH relativamente alto también tiende a disminuir la
actividad nucleasa y a desnaturalizar otras proteínas.

Paso 2. Disociación de los complejos proteína-ADN.

En esta etapa se utilizan detergentes para interrumpir las interacciones

iónicas entre las histonas cargadas positivamente y la columna vertebral
del ADN cargada negativamente. El dodecilsulfato de sodio (SDS), un
detergente aniónico, se une a las proteínas y les confiere un carácter
aniónico extenso. Una acción secundaria del SDS es actuar como
desnaturalizante de desoxirribonucleasas y otras proteínas. También
favorece la disociación de los complejos proteína-ADN el pH alcalino, que
reduce el carácter positivo de las histonas. Para asegurar la disociación
completa del complejo ADN-proteína y eliminar las aminas catiónicas
unidas, se añade una alta concentración de una sal (NaCl o perclorato de
sodio). La sal actúa disminuyendo las interacciones iónicas entre el ADN y
los cationes.

Paso 3. Separación del ADN de otros componentes celulares solubles.

Antes de que el ADN precipite, la solución debe desproteinizarse. Esto se

consigue mediante tratamiento con cloroformo/alcohol isoamílico y seguido
de centrifugación. Tras la centrifugación se producen tres capas:

• Una fase acuosa superior, una capa orgánica inferior y una banda
compacta de proteína desnaturalizada en la interfaz entre las fases
acuosa y orgánica. El cloroformo provoca la desnaturalización
superficial de las proteínas. El alcohol isoamílico reduce la formación de
espuma y estabiliza la interfaz entre la fase acuosa y las fases
orgánicas donde se acumula la proteína.

• A continuación, se separa la fase acuosa superior que contiene ácidos

nucleicos y el ADN se precipita mediante adición de etanol. Debido a la
naturaleza iónica del ADN, se vuelve insoluble si el medio acuoso se
vuelve menos polar mediante la adición de un disolvente orgánico. El
ADN forma un precipitado filiforme que puede recogerse "enrollándolo"
en una varilla de vidrio. El ADN aislado aún puede estar contaminado
con proteínas y ARN. La proteína se puede eliminar disolviendo el ADN
enrollado en medio salino y repitiendo el tratamiento con
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cloroformo/alcohol isoamílico hasta que no se acumule más proteína

desnaturalizada en la interfaz.

El ARN normalmente no precipita como el ADN, pero aun así podría ser un
contaminante menor. El ARN puede degradarse durante el procedimiento
mediante tratamiento con ribonucleasa después del primer o segundo paso
de desproteinización. Alternativamente, el ADN se puede precipitar con
isopropanol, lo que deja

ARN en solución. La eliminación del ARN a veces permite desnaturalizar

más proteínas utilizando cloroformo/alcohol isoamílico. Si se requiere ADN
en un estado altamente purificado, se pueden llevar a cabo varios pasos de
desproteinización y precipitación con alcohol. Se estima que se aísla hasta
el 50% del ADN celular. El rendimiento promedio es de 1 a 2 mg por gramo
de células empacadas en húmedo.

PROTOCOLO

1. Inocular 50 ml de cultivo líquido (por ejemplo, caldo L) con E. coli

2. Cultivar, agitando, durante la noche a 37°C (si no se dispone de un
agitador al baño maría, será suficiente el crecimiento anaeróbico (es
decir, sin agitación) a temperatura ambiente).
3. Centrifugar el cultivo (esto debe hacerse con relativa suavidad, es decir,
aproximadamente 12000 rpm durante 5 minutos en una microcentrífuga).
4. Resuspender los pellets en 200µl solución salina-EDTA
5. Opcional: a la suspensión celular agregar 10 ml de lisozima e incubar 30
min. a 37°C
6. A la suspensión agregar: 100µFicha de datos de
seguridad (MSDS)
100µNaCl
50µl Proteinasa K
Incubar a 60°C durante al menos 1 hora y hasta 24 horas.
7. Agregue suavemente 2 volúmenes de etanol enfriado en congelador
vertiéndolo con cuidado por el costado del tubo para que forme una
capa encima de la suspensión acuosa. Espere y observe durante unos
5 minutos; el material blanco de aspecto fibroso que se forma en la
interfaz es ADN (junto con cualquier otra molécula grande
contaminante)
8. "Enrolle" con cuidado este precipitado sobre la varilla de vidrio. Coloque
el precipitado en el tubo de microcentrífuga; raspe el costado para
quitarlo, si es necesario. Se debe tener cuidado en este paso de no
"perder" el ADN; puede volverse bastante transparente y difícil de ver.
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9. Deje que el tubo repose abierto en la gradilla durante unos 5 minutos.

para dejar que el alcohol se evapore (es decir, cuando ya no pueda oler
el alcohol). Luego, añade con cuidado 100µl tampón TE y deje reposar
la suspensión a temperatura ambiente durante la noche o en el
refrigerador durante varios días para permitir que el ADN se resuspenda
por completo.

10. A la suspensión, agregar RNAsa e incubar 30 min a 37°C.

11. Añadir un volumen igual de cloroformo-alcohol isoayml; Mezcle
suavemente las dos capas de forma continua, a mano, durante unos 10
min. Centrifugar (aproximadamente 4000 rpm durante 2 minutos en una
microcentrífuga; alternativamente, la reacción de ARNasa y el paso de
extracción se pueden realizar en un tubo más grande adecuado para
usar en una centrífuga de mesa)

12. Retire con cuidado la fase no acuosa superior, junto con el material
blanco esponjoso en la interfaz (esto es principalmente proteína
desnaturalizada).
13. El paso de extracción con cloroformo y alcohol isoamílico se puede
realizar 2 o 3 veces más, si se desea, hasta que la interfaz blanca ya no
se vea.
14. Repita el paso de precipitación con etanol, descrito anteriormente, en la
fase acuosa final, incluida la resuspensión del ADN en tampón TE.

Fondo

El aislamiento de ADN es uno de los procedimientos más utilizados en

muchas áreas de la fisiología bacteriana, la genética, la biología molecular
y la bioquímica. El ADN purificado es necesario para muchas aplicaciones,
como el estudio de la estructura y la química del ADN, el examen de las
interacciones entre el ADN y las proteínas, realizando hibridaciones de
ADN, secuenciación o PCR, realizando diversos estudios genéticos o
clonación de genes. El aislamiento de ADN de bacterias es un proceso
relativamente sencillo. El organismo a utilizar debe cultivarse en un medio
favorable a una temperatura óptima y debe cosecharse desde la fase tardía
hasta la fase estacionaria temprana para obtener el máximo rendimiento.
Luego se pueden lisar las células y aislar el ADN mediante uno de varios
métodos. El método elegido depende en parte del organismo de interés y
del uso que se le dará al ADN después de la purificación. Después de la
lisis, se eliminan selectivamente otros constituyentes celulares.

Una vez logrado esto, el ADN puede precipitarse a partir de una solución
con alcohol y disolverse en un tampón apropiado.
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La lisis de las bacterias se inicia resuspendiendo un sedimento bacteriano

en un tampón que contiene lisozima y EDTA. Además de inhibir las
ADNasas, el EDTA altera la membrana externa de la envoltura de los
gramnegativos eliminando el Mg.2+de la capa de lipopolisacárido. Esto
permite que la lisozima acceda al peptidoglicano. Después de la alteración
parcial del peptidoglicano, se añade un detergente como el SDS para lisar
las células. La mayoría de las células gramnegativas se lisarán después de
este tratamiento y muchas incluso pueden lisarse sin lisozima. Una vez
lisadas las células, la solución debe tratarse con cuidado para evitar la
rotura de las cadenas de ADN.

Los pasos posteriores implican la separación del ADN de otras

macromoléculas en el lisado. Tanto el fenol (que se ha equilibrado con
tampón Tris) como el cloroformo (con alcohol isoamílico como agente
antiespumante) se utilizan comúnmente para disociar proteínas de ácidos
nucleicos. Estos reactivos también eliminan lípidos y algunos polisacáridos.
A menudo se añaden enzimas proteolíticas como la pronasa o la
proteinasa K para eliminar aún más las proteínas. La proteinasa K es una
enzima particularmente útil porque no se desnaturaliza con el SDS y, de
hecho, funciona más eficazmente en presencia de SDS. Luego, los ácidos
nucleicos (incluido el ARN) se pueden precipitar en etanol helado si la
fuerza iónica de la solución es alta. A esto le sigue el tratamiento con
ARNasa para degradar el ARN. A continuación, se puede volver a precipitar
la solución con etanol. En esta precipitación, los ribonucleótidos del
tratamiento con RNasa permanecerán en solución dejando ADN purificado
en el sedimento. A continuación, el sedimento se puede disolver en un
tampón apropiado.

Las precipitaciones con alcohol de ADN y ARN se utilizan ampliamente en

biología molecular y son valiosas porque permiten concentrar los ácidos
nucleicos eliminándolos de la solución en forma de gránulos insolubles. Si
las concentraciones de ADN son relativamente altas (>1µg/ml) El ADN se
puede precipitar eficazmente en
10-15 minutos protegiendo la carga negativa con cationes monovalentes
(comúnmente se usan iones de Na 0,3 M o amonio 2,5 M), seguido de la
adición de 2 volúmenes de etanol al 95 %. Los factores que afectan las
precipitaciones de alcohol se detallan a continuación.

Una consideración importante en cualquier procedimiento de aislamiento

de ADN es la inhibición o inactivación de las ADNasas que pueden
hidrolizar el ADN. El tampón en el que se suspenden las células debe tener
un pH alto (8,0 o superior), que esté por encima del óptimo de la mayoría
de las ADNasas. EDTA también se incluye en el tampón de resuspensión
para quelar cationes divalentes (como Mg2+) que son requeridos por las
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ADNasas. El SDS también reduce la actividad de la ADNasa al

desnaturalizar estas enzimas. La actividad de la ADNasa se controla aún
más manteniendo las células y los reactivos fríos, utilizando enzimas
proteolíticas como la pronasa o la proteinasa K, y un paso de
calentamiento que desnaturalizará térmicamente la ADNasa (pero no debe
estar lo suficientemente caliente como para desnaturalizar el ADN).

El procedimiento utilizado aquí es útil para aislar ADN de una gran variedad
de bacterias gramnegativas. Produce ADN parcialmente purificado de
calidad suficiente para la mayoría de las técnicas, como la restricción.

digestión, ligación y clonación. Es posible que se requiera una purificación

adicional mediante extracción con disolvente adicional para experimentos
que necesiten ADN más puro (por ejemplo, estudios fisicoquímicos como
curvas de fusión, etc.)

DISCUSIÓN Y PREGUNTAS

1. Justificación de cada paso.

a. Las células deben resuspenderse en el tampón (algunos

protocolos exigen lavar las células en el tampón). - - es decir,
resuspender y centrifugar --- 2 o 3 veces) para que la fuerza
iónica de la solución sea compatible con las biomoléculas, en
particular, la sal y el pH. El EDTA es un agente quelante que
une iones metálicos divalentes; Estos iones suelen ser
cofactores necesarios para la acción de las ADNasas, enzimas
presentes en la célula que, cuando se liberan por lisis junto con
el ADN, pueden degradarlo.

b. SDS es un detergente iónico que lisará la mayoría de las

células y desnaturalizará algunas proteínas. C. La lisozima se
utiliza para lisar células resistentes al detergente.
d. El aumento de la fuerza iónica mediante la adición de NaCl 5 M
proporciona un entorno en el que la interacción ADN-proteína, que a
menudo se produce mediante interacciones iónicas, se neutraliza
termodinámicamente por la presencia de otros iones. Esto ayuda a
disociar las proteínas del ácido nucleico.

mi. La proteinasa K es una enzima ubicua que degrada proteínas.

Puede funcionar en presencia de detergente y a temperaturas
elevadas. Las temperaturas elevadas se utilizan para desnaturalizar
las ADNasas y facilitar la disociación ADN-proteína.
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F. El etanol reduce la concentración efectiva de agua, lo que hace

que grandes biomoléculas se interpenetren y agreguen. El resultado
es un precipitado visible en la interfaz, donde se concentra el
etanol. A medida que el ADN se precipita y se elimina, más se
expone al etanol y precipitará.

gramo. El ADN debe rehidratarse completamente antes de formar

una suspensión uniforme. Esto puede llevar mucho tiempo,
dependiendo de la concentración del ADN. Puede facilitarse
comenzando con un tampón de baja fuerza iónica y, una vez
resuspendido, agregando una cantidad adecuada de tampón
concentrado para llevar el tampón a la fuerza iónica correcta.

h. El cloroformo-alcohol isoamílico se utiliza para desproteinizar (se

llama "procedimiento Sevag" en honor a la persona que lo
desarrolló y utilizó por primera vez en 1938). El cloroformo provoca
la desnaturalización superficial de las proteínas; el alcohol
isoamílico reduce la formación de espuma, ayuda a la separación y
mantiene la estabilidad de la capa de la solución centrifugada y
desproteinizada.

2. ¿Qué harías para demostrar que el material precipitante es realmente ADN?

¿Cómo cuantificarías la cantidad?

Calcule la cantidad máxima de ADN que se espera de este protocolo. Supongamos que el
cultivo inicial tenía una densidad celular de 5x109 células/ml. El genoma de E. coli tiene
una longitud de 4,7 Mb y el peso molecular de un par de nucleótidos es de
aproximadamente 600 daltons:

3. ¿Cuáles son los principales contaminantes de la preparación? ¿Cómo medirías

sus concentraciones?
4. Si derrama SDS sobre su piel, uñas o cabello, ¿se disolverían? ¿Por qué?
5. ¿Cómo se podría evaluar la actividad de la Proteinasa K?
6. ¿Qué hace la lisozima en este protocolo? ¿Dónde se produce naturalmente y cuál
es su función?