El documento describe los pasos para extraer ADN y realizar una electroforesis. La extracción de ADN involucra lisar células, separar el ADN de otras moléculas mediante precipitación con alcohol. La electroforesis separa fragmentos de ADN basado en su tamaño a través de un gel de agarosa aplicando un voltaje eléctrico, permitiendo analizar el ADN extraído.
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El documento describe los pasos para extraer ADN y realizar una electroforesis. La extracción de ADN involucra lisar células, separar el ADN de otras moléculas mediante precipitación con alcohol. La electroforesis separa fragmentos de ADN basado en su tamaño a través de un gel de agarosa aplicando un voltaje eléctrico, permitiendo analizar el ADN extraído.
El documento describe los pasos para extraer ADN y realizar una electroforesis. La extracción de ADN involucra lisar células, separar el ADN de otras moléculas mediante precipitación con alcohol. La electroforesis separa fragmentos de ADN basado en su tamaño a través de un gel de agarosa aplicando un voltaje eléctrico, permitiendo analizar el ADN extraído.
El documento describe los pasos para extraer ADN y realizar una electroforesis. La extracción de ADN involucra lisar células, separar el ADN de otras moléculas mediante precipitación con alcohol. La electroforesis separa fragmentos de ADN basado en su tamaño a través de un gel de agarosa aplicando un voltaje eléctrico, permitiendo analizar el ADN extraído.
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EXTRACCIÓN DE ADN
I. FUNDAMENTO
El ADN es un polímero de desoxiribonucleótidos, que en eucariotes es el
componente de la cromatina o material genético. En la cromatina el ADN se encuentra como una doble hebra asociado a proteínas conocidas como nucleoproteínas de tipo histonas, protaminas y en menor proporción con proteínas de tipo ácidas. Para extraer el ADN sin arrastrar sus proteínas asociadas se podría emplear soluciones ácidas. Sin embargo, éstas soluciones podrían dañar la estructura de la hebra, de modo que se prefiere emplear solventes orgánicos como cloroformo, el cual extrae proteínas dejando insoluble al ADN.
La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de
que los iones salinos son atraídos hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolución y posterior extracción de la célula. Se empieza por lisar (romper) las células mediante un detergente, vaciándose su contenido molecular en una disolución tampón en la que se disuelve el ADN. En ese momento, el tampón contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, proteínas y otras sustancias en menor proporción.
Las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrán
fraccionado en cadenas más pequeñas y separadas de él por acción del detergente. Sólo queda, por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampón y detergente. La secuencia general de extracción es la siguiente:
1. Liberación del ADN en forma soluble por medio de la destrucción
de los sistemas membranosos de los tejidos (membrana celular y nuclear). 2. Separación de los complejos de nucleoproteína por desnaturalización de la parte proteica. 3. Separación del ADN de las otras macromoléculas por solubilidad diferencial. 4. Precipitación del ADN por insolubilidad en alcohol y bajas temperaturas.
A). Homogenización del Tejido
El método para desintegrar el tejido debe estar adaptado a las
características de éste. Para grandes volúmenes de tejidos blandos, suelen usarse licuadoras esencialmente iguales a las licuadoras domésticas. Para volúmenes menores, en general es suficiente un MORTERO y un pilón.
Tejidos más resistentes, como por ejemplo hueso o diente, necesitan
tratamientos mecánicos especiales. Aquellos tejidos con células cuya pared celular es resistente, como por ejemplo vegetales, hongos o bacterias, requieren también condiciones drásticas. Uno de los métodos más utilizados consiste en congelar la muestra en nitrógeno líquido y, manteniéndola congelada, pulverizarla con un mortero. Así, además de desintegrar la muestra, se logra que ésta se mantenga a muy baja temperatura durante el tratamiento, con lo cual se evita la acción de enzimas endógenas que pudieran degradar el material de interés.
En esta práctica se empleará un método de ruptura con mortero (sin
congelamiento). La principal ventaja de este método es que se adapta bastante bien a tejidos muy diversos. Asimismo, dado que se opera a temperatura ambiente, las ribonucleasas celulares pueden degradar parcialmente las moléculas de ARN. Para ayudar a la solubilización de los componentes celulares, a la ruptura de membranas y de complejos protéicos, la solución de lisis contendrá un detergente iónico (dodecilsulfato de sodio, SDS). Este detergente dispersa los componentes de las membranas y desnaturaliza las proteínas.
La solución de lisis contiene además el agente quelante de cationes
divalentes, EDTA. Esto
impide la acción de las ADNasas (dependientes de Mg2+ ), aunque no
tiene efectos sobre la mayor parte de las ribonucleasas. Seguir los siguientes pasos:
1 Las células se homogenizarán en un mortero empleando el medio de
homogenización. ES OBLIGATORIO el uso de guantes en todo momento para evitar la contaminación de la muestra con DNAasa proveniente del sudor de las manos que pueda degradar nuestras muestras de ADN.
2 Se lisarán las células agregando 10 ml de la solución de
homogenización por cada gramo de tejido con que se inició el proceso. Los componentes como el SDS, permitirá por una parte la separación de las proteínas asociadas a la cromatina y por otra parte la ruptura de membranas. El NaCl produce el estallido de los núcleos para liberar así las fibras de cromatina. El EDTA es un agente quelante que inactiva a las DNAasas.
3 Incubar la mezcla en un Baño María a 60°C por 15-20 min. exactos. El
calor ablandará el tejido permitiendo que los componentes de la solución homogenizadora ingrese a la célula. Además, esta temperatura denatura muchas enzimas que interfieren con el procedimiento.
4 Filtrar el homogenizado empleando la gasa estéril
5 Enfriar rápidamente la preparación filtrada en una cubeta con hielo,
por 10 minutos a fin de detener cualquier proceso degradativo del ADN.
B) Precipitación del ADN
La precipitación de los ácidos nucleicos permite su purificación y
concentración. Se basa en la simultánea neutralización de las cargas negativas y deshidratación de la molécula, lo cual posibilita su agregación y precipitación.
La precipitación es un fenómeno reversible (mediante la resuspensión
en soluciones acuosas) y no debe ser confundido ni con la desnaturalización (potencialmente reversible) ni con la degradación (irreversible) de los mismos.
Efectuar los siguientes pasos:
1 Lentamente, agregar etanol helado por el borde interno del recipiente
hasta que comience a aparecer una consistencia blanca que significa que el ADN ha precipitado.
2 Suavemente, a medida que se agrega el etanol helado, girar
enrollando a la vez con una bagueta de vidrio. 3 Reconoce 3 fases en tu solución: la del alcohol (que flota en agua), la de tu tejido triturado (abajo del todo) y la interfase entre los 2 que contiene ADN precipitado.
4 Poco a poco haciendo estos movimientos en una sola dirección, se
logrará apreciar el ADN en la bagueta, asemejando una madeja de un hilo sumamente fino o como copos de algodón.
Nota importante. El producto filamentoso obtenido de esta extracción
no es ADN puro ya que, entremezclado con él, hay fragmentos de ARN. Una extracción especifica se realiza añadiendo enzimas que fragmentan las moléculas de ARN (protocolos de PURIFICACIÓN de ADN).
SEGUNTA PARTE: ELECTROFORESIS
I. FUNDAMENTO
El problema de realizar separaciones de biomoléculas grandes es
enfrentado frecuentemente en las ciencias de la vida, tanto para análisis cuali- como cuantitativos de mezclas o de preparaciones individuales. En la mayoría de casos es deseable causar el mínimo de daño a las moléculas de manera que sus propiedades no cambien de manera significativa. Los métodos actuales para la separación de biomoléculas descansan por lo tanto en procesos físicos que causan el mínimo de desnaturalización, lo cual resulta en la máxima retención de cualquier actividad biológica. Un gran grupo de métodos de separación están basados en algunas propiedades químicas o biológicas, o en interacciones de la molécula que se investiga, y algunas otras están basadas en diferencias en pesos moleculares o cargas netas, o a veces una combinación de las dos propiedades. Los métodos electroforéticos pueden diseñar se para explotar cualquiera de los dos, o ambos parámetros, aunque las diferencias en tamaño son las principales en el caso de las separaciones de ácidos nucleicos.
La electroforesis en geles de agarosa es una técnica común en los
laboratorios de Biología Molecular. El proceso consiste en la aplicación de una diferencia de voltaje a una muestra de ADN que se encuentra inmersa en un gel de agarosa, y esta a su vez en bañada por un buffer determinado. La generación de campo magnético provoca la migración del ADN del polo cargado negativamente (Cátodo) al polo cargado positivamente (Ánodo), debido a que el ADN tiene una carga neta negativa. Los geles de agarosa son el medio más popular para separaciones electroforéticas de ácidos nucleicos ya que actúan como especie de red regulando la migración en función al tamaño y forma de la molécula. Las concentraciones más típicas de agarosa van de 0.3 hasta 2.5 %, y esta concentración depende de los tamaños de los ácidos nucleicos a separar. Aunque los geles de agarosa carecen de fuerza mecánica (especialmente los más diluidos), la manipulación se facilita por el uso de geles horizontales, los cuales pueden ser soportados por lámina de vidrio o de plástico.
El gel resultante es fotografiado en un aparato llamado transiluminador,
presencia de bromuro de etidio (cancerígeno), para poner en evidencia los fragmentos de ADN en el gel. En la presente práctica analizaremos la fotografía de un gel de agarosa y observaremos las distintas bandas de ADN que en él aparecen, discutiendo la razón por las que unas aparecen más arriba que otras. Realizaremos un análisis como el que se hace en ensayos de diagnóstico molecular y de clonación.