Lectura 12

EXTRACCIÓN DE ADN
I. FUNDAMENTO
El ADN es un polímero de desoxiribonucleótidos, que en eucariotes es el

componente de la cromatina o material genético. En la cromatina el
ADN se encuentra como una doble hebra asociado a proteínas
conocidas como nucleoproteínas de tipo histonas, protaminas y en
menor proporción con proteínas de tipo ácidas. Para extraer el ADN sin
arrastrar sus proteínas asociadas se podría emplear soluciones ácidas.
Sin embargo, éstas soluciones podrían dañar la estructura de la hebra,
de modo que se prefiere emplear solventes orgánicos como cloroformo,
el cual extrae proteínas dejando insoluble al ADN.
La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de

que los iones salinos son atraídos hacia las cargas negativas del ADN,
permitiendo su disolución y posterior extracción de la célula. Se empieza
por lisar (romper) las células mediante un detergente, vaciándose su
contenido molecular en una disolución tampón en la que se disuelve el
ADN. En ese momento, el tampón contiene ADN y todo un surtido de
restos moleculares: ARN, carbohidratos, proteínas y otras sustancias en
menor proporción.
Las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrán

fraccionado en cadenas más pequeñas y separadas de él por acción
del detergente. Sólo queda, por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de
tampón y detergente.
La secuencia general de extracción es la siguiente:
1. Liberación del ADN en forma soluble por medio de la destrucción

de los sistemas membranosos de los tejidos (membrana celular y
nuclear).
2. Separación de los complejos de nucleoproteína por
desnaturalización de la parte proteica.
3. Separación del ADN de las otras macromoléculas por solubilidad
diferencial.
4. Precipitación del ADN por insolubilidad en alcohol y bajas
temperaturas.
A). Homogenización del Tejido
El método para desintegrar el tejido debe estar adaptado a las

características de éste. Para grandes volúmenes de tejidos blandos,
suelen usarse licuadoras esencialmente iguales a las licuadoras
domésticas. Para volúmenes menores, en general es suficiente un
MORTERO y un pilón.
Tejidos más resistentes, como por ejemplo hueso o diente, necesitan

tratamientos mecánicos especiales. Aquellos tejidos con células cuya
pared celular es resistente, como por ejemplo vegetales, hongos o
bacterias, requieren también condiciones drásticas. Uno de los métodos
más utilizados consiste en congelar la muestra en nitrógeno líquido y,
manteniéndola congelada, pulverizarla con un mortero. Así, además de
desintegrar la muestra, se logra que ésta se mantenga a muy baja
temperatura durante el tratamiento, con lo cual se evita la acción de
enzimas endógenas que pudieran degradar el material de interés.
En esta práctica se empleará un método de ruptura con mortero (sin

congelamiento). La principal ventaja de este método es que se adapta
bastante bien a tejidos muy diversos. Asimismo, dado que se opera a
temperatura ambiente, las ribonucleasas celulares pueden degradar
parcialmente las moléculas de ARN. Para ayudar a la solubilización de
los componentes celulares, a la ruptura de membranas y de complejos
protéicos, la solución de lisis contendrá un detergente iónico
(dodecilsulfato de sodio, SDS). Este detergente dispersa los
componentes de las membranas y desnaturaliza las proteínas.
La solución de lisis contiene además el agente quelante de cationes

divalentes, EDTA. Esto
impide la acción de las ADNasas (dependientes de Mg2+ ), aunque no

tiene efectos sobre la mayor parte de las ribonucleasas.
Seguir los siguientes pasos:
1 Las células se homogenizarán en un mortero empleando el medio de

homogenización. ES OBLIGATORIO el uso de guantes en todo momento
para evitar la contaminación de la muestra con DNAasa proveniente
del sudor de las manos que pueda degradar nuestras muestras de ADN.
2 Se lisarán las células agregando 10 ml de la solución de

homogenización por cada gramo de tejido con que se inició el proceso.
Los componentes como el SDS, permitirá por una parte la separación de
las proteínas asociadas a la cromatina y por otra parte la ruptura de
membranas. El NaCl produce el estallido de los núcleos para liberar así
las fibras de cromatina. El EDTA es un agente quelante que inactiva a las
DNAasas.
3 Incubar la mezcla en un Baño María a 60°C por 15-20 min. exactos. El

calor ablandará el tejido permitiendo que los componentes de la
solución homogenizadora ingrese a la célula. Además, esta
temperatura denatura muchas enzimas que interfieren con el
procedimiento.
4 Filtrar el homogenizado empleando la gasa estéril
5 Enfriar rápidamente la preparación filtrada en una cubeta con hielo,

por 10 minutos a fin de detener cualquier proceso degradativo del ADN.
B) Precipitación del ADN
La precipitación de los ácidos nucleicos permite su purificación y

concentración. Se basa en la simultánea neutralización de las cargas
negativas y deshidratación de la molécula, lo cual posibilita su
agregación y precipitación.
La precipitación es un fenómeno reversible (mediante la resuspensión

en soluciones acuosas) y no debe ser confundido ni con la
desnaturalización (potencialmente reversible) ni con la degradación
(irreversible) de los mismos.
Efectuar los siguientes pasos:
1 Lentamente, agregar etanol helado por el borde interno del recipiente

hasta que comience a aparecer una consistencia blanca que significa
que el ADN ha precipitado.
2 Suavemente, a medida que se agrega el etanol helado, girar

enrollando a la vez con una bagueta de vidrio.
3 Reconoce 3 fases en tu solución: la del alcohol (que flota en agua), la
de tu tejido triturado (abajo del todo) y la interfase entre los 2 que
contiene ADN precipitado.
4 Poco a poco haciendo estos movimientos en una sola dirección, se

logrará apreciar el ADN en la bagueta, asemejando una madeja de un
hilo sumamente fino o como copos de algodón.
Nota importante. El producto filamentoso obtenido de esta extracción

no es ADN puro ya que, entremezclado con él, hay fragmentos de ARN.
Una extracción especifica se realiza añadiendo enzimas que
fragmentan las moléculas de ARN (protocolos de PURIFICACIÓN de
ADN).
SEGUNTA PARTE: ELECTROFORESIS

I. FUNDAMENTO
El problema de realizar separaciones de biomoléculas grandes es

enfrentado frecuentemente en las ciencias de la vida, tanto para
análisis cuali- como cuantitativos de mezclas o de preparaciones
individuales. En la mayoría de casos es deseable causar el mínimo de
daño a las moléculas de manera que sus propiedades no cambien de
manera significativa. Los métodos actuales para la separación de
biomoléculas descansan por lo tanto en procesos físicos que causan el
mínimo de desnaturalización, lo cual resulta en la máxima retención de
cualquier actividad biológica. Un gran grupo de métodos de
separación están basados en algunas propiedades químicas o
biológicas, o en interacciones de la molécula que se investiga, y
algunas otras están basadas en diferencias en pesos moleculares o
cargas netas, o a veces una combinación de las dos propiedades. Los
métodos electroforéticos pueden diseñar se para explotar cualquiera
de los dos, o ambos parámetros, aunque las diferencias en tamaño son
las principales en el caso de las separaciones de ácidos nucleicos.
La electroforesis en geles de agarosa es una técnica común en los

laboratorios de Biología Molecular. El proceso consiste en la aplicación
de una diferencia de voltaje a una muestra de ADN que se encuentra
inmersa en un gel de agarosa, y esta a su vez en bañada por un buffer
determinado. La generación de campo magnético provoca la
migración del ADN del polo cargado negativamente (Cátodo) al polo
cargado positivamente (Ánodo), debido a que el ADN tiene una carga
neta negativa.
Los geles de agarosa son el medio más popular para separaciones
electroforéticas de ácidos nucleicos ya que actúan como especie de
red regulando la migración en función al tamaño y forma de la
molécula. Las concentraciones más típicas de agarosa van de 0.3 hasta
2.5 %, y esta concentración depende de los tamaños de los ácidos
nucleicos a separar. Aunque los geles de agarosa carecen de fuerza
mecánica (especialmente los más diluidos), la manipulación se facilita
por el uso de geles horizontales, los cuales pueden ser soportados por
lámina de vidrio o de plástico.
El gel resultante es fotografiado en un aparato llamado transiluminador,

presencia de bromuro de etidio (cancerígeno), para poner en
evidencia los fragmentos de ADN en el gel. En la presente práctica
analizaremos la fotografía de un gel de agarosa y observaremos las
distintas bandas de ADN que en él aparecen, discutiendo la razón por
las que unas aparecen más arriba que otras. Realizaremos un análisis
como el que se hace en ensayos de diagnóstico molecular y de
clonación.

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EXTRACCIÓN DE ADN

El ADN es un polímero de desoxiribonucleótidos, que en eucariotes es el

La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de

Las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrán

1. Liberación del ADN en forma soluble por medio de la destrucción

A). Homogenización del Tejido

El método para desintegrar el tejido debe estar adaptado a las

Tejidos más resistentes, como por ejemplo hueso o diente, necesitan

En esta práctica se empleará un método de ruptura con mortero (sin

La solución de lisis contiene además el agente quelante de cationes

impide la acción de las ADNasas (dependientes de Mg2+ ), aunque no

1 Las células se homogenizarán en un mortero empleando el medio de

2 Se lisarán las células agregando 10 ml de la solución de

3 Incubar la mezcla en un Baño María a 60°C por 15-20 min. exactos. El

4 Filtrar el homogenizado empleando la gasa estéril

5 Enfriar rápidamente la preparación filtrada en una cubeta con hielo,

B) Precipitación del ADN

La precipitación de los ácidos nucleicos permite su purificación y

La precipitación es un fenómeno reversible (mediante la resuspensión

Efectuar los siguientes pasos:

1 Lentamente, agregar etanol helado por el borde interno del recipiente

2 Suavemente, a medida que se agrega el etanol helado, girar

4 Poco a poco haciendo estos movimientos en una sola dirección, se

Nota importante. El producto filamentoso obtenido de esta extracción

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