Manual de Practicas de Laboratorio Microbiología General IB Plan 2016 - Versión Final

Manual de Prácticas de Laboratorio de Microbiología General para IB plan 2016
Manual de Prácticas de Laboratorio de

Microbiología General IB plan 2016
Nombre del alumno: __________________________________________________

ID: _________________________________________________________________
Carrera: ____________________________________________________________
Semestre: __________________________________________________________
Equipo No. _________________________________________________________
Nombre del profesor: _________________________________________________
Manual de Prácticas de Laboratorio de

Microbiología General IB plan 2016
Autores
Dr. Ernesto Uriel Cantú Soto
Dra. Olga Nydia Campas Baypoli
MI. Anacleto Félix Fuentes
Dr. Alejandro Miguel Figueroa López
MI. Andrés Francisco Chávez Almanza
MC. Julio Armando Anduro Jordan
MC. Dante Alejandro Ruíz Vega
Instituto Tecnológico de Sonora

2018
Primera edición, 2018
D.R. © 2018, Instituto Tecnológico de Sonora

Dirección Académica de la División de Recursos Naturales
Departamento de Biotecnología y Ciencias Alimentarias
Av. Antonio Caso s/n Col. Villa ITSON, C.P. 85130
Cd. Obregón, Sonora, México
ISBN:
Impreso y hecho en México

Printed and made in Mexico
ÍNDICE GENERAL
DESCRIPCIÓN Página
ÍNDICE GENERAL……………………………………………………………………… i
INTRODUCCIÓN GENERAL…………………………………….……………………. ii
PROTOCOLO DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO…………………………. iii
RECOMENDACIONES PARA EVALUACIÓN……………………………………… vi
PRÁCTICA No. 1 Operaciones básicas para el uso de autoclave y horno de
1
calor seco………………………………...................................................................
PRÁCTICA No. 2 Limpieza, preparación y esterilización del material empleado
7
en el Laboratorio de Microbiología……….............................................................
PRÁCTICA No. 3 Tinción y preparación en fresco de microorganismos para su
12
observación………………………………………………………………………………
PRÁCTICA No. 4 Preparación y esterilización de medios de cultivo……………. 20
PRÁCTICA No. 5 Técnicas de siembra en medios de cultivo: observación y
26
características de crecimiento microbiano…………………………………………..
PRÁCTICA No. 6 Obtención de cultivos puros y crio preservación de
31
microorganismos………………………………….....................................................
PRÁCTICA No. 7 Perfil bioquímico bacteriano y efecto de factores
37
ambientales………………………………………………………………………………
PRÁCTICA No. 8 Viabilidad y Cinética de crecimiento de levaduras……………. 45
PRÁCTICA No. 9 Crecimiento radial y determinación de peso seco en cultivos

53
sumergidos de hongos …………………………………………………………………
PRÁCTICA No. 10 Calidad microbiológica del agua en procesos
58
biotecnológicos…………………………………………………………………………..
Bibliografía …...…………………………………………………………………………. 65
Anexos ……….…………………………………………………………………………. 67
ii
INTRODUCCIÓN GENERAL
El presente Manual de Laboratorio de Microbiología General está desarrollado para
que el alumno de la carrera de Ingeniería Biotecnológica desarrolle habilidades en el
manejo de herramientas básicas para el estudio de los diferentes grupos de
microorganismos de interés en procesos industriales catalíticos. La Microbiología es
una ciencia dinámica e interdisciplinaria que requiere de otras ciencias como la
Biología Molecular, Química, Biología Celular, y la Biotecnología; en esta disciplina
constantemente se incorpora conocimiento científico nuevo sobre las características
de los microorganismos, su ecología, comportamiento, así como el desarrollo cada
vez más acelerado de nuevas técnicas de identificación y caracterización de los
mismos.
El Manual contiene 10 actividades prácticas puntualmente definidas donde el
estudiante iniciará aprendiendo las operaciones básicas para el uso del autoclave y
horno de calor seco, limpieza, preparación y esterilización del material empleado en
el Laboratorio de Microbiología y la preparación de colorantes para realizar tinción y
preparación en fresco de microorganismos para su observación; posteriormente se
enfocará en el conocimiento profundo de los medios de cultivo a través de su
preparación, esterilización y uso para su empleo en la inoculación de bacterias,
levaduras y hongos mediante diversas técnicas de siembra y la obtención de cultivos
puros y crio preservación de dichos grupos. En las prácticas finales del manual el
estudiante se enfocará en la identificación bioquímica de bacterias, en el
establecimiento de la viabilidad y cinética de crecimiento de levaduras mediante
técnicas microscópicas y espectrofotométricas, así como el desarrollo de hongos
mediante crecimiento radial y la determinación de peso seco en cultivos sumergidos.
Por último, se utilizarán las técnicas adquiridas en la evaluación de la calidad
microbiana de agua para uso en procesos biotecnológicos y además de la
elaboración de un artículo científico y un cartel con características de presentación
en eventos científicos arbitrados.
El manual tiene como objetivos prioritarios el facilitar el aprendizaje de instrumentos
y técnicas comúnmente empleadas en Microbiología, mostrar la importancia de los
microrganismos en la vida diaria y algunas medidas para su control. Las actividades
contemplan la investigación mediante la sección de cuestionario para revisión y
discusión grupal, y requiere que el estudiante de Ingeniería Biotecnológica evalué
los resultados experimentales para ser capaz de obtener conclusiones de su
aprendizaje al término de cada actividad. Adicionalmente se pretende estimular el
razonamiento analítico y las habilidades prácticas mínimas necesarias para el
ejercicio de la Microbiología.
iii
PROTOCOLO DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

La seguridad es un factor importante en el Laboratorio de Microbiología, dado que se
trabaja con microorganismos potencialmente patógenos o que pueden causar daño
a la salud humana. Estudiantes e instructores deberán enfocarse en la necesidad de
implementar procedimientos de seguridad dentro del Laboratorio. La información a
continuación será una guía para cualquier usuario en el Laboratorio de
Microbiología, con el fin de reducir los riesgos y hacer seguro el ambiente de este
sitio.
Reglamento interno del laboratorio e indicaciones de seguridad.
Al cual se sujetarán los alumnos del Laboratorio de Microbiología General para IB

plan 2016.
1. El tiempo máximo de tolerancia para ingresar al laboratorio será de 15 minutos
posteriores a la hora programada para realizar la práctica.
2. Guarde sus pertenencias personales en el cajón de las gavetas, nunca los ponga
sobre la mesa de trabajo. Solo conservar manual de laboratorio, bitácora y pluma.
3. Los estudiantes deberán entrar siempre al laboratorio con bata blanca manga
larga, limpia y cerrada, además de pantalón y zapato cerrado.
4. Recoja su cabello antes de iniciar cualquier actividad dentro del Laboratorio de
Microbiología.
5. Cuando la práctica lo requiera deberá usarse cofia, cubre bocas, guantes, lentes
de seguridad o mascarilla.
6. No deberá comer ningún alimento, masticar chicle, ni fumar dentro del laboratorio.
7. No deberá pipetear con la boca reactivos, muestras de agua residual entre otras
matrices de riesgo a la salud; utilizar perillas microbiológicas o micropipetas y por
ningún motivo utilizar perillas del área de Química.
8. Acostumbrarse a no llevarse nunca a la boca lápices u otros objetos, ya que se
trabaja con microorganismos viables.
9. Manténgase constantemente limpia la mesa, así como los equipos de laboratorio
que use.
10. En caso de que un cultivo con microorganismos vivos se derrame avise
inmediatamente al instructor.
11. Todos los objetos sólidos no contaminados tales como algodón, papeles, cerillos
(apagados), deberán tirarse en los recipientes que con ese objeto existen en el
laboratorio.
12. En caso de accidente personal tales como cortadas o piquetes en los dedos o
caída de cultivo en los ojos, piel, tome acciones de salvaguarda y avise al instructor
del curso.
13. Al final de la práctica limpie y ponga el material y equipo en su sitio, así mismo
desinfecte cuidadosamente la mesa y su área de trabajo.
14. Antes de salir del laboratorio verifique que las llaves de gas y agua estén bien
cerradas y desconectados los aparatos eléctricos (excepto incubadoras y
refrigerador).
iv
15. Lave perfectamente sus manos con agua y jabón antes de salir del laboratorio,
además de desinfectarlas con etanol al 70%.
16. Conserve usted notas completas de los experimentos realizados en cada
práctica en la sección de notas del presente manual; el instructor del laboratorio
indicará la fecha máxima de entrega de reportes.
17. Queda estrictamente prohibido:
- Maltratar el material, equipos o infraestructura.
- Sustraer material que no sea del equipo de trabajo de hornos, incubadoras,
refrigeradores, ultracongeladores o gavetas.
- Excederse en el tiempo fijado en el horario de práctica.
- Realizar cualquier acto que motive el relajamiento de la disciplina o ponga en
riesgo la seguridad e integridad de los usuarios.
- Recibir visitas durante la realización de la práctica.
- Utilizar celulares, radios, audífonos o mp3 durante el desarrollo de las prácticas.
Manejo de Residuos Peligrosos.

Desecho de medios de cultivo inoculados.
Los medios de cultivo inoculados utilizados en las prácticas de laboratorio deben ser
tratados por métodos físicos o químicos que garanticen la eliminación de
microorganismos patógenos para su disposición final. Preferentemente utilizar
esterilización por calor húmedo a 121°C/15 psia por 15 minutos.
Manejo de derrames de cultivo.
Los cultivos microbianos derramados sobre las mesas de trabajo deben ser
cubiertos con solución de cloro al 2% o iodo a 200 mg/L por 20 minutos.
Posteriormente se debe retirar con papel toalla.
Nota. En caso de tocar los cultivos con manos o recibir salpicaduras en la piel aplicar
alcohol etílico al 70% hasta evaporación y lavar posteriormente con agua y jabón.
Manejo de sustancias químicas.
Los residuos de sustancias químicas no pueden ser reciclados, reutilizados o
arrojados al sistema de alcantarillado. El material peligroso debe ser colocado en
contenedores cerrados, sellados y etiquetados correctamente.
Los contenedores de residuos no deben exceder las 3/4 partes de su capacidad y
deben ser separados de acuerdo con el tipo de material, sean ácidos, inflamables o
bases.
Criterios para la bioseguridad en el laboratorio.
Todas las actividades prácticas de este manual de actividades en el laboratorio
pueden realizarse con microorganismos asignados en el nivel uno de bioseguridad
(BSL-1, por sus siglas en ingles); en algunos casos y con una estricta supervisión
del instructor podrán utilizarse BSL-2. En la tabla siguiente se muestran algunos
microorganismos y sus niveles de seguridad biológica:
v
Tabla 1. Niveles de seguridad biológica para algunos agentes infecciosos.

Nivel de
seguridad Riesgo Organismo
biológica
Achromobacter denitrificans,
Alcaligenes facecalis, Bacillus cereus,
Bacillus subtilis, Corynebacterium
No existe riesgo de pseudodiphtheriticum, Enterococcus
1
enfermedad en adultos sanos faecalis, Micrococcus luteus, Proteus
vulgaris, Pseudomona aeruginosa,
Staphylococcus epidermidis,
Staphylococcus saprophyticus
Representa un riesgo Enterobacter aerogenes, Escherichia
moderado para la salud en coli, Klebsiella pneumonie, Salmonella
adultos, poca probabilidad de entérica var. typhimurium, Shigella
2
diseminación a la comunidad; flexneri, Staphylococcus aureus,
existen tratamientos efectivos Streptococcus pneumonie,
disponibles con facilidad. Streptococcus pyogenes
Coxiell aburnetti, Pseudomonas mallei,
Pueden causar enfermedad en
Yersinia pestis, Ricketsia canadienses,
adultos sanos; pueden
Ricketsia prowaseki, Mycobacterium
3 diseminarse a la comunidad;
tuberculosis, Mycobacterium bovis,
existen tratamientos efectivos
Histoplasma capsulatum, Francisella
disponibles con facilidad.
tularensis
Causan enfermedad en
adultos sanos; poseen riesgo
4 Filovirus, Virus lassa, Virus mar
letal y no responden a vacunas
o terapia con antimicrobianos.
Fuente: Manual de actividades prácticas en Microbiología de Muñiz y cols., (2013).
vi
RECOMENDACIONES PARA EVALUACIÓN

1. El alumno deberá presentarse al laboratorio al inicio de cada práctica con el
presente manual de laboratorio, donde deberá traer debidamente estructurado el
diagrama de flujo y resuelto el cuestionario.
2. El alumno presentará y discutirá el cuestionario de la práctica, previo a la
realización de ésta.
3. El reporte final de cada práctica se realizará en equipo, para entregar al inicio de
la siguiente sesión. Dicho reporte deberá incluir, además de lo mencionado en el
punto 1, lo siguiente: resultados, discusión de resultados, conclusión y bibliografía,
con al menos 3 fuentes bibliográficas consultadas.
4. El alumno deberá presentarse al 100% de las sesiones de prácticas, sin
excepción.
5. Cuando menos se realizarán 2 evaluaciones por maestros de la academia de
Microbiología, la primera al finalizar la práctica 7 del presente manual y la segunda
en la semana 15 o 16 del semestre.
6. Por equipo se realizará un reporte en forma de artículo científico y se realizará
una exposición en cartel, la cual será evaluada por parte de los maestros de la
Academia de Microbiología.
7. La nota final del laboratorio será del acreditado (A) o no acreditado (NA).
vii
PRÁCTICA No. 1
Operaciones básicas para el uso de autoclave y horno de calor seco
I. OBJETIVO
Realizar la operación de autoclaves y hornos de calor seco siguiendo las
indicaciones de los manuales técnicos con el fin de esterilizar medios de cultivo, reactivos y
material de vidrio del área de Microbiología.
II. INTRODUCCIÓN
La esterilización es la eliminación completa de cualquier forma de vida y existen
varios métodos para llevarla a cabo.
En el caso específico del calor húmedo, el equipo empleado es el autoclave, la cual
es un recipiente de presión metálico de paredes gruesas con un cierre hermético que
permite trabajar a alta presión para realizar una reacción industrial, una cocción o
una esterilización con vapor de agua. Su construcción debe ser tal que resista la presión y
temperatura desarrollada en su interior. La presión elevada permite que el agua alcance
temperaturas superiores a los 100 °C. La acción conjunta de la temperatura y el vapor
produce la coagulación de las proteínas de los microorganismos, entre ellas las esenciales
para la vida y la reproducción de éstos, hecho que lleva a su destrucción.
En el ámbito industrial, equipos que funcionan por el mismo principio tienen otros
usos, aunque varios se relacionan con la destrucción de los microorganismos con fines
de conservación de alimentos, medicamentos, y otros productos.
La palabra autoclave no se limita a los equipos que funcionan con vapor de agua ya
que los equipos utilizados para esterilizar con óxido de etileno se denominan de la misma
forma.
Las autoclaves funcionan permitiendo la entrada o generación de vapor de agua pero
restringiendo su salida, hasta obtener una presión interna de 103 kPa por encima de la
presión atmosférica, lo cual provoca que el vapor alcance una temperatura de 120 grados
Celsius. Un tiempo típico de esterilización a esta temperatura y presión es de 15-20 minutos.
Las autoclaves más modernas permiten realizar procesos a mayores temperaturas y
presiones, con ciclos estándar a 134 °C a 200 kPa durante 5 min para esterilizar material
metálico; incluso llegan a realizar ciclos de vacío para acelerar el secado del material
esterilizado.
Las autoclaves suelen estar provistas de manómetros y termómetros, que permiten
verificar el funcionamiento del aparato. Aunque en el mercado existen métodos testigo
anexos, por ejemplo, testigos químicos que cambian de color cuando cierta temperatura es
alcanzada, o bien testigos mecánicos que se deforman ante las altas temperaturas. Por este
medio es posible esterilizar todo tipo de materiales a excepción de materiales volátiles, por
lo que se debe tener gran precaución.
El calor seco, a diferencia del calor húmedo, deshidrata las células y oxida sus
proteínas. Es recomendable exponer el material por lo menos una hora 30 minutos a una
temperatura de 180 a 220°C, que se controla por medio de un termostato. Este método de
esterilización se emplea para material de vidrio.
III. MATERIALES Y EQUIPOS

Tubos de cultivo, tubos de ensayo, matraces Erlenmeyer, papel de envoltura (de
aluminio), canastas, guantes de asbesto.
Autoclaves automáticas, semiautomáticas y manuales, hornos de calor seco.
1
IV. PROCEDIMIENTO
Instrucciones generales en el uso de las autoclaves manuales.
1. Checar que la válvula de descarga de agua esté cerrada y ponga agua hasta la marca
del nivel (2 litros aproximadamente).
2. Colocar en la parte inferior de la cámara la rejilla de protección de las resistencias.
3. Verificar que la válvula de escape de vapor en la tapa inicialmente no esté instalada
para asegurar la completa evacuación del aire.
4. Introducir la canastilla en la cámara con el material a esterilizar y antes de conectar a la
corriente, cerciórese que la perilla esté en “apagado”.
5. Encender la autoclave girando el botón de encendido/apagado a la izquierda colocando
el nivel mínimo, medio y máximo hasta que empiece a escapar vapor por la válvula de
seguridad.
6. Cerrar completamente la válvula de escape y dejar esterilizando el material a una
temperatura de 121°C/15 psi por 15 minutos.
7. Colocar el botón de encendido/apagado en posición de apagado.
8. Abrir la válvula de seguridad poco a poco y dejar que escape completamente el vapor, y
que la presión marque 0 psi.
9. Abrir la tapa de la autoclave con guantes de resistencia al calor y con cuidado de no
estar frente al orificio de esta para evitar ser quemado por el vapor.
10. Retirar material esterilizado.
Advertencias:
- Cambiar el agua de la autoclave cada vez que se esterilice material sucio.
- Esta autoclave no es automática.
- Esta autoclave está diseñada para trabajar a presiones menores a 1.75 kg/cm² (25 psi) por
lo tanto no deberá de exceder de esta.
- La válvula de seguridad deberá accionar entre 1.4 kg/cm² (19 psi) y 1.55 kg/cm² (22 psi)
por lo que se aconseja en el caso de exceder estas, desconectar su aparato y solicitar un
técnico para calibrar nuevamente la válvula.
- Vigile siempre la válvula de seguridad y el manómetro.
- Para su manejo general frio o caliente use guantes resistencia al calor.
Instrucciones generales en el uso de las autoclaves automáticas.
1. Cerrar la válvula de drenado.
2. Llenar de agua hasta el soporte de la canastilla.
3. Introducir la canastilla con el material a esterilizar.
4. Cerrar la tapa hasta que el brazo tope en la guía y apriete el volante.
5. Presionar el botón START.
6. Verificar que la autoclave marque el tiempo de 15 a 20 min y una temperatura de
121°C.
7. Abrir la tapa hasta que el manómetro marque cero, para retirar el material estéril.
8. Retirar material esterilizado usando guantes de asbesto.
Advertencias
- Es importante mencionar que el tiempo de esterilización programado inicia una vez que el
Autoclave haya alcanzado la temperatura de operación programada.
- La autoclave cuenta con una alarma auditiva que el usuario puede activar para que cuando
exista alguna falla en el sistema o a la terminación de un ciclo de esterilización programado
dicha alarma suene. Al entrar en esta sección del menú el display presentara el mensaje
“BEEP” y luego el estado actual de la alarma (Encendida “ON” o Apagada “OFF”). Con las
teclas de incremento o decremento usted puede seleccionar el estado de la alarma, una vez
hecha su selección presione la tecla menú.
2
- Si por algún motivo es necesario detener el proceso de esterilización presione la tecla

“START” y el sistema detendrá el proceso. Si el Autoclave ya tiene presión en la cámara
procederá a realizar la evacuación de acuerdo a la programación.
Instrucciones generales en el uso de horno de calor seco.
1. Verificar que el programa del horno esté programado en la temperatura y tiempo de
esterilización.
2. Introducir el material a esterilizar, utilizando un 80% del espacio disponible al interior
del horno.
3. Iniciar la operación del horno acorde a las instrucciones del manual de operación
4. Una vez terminado el material y previo enfriamiento, retirar el material esterilizado
usando guantes de asbesto.
V. RESULTADOS
- Reportar las principales condiciones de operación del autoclave y hornos de calor seco,
observaciones
VI. CONCLUSIONES
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3
VII. CUESTIONARIO
1. ¿Qué es la autoclave y el horno de calor seco?

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2. ¿Describa en sus palabras la importancia del uso de la autoclave en el Laboratorio de
Microbiología, estableciendo los fundamentos de cada forma de esterilización?
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Nombre / ID del
alumno
Fecha de entrega
Firma del profesor
Calificación
4
NOTAS DE LA PRÁCTICA
5
6
PRÁCTICA No. 2
Limpieza, preparación y esterilización del material empleado en el Laboratorio
de Microbiología
I. OBJETIVO
Conocer el tipo de material requerido para llevar a cabo las prácticas del Laboratorio de
Microbiología, así como las diversas técnicas y quipos utilizados para la esterilización del
mismo.
II. INTRODUCCIÓN
La esterilización es la eliminación completa de cualquier forma de vida y existen varios
métodos para llevarla a cabo.
La elección del método depende de la naturaleza física del material al que se va esterilizar y
del uso que se le piensa dar. Entre los métodos utilizados tenemos:
Calor al rojo. Se utiliza para las asas de platino empleadas en la siembra o inoculación,
para las bocas de los tubos de cultivo y frascos, portaobjetos y cubreobjetos. Se esteriliza
suspendiéndolos en la flama del mechero.
Ebullición. El agua en ebullición mata a las formas vegetativas por coagulación de las
proteínas, pero no mata a las esporas. Este método raramente se usa en el trabajo de
laboratorio.
Esterilización por vapor. El vapor esteriliza por coagulación de las proteínas. El vapor a
presión es un agente esterilizante debido a que se alcanzan temperaturas superiores a las
alcanzadas por ebullición.
El aparato de laboratorio diseñado para esterilizar por éste método se llama autoclave.
Consiste en una doble cámara que puede saturarse de vapor y mantenerse a una
determinada presión y temperatura durante un tiempo largo. Es importante que el aire de la
cámara sea reemplazado por completo por vapor saturado. Si hay aire presente se
alcanzará una temperatura inferior.
Este método es empleado para esterilizar medios de cultivo, soluciones, cantidades medidas
de agua en tubos o botellas, etc.
Generalmente se opera a una presión de 15 lb/pul2 (121°C). El tiempo de operación
depende de la naturaleza del material por esterilizar, del tipo de recipiente y del volumen.
Esterilización por calor seco. El calor seco, a diferencia del calor húmedo, deshidrata las
células y oxida sus proteínas. Es recomendable exponer el material por lo menos una hora
30 minutos a una temperatura de 180 a 220°C, que se controla por medio de un termostato.
Este método de esterilización se emplea para material de vidrio.
Radiaciones. La luz solar tiene un poderoso efecto germicida. Esta propiedad se debe a los
rayos muy cortos de alta frecuencia llamados ultravioleta, que matan a las bacterias cuando
su intensidad es fuerte.

Pipetas terminales de 10 mL, 5 mL y 1mL , cajas de Petri de vidiro, tubos de cultivo, tubos
de ensayo, matraces Erlenmeyer, portaobjetos, algodón, papel de envoltura (de aluminio),
cajeros, pipeteros, canastas, guantes de nitrilo, guantes de asbesto, asas redondas, asas
rectas, mecheros.
Horno de calor seco, estufas de secado, incinerador de asas, gabinete UV.
7
IV. PROCEDIMIENTO
Limpieza del material de vidrio
1. Sumergir el material a limpiar en una mezcla sulfocrómica preparada de la siguiente
manera:
K2Cr2O7 (50 g); H2SO4 (100 mL), H20 (1000 mL)
Los objetos de vidrio, podrán permanecer en esta mezcla un tiempo largo proporcional a la
cantidad de materia orgánica que contengan (hasta un máximo de 24 h), posteriormente se
lavan con agua acidificada con HCl seguido de agua alcalina con KOH. Un lavado
abundante con agua corriente y agua destilada al final de la operación.
2. Secar el material en el horno
3. Proceda a tapar con algodón las bocas de los matraces y pipetas teniendo especial
cuidado de que los tapones de algodón no formen arrugas ni queden flojos.
Envuelva las cajas Petri, pipetas, matraces y demás material que le proporcionen de
acuerdo con la técnica indicada, cubrir con capuchones de papel los tapones de algodón de
los tubos y matraces.
Esterilizar el material de vidrio en el horno a una temperatura de 180 a 220°C durante 2
horas.
V. RESULTADOS
- Reporte las principales operaciones de limpieza y esterilización del material.
VI. CONCLUSIONES
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VII. CUESTIONARIO
1. ¿Defina esterilización?
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2. ¿Mencione en qué casos se utiliza el calor seco y el calor húmedo para la esterilización?
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3. ¿Qué función tiene la mezcla sulfocrómica en la limpieza del material de vidrio?

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4. Definir ¿qué es el punto térmico mortal?

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6. ¿Por qué es importante un buen lavado del material de vidrio antes de esterilizarlo?
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8. Indique cuando menos 4 métodos de esterilización y en qué casos los emplearía.

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9. ¿Cuándo se emplean soluciones ácidas o básicas para la limpieza de material de vidrio?

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10. ¿Por qué deben taparse con algodón los tubos, matraces y pipetas y por qué deben
envolverse o cubrir con papel, cuándo este material va a ser esterilizado?
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Nombre / ID del
alumno
Fecha de entrega
Firma del profesor
Calificación
9
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11
PRÁCTICA No. 3
Tinción y preparación en fresco de microorganismos para su observación
I. OBJETIVO
Preparar colorantes y reactivos mediante las recomendaciones de manuales
nacionales e internacionales para su uso en la preparación en fresco de hongos y algas, así
como tinción simple y diferencial de levaduras y bacterias.
Observar las características morfológicas de bacterias, hongos, levaduras y algas, para su
estudio
II. INTRODUCCIÓN
El microscopio es una de las herramientas más utilizadas en el estudio de los
microorganismos, ya que nos proporciona la amplificación necesaria para poder observarlos
ya que no son posibles de ser observados a simple vista. El conocer y entender cómo
funciona este instrumento es de vital importancia para todo trabajo en el laboratorio de
Microbiología.
Los microscopios son de dos tipos diferentes: el óptico y el electrónico, según sea el
principio en el cual se basa la amplificación. En el microscopio óptico se obtiene la
amplificación por medio de un sistema de lentes mientras que en el microscopio electrónico
se usa un haz de electrones en lugar de ondas luminosas para obtener la imagen
amplificada.
Del microscopio óptico, el más sencillo es conocido como microscopio simple y
consta de una sola lente convergente, también conocida como lupa, de capacidad
amplificadora muy reducida. El más utilizado es el microscopio compuesto o microscopio
óptico de campo claro que supera extraordinariamente al anterior, ya que básicamente
consta de dos sistemas de lentes, uno de ellos amplia la imagen del objeto observado, que
es captada y nuevamente amplificada por el segundo sistema, consiguiéndose con esto un
mayor poder de resolución. El poder de resolución puede describirse como la capacidad
para distinguir dos puntos muy próximos, de modo que pueden verse separados.
Además del microscopio de campo claro, existen los siguientes tipos; de campo
oscuro, luz ultravioleta, fluorescencia y contraste de fase, etc.
El microscopio consta de dos partes fundamentales:
a) Parte mecánica consta de: pie o base del microscopio, brazo, platina, tornillo
macrométrico, tornillo micrométrico, revólver de objetivos, objetivos.
b) Parte óptica consta de: espejo, diafragma, condensador, lente de luz de los
objetivos, lentes y espejos del tubo del microscopio, lentes de los oculares.
Fuente de luz. La mejor fuente de luz se obtiene de la luz indirecta del sol, pero
debido a la variabilidad de estas condiciones se emplea luz artificial. La luz del espejo es
enfocada por el condensador que se encuentra bajo la platina, el objeto de estudio es
colocado en el portaobjeto que se pone en la platina, la imagen producida por el objeto es
amplificada por el ocular.
Enfoque. El microscopio tiene tres objetivos: el de 16 mm o seco débil, el de 4 mm o
seco fuerte y el de 1.8 mm u objetivo de inmersión. Estos nombres se refieren a la "distancia
de trabajo", se puede notar que las dos últimas distancias de trabajo son cortas por lo que
siempre se ajustan con el tornillo de ajuste fino o micrométrico.
Objetivo de inmersión. Evite el uso de una cantidad excesiva de aceite de cedro;
después de usar el microscopio siempre se limpia el objetivo. Esta limpieza es muy
importante puesto que el residuo gomoso reduce la eficacia de los lentes.
12
Localización y enfoque del objeto. Ajustar la fuente de luz usando el objetivo seco
débil, mirando a través del tubo de ajuste del espejo hasta que la fuente de luz esté en el
centro del tambo; el tambo debe quedar iluminado uniformemente. El diafragma debe estar
completamente abierto, el condensador totalmente arriba. Para enfocar el objeto que se va a
observar, sin mirar por el ocular (viendo el portaobjeto) mueva el tubo hacia abajo con el
tornillo de ajuste macrométrico hasta que el lente esté a cierta distancia de la preparación.
Ahora mire el ocular, con el tornillo de ajuste macrométrico haga que el objeto sea visible, si
es necesario use el tornillo de ajuste micrométrico para enfocar mejor. Estos movimientos se
hacen lentamente.
Limpieza del microscopio. Una vez utilizado el microscopio se deberá apagar la
fuente de la luz artificial, acto seguido, hacer la limpieza con papel de seda, de los objetivos
(en especial el de inmersión), de los oculares y de la platina. Cubrir el microscopio con su
camisa o colocar en su caja. Limpie perfectamente su área de trabajo. Al transportar el
microscopio, se colocará la base del microscopio sobre la palma de la mano izquierda y con
la mano derecha se tomará firmemente del brazo del microscopio.
En cuanto a los microorganismos, tres características básicas hacen necesario el
empleo de técnicas especializadas en la investigación microbiológica como son: su tamaño
diminuto, la aparente ausencia de diferencias individuales y su amplia distribución en la
naturaleza. Es por esto necesario emplear estudios microscópicos de alto poder de
amplificación, por consiguiente el procedimiento más correcto para estudiar la morfología de
los microorganismos principalmente bacterias, consiste en el examen de un frotis, que
previa fijación a un portaobjetos se tiñe con algún colorante y se examina después
microscópicamente con el objetivo de inmersión, que es el de mayor poder de resolución.
Para obtener un buen frotis, debe "extenderse" el material, con objeto de formar una película
delgada, y obtener así una sola capa de bacterias, perfectamente separadas sobre el
portaobjetos. Con esta preparación previa pueden observarse perfectamente células
aisladas, ya que de otra forma, los microorganismos se aglomeran en masas sólidas
impenetrables a la luz.
Es necesaria la tinción, ya que la diminuta célula bacteriana en su estado natural
permitirá el paso de cantidad excesiva de luz y no se puede tener una buena observación.
Las células toman la tinción total o parcialmente de acuerdo con una relación química
entre alguna sustancia celular y el colorante o bien, su superficie queda teñida por un
mecanismo de atracción. En otras palabras las propiedades tintoriales de una célula
dependen de su composición química y las diferencias en sus reacciones de coloración,
constituyen índices importantes para distinguir unas bacterias de otras.
Existen dos grandes métodos de tinción para diferenciar a las bacterias: la tinción al
GRAM que separa a las bacterias en Gram positivas y Gram negativas, dependiendo esto
de la coloración que tome la célula. La otra tinción es la de ZIEHL-NEELSEN o de ácido-
resistencia que se emplea para identificar algunos grupos de bacterias con alto contenido de
lípidos.

Cajas de Petri, tubos de ensayo con tapón de rosca, probetas, matraces, morteros,
pipetas, matraces volumétricos, matraces Erlenmeyer, embudos, frascos de dilución,
cajeros, pipeteros, frascos, goteros, cultivos de 18 a 24 hrs., de bacterias, hongos,
levaduras, algas; entre otros.
Incubadoras, hornos de calor seco, autoclave, microscopio compuesto, esteroscopio,
potenciómetro, refrigerador, balanza analítica, homogeneizador para medios de cultivo,
parrilla eléctrica; entre otros.
13
IV. PROCEDIMIENTO
Preparar los siguientes colorantes y/o reactivos:
1. Azul de metileno
Azul de metileno = 0.3 g
Alcohol etílico al 95% = 10 ml
Agua destilada = 90 ml
Disolver el colorante en el alcohol, agregar agua destilada poco a poco y dejar reposar 18
horas y filtrar por papel filtro.
2. Cristal violeta
Cristal violeta = 0.25 g
Disolver el colorante en el alcohol, agregar agua destilada poco a poco reposar 18 horas y
filtrar por papel filtro.
3. Safranina
Safranina = 0.25 g
Disolver la safranina en el alcohol, agregar agua destilada poco a poco, dejar reposar 18
horas y filtrar por papel filtro.
4. Carbol-fucsina
Fucsina básica = 1 g
Fenol al 5% = 90 ml
Disolver la Fucsina en el alcohol, agregar la solución de fenol y dejar reposar por 18 horas y
filtrar.
5. Alcohol-acetona
Alcohol al 95% = 75 ml
Acetona = 25 ml
6. Alcohol-acido
Ácido nítrico = 2.5 ml
Alcohol etílico al 95% = 97.5 ml
7. Lugol (I-KI)
Yodo = 1 g
Yoduro de potasio = 2 g
Triturar el yodo y el yoduro de potasio en un mortero hasta obtener una mezcla más o
menos homogénea y agregar poco a poco el agua.
Nota: todos los colorantes y reactivos conservarse en frascos goteros color ámbar.
8. Cloro al 2%
Hipoclorito de sodio comercial = 10 mL
Agua corriente = 490 mL
Mezclar bien y colocarlo en una piseta para su posterior uso.
9. Alcohol al 70%
Alcohol etílico al 96° = 70mL
Agua destilada = 30 mL
Mezclar bien y colocarlo en un atomizador.
14
Observación de cultivos puros

a) Flamear hasta el rojo el asa de inocular
b) Quitar el tapón de uno de los cultivos de microorganismo proporcionado y flamear el
borde del tubo.
c) Recoger una asada del cultivo y colocarla en el centro del portaobjeto limpio (en caso de
que el cultivo sea sólido suspenderlo en una gota de agua estéril)
d) Flamear de nuevo el borde del tubo y volver a taparlo
e) Esterilizar el asa de inocular
f) Colocar un cubreobjetos sobre la suspensión del cultivo y presionar suavemente
g) Observar la preparación con el objetivo seco débil y después con el seco fuerte
Técnica para hacer un frotis
a) Anotar el número correspondiente con lápiz graso sobre el portaobjetos, de la
muestra por observar, indicando con más detalle la descripción en un cuaderno de
anotación
b) Tomar y extender en un portaobjetos con el asa una gota del producto que se va a
examinar si éste es fluido. Si es de consistencia más sólida, se diluye una pequeña porción
del mismo en una gota de agua estéril colocada previamente sobre el portaobjetos con el
asa
c) Las extensiones deben ser suficientemente finas para que los microorganismos
aparezcan bien aislados al examen microscópico y lo suficientemente gruesa para ser
localizado y hacer el enfoque con facilidad
d) Secar la preparación al aire, calentar muy suavemente en la corriente del aire
caliente del mechero para acelerar la desecación
e) Fijar por medio del calor. Pasar el portaobjetos dos o tres veces con cierta lentitud
sobre la llama del mechero hasta una temperatura soportable al aplicarlo sobre el dorso de
la mano. Se puede provocar alteraciones en la morfología de las bacterias si el
calentamiento es excesivo
f) Dejar enfriar y hacer las siguientes tinciones
Tinción simple
a) La preparación seca y fijada se tiñe cubriéndola durante unos minutos (1 a 3) con
una solución colorante
b) Lavar con agua de la llave
c) Secar al aire
d) Observar con el objetivo de inmersión
Tinción de Gram
a) Preparar un frotis, dejar secar al aire y fijar a la flama
b) Cubra la preparación con la solución de cristal violeta dejar actuar el colorante
durante un minuto
c) Escurra el colorante, lave con agua de la llave, cubra la preparación con Lugol,
dejar actuar este agente durante 15 segundos
d) Escurra el Lugol, lave con agua corriente, cubra la preparación con alcohol-
acetona de 30 a 60 segundos, lave abundantemente con agua de la llave
e) Cubra la preparación con safranina por un minuto y lave con agua de la llave,
secar la preparación al aire, se observa con el objetivo de inmersión
Tinción de Ziehl-Neelsen
Es la coloración de microorganismos alcohol-ácido resistente (BAAR)
a) Prepare un frotis, seque al aire y fije al calor
15
b) Cubra la preparación con carbol-fucsina y caliente por el reverso hasta emisión de

vapores durante 5 a 10 minutos, cuidando de que no hierva el colorante, añadir colorante de
vez en cuando para evitar que este se seque
c) Lave con agua y decolore con alcohol-ácido, limpiar el reverso del portaobjetos,
lado contrario al frotis
d) Lave con agua y cubra la preparación con azul de metileno durante 60 segundos
e) Lave con agua, dejar reposar y observe con el objetivo de inmersión
V. RESULTADOS
- Reporte los cálculos realizados para la preparación de los colorantes y reactivos.

- Representación de las morfologías observadas en 10X, 40X y 100X de bacterias, hongos,
levaduras y algas.
VI. CONCLUSIONES
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VII. CUESTIONARIO
1. Definir que es un colorante.

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2. Explique las propiedades de los colorantes básicos y ácidos.

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3. ¿Qué es un desinfectante?, de 5 ejemplos.
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4. ¿Qué es un mordiente?, de 3 ejemplos.
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5. Mencione y dé los usos de 5 equipos más utilizados en el laboratorio de Microbiología.
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Nombre / ID del
alumno
Fecha de entrega
Firma del profesor
Calificación
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18
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PRÁCTICA No. 4
Preparación y esterilización de medios de cultivo
I. OBJETIVO
Conocer los medios de cultivo que frecuentemente se utilizan para el crecimiento de
microorganismos, así como su composición y forma de preparación.
II. INTRODUCCIÓN
El estudio de algunos procesos bioquímicos fundamentales de las células se ha
realizado en microorganismos debido a que son fáciles de cultivar en el laboratorio
bajo condiciones controladas que permiten verificar sus características en
generaciones sucesivas en tiempos relativamente cortos.
Para cultivar los microorganismos en el laboratorio es necesario conocer los
requerimientos nutricionales de cada cepa en particular y controlar factores físicos
como temperatura y pH (la mayoría de las bacterias pueden crecer a una
temperatura de 30°C o más aunque algunas cepas se alejan mucho de este rango);
el rango normal del pH tolerado es de 5 a 8; para controlar el pH se usan
generalmente medios de cultivo regulados.
Todas las células requieren para su crecimiento normal de agua, una fuente de
carbono, de nitrógeno, azufre, fósforo, energía y sales minerales en pequeñas
cantidades como sodio, potasio, calcio, magnesio; tanto los microorganismos como
las plantas requieren que estos nutrientes estén en solución para poderlos asimilar.
Por ello se debe seleccionar el medio de cultivo de tal manera que contenga los
elementos necesarios para el adecuado crecimiento de la cepa que se desea.
Los medios de cultivo se han clasificado de acuerdo con su composición química y
el uso a que se destinan en: enriquecidos, selectivos, diferenciales principalmente. O
bien considerando su consistencia se clasifican en: sólidos, semisólidos y líquidos.
En la preparación de medios de cultivo existen algunos materiales de uso muy
común como son las peptonas, el extracto de carne, extracto de levadura y el Agar.
Estos materiales, nutrientes para la célula, hacen posible el desarrollo de una gran
cantidad de microorganismos.
El caldo nutritivo y el Agar nutritivo son ejemplos de medios de cultivo líquido y
sólido que permiten el desarrollo de muchos tipos de microorganismos heterótrofos.

Medios de cultivo (agar nutritivo, caldo nutritivo, agar dextrosa de papa, agar
extracto de malta, agar endo, agar Kligler, agar citrato de Simmons, caldo lactosado,
medios SIM).
Mecheros, tripie, tela de asbesto, matraces, espátulas, balanza analítica, balanza
semianalítica, autoclave, algodón, aluminio, tela gasa.
IV. PROCEDIMIENTO
El instructor indicará los medios de cultivo que se preparan y esterilizan en esta
sesión.
Técnicas para preparar medios de cultivo:
20
1. Según las instrucciones de cada uno de los medios de cultivo, tomar la parte
proporcional de éste y disolverlos en agua destilada, mezclar hasta obtener una
suspensión uniforme, calentar agitando frecuentemente (si es agar o medio, los
caldos solo disolver agitando), hervir durante un minuto.
Tapar el matraz con algodón de tal manera que quede firme, cubrirlo con papel
aluminio y colocar cinta testigo.
Esterilizar en autoclave a una temperatura de 121C o 15 libras de presión por
pulgada cuadrada por 15 minutos (o la temperatura indicada para el medio).
Sacar el medio de la autoclave, enfriar a una temperatura aproximada de 45C
(temperatura soportable al dorso de la mano).
Vaciar en placas hasta la altura indicada en las mismas (aproximadamente 15 a 20
ml), tapar y dejar solidificar.
2. Medio en tubo inclinado: una parte del medio preparado en las instrucciones
anteriores y después de que hierva, pasarlo a los tubos de cultivo con tapón de
rosca; colóquelos en posición vertical en un recipiente y esterilice en el autoclave.
Después de la esterilización, colóquelos en la posición inclinada levantando la parte
donde se encuentra el tapón. Dejando el "botón" lo suficientemente grande para que
se conserve mayor tiempo el medio.
3. Medios de cultivo para picadura: Siga el mismo procedimiento anterior, sólo que
en lugar de inclinar los tubos, déjelos en posición vertical.
4. Medios de cultivo líquidos: Siga las instrucciones del medio deshidratado y
después de esterilizar, dejar los tubos en posición vertical.
V. RESULTADOS
- Reportar los cálculos para cada uno de los medios de cultivo preparados.
- Secuencia fotográfica de la apariencia de los medios de cultivo preparados.
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VI. CONCLUSIONES
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VII. CUESTIONARIO
1. Explique concretamente a qué se llama medio de cultivo.
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2. Defina medio sintético y medio no sintético. Dar cinco ejemplos de cada uno
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3. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de emplear medios de cultivos sintéticos y
no sintéticos?
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4. Cite algunas propiedades de Agar-Agar y la gelatina
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5. Indique un método para ajustar el pH de un medio de cultivo
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6. Indique las propiedades químicas de las peptonas, extracto de carne, extracto de
levadura.
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7. ¿Cuáles son los ingredientes del Agar nutritivo y qué tipo de nutrientes
proporcionan para el desarrollo de los microorganismos?
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8. Indique las diferencias entre un medio de cultivo enriquecido, selectivo y para
pruebas bioquímicas.
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9. ¿Qué precauciones se deben considerar en la preparación y esterilización de los

medios de cultivo?
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Nombre / ID del
alumno
Fecha de entrega
Firma del profesor
Calificación
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25
PRÁCTICA No. 5
Técnicas de siembra en medios de cultivo: observación y características de
crecimiento microbiano
I. OBJETIVO
Aplicar los diferentes tipos de siembra de microorganismos, así como la observación
de crecimiento de estos en diferentes medios de cultivo.
II. INTRODUCCIÓN
La inoculación de medios para cultivo e identificación de microorganismos es un
procedimiento a la vez fundamental e importante en toda investigación
microbiológica, es por eso que se debe tener cuidado con esta técnica con el objeto
de evitar la contaminación de los cultivos; las medidas de precaución que se aplican
para prevenir la contaminación comprenden el procedimiento denominado técnica
aséptica. Es de suma importancia tomar en cuenta que los ingredientes y los
utensilios de vidrio que se usan en la preparación de los medios pueden contener
microorganismos indeseables, por tal motivo los medios recién preparados se deben
esterilizar inmediatamente, los tubos que contienen medio se tapan con tapón de
algodón o tapas metálicas o plásticas con el fin de evitar la penetración de
microorganismos extraños. Otras precauciones que se deben tener en los
procedimientos de aislamiento y cultivo de microorganismos es flamear el borde de
los tubos y el calentamiento al rojo del asa o agujas de inoculación.
Esta práctica está destinada a que el estudiante se familiarice con las técnicas
fundamentales de siembra empleadas para aislar y desarrollar cultivos microbianos;
además de observar las diferentes características de crecimiento como son:
turbidez, formación de sedimento, crecimiento en la superficie en el caso de medios
líquidos. En medios sólidos se observa la formación de colonias en su extensión,
color, opacidad, consistencia y modificación que sufre el medio por el metabolismo
bacteriano.

Para el desarrollo bacteriano general: placas con Agar nutritivo, tubos con caldo
nutritivo.
Para desarrollo de hongos y levaduras: placas con agar extracto de malta, placas
con agar dextrosa Papa.
Medios para pruebas bioquímicas (diferenciación): tubos con agar Kligler inclinado,
tubos con agar citrato de Simmons inclinado, tubos con medio SIM, tubos con caldo
bilis verde brillante, tubos con caldo lactosado.
Asas redondas, asas rectas, mecheros, incubadoras.
IV. PROCEDIMIENTO
El instructor demostrará por primera vez algunas técnicas de siembra, luego cada
estudiante hará con su juego de medios de cultivo lo siguiente:
a) Inocule por asada simple y doble los medios líquidos
b) Inocule el medio SIM por picadura según técnica
26
c) Inocule las placas por estría simple y/o estría por agotamiento y los tubos
inclinados en estría en la superficie, procurando que la cantidad de inoculo sea
suficiente pero no excesivo con objeto de tener colonias aisladas y poder hacer un
estudio del cultivo
d) Incube todos los medios sembrados a 37°C
V. RESULTADOS
- Estudie y anote las características de cultivo de las cepas sembradas en medio

líquido, anotando el grado de crecimiento, turbidez, sedimento, crecimiento en
superficie y otras características
- Haga el estudio de los cultivos en picadura anotando grado, forma, la extensión,
crecimiento en la superficie, color y opacidad, etc.
- Anote las características del cultivo en medios inclinados según su: forma,
elevación, superficie, borde, color, opacidad, consistencia, modificación que sufre el
medio
- Haga el estudio de las colonias sembradas en la superficie anotando: su forma,
tamaño, elevación, estructura, bordes, color, consistencia, etc.
- Las anotaciones que se hagan deben corresponder a las observaciones de: 24, 48
y 72 horas, debiendo ser lo más cuidadosas y concretas posibles, haciendo una
secuencia fotográfica de estas.
VI. CONCLUSIONES
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VII. CUESTIONARIO
1. Describa algunos métodos de siembra en medios líquidos y sólidos
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2. ¿Por qué es importante el pH en un medio de cultivo?
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3. ¿Cuál es el efecto de la temperatura en el desarrollo de los microorganismos?
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4. Compare el desarrollo bacteriano en un medio de cultivo sólido y uno líquido
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5. Mencione 5 medios de cultivo para el desarrollo bacteriano e indicando su

contenido nutritivo
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6. Mencione 3 medios de cultivo para hongos y levaduras y su composición química

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7. En un medio líquido ¿cómo espera que sea el crecimiento de un hongo?
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Nombre / ID del
alumno
Fecha de entrega
Firma del profesor
Calificación
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29
30
PRÁCTICA No. 6
Obtención de cultivos puros y crio preservación de microorganismos
I. OBJETIVO
Aplicar las técnicas de las Normas Oficiales Mexicanas para cuantificar
microorganismos y obtener cultivos puros de bacterias, hongos y levaduras para su estudio.
II. INTRODUCCIÓN
Los microorganismos en su estado y hábitat natural no existen en forma pura, sino
en comunidades o poblaciones microbianas mezcladas; sin embargo, la mayoría de los
estudios microbiológicos se realizan aislando a microorganismos y estudiando su
comportamiento en cultivos puros (cultivo conteniendo solamente un sólo tipo de
microorganismos).
Un aspecto importante de las matrices agua y alimento es la carga microbiana que

contiene y que puede definir su calidad sanitaria o su posibilidad de deterioro (vida de
anaquel); en ese sentido las NOM han establecido en la NOM-092, NOM-111, NOM-113 los
procedimientos para cuantificar los principales indicadores sanitarios que permiten decidir si
el producto es apto para el uso y/o consumo humano, o bien el tiempo que podré
mantenerse en exhibición.
Una vez obtenidos el cultivo puro, el éxito de su preservación es esencial para las
actividades de investigación o industriales basadas en la actuación de estos
microrganismos. Las cepas valiosas se tienen que conservar durante largos periodos, libres
de cambios fenotípicos adversos. Un cultivo de aplicación industrial tiene que reunir
determinadas características, como contener el máximo número de células viables, estar
libres de contaminantes y ser activo en las condiciones de procesamiento. Por esta razón, el
mantenimiento de cultivos es extremadamente importante.
No existe un método universal para mantener los cultivos de microorganismos; sin

embargo, la selección del método se basa en la naturaleza del cultivo y en las ventajas e
inconvenientes del método escogido. Si el microorganismo aún no se conoce del todo, es
aconsejable utilizar varios métodos de conservación. Los cultivos de microorganismos se
siembran en medios estériles y en condiciones de asepsia, a través de uno de los siguientes
métodos:
- Reducción o control de su actividad metabólica mediante refrigeración; este método

se utiliza para períodos cortos de almacenamiento.
- Conservación por congelación y secado; métodos aplicables para periodos largos.

Muestra problema, placas estériles, placas con agar nutritivo, agar nutritivo, dextrosa
de papa estéril, pipetas de 10, 5 y 1 ml estériles, tubos con tapón de rosca estériles, agua
destilada estéril, frascos de dilución.
Mecheros, incubadoras, contadores de colonia.
31
IV. PROCEDIMIENTO
Método de dilución:
a) Coloque sobre la mesa de trabajo 1 frasco de dilución con 90 mL de agua destilada estéril
y una gradilla con 4 tubos con tapón de rosca con 9 mL de agua o solución salina estéril;
numere sus tubos (2 al 5).
b) Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30
cm efectuados en un tiempo de 7 segundos; con una pipeta estéril mezcle usted en el frasco
de dilución 10 mL de la solución problema (suspensión de microorganismos).
c) Mezcle perfectamente el contenido del frasco 1 y pase 1 mL de el al tubo 2, después de
mezclar perfectamente, pasar 1 mL de éste al tubo 3, y así sucesivamente hasta terminar en
el tubo 5, en éste último mezclar perfectamente y desechar 1 mL (NOM-110-SSA1-1994).
Nota: en cada tubo agite exactamente igual que en la muestra problema.
d) Marcar las cajas en sus tapas con los datos pertinentes previamente a su inoculación;
después inocular las diluciones de las muestras preparadas y agregar de 12 a 15 mL del
medio preparado, y mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el
sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una
superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporación del inóculo en el medio;
cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar.
e) Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de
esterilidad.
f) El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente
hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20
minutos.
g) Incubar las cajas en posición invertida (la tapa hacia abajo) por 48 h a 37°C, realizando
conteo preliminar a las 24 h.
h) En la lectura seleccionar aquellas placas (o dilución) donde aparezcan entre 25 a 250
UFC, para disminuir el error en la cuenta, y multiplicar por el inverso de la dilución.
Aislar por el método de estrías, colonias típicas de: bacterias, levaduras y hongos, para
conservarlos como cultivos puros.
Método de las estrías.
a) Tome una asada de cada dilución e inocule por estría la superficie de una placa de Agar
nutritivo.
b) Deje una placa sin inocular como control de esterilidad del Agar y de la técnica de
preparación de placas
c) Invierta las placas e incúbelas placas a 37°C. Haga las observaciones correspondientes a
las 24-48 horas y reporte resultados.
Determine las diferentes formas de bacterias, hongos y levaduras que encuentre, para lo
cual necesita hacer un estudio de la morfología colonial, afinidades tintoriales de los
individuos que integran cada colonia.
Crio preservación de cepas
1. Preparación del inoculo:
- Propagar las cepas aisladas o de interés industrial, en un tubo de ensayo el cual contendrá
5 mL de caldo nutritivo estéril.
- Incubar los tubos a 30-37ºC durante 24h.
2. Crio preservación
- Centrifugar los tubos del caldo de propagación a 3000 rpm/10 min.
- Eliminar el sobrenadante con mucho cuidado para evitar pérdida de células precipitadas.
- Resuspender las células con 1mL de solución tampón de fosfatos:glicerol (20% de glicerol)
estéril; agitar y traspasar la suspensión a un tubo de crio preservación.
32
- finalmente congelar las muestras a -20ºC o -80ºC.

Nota importante: los cultivos en crio preservación a -80ºC se mantendrán hasta el semestre agosto –
diciembre para su uso en cursos posteriores.
V. RESULTADOS
Cuenta Total Viable de Mesofilos aerobios (UFC/mL)
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
- Describir las características macroscópicas y microscópicas de las colonias seleccionadas.

- Registrar la clave de crio preservación de sus cultivos puros.
VI. CONCLUSIONES
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VII. CUESTIONARIO
1. Señale usted concretamente las ventajas y dificultades del método de diluciones y el de
estrías para aislar cultivos puros.
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2. Indique usted cuando se debe emplear cada uno de los métodos anteriores.
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3. ¿Qué objeto tiene el invertir las placas al incubarlas?
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4. ¿Qué es un cultivo puro?
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5. ¿Qué es un cultivo mixto?
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6. ¿Cómo se pueden conservar los cultivos puros?
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7. ¿Qué es un cepario?
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8. ¿Es importante la conservación de un cepario en una institución educativa?
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9. Establezca los fundamentos de las NOM: 092, 110 y 111.
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Nombre / ID del
alumno
Fecha de entrega
Firma del profesor
Calificación
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PRÁCTICA No. 7
Perfil bioquímico bacteriano y efecto de factores ambientales
I. OBJETIVO
Identificar bacterias aisladas de cultivo mixto mediante observación macro y microscópica
así como pruebas bioquímicas con el fin de conocer su metabolismo.
Utilizar la bacteria aislada e identificada exponiéndola a algunos efectos físicos y químicos
del medio ambiente para conocer su comportamiento de desarrollo.
II. INTRODUCCIÓN
Metabolismo Bacteriano. Las pruebas bioquímicas consisten en distintas reacciones entre
microorganismos, las enzimas que produce y los nutrientes del medio de cultivo, que
permite diferenciar entre especies de bacterias y algunas levaduras, así como conocer el
comportamiento fisiológico de los mismos en diferentes condiciones de cultivo. Su sistema
de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una vía metabólica a
partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer
incorpora o no. Para observar los resultados de las distintas pruebas bioquímicas existen
diversas técnicas; en muchos casos el cambio de pH subsecuente a la utilización de un
sustrato o a la acción de un enzima, es el modo más sencillo y rápido de comprobar el
resultado, incorporando un indicador al medio de cultivo
Algunas pruebas bioquímicas se enumeran a continuación:
- Fermentación de Hidratos de Carbono (agar triple azúcar hierro -TSI-/ agar Kligler –KIA-
inclinado).
El TSI y el KIA son medios de cultivos diferenciales que permiten determinar la capacidad de
un microorganismo para atacar un hidrato de carbono especifico incorporado en un medio
de desarrollo basal, con producción de gas o sin ella, junto con la determinación de la
posible producción de ácido sulfhídrico (H2S). Son medios útiles para la identificación de
enterobacterias.
El KIA contiene dos hidratos de carbono: 1% de lactosa y 0.1% glucosa, el TSI puede
sustituir el KIA; la diferencia primaria es el agregado de un tercer hidrato de carbono, la
sacarosa, a una concentración de 1%. La fermentación de los hidratos de carbono puede
ocurrir con producción de gas o sin ella (CO2 + H2).
- Prueba de Indol (Medio SIM).
El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptofano. Las
bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con
producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica
importante para la identificación de muchas especies de microorganismos.
La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando este reacciona
con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de los
reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.
Mediante esta prueba se detecta la liberación de indol en un cultivo bacteriano. Dicha
liberación se debe a la degradación del aminoácido triptofano mediante la enzima
triptofanasa.
- Prueba de la Ureasa
La ureasa es una importante enzima microbiana vinculada con la descomposición de los
compuestos orgánicos. Esta prueba determina la capacidad de un organismo de desdoblar
la urea formando dos moléculas de amoniaco por acción del enzima ureasa, con el resultado
alcalino. Esta actividad enzimática es característica de todas las especies de Proteus y se
37
usa sobre todo para diferenciar este género de otras enterobacterias que dan negativo o
positivo retardado.
- Prueba de Voges-Proskauer
La Prueba se basa en la producción del acetilmetilcarbinol (acetoína) un producto final
neutro derivado de la fermentación de la glucosa. Esta es metabolizada en ácido pirúvico,
intermediario primario de la glucólisis. La producción de acetoína es uno de los ciclos
utilizados para la degradación de la glucosa en las bacterias.
- Prueba del rojo de metilo
Se basa en un indicador de pH que es el rojo de metilo, para determinar la concentración de
iones hidrógenos presentes cuando un organismo fermenta la glucosa. La concentración de
hidrógenos depende de la relación gaseosa (CO2 y H2) que a su vez es un índice de los
diferentes ciclos del metabolismo de la glucosa que muestran diversos organismos.
- Prueba del Citrato
Esta prueba sirve para determinar si un organismo es capaz de utilizar citrato como única
fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su
metabolismo, provocando una alcalinización del medio. Este aumento de pH se visualiza
con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7.6.
-Hidrólisis de la Gelatina
La mayoría de los polímeros son demasiado grandes para ser transportados dentro de las
células. Las bacterias excretan enzimas extracelulares que hidrolizan esos polímeros
transportando al interior de la célula en monómeros que les sirven para crecer.
La producción de proteasas es evaluada por incorporación de una proteína (gelatina o
caseína) en un medio sólido. Se incorpora gelatina en diversos medios para determinar la
capacidad de un organismo para producir enzimas del tipo proteolíticas que a su vez, son
detectadas por la digestión o licuefacción de la gelatina presentes.
Efecto de Factores Físicos y Químicos. Las bacterias están casi por completo a merced de
su medio ambiente. Como sabemos, algunos microorganismos poseen mecanismos
limitados para regular el pH de su alrededor y algunos otros móviles pueden rechazar
sustancias nocivas o bien pueden ser atraídos por mecanismos quimiotácticos a una fuente
de alimentos. Otro factor es la temperatura de un medio de cultivo ya que rige los índices de
velocidad de crecimiento, multiplicación y muerte de los microorganismos; también con las
radiaciones directas en los cultivos se ha encontrado que tienen dos efectos en los
microorganismos: el primero de ellos es la muerte y el otro es la producción de mutantes en
la población superviviente.
Otro factor importante es la presión osmótica, que en el caso de las bacterias es mayor que
en los medios de cultivo, por contener concentraciones mayores de sales, aminoácidos y
numerosos compuestos orgánicos e inorgánicos; esto crea una tendencia a la entrada de
agua al protoplasma por osmosis a través de la membrana citoplasmática semipermeable.
En condiciones normales de cultivo, las células mantienen un estado de turgencia.

- Cultivos: bacteria aislada en la práctica 6, cepas 1 y 2 proporcionadas por el profesor del
curso.
- Tubos con caldo nutritivo cultivados con bacteria aislada en práctica 6 por 24 horas.
- Medios de cultivos y Reactivos: tubos con caldo nutritivo, con agar Kligler o TSI, con
medios SIM, con caldo urea, con caldo RM-VP, con agar citrato de Simmons, con caldo
lactosado (con campana Durham), con medio gelatina, con caldo bilis verde brillante (con
campana Durham), placas con Agar ENDO, con agar SS, con Agar nutritivo.
- Tubos con caldo nutritivo con 2, 4, 6 y 8% de NaCl.
38
- NaOH y KOH al 40%, α-Naftol, Reactivo de Kovac´s o Ehrlich.

- Termómetro (-20 a 50°C), baño maría, Incubadora, autoclave, horno, refrigerador, asas
bacteriológicas.
IV. PROCEDIMIENTO
Metabolismo Bacteriano
- Medio Agar Kligler o TSI (inclinado)
Sembrar por picadura y estría, se determina producción ácido sulfhídrico requerimiento del
carbono de lactosa, glucosa con producción de ácido y/o gas.
- Medio de SIM
Sembrar por picadura, se determina producción de ácido sulfhídrico, Indol del triptófano,
motilidad.
- Medios de caldo urea
Sembrar por asada y se utiliza para determinar aprovechamiento de nitrógeno de urea.
- Prueba de Voges-Proskauer
Para esta prueba se necesitan 10 ml de caldo RM-VP, se determina desarrollo bacteriano en
el caldo. Con producción de acetil-metil carbinol por fermentación de glucosa durante 48-72
horas. Agregue a cada tubo dos gotas de solución cloruro férrico al 2% y 5 ml de KOH al
10%, agite y deje reposar, una coloración rosada indicará reacción positiva.
- Prueba del rojo de metilo
Para esta prueba se requiere de un cultivo en 5 ml de caldo RM-VP incubado durante 5
días. Después de incubado agregar 5 gotas del indicador rojo de metilo. La prueba es
positiva si el medio vira a color rosa.
- Agar citrato de Simmons
Siembra por picadura y estría. Se determina aprovechamiento de carbono de citrato.
- Caldo lactosado (medio de enriquecimiento)
Se utiliza para la prueba presuntiva de coliformes
- Caldo bilis verde brillante (medio selectivo)
Se utiliza para confirmar la presencia de coliformes
- Medio de gelatina
Siembra por picadura. Se determina licuefacción de la gelatina y forma de desarrollo
- Placas con Agar endo
Siembra por estría. Medio selectivo en el cual se determina bacilos Gram -, enterobacterias,
color característico de la colonia (verde brillante metálico, para E. coli)
- Placa con Agar SS
Siembra por estría, es un medio selectivo para el grupo de Salmonella-Shigella, aunque en
ocasiones pueden desarrollar otras enterobacterias.
Efecto de Factores Físicos y Químicos.
- Efecto de la temperatura
a) Inocule cuatro tubos con caldo nutritivo (dos asadas).
b) Numérelos del I al IV e incúbelos a las siguientes temperaturas, durante 24-48 horas.
TUBO I TUBO II TUBO III TUBO IV

4°C 25°C 37°C 55°C
Refrigerador Temp. Lab. Incubadora I Incubadora II
39
c) Observe crecimiento y anote resultados de acuerdo a la siguiente clasificación.

- no crecimiento
+ Crecimiento pobre
++ Buen crecimiento
+++ Crecimiento excelente
- Punto térmico mortal

a) Haga frotis con cada uno de los cultivos y tíñalos al Gram para determinar su pureza.
b) Marque sus cajas Petri con cada una de las temperaturas que se indicarán
c) Caliente el agua del baño maría a una temperatura de 45°C
d) Después de sembrar una caja Petri con agar nutritivo que servirá de control, coloque sus
tubos de cultivo en baño maría y déjelos ahí durante 11 minutos.
e) Al final de este período, siembre en cajas Petri (después de enfriados los cultivos).
f) Eleve ahora la temperatura del agua del baño María a 70°C y repita la operación.
g) Incube invirtiendo las cajas a 37°C durante 48 horas y anote los resultados obtenidos
- Efecto de rayos ultravioleta
a) Inocule sus cajas Petri con agar nutritivo con las cepas de trabajo (inoculando por toda el
área de la caja).
b) Coloque un papel negro que cubra la mitad de la caja Petri (quita previamente las tapas).
c) Exponga las cajas Petri a la acción directa de los rayos ultravioleta durante 5 minutos,
tape la caja Petri e inviértala.
d) Incube a 37°C durante 48 horas y anote los resultados
- Efecto de la presión osmótica
a) Inocule los tubos con las cepas de trabajo
b) Incube durante 5 días a 37°C
c) Observar cada 24 horas
d) Hacer frotis y teñir al Gram al quinto día.
40
V. RESULTADOS
Prueba Bioquímica o
característica morfológica y/o Cepa 1 Cepa 2 Cepa 3
colonial
Oxidasa
Catalasa
H2S
Fermentación de glucosa
Fermentación de lactosa
Indol
Rojo de metilo
Voges Proskauer
Citrato de Simmons
Malonato
Prueba de la urea
Licuefacción de gelatina a 22°C
Lisina descarboxilasa
Ornitina descarboxilasa
Producción de gas
O/F de la glucosa
Reacción Gram
Característica colonial
- Compare los resultados de pruebas bioquímicas con el anexo 2.

- Anote los principales resultados de efecto de la temperatura, punto térmico mortal, rayos
ultravioleta y presión osmótica.
VI. CONCLUSIONES
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41
VII. CUESTIONARIO
¿Qué es una prueba bioquímica?
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¿Qué es una enzima?
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¿Qué importancia tienen las enzimas en las reacciones bioquímicas de los
microorganismos-medios de cultivo?
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Describa 3 pruebas bioquímicas diferentes a las estudiadas en esta práctica.
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En base a la temperatura, ¿Cómo se clasifican los microorganismos?
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¿Qué entiende por temperatura óptima de crecimiento?
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¿Qué es el pH?
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¿Qué es un microorganismo halófilo?
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Nombre / ID del
alumno
Fecha de entrega
Firma del profesor
Calificación
42
43
44
PRÁCTICA No. 8
Viabilidad y cinética de crecimiento de levaduras
I. OBJETIVO
Establecer la viabilidad y las fases de desarrollo de un cultivo puro de levaduras mediante el
uso de cámara de Neubauer y espectrofotometría para la caracterización del
microorganismo.
II. INTRODUCCIÓN
Típicamente las levaduras son organismos unicelulares aunque frecuentemente después de
la fisión quedan varias células reunidas. Las células de las levaduras son de 20 a 100 veces
más voluminosas que la mayor parte de las bacterias y se pueden presentar en forma
esférica, ovoide y elipsoidal; se pueden teñir con colorantes sencillos, como el azul de
metileno o safranina. La tinción hace más fácil la observación de las células microscópicas,
debido a esto se ha creado una tinción especial para levaduras "Tincion Güstein" que ayuda
al microbiólogo a cuantificar el porcentaje de viabilidad de los cultivos de levaduras, que es
de gran utilidad en los procesos fermentativos.
Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes métodos. El más común es el de

tinción con azul tripan el cual es un coloide que se introduce en el interior de las células que
presentan roturas en la membrana. Así pues las células que aparecen en la imagen,
claramente de color azul, son consideradas no viables. Asimilar células blancas, por
exclusión, a células viables es un error pues por este método se sobrevalora la viabilidad de
las células en la suspensión, determinando como inviables sólo aquellas con la membrana
rota. Existen otros métodos de determinación de la viabilidad celular como el más preciso de
la tinción con ioduro de propidio.
Una suspensión celular se caracteriza por presentar un número de partículas microscópicas

dispersas en un fluido. Es habitualmente necesario determinar tanto la densidad de las
células en la suspensión como el porcentaje de éstas que son viables. Para determinar la
densidad de las células se emplean diferentes técnicas, desde la relativamente simple como
la cámara de conteo celular de la que existen numerosas variantes, entre ellas la más
empleada es la cámara de Neubauer hasta equipos automáticos de conteo celular como el
Cell Counter. La cámara de Neubauer es un herramienta de conteo adaptada al microscopio
de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en
el centro en el cual el fondo se ha marcado con la ayuda de un diamante con una cuadrícula
como la que se observa en la figura 1. Es un cuadrado de 3x3 mm, con una separación
entre dos líneas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L
corresponde a 1 milímetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1
mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista
45
de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el

cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro.
Figura 1. Cuadriculas de Cámara de Neubauer

La parte central de la cámara de Neubauer es la más recomendable para el conteo de
células de levadura, realizando el conteo en diagonal utilizando el objetivo de 40X (5
cuadros totales) (figura 2).
Posterior al conteo se podrá utilizar la siguiente fórmula para calcular la concentración
celular:
_
( X /16) 4x106 = Cel/mL
_
Donde X = es el número de levaduras totales de los cuadros contados entre 5.
Nota: si se realizan diluciones multiplicar el resultado por el inverso de la dilución.
Figura 2. Parte central de la cámara de Neubauer vistas en 4X, 10X, 40X.
46
El comportamiento de un microorganismo en crecimiento es el resultado de la interacción

del microorganismo, el medio ambiente y la influencia de diversos factores, como
temperatura, agitación, aeración y pH. Las poblaciones microbianas presentan un
característico patrón de crecimiento llamado crecimiento exponencial, que puede dar como
resultado un aumento explosivo en la cantidad de células y la transformación de los
nutrientes del medio de cultivo en metabólicos.
Las etapas o fases de crecimiento se describen a continuación y se observan en la Figura 1:
a) Fase lag. En esta el microorganismo se adapta a las nuevas condiciones; puede haber
deficiencias enzimáticas y durante esta etapa de produce una síntesis de estas.
b) Fase logarítmica o exponencial. En ella la población se duplica de manera exponencial a
intervalos iguales. Es el periodo de mayor crecimiento en condiciones óptimas; sin embargo
la velocidad de crecimiento varía de un microorganismo a otro.
c) Fase estacionaria. Es el periodo en el cual alguno de los nutrientes indispensables se
agota o algún producto de desecho fabricado en el medio llega a un nivel en el cual es
inhibidor y cesa el crecimiento exponencial. No hay incremento ni decremento en la cantidad
de células.
d) Muerte. Si la incubación continúa después de que la población alcanza la fase
estacionaria, le seguirá la fase de muerte. Durante esta fase la viabilidad disminuye
lentamente.
A escala industrial es importante conocer las etapas de crecimiento microbiano, debido a
que en el transcurso de ellas se llevan a cabo procesos en los cuales el producto deseado
es un metabolismo microbiano. Hay dos tipos de metabolitos, los primarios, que son
fabricados durante la fase primaria de crecimiento del microorganismo, y los secundarios
que se fabrican al final de la fase primaria, cerca de la estacionaria. La mayor parte de los
productos de importancia económica son metabolitos secundarios, por lo que es
imprescindible entender cómo se regula la síntesis de estos productos para el desarrollo de
procesos efectivos a gran escala.
Figura 1. Fases del crecimiento microbiano.

Fuente: Madigan, M. T., Martinko, J. M., Parker, J., Fernández, M. G., Brock, T. D., Fernández, C. R.,
& Pérez, M. S. (2004). Brock biología de los microorganismos: Pearson Educación.
47

- Cultivos puros levadura aislado en práctica 6 en caldo extracto de malta con 18-24 h de
cultivo.
- 1 matraz de 500 mL con 250 mL de caldo extracto de malta estéril, 3 tubos con 10 mL de
caldo extracto de malta estéril, 5 tubos con 9 mL de agua destilada.
- pipetas de 10, 5 y 1 mL, cámara de Neubauer, celdas para espectrofotómetro.
- Incubadora, autoclave, horno, asas bacteriológicas, cámara de Neubauer, portaobjetos,
cubreobjetos, microscopio, espectrofotómetro.
IV. PROCEDIMIENTO
Curva de crecimiento
Activación del cultivo de levadura. A partir del cultivo puro de levaduras tome una asada e
inocule un tubo con 10 mL de caldo extracto de levadura. Incube a 30°C por 24h.
nota: de ser factible incubar en baño con agitación a 250 rpm.
Inoculación del matraz. Agregue 10% (1mL) del inoculo de levadura previamente activado.
Tome una muestra en el tiempo cero (T0) y contar el número de células contenidas en la
muestra utilizando la cámara de Neubauer, tomando 5 campos para el conteo (en diagonal).
- Simultáneamente tome lectura de la absorbancia a 600 nm utilizando espectrofotómetro y
como blanco el caldo de cultivo.
- Incube el matraz durante 12 a 24h a 30°C.
- Tomar muestras y realizar conteo de células y medición de la absorbancia cada hora.
Tinción de Güstein para levaduras
Del cultivo de Sacharomyces sp y Cándida sp, haga frotis de la misma manera como si fuera
un frotis microbiano.
Solución al:
- 1% de azul de metileno en agua destilada
- 5% de ácido tánico en agua destilada
- 1% de safranina en agua destilada
Nota: Estos reactivos deben prepararse en pequeñas cantidades antes de usarse.
- Hacer un frotis, dejar secar al aire, fijar al calor pasándolo por la flama (temperatura
soportable por la mano) 20 veces.
- Teñir con la solución azul de metileno durante 4 minutos. Enjuagar con agua de la llave
durante 30 segundos.
- Teñir con la solución ácido tánico durante 2 minutos y lavar con agua durante 30
segundos.
- Teñir con safranina 1 minuto, enjuagar con agua durante 30 segundos, dejar secar y
observar en el objetivo de 10x, 40x y 100x.
48
V. RESULTADOS
Tabla de datos de la cinética de crecimiento de levadura.
Tiempo Conteo de células en 5 campos Densidad óptica a
células/mL
(h) de la cámara 600 nm
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
- Grafique el número de células contra tiempo y absorbancia contra tiempo e identifique las
fases de crecimiento de la levadura estudiada.
- Calcule la velocidad media de crecimiento (µ) para el cultivo.
VI. CONCLUSIONES
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VII. CUESTIONARIO
1. Relacione y explique cada uno de las etapas de crecimiento de las levaduras.
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2. Que tipos de metabolitos de levaduras existen y en qué fase se producen.
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3. Explique que es el tiempo de duplicación de un microorganismo.
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4. Compare las exigencias nutritivas de los hongos y las levaduras.
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
5. ¿Qué importancia tiene la tinción Güstein?
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Nombre / ID del
alumno
Fecha de entrega
Firma del profesor
Calificación
50
51
52
PRÁCTICA No. 9
Crecimiento radial y determinación de peso seco en cultivos sumergidos de
hongos
I. OBJETIVO
Determinar el crecimiento y peso seco de un cultivo de hongo
II. INTRODUCCIÓN
La determinación de la biomasa es un factor importante que se mide en un proceso
biotecnológico o bioproceso, ya que la determinación de esta variable nos lleva a
comprender lo eficiente que es. Esta variable ayuda a determinar la tasa de producción, el
consumo de nutrientes y el balance de masa de un bioproceso. El peso celular y el número
de células son métodos clásicos directos usados para determinar la biomasa. Dentro de los
métodos para determinar el número células se usan los métodos de observación, basados
en propiedades físicas; en la actualidad resalta un interés sobre métodos alternativos para
determinar biomasa, siendo estos métodos indirectos y miden algún componente celular o
alguna actividad específica del metabolismo.
Dentro del método directo para determinar biomasa se encuentra el método gravimétrico, en
este método la cantidad de biomasa de una muestra puede medirse en términos de peso
seco por unidad de volumen como solidos suspendidos totales. Esta técnica tiene como
desventaja que su determinación incluye no solo microorganismos activos sino
microorganismos muertos, material inerte, polímeros extracelulares y materia orgánica
absorbida. Otra desventaja que presenta es que no se aplica cuando se utilizan sustratos no
solubles.

Cultivo de hongo sumergido, agua destilada, tubos de ensayo, placas Petri vaso de
precipitado, pipeta, centrifuga, horno, balanza electrónica.
IV. PROCEDIMIENTO
Determinación de crecimiento radial de hongos.La medida de crecimiento radial se
realiza en cajas de Petri de 15 cm de diámetro conteniendo aproximadamente 25 mL de
medio Agar Dextrosa de Papa (PDA).
- De una placa de Asperguillus niger se hacen círculos en el agar con un orador y en el

centro de la caja de Petri con PDA se coloca un círculo de agar de Asperguillus niger.
- Las cajas de Petri son incubadas a temperatura ambiente y 30°C durante 12 días.
- Cada día se mide el radio de las cajas y se grafica el crecimiento por día, se calcula la
pendiente y el resultado se expresa la velocidad de crecimiento radial en mm /día.
Recolección y conteo de esporas

Los hongos se inoculan en frascos de Roux con 250 mL de medio agar dextrosa de papa y
se incuban por 5 días a 35°C. Una vez concluida la incubación se recolectan las esporas de
la manera siguiente:
- Se adiciona a los frascos de Roux perlas de vidrio y 50 mL de tween 80 al 0.02%
(estériles).
- Las esporas se remueven por medio de agitación manual suave.
53
- En un matraz Erlenmeyer con la ayuda de un embudo y gasa estéril para retener las
perlas de vidrio.
- De la suspensión de esporas se toma un mililitro para hacer diluciones de 10-1, a la
-3
10 .
- El conteo de esporas se hace en la cámara de Neubauer.
NOTA: Las suspensiones de esporas se pueden almacenar a 4°C por un período no mayor
a 1 mes.
Determinación de biomasa fúngica.

A) Determinación de peso húmedo.
Tomar 5 mL del cultivo y colocarlo en un tubo de ensayo, realizar esto en tres tubos
previamente pesados.
Centrifugar los tubos a una velocidad de 4000 rpm por 10 min y eliminar exceso de
sobrenadante.
Pesar los tubos en una balanza analítica, anotar los pesos y luego promediar.
B) Determinar el peso seco.

Tomar 5 mL del cultivo y colocarlo en 3 tubos de ensayo que fueron previamente pesados.
Centrifugar los tubos para eliminar el exceso de sobrenadante a una velocidad de 4000 rpm
por 10 min.
Llevar los tubos al horno y colocarlos a una temperatura de 105°C por un tiempo
aproximado de 3 horas.
Al terminar las 3 horas pesar los tubos y anotar los pesos y calcular el promedio.
Las ecuaciones para determinar los pesos son:
𝒎𝑯 (𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑡𝑢𝑏𝑜 + 𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝐻ú𝑚𝑒𝑑𝑎) − (𝑃𝑒𝑠𝑜 𝐼𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑇𝑢𝑏𝑜)

𝑷𝒆𝒔𝒐 𝑯ú𝒎𝒆𝒅𝒐 (𝒈 ) =
𝒎𝑳 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (= 5𝑚𝑙)
𝒎𝑺 (𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑡𝑢𝑏𝑜 + 𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑆𝑒𝑐𝑎) − (𝑃𝑒𝑠𝑜 𝐼𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑇𝑢𝑏𝑜)

𝑷𝒆𝒔𝒐 𝑺𝒆𝒄𝒐 (𝒈 ) =
𝒎𝑳 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (= 5𝑚𝑙)
V. RESULTADOS
Peso tubo + Peso tubo + Peso en Peso en

Muestra Peso tubo
muestra húmeda muestra seca húmedo seco
original vacío (g)
(g) (g) (g/mL) (g/mL)
PROMEDIO
54
VI. CONCLUSIONES
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__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
VII. CUESTIONARIO
1. ¿Qué es la biomasa?
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2. Describe otros métodos para determinar biomasa

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__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
3. ¿Por qué es importante determinar biomasa?
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
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Nombre / ID del
alumno
Fecha de entrega
Firma del profesor
Calificación
55
56
57
PRÁCTICA No. 10
Calidad microbiológica del agua en procesos biotecnológicos
I. OBJETIVO
Evaluar la calidad sanitaria del agua para uso y consumo humano e industrial
mediante análisis microbiológicos establecidos en las Normas Oficiales Mexicanas, con el fin
de comprobar si son aptas para estos usos.
Realizar análisis microbiológicos en agua para uso y consumo humano e industrial,

con el fin de evaluar su calidad sanitaria y comprobar si es apta para estos usos.
II. INTRODUCCIÓN
El agua representa uno de los problemas más importantes en el mundo ya que el
80% de las enfermedades infecciosas y parasitarias gastrointestinales, como las diarreicas y
una tercera parte de las defunciones causadas por éstas se deben al uso y consumo de
agua insalubre.
La vigilancia de la calidad del agua para uso y consumo humano, tiene como objetivo
prevenir la transmisión de enfermedades infecciosas y parasitarias, así como las derivadas
de la continua ingestión de sustancias tóxicas que puede contener el agua abastecida a la
población. Ésta debe contemplar programas estructurados por las autoridades competentes,
para evaluar el control de calidad que llevan a cabo los organismos operadores
responsables de los sistemas de abastecimiento y en función de estos programas, apoyarlos
a fin de que se garantice el suministro de agua potable a la población.
Los organismos transmitidos por el agua habitualmente crecen en el tracto intestinal
de humanos y animales de sangre caliente, y abandonan el cuerpo por las heces. Los
microorganismos patógenos que prosperan en los ambientes acuáticos pueden provocar
cólera, fiebre tifoidea, disentería, poliomielitis, hepatitis y salmonelosis, entre otras
enfermedades. Los padecimientos se manifiestan en forma general en el cuerpo como:
diarrea, fiebre, náuseas, vómito y deshidratación, que en casos severos puede causar la
muerte.
Los microorganismos patógenos que más incidencia tienen en la población y que
atacan principalmente a niños y adultos mayores, son Salmonella tiphy, Escherichia coli,
Vibrio cholerae, Shigella, y amibas, atacando con frecuencia a órganos como el esófago,
estómago, duodeno, ano, recto, páncreas e intestinos delgado y grueso.
La determinación de la calidad bacteriológica de un agua es de vital importancia para
el bienestar de la comunidad, ya que un agua contaminada puede provocar epidemias en
una población. La calidad de un agua puede determinarse utilizando diferentes indicadores
microbiológicos de contaminación, entre los más importantes se encuentran la Cuenta Total
Viable de bacterias mesófilas aerobias y de hongos y levaduras, Número Más Probable de
coliformes totales y fecales, aislamiento e identificación por pruebas bioquímicas de
Salmonella sp., y Vibrio cholerae.

Tubos con 9 mL de Agua destilada estéril, frascos de dilución con 90 mL de agua
destilada estéril, cajas de Petri estériles, agar nutritivo, tubos con caldo lauril sulfato de sodio
concentración doble y sencilla con campana Durham, tubos con caldo EC y campana
Durham, agua peptonada amortiguada, caldo RVS, caldo MKTTn, agar XLD, agar ASB, agar
EH, agar verde brillante, agar TSI y LIA, medio SIM, medio RM-VP, caldo peptona alcalino,
agar TCBS.
58
Mecheros, asas, pipetas estériles de 1, 5 y 10 mL, autoclaves, incubadoras, baño María.
IV. PROCEDIMIENTO
Cuenta total viable de organismos mesofilos aerobios (NOM-092-SSA1-1994).
Agitar vigorosamente el frasco que contenga la muestra por 25 veces y transferir 10 ml a
una botella de dilución que contiene 90 mL de agua destilada estéril, para obtener la dilución
10-1 (NOM-110-SSA1-1994).
Realizar diluciones hasta 10-2 para agua potable y hasta 10-5 para agua para uso recreativo.
Colocar 1 mL de las diluciones en cajas de Petri. Para agua potable además se recomienda
sembrar de la muestra directa.
Verter encima Agar nutritivo previamente fundido y enfriado a una temperatura entre 43 y 45
C.
Homogenizar, dejar solidificar e incubar invirtiendo las cajas a 35 - 37 C.
Hacer observaciones a las 24 y 48 horas. Contar el número en aquellas placas en las que
haya entre 30 y 300 UFC.
Hacer los cálculos para determinar el número de microorganismos por ml de la muestra
original
Técnica de los tubos de fermentación múltiple para determinar el NMP de coliformes

totales y fecales (NOM-201-SSA1-2014, apéndice H normativo).
Prueba presuntiva.
Se agita la muestra 25 veces en un arco de 30 cm por 7 s a fin de homogenizar.
Transferir porciones de 10 mL a 10 tubos con caldo lauril sulfato de sodio con campana
Durham e incubar a 35°C ± 0.5°C por 48h ± 2h. Los tubos con turbidez y gas se consideran
positivos.
Prueba confirmativa.
De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una asada y sembrar en un número
igual de tubos de Caldo EC para la prueba confirmativa; inocular en tubos de EC un control
positivo de E. coli y un control negativo de Enterobacter aerogenes e incubar con las
muestras.
Incubar los tubos para prueba de coliformes totales a 35°C ± 0.5°C por 48h ± 2h y para la
prueba de coliformes fecales a 45.5°C ± 0.2°C en baño de agua con recirculación continua
durante 24h, observar si hay formación de gas, registrar la lectura, en caso de no haber
formación de gas, incubar 24h más. Utilizar estos resultados para calcular el NMP de
coliformes totales y coliformes fecales respetivamente. Consultar la sección de cálculos.
Nota: Para todos los alimentos que se les determine coliformes fecales, la incubación debe
ser a 45.5°C ± 0.2°C por 24h a 48h, excepto para muestras de agua que deberán incubarse
a 44.5°C ± 0.2°C durante 24h a 48h.
Realizar el cálculo del Número Más Probable en base a los Anexos 3 y 4 del presente
manual según sea el tipo de agua analizada.
Determinación de Salmonella en agua (NOM-201-SSA1-2014, apéndice A normativo).
Procedimiento analítico.
Pre-enriquecimiento.
En caso de uso general utilizar como medio de pre-enriquecimiento agua peptonada
amortiguada incubar la dilución inicial a 36°C ± 1°C por 18h ± 2h.
Enriquecimiento selectivo.
Transferir 0.1mL del cultivo de pre-enriquecimiento a un tubo del 10 mL de caldo RVS y 1mL
a un tubo conteniendo 10mL de caldo MKTTn.
Incubar el caldo RVS a 41.5°C ± 1°C por 24h ± 3h y el caldo MKTTn a 36°C ± 1°C por 24h ±
3h.
59
Aislamiento e identificación.
Para el aislamiento, inocular a partir de los cultivos obtenidos en el punto anterior, 3 medios
selectivos en placa como sigue:
Agar XLD para el aislamiento de colonias típicas y ASB para aislamiento de colonias lactosa
positivas y cualquier otro medio selectivo sólido complementario. El laboratorio puede
seleccionar que medio utilizar. Por ejemplo, se pueden elegir el EH, Agar Verde Brillante,
entre otros incluidos agares cromogénicos.
El agar XLD se incuba a 36°C ± 1°C durante 24h ± 3h, el segundo y tercer agar selectivo
incubar de acuerdo a las recomendaciones contenidas en los manuales de medios de cultivo
de los fabricantes.
Morfología colonial Típica de Salmonella spp.

Seleccionar 1 o más colonias de Salmonella spp de acuerdo con las características
siguientes, en cada agar selectivo:
XLD. Colonias rosas con o sin centro negro. Muchos cultivos de Salmonella spp pueden
producir colonias con un centro negro muy grande o completamente negras.
EH. Colonias azul-verdes o azules, con o sin centro negro. Muchos cultivos de Salmonella
spp pueden producir colonias con un centro negro muy grande o completamente negras,
después de haber sido incubadas a 36°C ± 1°C durante 24h ± 3h.
ASB. Colonias cafés, grises o negras; algunas veces pueden presentar brillo metálico y el
medio circundante a la colonia generalmente es café al principio y a medida que se prolonga
el tiempo de incubación, pueden aparecer de color negro. Después de haber sido incubadas
a 36°C ± 1°C durante 24h ± 3h o hasta 48h.
Selección de colonias para su confirmación.

Para la confirmación, tomar de cada agar selectivo al menos 1 colonia considerada como
típica o en total 3 colonias sospechosas si no existe la primera posibilidad.
Estriar cada colonia seleccionada en cualquier agar nutritivo, preferiblemente sin agua de
condensación, de tal manera que permita el aislamiento de colonias. Incubar las placas
inoculadas a 36°C ± 1°C durante 24h ± 3h.
Utilizar cultivos puros para la confirmación por pruebas bioquímicas.
Confirmación Bioquímica.
A partir del agar nutritivo, con un asa recta estéril, tocar ligeramente el centro de la colonia
seleccionada e inocular en tubos de agar inclinado de TSI y LIA. Sembrar por picadura en el
fondo y estría en la superficie inclinada. Debido a que la reacción de descarboxilación de la
lisina, es estrictamente anaerobia, el fondo del medio de LIA, debe medir 4 cm y el bisel de
al menos 2.5cm.
Mantener las placas de agares selectivos y nutritivos entre 2°C-8ºC, hasta la conclusión del
análisis.
Incubar los tubos de TSI y LIA a 36°C ± 1°C por 24h ± 3h. Dejar los tapones flojos de los
tubos para mantener condiciones de aerobiosis mientras se incuban evitando excesiva
producción de H2S.
Prueba de ureasa (convencional).

Con un asa estéril inocular tubos de agar urea de Christensen. Debido a que algunas veces
los tubos de agar urea de Christensen sin inocular, pueden virar a rojo púrpura (prueba
positiva), debe incluirse, un tubo de este agar sin inocular como control en una prueba
60
negativa. Para Salmonella spp no se produce cambio en la coloración (amarillo anaranjado).

Incubar 24h ± 2h a 36°C ± 1°C.
Prueba de Indol.
Inocular un tubo conteniendo 5mL del caldo triptona con una suspensión homogénea de la
colonia sospechosa.
Incubar a 36°C ± 1°C por 24h ± 3h después de la incubación adicionar de 0.2 mL a 0.3 mL
de reactivo de Kovac, sin agitar y resbalando por las paredes.
La formación de un anillo de color rojo indica una reacción positiva. Un anillo de color
amarillo indica una reacción negativa.
Prueba de VP.
Re-suspender una asada de la colonia seleccionada en un tubo estéril conteniendo 3mL del
medio VP. Incubar 36°C ± 1°C por 24h ± 3h.
Después de la incubación adicionar dos gotas de solución de creatina, tres gotas de
solución á-naftol y al final dos gotas de solución de KOH, agitar después de cada reactivo.
Interpretar las pruebas bioquímicas comparando los resultados con el anexo 5 del presente
manual para identificar la especie de Salmonella de que se trate.
Determinación de Vibrio cholerae en agua (NOM-242-SSA1-2009)

 Inocular 25 mL de muestra en un matraz que contenga 225 mL de Caldo peptona
alcalino
 Incubar a 35 + 2 ºC por 24 horas.
 Inocular por estrías de agotamiento una caja con Agar TCBS.
 Incubar a 35 + 2 ºC por 24 horas.
 Observar si hay colonias típicas de Vibrio cholerae (amarillas, diminutas, con cambio
de color del medio de verde a amarillo)
 Realizar pruebas bioquímicas a las colonias aisladas.
 Comparar los resultados con bibliografía para identificar a la colonia aislada
V. RESULTADOS
Cuenta total viable de mesofilos aerobios
Agua de uso biotecnológico
Tiempo/Dilución Directa 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
24 h
48 h
- Reporte el NMP de coliformes totales y fecales

- Reporte la ausencia o presencia de Salmonella sp, V. cholerae
61
VI. CONCLUSIONES
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________
VII. CUESTIONARIO
1. ¿Por qué es importante determinar la calidad bacteriológica de agua para uso en

procesos Biotecnológicos?
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
2. Describa los principales indicadores bacteriológicos de contaminación del agua.

__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
3. ¿Qué significado sanitario representa la presencia de E. coli en agua potable?

__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
4. ¿Define al grupo coliforme?

__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
6. Investigue la técnica de filtros Millipore para determinar coliformes.

__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
7. Explique si Salmonella puede estar presente en el agua como contaminante y que

repercusiones tendría al utilizar esta agua en procesos biotecnológicos.
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________
Nombre / ID del
alumno
Fecha de entrega
Firma del profesor
Calificación
62
63
64
BIBLIOGRAFIA
AGUILAR USCANGA B.R., SOLÍS PACHECO J.R., RAMOS IBARRA J.R. (2016). Manual
de Prácticas de Laboratorio Microbiología Industrial. Universidad de Guadalajara,
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AMADOR/MOTA DE LA GARZA/AVILES (1990). Manual de Laboratorio de Microbiología

Sanitaria. Editorial I.P.N., México.
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CARPENTER, PHILLIP (1979). Microbiología. Editorial McGraw-Hill, México.
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MACFADDIN, JEAN F. (2003), Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de

Importancia Clínica, Ed. Médica Panamericana.
MADIGAN, M. (1991). Microbiología. Editorial Prentice-Hall, México.
MARQUEZ, O. (1977). Manual de Prácticas de Microbiología. Editorial Nacional, México.
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NORMA Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994, Bienes y servicios. Método para la Cuenta

de Bacterias Aerobias en Placa.
NORMA Oficial Mexicana NOM-110-SSA1-1994, Bienes y servicios. Preparación y Dilución

de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico.

de Mohos y Levaduras en Alimentos.

de Microorganismos Coliformes Totales en Placa.
Modificación a la NORMA Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-1994, Salud Ambiental. Agua

para Uso y Consumo Humano. Límites Permisibles de Calidad y Tratamientos a que Debe
Someterse el Agua para su Potabilización.
65
NORMA Oficial Mexicana NOM-201-SSA1-2015, Productos y servicios. Agua y Hielo para

Consumo Humano, Envasados y a Granel. Especificaciones Sanitarias.
NORMA Oficial Mexicana NOM-210-SSA1-2014, Productos y servicios. Métodos de Prueba

Microbiológicos. Determinación de Microorganismos Indicadores. Determinación de
Microorganismos Patógenos.
NORMA Oficial Mexicana NOM-230-SSA1-2002, Salud Ambiental. Agua para Uso y

Consumo Humano, Requisitos Sanitarios que Deben Cumplir los Sistemas de
Abastecimiento Públicos y Privados Durante el Manejo del Agua. Procedimientos Sanitarios
para el Muestreo.
NORMA Oficial Mexicana NOM-245-SSA1-2010, Requisitos Sanitarios y Calidad del Agua

que Deben Cumplir las Albercas.
ORGANIZACIÓN PANAMERICANA DE LA SALUD (1990). Criterio Ecológico para aguas de

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http://www.paot.org.mx/centro/ine-semarnat/gacetas/GE06.pdf
PELCZAR/REID/CHAN (1993). Microbiología. Editorial McGraw-Hill, México.
WALTER/MCBEE/TEMPLE (1980). Introducción a la Microbiología. Editorial Cecsa, México.
66
ANEXOS
67
Anexo 1
Técnicas de siembra
Figura 1. Estrías simple
Figura 2. Estrías por agotamiento
Figura 3. Picadura
68
Anexo 2
Perfil bioquímico de Escherichia coli, Salmonella sp., Shigella sp., Enterobacter aerogenes,
Pseudomona aeruginosa
Medios de Escherichia Salmonella Vibrio Shigella Enterobacter Pseudomona
Prueba coli sp. cholerae sp. aerogenes aeruginosa
Oxidasa - - + - - +
Catalasa + + + + + +
Producción de
- V+ - - - -
H2S
Aprovechamiento
del carbono de + + V + + -
glucosa
Aprovechamiento
del carbono de + - V+ - + -
lactosa
Producción de
+ - V V - -
Indol
Rojo de metilo + + V + - -
Vogues-
- - V - + -
Proskauer
Citrato de
- V+ V - + +
Simmons
Utilización del
- - - - V +
Malonato
Ureasa de
- - - - - -
Christensen
Motilidad V+ V+ + - + +
Hidrólisis de la
- - + - V +
gelatina 22°C
Lisina
V+ + V+ - + -
descarboxilasa
Ornitina
V - + V+ + -
descarboxilasa
Producción de
+ V V - + V
gas
O-F de glucosa O/F O/F O/F F O/F O
Fuente: MACFADDIN, JEAN F. (2003), Pruebas Bioquímicas para la Identificación de Bacterias de

Importancia Clínica.
69
Anexo 3
Agua para uso y consumo humano. NMP/100 mL de muestra e intervalos de confianza del 95%
utilizando 10 tubos con 10 mL de muestra.
Fuente: NOM-210-SSA1-2014.
70
Anexo 4
Agua para uso recreativo. NMP/100mL de muestra cuando se usan 5 porciones en cada una de tres
diluciones con series geométricas (10, 1 y 0.1 mL de la muestra).
71
Anexo 5
Interpretación de las pruebas bioquímicas para especies de Salmonella.
72

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Manual de Prácticas de Laboratorio de

Nombre del alumno: __________________________________________________

Manual de Prácticas de Laboratorio de

Instituto Tecnológico de Sonora

Primera edición, 2018

D.R. © 2018, Instituto Tecnológico de Sonora

Impreso y hecho en México

PRÁCTICA No. 9 Crecimiento radial y determinación de peso seco en cultivos

PROTOCOLO DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Reglamento interno del laboratorio e indicaciones de seguridad.

Al cual se sujetarán los alumnos del Laboratorio de Microbiología General para IB

Manejo de Residuos Peligrosos.

Tabla 1. Niveles de seguridad biológica para algunos agentes infecciosos.

RECOMENDACIONES PARA EVALUACIÓN

III. MATERIALES Y EQUIPOS

- Si por algún motivo es necesario detener el proceso de esterilización presione la tecla

1. ¿Qué es la autoclave y el horno de calor seco?

III. MATERIALES Y EQUIPOS

- Reporte las principales operaciones de limpieza y esterilización del material.

3. ¿Qué función tiene la mezcla sulfocrómica en la limpieza del material de vidrio?

4. Definir ¿qué es el punto térmico mortal?

8. Indique cuando menos 4 métodos de esterilización y en qué casos los emplearía.

9. ¿Cuándo se emplean soluciones ácidas o básicas para la limpieza de material de vidrio?

III. MATERIALES Y EQUIPOS

Observación de cultivos puros

b) Cubra la preparación con carbol-fucsina y caliente por el reverso hasta emisión de

- Reporte los cálculos realizados para la preparación de los colorantes y reactivos.

1. Definir que es un colorante.

2. Explique las propiedades de los colorantes básicos y ácidos.

3. ¿Qué es un desinfectante?, de 5 ejemplos.

4. ¿Qué es un mordiente?, de 3 ejemplos.

5. Mencione y dé los usos de 5 equipos más utilizados en el laboratorio de Microbiología.

III. MATERIALES Y EQUIPOS

- Secuencia fotográfica de la apariencia de los medios de cultivo preparados.

9. ¿Qué precauciones se deben considerar en la preparación y esterilización de los

III. MATERIALES Y EQUIPOS

- Estudie y anote las características de cultivo de las cepas sembradas en medio

5. Mencione 5 medios de cultivo para el desarrollo bacteriano e indicando su

6. Mencione 3 medios de cultivo para hongos y levaduras y su composición química

Un aspecto importante de las matrices agua y alimento es la carga microbiana que

No existe un método universal para mantener los cultivos de microorganismos; sin

- Reducción o control de su actividad metabólica mediante refrigeración; este método

- Conservación por congelación y secado; métodos aplicables para periodos largos.

III. MATERIALES Y EQUIPOS

- finalmente congelar las muestras a -20ºC o -80ºC.

- Describir las características macroscópicas y microscópicas de las colonias seleccionadas.

III. MATERIALES Y EQUIPOS

- NaOH y KOH al 40%, α-Naftol, Reactivo de Kovac´s o Ehrlich.

TUBO I TUBO II TUBO III TUBO IV

c) Observe crecimiento y anote resultados de acuerdo a la siguiente clasificación.

- Punto térmico mortal

- Compare los resultados de pruebas bioquímicas con el anexo 2.

Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes métodos. El más común es el de

Una suspensión celular se caracteriza por presentar un número de partículas microscópicas

de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el

Figura 1. Cuadriculas de Cámara de Neubauer

Figura 2. Parte central de la cámara de Neubauer vistas en 4X, 10X, 40X.

El comportamiento de un microorganismo en crecimiento es el resultado de la interacción