Universidad Veracruzana Laboratorio de M

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
Manual de:
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
M.C. Juana Ramírez Aguilera

M.E. Yolanda Medina Romero
QFB. Irma Uscanga García
Agosto 2014
Manual de Laboratorio De Microbiología i

INDICE
INTRODUCCION ........................................................................................................................ iii

JUSTIFICACION .......................................................................................................................... v
OBJETIVOS ..................................................................................................................................vi
EVALUACION DEL DESEMPEÑO ........................................................................................ vii
Acreditación ................................................................................................................................ viii
Práctica No. 1 CONTROL Y ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD EN EL
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA ................................................................................. 1
Practica No. 2 TECNICAS ASÉPTICAS .................................................................................... 4
Práctica no. 3 MÉTODO DIRECTO EN FRESCO ................................................................. 11
Practica No. 4 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO ............................................ 12
Práctica No.5 INOCULACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO ........................................... 16
5.1. CULTIVOS DE AEROBIOS .................................................................................................. 17
5.2. CULTIVO DE ANAEROBIOS .............................................................................................. 23
Práctica No.6. MORFOLOGIA COLONIAL .......................................................................... 28
Practica No. 7 TECNICAS DE TINCIÓN ................................................................................ 33
7.1 TINCIÓN SIMPLE .................................................................................................................. 36
7.2 TINCIÓN DE GRAM .............................................................................................................. 38
7.3 TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN ........................................................................................... 39
7.4 TINCIONES ESTRUCTURALES .......................................................................................... 41
7.5 TINCIÓN DE CÁPSULAS ...................................................................................................... 42
7.6 TINCIÓN DE ESPORAS........................................................................................................ 43
Practica No. 8 PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA LA IDENTIFICACION DE
BACTERIAS: ............................................................................................................................... 45
8.1. PRUEBA DE ROJO DE METILO Y VOGES PROSKAUER (RM – VP) ........................... 45
8.2. REDUCCIÓN DE NITRATOS ............................................................................................. 50
8.3. REACCIONES EN MEDIOS DE: UREA, SIM, TSI, LIA Y CITRATO .............................. 53
8.4. REACCIONES ENZIMÁTICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS .......... 67
Practica No. 9 ACCIÓN OLIGODINÁMICA DE LOS METALES PESADOS Y DE LOS
DESINFECTANTES .................................................................................................................... 75
Practica No. 10 PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS ....... 81
Practica No. 11. PRUEBAS RÁPIDAS ...................................................................................... 86
Practica No. 12 ANÁLISIS MICROBIOLÓGIC DE AGUA PURIFICADA O PARA USO
Y CONSUMO HUMANO. .......................................................................................................... 90
Manual de Laboratorio De Microbiología i

Practica No. 13 ANALISIS MICROBIOLOGICO DE ALIMENTO (MERMELADA O
LECHE)......................................................................................................................................... 95
BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................................ 99
APENDICE A. PREPARACION DE REACTIVOS UTILIZADOS EN ESTE MANUAL101
APENDICE B. PREPARACION DE COLORANTES UTILIZADOS EN ESTE MANUAL
...................................................................................................................................................... 103
APENDICE C. TABLA PARA LA IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS POR
MEDIO DE PRUEBAS BIOQUIMICAS ................................................................................ 105
APENDICE E. MEDIOS DE CULTIVOS ............................................................................. 110
ANEXO 1. REGLAMENTO DEL LABORATORIO ............................................................ 123
ANEXO 2. MATERIAL Y EQUIPO NECESARIO PARA EL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIA ................................................................................................................... 124
Manual de Laboratorio De Microbiología ii

INTRODUCCION
El presente Manual constituye una guía para que el alumno conozca los elementos
temáticos en que se sustenta el curso de Laboratorio de Microbiología, aprecie la profundidad y
los alcances del conocimiento que ira adquiriendo a lo largo del periodo escolar. En este Manual
se ha añadido una breve introducción a cada tema, con el propósito de que el alumno tenga una
visión general del panorama que ofrece cada uno de los temas, sin tener la pretensión, puesto
que no es la idea, de ofrecer un texto de consulta.
En México y en los países denominados del 3er. Mundo, la mortalidad por enfermedades
infecciosas alcanzan cifras alarmantes, comparables a las que presentaban los países
desarrollados a fines del siglo XIX y principios de este. Los agentes etiológicos son bacterias,
virus, parásitos y hongos, y aunque todos ellos muy importantes, son sin embargo las bacterias
las causantes del mayor número de plagas que han diezmado a la humanidad, tanto en pandemias,
epidemias como en enfermedades establecidas en forma endémica. La especificidad de los
diagnósticos clínico y radiológico es difícil y es el Microbiólogo el que generalmente lo
determina con precisión.
Lo anterior habla de por sí, de la necesidad de contar con el profesional especializado en

manejar eficiente y eficazmente este diagnóstico, es decir el Químico Farmacéutico Biólogo. La
Facultad de Q.F.B. prepara a estos profesionales cuyo título es Licenciado en Químico
Farmacéutico Biólogo, los cuales cursan la materia denominada Microbiología.
Esta Experiencia Educativa corresponde al Área de Iniciación a la Disciplina del Plan de

Estudios de Químico Farmacéutico Biologo de la Universidad Veracruzana, pretende que los
estudiantes desarrollen competencia en la ejecución e interpretación de pruebas básicas del
laboratorio de Microbiología. El contenido esta diseñado para lograr su correlación con el curso
teórico y retoma en cada unidad la ejecución de Programas de Control de Calidad en sus etapas
preanalítica, analítica y postanalítica.
Manual de Laboratorio De Microbiología iii

Así mismo durante todo el desarrollo del curso se procurara la formación del estudiante
en las medidas de Bioseguridad y en el manejo de Residuos Peligrosos Biológico Infecciosos. La
metodología esta centrada en el desarrollo de habilidades de ejecución y pensamiento lógico que
permitan al estudiante tener un buen desempeño en un laboratorio de Analisis Clínico,
Farmacéutico de Alimentos etc.; fomenta tanto el trabajo individual como colectivo. Identificar
este extenso y variado número de microorganismos, resulta complicado y difícil sin contar con
las técnicas: metódicas, específicas y accesibles. Este conjunto de características deben estar al
alcance de los estudiantes.
El Manual se ha diseñado, siguiendo el orden sistemático del programa de la experiencia

educativa del laboratorio de Microbiología. Es de esperar que este material llene la demanda de
los jóvenes en formación y aún, que sea de gran utilidad a los egresados, y a todos aquellos que
se dedican al diagnóstico microbiológico. La metodología está centrada en el desarrollo de
habilidades de ejecución y de pensamiento que permitan al alumno tener un buen desempeño en
un laboratorio de análisis clínicos; fomenta tanto el trabajo individual como colectivo. En la
evaluación del aprendizaje se consideran la realización de prácticas, participación, entrega de
reportes por escrito, así como exámenes teóricos y prácticos.
Manual de Laboratorio De Microbiología iv

JUSTIFICACION
El laboratorio de Microbiología constituye una parte fundamental en las áreas donde incursiona
el Q.F.B. (Clínica, Farmacéutica, Alimentos), ya que esta enfocado al desarrollo de habilidades
en el estudiante para que sea capaz redesarrollar e interpretar la metodología analítica utilizada
para la ejecución de las distintas pruebas indispensables para él diagnóstico microbiológico, de
acuerdo a las normas de control de calidad que le permitirán su integración en el mercado laboral.
El laboratorio de microbiología pone de manifiesto para el estudiante la importancia de la
preparación y condiciones para la toma de muestras, así como el adecuado manejo de las mismas.
La realización de las pruebas utilizando métodos manuales, semiautomatizados o automatizados

que permitirán al alumno comprender sus ventajas y desventajas. Parte importante de esta
experiencia educativa es la formación del estudiante para el trabajo en equipo ínter y
multidisciplinario, así como las relaciones humanas.
La elaboración de este Manual es muy importante ya que sirve de guía para el alumno,
proporcionandole las herramientas básicas para cursar con mayor facilidad esta experiencia
educativa del laboratorio de microbiología.
Manual de Laboratorio De Microbiología v

OBJETIVOS
Objetivo general
Que el estudiante adquiera los conocimientos y desarrolle las habilidades necesarias para su
incorporación al trabajo en el área de microbiología, asegurando la calidad de los resultados
obtenidos, mediante la operación de un programa de control de calidad, además de que desarrolle
las actitudes que le permitan el trabajo responsable en equipo y su interpelación.
Objetivos particulares
Que el estudiante
1. Seleccione, realice e interprete adecuadamente las pruebas básicas de laboratorio de
microbiología
2. Aplique adecuadamente los programas de control de calidad en el laboratorio.
3. Maneje la legislación básica relacionada con el laboratorio.
4. Aplique los aspectos administrativos básicos de laboratorio.
5. Desarrolle aprendizaje autónomo, trabajo en equipo, trabajo de investigación, así como
actitudes profesionales de apertura, autocrítica, compromiso y responsabilidad social.
Manual de Laboratorio De Microbiología vi

EVALUACION DEL DESEMPEÑO
Ámbito(s) de Evidencia (s) de Criterios de desempeño Porcentaje

aplicación desempeño %
Laboratorio Examen escrito 0
Laboratorio Guía de observación 30

Prácticas de acuerdo al programa.
5
manejo del equipo de laboratorio.
5
desarrollo de los procedimientos
de laboratorio
5
comportamiento en el laboratorio
(responsabilidad, compromiso,
optimismo, atención, honestidad)
(colaboración, participación, 5
tolerancia, respeto, etc
Laboratorio Bitácoras personales 5
Laboratorio * Reporte de práctica 20

incluidas en el programa reporte.
* La entrega es
individual; excepto los elementos establecidos para cada
resultados. La reporte).
información no debe ser
igual entre los comentarios personales, análisis y
estudiantes. conclusión.
n.
Laboratorio Examen escrito (2) 25
en el laboratorio
Total 100
Manual de Laboratorio De Microbiología vii

Acreditación
100% de asistencia al curso de laboratorio.
de los reportes de las prácticas de laboratorio solicitados.
% equivale a la teoría y el 40 % al laboratorio.
Manual de Laboratorio De Microbiología viii

Práctica No. 1 CONTROL Y ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD EN EL
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
INTRODUCCION
El laboratorio clínico de microbiología moderno, requiere para su correcto funcionamiento de un
adecuado y constante control de calidad sobre todas las etapas en el recibo, manejo y reporte de
especimenes clínicos.
En general este control debe identificar, monitorear, evaluar y aprobar metodologías relativas al
cuidado del paciente. En este contexto el control de calidad en Microbiología Clínica envuelve el
monitoreo de los medios de cultivos, reactivos, instrumentos, procedimientos y el personal, para
asegurar una adecuada práctica en el aislamiento, identificación y caracterización de agentes
etiológicos y su correspondiente prueba de susceptibilidad como una guía de la terapia.
Un programa de control de calidad debe incluir además un Manual de Procedimientos, validación

de metodologías y equipos, el desarrollo de ciclos de educación continuada, elementos de
bioseguridad y una supervisión sobre los reportes generados. En éste sentido se hace énfasis en la
correcta valoración de las pruebas de laboratorio, los agentes causales de enfermedades, el
conocimiento de la flora normal, la taxonomía bacteriana y la interpretación correcta de las
pruebas de susceptibilidad a los antibióticos.
El Aseguramiento de la Calidad, es un concepto un tanto más difícil de cuantificar que el control

de calidad, ya que su foco es el impacto de las pruebas de laboratorio en el cuidado del paciente.
Este control nos indica que tan bueno es nuestro trabajo y establece mecanismos para asegurar la
generación de información de utilidad clínica rápida y segura. Este concepto incluye
entrenamiento y calificación del personal, evaluación de los reportes, rapidez y seguridad
diagnóstica, certificación de los laboratorios, controles externos, etc. El Control de Calidad y el
Aseguramiento de la Calidad son similares en sus propósitos, aunque su significado y su manera
de funcionar sean diferentes; sin embargo, ambos conceptos deben desarrollarse interactivamente
durante un programa de control de calidad.
El control de calidad en el laboratorio tiene como objetivo , que el producto final del trabajo
tenga un grado aceptable de seguridad , de conformidad con los limites establecidos. Debido a
que la mayoría de los resultados en microbiología son producto de interpretaciones y evaluación
de reacciones bioquímicas de seres vivos, donde la capacidad y experiencia del evaluador tienen
un gran valor, los cálculos de coeficientes de variación y desviaciones estándares que son parte
de funciones analíticas, tienen poca aplicación en el laboratorio de microbiología. Es por ello que
algunos expertos consideran que el control de calidad en microbiología es mas un arte que una
ciencia.
Un programa de control de calidad debe contar con los siguientes elementos mínimos:
Las pruebas y los procedimientos.

Verificación y validación del test.
Manual de procedimientos.
Manual de Laboratorio De Microbiología 1

Mantenimiento de reportes y libros de registros.
Evaluación del personal.
Controles externos.
El programa evalúa y documenta el desempeño de todos los aspectos de un procedimiento. Esto
incluye la calidad del espécimen, la eficiencia de los reactivos, medios e instrumentos y verifica
los resultados del test por errores.
El Manual de Procedimientos del laboratorio de microbiología, debe contener todos los aspectos
relevantes en la operación del laboratorio y la generación de reportes que tienen que ver con la
salud de los pacientes.
El factor más importante en la generación de reportes microbiológicos de calidad corresponde al

personal. El personal del laboratorio de microbiología debe ser escogido en base a sus cualidades
académicas y personales. Debe poseer habilidad para ejecutar pruebas complejas, la mayoría de
las veces manuales, interés en mantenerse al día en las ejecutorias y taxonomía bacteriana,
excelente concepto de protección de grupo y de bioseguridad en general.
El control de calidad en resumen, es un elemento vital en el laboratorio, ya que ayuda en la

confiabilidad de las pruebas, su reproducibilidad, asegura la calidad de los materiales, reactivos y
equipos empleados, mejora la auto confianza del personal, detecta fallas que pueden reflejarse en
el informe de resultados y en general provee un entorno de excelencia en todos los aspectos del
trabajo.
Conociendo los elementos básicos que debe poseer un programa de control de calidad moderno,
los albores de un nuevo milenio nos obligan a la confección de un Manual que pueda ser una guía
para el personal dedicado a la microbiología clínica en el país, una disciplina de las Ciencias del
Laboratorio en constante evolución que marcha a la par del progreso de la medicina moderna.
En atención a los inminentes cambios globales que traerán los años futuros, presentamos a la
consideración de todos los colegas el siguiente Manual de Control de Calidad en Microbiología,
el cual esperamos llene las expectativas y necesidades en nuestros laboratorios.
OBJETIVO
 Realizar los Controles de Calidad de insumos, materiales y equipos de este laboratorio,
así como el desarrollo de bitácoras en la etapa preanalítica, analítica y postanalítica.
 Establecer de acuerdo a la normatividad y legislación vigente cuales son las medidas de

higiene y seguridad que se requieren para un laboratorio de microbiología.
a) Control de calidad de los medios de cultivo.

b) Control de calidad de los reactivos.
c) Control de calidad de colorantes.
d) Control de calidad de las soluciones.
e) Control de calidad del agua.
f) Control de calidad de los sensidiscos.
g) Control de calidad de los equipos e instrumentos.

h) Control de calidad de los materiales
i) Medidas de seguridad en este laboratorio
j) Bioetica y bioseguridad
k) NOM 087, 166 etc.
l) Manejo de Residuos Peligrosos Biológico Infecciosos.
m) Estructura organizacional de este laboratorio.
NORMAS
Se utilizaran las normas de laboratorio clínico publicada en el Diario Oficial. Jueves 13 de enero
de 2001. 1ª sección. Norma Oficial Mexicana NOM-166-SSA1-1997, para la organización y
funcionamiento de los laboratorios clínicos y Diario Oficial. Jueves 1º de noviembre de 2001. 1ª
sección. Proyecto de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-087-ECOL-SSA1-2000. Protección
ambiental-Salud ambiental-Residuos peligrosos biológico-infecciosos. Clasificación y
especificaciones de manejo.
Diario oficial. Lunes 17 de febrero de 2003. Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-

SSA1-2002. Protección ambiental-Salud ambiental-Residuos peligrosos biológico-infecciosos.
Clasificación y especificaciones de manejo.
REFERENCIAS
1. Williams N. How reliable is laboratory testing? Available for: URL
http://labtestsonline.org/understanding/features/
2. reliability/hmt. February 2005. Consultado junio 5, 2006.
3. ISO 15189:2003 Medical Laboratories – Particular requirements for quality and
competent. Available for: URL http://www.iso.org/iso/en. February 2003. Consultado
junio 10, 2006.
4. Sierra Ari. El laboratorio clínico y el control de calidad. Editorial
Bioquimia 2006; 31 (2): 39-40

Practica No. 2 TECNICAS ASÉPTICAS
INTRODUCCION
Métodos Químicos
Estos métodos son realmente desinfectantes o antisépticos, a pesar de que muchos los
consideran esterilizadores. Los desinfectantes son los que comúnmente se utilizan para limpiar el
material del laboratorio como son: las mesas, pisos, e instrumentos y los antisépticos son los que
se utilizan para la desinfección de los tejidos corporales, aunque la mayoría son muy tóxicos;
algunos productos utilizados son:
Oxido de etileno.- Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógenos

lábiles como los que tienen grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos, hidroxilos,etc. Es utilizado
en la esterilización gaseosa, generalmente en la industria farmacéutica. Destruye todos los
microorganismos incluso virus. Sirve para esterilizar material termo sensibles como: goma,
plástico, papel, etc, equipos electrónicos, metal, etc. Es muy peligroso por ser altamente
inflamable y explosivo, y además cancerigeno.
Aldehídos.- Son agentes alquilantes que actúan sobre las proteínas, provocando una
modificación irreversible en enzimas e inhiben la actividad enzimática. Estos compuestos
destruyen las esporas.
Glutaraldehídos.- Consiste en preparar una solución alcalina al 2% en la cual se debe

sumergir el material a esterilizar de 20 a 30 minutos, y luego un enjuague de 10 minutos.
Este método tiene la ventaja de ser rápido y ser el único esterilizante efectivo frío. Puede
esterilizar plástico, goma, vidrio, metal, etc.
Formaldehído.- Se utilizan las pastillas de paraformaldehído, las cuales pueden

disponerse en el fondo de una caja envueltas en gasa o algodón, que después pueden ser
expuesta al calor para un rápida esterilización (acción del gas formaldehído). También pueden
ser usadas en Estufas de Formol, que son cajas de doble fondo, en donde se colocan las
pastillas y se calienta hasta los 60° C y pueden esterilizar materiales de látex, goma, plásticos,
etc.
Las pastillas de formalina a temperatura ambiente esterilizan en 36 hs.
Esterilización por gas-plasma de Peróxido de Hidrógeno.- Es proceso de esterilización

a baja temperatura la cual consta de la emisión de peróxido de hidrógeno en fase plasma
(estado entre líquido y gas), que ejerce la acción biocida.
Posee como ventajas:
1. No deja ningún residuo tóxico.

2. Se convierte en agua y oxígeno al final del proceso.

3. El material no precisa aireación.
4. El ciclo de esterilización dura entre 54 y 75 minutos.
Desventajas:
1. No se pueden esterilizar objetos que contengan celulosa, algodón, líquidos, humedad, madera.
2. Es el método de esterilización más caro de entre los descritos.
Métodos físicos
Son los métodos físicos utilizados para la esterilización como: radiación, filtración y
calor.
Radiación.- la luz ultravioleta es bactericida desde la longitud de onda de 633 nm y su actividad

bactericida aumenta a menores longitudes de onda. La radiación Ionizante, como los rayos X son
mortales para todas las células, incluso bacterias y esporas, cuando se usa en dosis y tiempo
suficientes. Existen diversos tipos de radiación como son:
 Ionizantes.- Producen iones y radicales libres que alteran las bases de los ácidos
nucleicos, estructuras proteicas y lipídicas, y componentes esenciales para la viabilidad de
los microorganismos. Tienen gran penetrabilidad y se las utiliza para esterilizar
materiales termolábiles (termosensibles) como jeringas descartables, sondas, etc. Se
utilizan a escala industrial por sus costos.
 Rayos Gamma.- Su empleo esta basado en los conocimientos sobre la energia atomica.
Este tipo de esterilización se aplica a productos o materiales termolábiles y de gran
importancia en el campo industrial. Puede esterilizar antibióticos, vacunas, alimentos, etc.
Filtración.- Este se utiliza en soluciones que no toleran temperaturas altas como: aceites,
algunos tipos de pomadas, soluciones oftálmicas, soluciones intravenosas, drogas diagnósticas,
medios para cultivos celulares, y soluciones de antibióticos y vitaminas, en este método se
utilizan filtros con poros de 1.0 nm o menos y por ello retienen las bacterias. En el comercio se
encuentran diferentes tipos de filtros de diversos materiales, por ejemplo: tierras infusoriales,
porcelana no glaseada, vidrio molido y membranas de celulosa. Se debe tener en cuenta que los
líquidos no pasan fácilmente a través de los filtros por gravedad y por ello es necesario aplicar
presión.
Calor
La utilización de este método y su eficacia depende de dos factores: el tiempo de

exposición y la temperatura. Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la
acción del calor. El calor provoca desnaturalización de proteínas, fusión y desorganización de las
membranas y/o procesos oxidantes irreversibles en los microorganismos; el calor aplicado puede
ser de dos tipos seco y húmedo.
Calor seco

Este requiere generalmente mas temperatura de esterilización que el calor húmedo y por
eso no se usa para materiales que se carbonizarían o destruirían, como es el caso del material
de plástico, y los medios de cultivo. Existen diversos tipos de calor seco como son:
Flameado.- se usa para esterilizar las bocas de frascos y tubos de cultivo, portaobjetos,
cubreobjetos y varios instrumentos.
Quemado.- se usa para esterilizar espátulas y asas de inoculación manteniendo el objeto en la

llama del mechero de gas hasta que tomen un color rojo vivo.
El horno de calor seco, aunque puede ser de gas o eléctrico, es utilizado para artículos de
vidrio, instrumentos de metal, y otros materiales que deban estar secos para su uso. Diversos
polvos, aceites o vaselina también se esterilizan aquí por que son afectados por la humedad.
Ventajas del calor seco:
 No es corrosivo para metales e instrumentos.

 Permite la esterilización de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias
viscosas no volátiles.
Desventajas:
 Requiere mayor tiempo de esterilización, respecto al calor húmedo, debido a la baja

penetración del calor.
Calor Húmedo
La esterilización completa por medio del calor húmedo se logra aplicándolo con
temperaturas mayores de 100 °C, usando vapor saturado bajo presión, en la autoclave durante un
tiempo fijado a una determinada temperatura. El vapor a una presión de 15 libras por pulgada
cuadrada (Psi) sobre la presión atmosférica tiene una temperatura de 121 °C , hasta las esporas
mas resistentes mueren, mientras que en el horno de calor seco se requiere de una hora a 160 °C,
este es el tipo de esterilización mas utilizado.
El calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de proteínas. Estos efectos se

deben principalmente a dos razones:
1. El agua es una especie química muy reactiva y muchas estructuras biológicas son
producidas por reacciones que eliminan agua.
2. El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho más elevado que el
aire.
Autoclave
Se realiza la esterilización por el vapor de agua a presión. El modelo más usado es el de

Chamberland. Esteriliza a 121º C a una atmósfera de presión (estas condiciones pueden
variar)y se deja el material durante 20 a 30 minutos.
Equipo:
Consta de una caldera de cobre, sostenida por una camisa externa metálica, que en la parte
inferior recibe calor por combustión de gas o por una resistencia eléctrica, esta se cierra en la
parte superior por una tapa de bronce. Esta tapa posee tres orificios, uno para el manómetro, otro
para el escape de vapor en forma de robinete y el tercero, para una válvula de seguridad que
funciona por contrapeso o a resorte.
Funcionamiento:
1. Se coloca agua en la caldera, verificando que sea el adecuado para que su nivel no alcance
a los objetos.
2. los objetos se colocan en una canastilla de metal que se introduce y se pone sobre la rejilla
de metal de la autoclave.
3. se enciende la autoclave, se cierra asegurando la tapa, teniendo cuidado de cerrar las
llaves en parejas para evita que estas se salgan y garantizando que la fuerza sea la misma
en cada una de las llaves; se debe dejar abierta la válvula de escape hasta que todo el aire
se desaloje y comience la salida de vapor en forma de chorro continuo y abundante.
4. cuando el vapor comience a salir por la válvula, esta se cierra y la presión y temperatura
comenzaran a aumentar. Eperar a que suba a 1 kg de presión, apagar o bajar el termostato
a medio hasta cero, abriendo la valvula de escape, posteriormente volver a cerrar la
valvula de escape y esperar a que suba la temperatura a 121oC o 15 libras de presión o la
indicada para esterilizar. Debe verificarse continuamente que el autoclave no rebase las
condiciones adecuadas.
5. cuando se ha llegado a las condiciones de presión, temperatura y tiempo adecuado, el
autoclave se desconecta y se abre lentamente la válvula para que el vapor escape
lentamente, solo se puede abrir la tapa cuando ya haya bajado la presión por completo.
Tyndalización
Esterilización por acción discontinua del vapor de agua, se basa en el principio de Tyndal
Las bacterias que resisten una sesión de calefacción, hecha en determinadas condiciones, pueden
ser destruidas cuando la misma operación se repite con intervalos separados y en varias sesiones.
Se efectúa por medio del autoclave de Chamberland, dejando abierta la válvula de escape, o sea
funcionando a la presión normal. Puede también realizarse a temperaturas más bajas, 56º u 80º
ocúpara evitar la descomposición de las sustancias a esterilizar, por las temperaturas elevadas.
Ventajas del calor húmedo:
 Rápido calentamiento y penetración

 Destrucción de bacterias y esporas en corto tiempo
 No deja residuos tóxicos
 Hay un bajo deterioro del material expuesto
 Económico
Desventajas:

 No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua
 Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos
Control de calidad de la autoclave
El autoclave es un aparato que requiere de gran cuidado, es recomendable que siempre

este en perfectas condiciones, pues de esto depende en gran parte obtener resultados confiables.
1. Debe estar en un lugar protegido, limpio y completamente plano para evitar algún
accidente.
2. El agua que se utiliza debe ser limpia, se debe verificar después de su utilización que el
agua permanezca transparente ya que si no es así puede indicar que hubo derrame dentro
del autoclave, que pueda dañara o tapar su interior.
3. Se recomienda que una vez por semana se añada en la carga para esterilizar, cintas
indicadoras, esto es para observar el funcionamiento del autoclave, aunque esto no indica
que este realizando una buena esterilización.
4. Para un control adecuado de l a autoclave se sugiere utilizar ampolletas biondicadoras
(ampulas de vidrio selladas) que contienen una suspensión de esporas de concentración
conocida en un medio de cultivo de composición definida y requerida para que las
esporas presentes puedan germinara incubando en la ampula intacta, sin peligro de una
contaminación posterior. Además de indicar si el autoclave presenta las condiciones
necesarias , también va a verificar la distribución del calor en las diversas áreas de la
cámara de esterilización.
FUNDAMENTO:
La esterilización es el proceso físico o químico que destruye a todas las formas de

microorganismos: la esterilización es un procedimiento esencial en la microbiología, ya que la
preparación de medios, el asilamiento y mantenimiento de cultivos puros depende de la
esterilidad de recipientes, artículos de vidrio e instrumentación; comprende todos los
procedimientos físicos, mecánicos y químicos, que se emplean para destruir gérmenes
patógenos.
OBJETIVO:
 Aprender el manejo de los equipos, materiales y sustancias que son empelados en este
laboratorio con fines de sepsis.

Imagen del autoclave y sus componentes
Válvulas de escape y Tapa del autoclave

descarga Empaque
Válvula de seguridad
Camara del Autoclave
Nivel de Agua
Encendido y apagado
Manometro
Partes internas del autoclave:

Canastilla
Base del autoclave Rejilla de protección de las
resistencias
ACTIVIDADES:
Contestar las siguientes preguntas:
1. ¿Qué es un autoclave?
2. Elaborar una lista de los materiales que se puedan esterilizar por calor seco o calor
húmedo, según corresponda.

NORMAS
Se utilizaran las normas de laboratorio clínico publicada en el Diario Oficial. Jueves 13 de enero
de 2001. 1ª sección. Norma Oficial Mexicana NOM-166-SSA1-1997, para la organización y
REFERENCIAS
1. NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Protección ambiental - Salud
ambiental - Residuos peligrosos biológico-infecciosos - Clasificación y especificaciones
de manejo. http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/087ecolssa.html
2. Guía para el manejo de los residuos peligrosos biológico infecciosos en unidades de

salud.
http://www.dgepi.salud.gob.mx/pandemia/PS%20materiales/Guiamanejoresiduos.pdf
3. Williams N. How reliable is laboratory testing? Available for: URL

http://labtestsonline.org/understanding/features/
4. reliability/hmt. February 2005. Consultado junio 5, 2006.
5. ISO 15189:2003 Medical Laboratories – Particular requirements for quality and
competent. Available for: URL http://www.iso.org/iso/en. February 2003. Consultado
junio 10, 2006.
6. Sierra Ari. El laboratorio clínico y el control de calidad. Editorial
Bioquimia 2006; 31 (2): 39-40

Práctica no. 3 MÉTODO DIRECTO EN FRESCO
INTRODUCCIÓN
Mediante el examen directo en fresco se pueden detectar hemoflagelados o microfilarias, debido a su
motilidad o a su gran tamaño. Sin embargo, es necesario realizar preparaciones teñidas, para visualizar las
características morfológicas específicas, ya sea en extendido delgado o gota gruesa. Para estudios de
diagnostico micologico se emplean exámenes directos: al estado fresco, preparaciones con hidróxido de
potasio (KOH).
OBJETIVO
Observar algunos microorganismos de forma directa, a través de muestras que permitan apreciar su
morfología.
a) Examen en fresco de muestras de agua de charca, copros, mohos de pan, tortilla, yoghurt,
levaduras etc.
b) Observaciones de preparaciones fijas
MATERIAL
a) Frascos gotero con lugol.
b) Frascos gotero con solución de NaCl a 0.85%.
c) Aplicadores de madera.
d) Portaobjetos de 26 x 76 mm.
e) Cubreobjetos de 22 x 22 mm.
f) Microscopio
TECNICA
A) Colocar una gota de solución NaCl al 0.85%, en un portaobjetos.
b) Con un aplicador obtener aproximadamente 2 mg de la materia fecal y
mezclarla en la gota de solución salina.
c) Hacer una suspensión uniforme y retirar los detritos macroscópicos.
d) Colocar un cubreobjetos y hacer la observación microscópica inmediatamente con los
objetivos 10X y 40X.
e) En otro portaobjetos colocar una gota de lugol y continuar como con la gota de solución
salina.
NORMAS
Se utilizaran las normas de laboratorio clínico NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-
SSA1-2002, Protección ambiental - Salud ambiental - Residuos peligrosos biológico-infecciosos
- Clasificación y especificaciones de manejo.
http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/087ecolssa.html
REFERENCIAS
1. TORTORA GJ. Introduccion a la Microbiología. (9ª Ed.) Ed. Panamericana. 2007
2. BAILEY SCOTT. Diagnostico Microbiologico. Panamericana. 2009
3. TAY ZAVALA JORGE. Microbiología y Parasitología Medica, Ed. 3ª Edit. Méndez Editores,
México D.F. 2003
4. MURRAY, P. R.; ROSENTHAL, K. S; PFALLER, M. H.: Microbiología Médica. (6ª
Ed.) Elsvier, 2009

Practica No. 4 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
INTRODUCCION
Los microorganismos heterotróficos a cuyo grupo pertenecen los gérmenes patógenos,

necesitan una amplia variedad de exigencias para su cultivo; la exigencia mas importante es la
nutricional que se puede satisfacer en un medio de cultivo. Los componentes básicos para un
medio de cultivo de microorganismos son los siguientes:
1. Extracto de carne: el cual aporta al medio de cultivo carbohidratos, componentes

orgánicos nitrados, vitaminas y sales.
2. Peptonas: obtenidas a través de una hidrólisis parcial de proteínas, aportan nitrógeno
orgánico.
3. Agar: es un carbohidrato obtenido de algas marinas, da consistencia sólida al medio por
su acción como coagulante. No aporta ningún valor nutritivo.
Existen medios de cultivo sólidos que contienen suficiente agar, medios semisólidos que
contienen una cantidad mínima de agar y medios líquidos (caldos) que no contienen agar ni
gelatina. De acuerdo a la composición química de los medios de cultivo se pueden clasificar
como:
1. Medios simples: están compuestos por los nutrientes básicos, ejemplo: Agar y caldos
nutritivos.
2. Medios enriquecidos: contienen sustancias que proveen al medio de nutrientes
necesarios para el desarrollo de microorganismos exigentes, por ejemplo: Agar chocolate
y agar sangre.
3. Medios selectivos: contienen sustancias que inhiben el crecimiento de algunos
microorganismos pero que permiten el desarrollo de otros, ejemplo: Medio de
Salmonella-Shigella.
4. Medios diferenciables: contienen sustancias químicas que permiten diferenciar las
transformaciones metabólicas ocurridas en el medio por las bacterias.
De acuerdo en la manera en que se utilizarán, los medios de cultivo sólidos se pueden

emplear en diversas formas:
 En placa: se utilizan cajas Petri, adicionando el medio de cultivo todavía liquido ya

esterilizado, a una temperatura aproximada entre 45 y 50 °C para evitar la formación de
agua en la tapadera de la caja. El volumen que se adiciona es de aproximadamente 15 o
20 ml.
 En tubo de agar inclinado: los tubos con agar esterilizado todavía líquido, son
colocados en una posición inclinada de tal forma que se forme una capa aproximada de
3 cm y una superficie inclinada de iguales dimensiones dejando que se solidifique. Los

tubos de agar inclinado se han utilizado para conservación de cepas en algunas pruebas
bioquímicas.
Medios de cultivo líquido se usan por lo general en un tubo en cantidades especificas para cada
prueba.
Los recipientes destinados a la preparación se limpiaran perfectamente con agua limpia

destilada esto es con el fin de eliminar cualquier residuo de otra sustancia que pueda alterar la
composición del medio. Es importante tener en cuenta que el recipiente sea grande, para que el
medio de cultivo que se prepare pueda ser agitado con facilidad y no se derrame.
FUNDAMENTO:
Un medio de cultivo es una sustancia en la que se puede desarrollar un microorganismo;

contiene los elementos nutritivos esenciales en una concentración adecuada, la necesaria cantidad
de sales, el adecuado volumen de agua, exento de sustancias inhibidoras del organismo que se va
a cultivar, tiene la consistencia deseada, el pH adecuado y es estéril.
OBJETIVO:
 Elaborar medios de cultivo, que se utilizaran para el aislamiento e identificación de

bacterias.
MATERIAL:
 Matraces Erlenmeyer de 500ml
 Probeta graduada de 250 ml
 Cajas Petri
 Tubos c/ tapón de rosca de 13 x 100.
 Parrilla de calentamiento.
 Gasa
 Algodón
 Mechero Bunsen
 Espátula limpia.
 Desinfectante
 Preparar Los Siguientes Medios:
EMB, AGAR SANGRE, AGAR
CHOCOLATE, AGAR VOGEL
JOHNSON, AGAR SS, CALDO
NUTRITIVO Y CALDO
TIOGLICOLATO; aproximadamente
50 ml de los caldos y 100ml de cada
agar.

TÉCNICA:
1. Consultar las indicaciones del fabricante del medio de cultivo a preparar para conocer las
condiciones en las que se elaborara el medio.
2. Pesar exactamente la cantidad del medio de cultivo calculada por regla de tres en relación
con la especificada en el envase para un litro. El medio deshidratado se debe pesar en papel
aluminio o cera, limpio.
3. Al medio de cultivo pesado se le añade aproximadamente la mitad del agua destilada, se
agita lo suficiente tratando de hacer una suspensión homogénea, se deja reposar unos
minutos y después se le adiciona el resto del agua arrastrando el medio que pudo quedar
pegado en las paredes del matraz.
4. el medio de cultivo se debe calentar para disolverlo. Este calentamiento debe efectuarse en
baño María o directamente en la parrilla. El medio estará listo cuando al agitar el recipiente
no se adhieran a las paredes internas, partículas del agar. Es necesario que el tiempo de
calentamiento sea el indicado, ya que los medios de cultivo son muy sensibles. Los medios
de cultivo que no contienen agar son fáciles de disolver en el agua fría o con un ligero
calentamiento.
5. la esterilización del medio de cultivo se lleva a cabo en autoclave, a 121 °C durante 15
minutos. Se recomienda repartir el medio en porciones mas pequeñas por ejemplo, en los
tubos donde va a quedar definitivamente, no se recomienda esterilizar en las cajas Petri.
6. se debe verificar si el pH del medio preparado es el especificado, este puede ser medido con
un potenciómetro, si el medio es solido debe ser medido a una temperatura de 45 o 50°C
(líquido) y si es líquido a temperatura ambiente.
7. el vertido en placas se debe hacer, cuando el medio se encuentre a una temperatura de 45 o
50 °C, en un ambiente estéril, evitando la formación de burbujas, si esto ocurre al terminar
el vaciado se pasa el mechero rápidamente por la caja con el medio. El volumen que se le
agrega a la caja es de unos 15 o 20 ml. En los tubos dependiendo del tamaño se adicionara
aproximadamente la mitad del tubo cuando son agares, y para el medio de cultivo líquido
(caldos) se le agregara a cada tubo de 2 a 3 ml.
8. cuando el medio de cultivo este solidificado o frío se empaquetaran en cajas o en tubos y se
rotularán con el nombre del medio, fecha de preparación, numero de equipo que lo elaboro
y se guardaran en el refrigerador en forma invertida.

ACTIVIDADES:
1. ¿qué necesidades nutricionales en términos de sustancias químicas son necesarias para el

desarrollo de los microorganismos?
2. ¿cuáles son los ingredientes del caldo nutritivo y del agar nutritivo, que tipo de nutrientes
puede aportar cada uno de sus componentes?
3. Desde el punto de vista químico ¿cuál es la diferencia entre caldo nutritivo y un medio
sintético?
4. ¿cuál es la diferencia entre las bacterias fototróficas y las quimiotróficas, y entre las
autotróficas y las heterotróficas?
NORMAS
Se utilizaran las normas de laboratorio clínico publicada en el Diario Oficial. Jueves 13 de enero de
2001. 1ª sección. Norma Oficial Mexicana NOM-166-SSA1-1997, para la organización y
REFERENCIAS
3. TAY ZAVALA JORGE. Microbiología y Parasitología Medica, Ed. 3ª Edit. Méndez Editores,
México D.F. 2003
4. MURRAY, P. R.; ROSENTHAL, K. S; PFALLER, M. H.: Microbiología Médica. (6ª Ed.)
Elsvier, 2009

Práctica No.5 INOCULACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO
INTRODUCCION:
En la microbiología se debe destacar la importancia de obtener un buen cultivo de bacterias,

ya que de esto depende que se puedan observar fácilmente las características de las colonias,
propiedades bioquímicas morfología, reacciones de coloración, reacciones inmunológicas y la
susceptibilidad de una especie microbiana a los agentes antimicrobianos. En la naturaleza los
microorganismos se presentan como cultivos mezclados que contienen una gran variedad de géneros
y especies individuales es necesario aislarlos en un cultivo puro, es decir un cultivo que contenga
una sola especie.
El medio que requiere para obtener un crecimiento puede ser líquido o sólido. Se debe tener
en cuenta que el medio debe tener las propiedades y características apropiadas para el crecimiento
así como también las condiciones ambientales óptimas, como son: Temperatura, pH, presión y
oxígeno.
Al inocular un medio de cultivo para hacer crecer cierto microorganismo es necesario tomar
una muestra de este, teniendo cuidado de mantener la pureza del cultivo. A este procedimiento se le
conoce como técnica aséptica. El asa de inoculación debe ser esterilizada en la llama al rojo vivo,
antes y después de inocular el medio. El asa debe mantenerse en el fuego del mechero de manera
que caliente a lo largo y en la base del mango. El asa o aguja que generalmente se utiliza es de
Nichrome o platino, calibradas para contener 0.01 ó 0.001 ml de líquido. La aguja de inoculación es
un alambre recto del mismo material que las asas. Observar figura 1.
A B
Figura 1. A) asa de inoculación; B) aguja de inoculación

Hay diferentes formas de inocular medios de cultivo, el más común es el método de estría,
pero también se encuentra la inoculación por picadura, placa vaciada, inoculacion semicuantitativo,
entre otras. El asa se utiliza generalmente para inocular microorganismos en placa y el aguja de
inoculación para la transferencia de cultivos puros en placa a tubos con medio sólido. Dependiendo
del cultivo que se trate, es la elección de la técnica de inocular, en esta practica se abordaran dos
tipos de cultivo que el A) cultivo de microorganismos aerobios y B) El cultivo de microorganismos
anaerobios, los cuales se describen en el siguiente apartado.
FUNDAMENTO:
Inoculación es la introducción artificial de microorganismos en un medio de cultivo y

consiste en la dilución de un cultivo mediante el estriado en la superficie de un medio sólido, en una
caja Petri. Los microorganismos se van quedando al hacer las estrías en diferentes partes de la
superficie del medio de tal modo que quedarán células individuales que al multiplicarse darán lugar
a una colonia.
OBJETIVO:
 Conocer y practicar la inoculación de bacterias en diversos medios de cultivo para su

desarrollo y estudio.
5.1. CULTIVOS DE AEROBIOS
MATERIAL Y EQUIPO:
 Asas de diferentes calibres y agujas bacteriológicas.

 Tubos con caldo nutritivo.
 Tubos con agar nutritivo
 Placas con tres divisiones y sin división: medio de cultivo: EMB, Agar Mac Conkey, S- 110,
Agar Vogel Jonson, Agar Sal y Manitol. Agar nutritivo.
 Mechero Bunsen
MATERIAL BIOLÓGICO:
 Cepas: Sarcina lutea, Serratia marcesens, Escherichia coli, Staphylococcus aureus,

Staphylococcus epidermidis.
TÉCNICA:

I.- INOCULACIÓN POR ESTRÍA ENCAJA
a) MÉTODO DE INOCULACIÓN POR ESTRIA CRUZADA
El aislamiento de las bacterias de las muestras en estudio en el laboratorio se hace casi

siempre por sembrado en la superficie de una placa de agar, la finalidad de la siembra es repartir el
inóculo de forma que en la incubación aparezcan colonias aisladas para su estudio individual.
Al inocular debe trabajarse siempre dentro del radio de un mechero Bunsen (30 cm.), o, en el
ambiente dentro de una campana de flujo laminar, ya que, la corriente ascendente de aire que va por
la llama, o la corriente de aire del flujo laminar arrastra el polvo y otras partículas con el aire hacia
arriba, o hacia afuera; impidiendo la contaminación del medio de cultivo. El asa debe ser flameada
adecuadamente y enfriada antes de tocar el inóculo, o el medio de cultivo. No contaminar ni destruir
el inóculo.
1.- Esterilizar el asa por calor seco en el mechero, de forma vertical.
2.- Quitar el tapón del tubo y mantenerlo en la misma mano en que se tiene el asa de inoculación.
Flamear la boca del tubo y con el asa tomar una pequeña porción de la colonia. Flamear nuevamente
la boca del tubo de donde se obtuvo la muestra.
3.- Se toma la caja que se va a inocular cerca del mechero, se hacen una serie de estrías en una
esquina de la caja, se da vuelta a la caja y con el asa se toca las dos últimas estrías una o dos veces y
se hace una nueva serie de estrías, repitiéndose esto en el resto de la caja. Observar figura 2 a y b.
1 2
3 4
FIG.2 A. Forma en que se comienza el estriado en caja

Figura 2B. Patrón en estrías para inocular placas para aislamiento de colonias bacterianas.
4.- Se procede igual con todas las cajas proporcionadas.
5.- Todas las placas y tubos deben estar perfectamente rotulados con el nombre de la bacteria, el
número de equipo que realizó la prueba y la fecha de inoculación.
6.- Incubar las placas a 37ºC por 24 hrs. Algunas cepas, como en el caso de Serratia marcesens se
debe incubar a temperatura ambiente.
MÉTODO DE INOCULACIÓN SEMICUANTITATIVO
Otra forma de estriar una caja para el desarrollo de una bacteria es la siguiente:
1.- Flamear el asa en la forma indicada.
2.- Con el asa se toma una muestra del caldo o de una dilución de bacterias.
3.- Se traza una línea a la mitad de la caja; tomando el punto donde se inicia la línea, se comienza a
estriar en forma perpendicular a esta de manera continua hasta llegar a la mitad de la caja, a
continuación se le da vuelta a la caja y se repite el procedimiento a partir de la última estría hasta
completar la caja. Por último se realiza un estriado en forma contraría para obtener un crecimiento
enrejado. Observar figura 3.

Figura 3. Patrón en estrías para inocular medios para recuento semicuantitativo de colonias
bacterianas.
4.- Se rotula la caja con los datos específicos y se incuba.
Este tipo de estriado es la técnica de diseminación usada para la inoculación de medios con agar
para recuentos semicuantitativos de colonias. Por lo tanto se recomienda usar el asa calibrada. Un
ejemplo de utilización de este método es en el recuento de bacterias en una muestra de orina.
II.- INOCULACIÓN EN TUBO

El medio de cultivo entubo puede ser sólido, líquido o semisólido. De acuerdo al
procedimiento de inoculación se puede utilizar el asa aunque se utiliza con más frecuencia la aguja
de inoculación. El desarrollo de las bacterias en un tubo es de gran utilidad ya que se pueden ocupar
de diferentes maneras, como son: En caldo para desarrollar un crecimiento bacteriano, en pico de
flauta para las pruebas bioquímicas o en agar nutritivo para la conservación de cepas. Antes de
introducir el tubo a la estufa de cultivo debe soltarse el tapón de goma para evitar que los gases
expulsen el tapón.
a) MÉTODO DE INOCULACIÓN POR AGITACIÓN.
1.- Flamear el asa, tomar una asada de manera aséptica de la muestra que se va a inocular.
2.- Depositar la muestra en el tubo con caldo agitando el asa en él para desprender bien el inóculo.
Observar figura 4.
A B
Figura 4. Técnica para inocular un tubo de caldo de cultivo. A.- se inclina el tubo y se deposita la
inoculación. B.- se endereza el tubo y se agita el asa.
3.- Flamear nuevamente el asa.

4.- Rotular el tubo con todos los datos necesarios.
5.- Incubar los tubos a 37ºC, en caso de no especificar otra indicación.
b) MÉTODO DE INOCULACIÓN POR PICADURA.
1.- Flamear la aguja de inoculación. Tomar una asada de manera aséptica de la muestra a inocular.
2.- Se introduce la aguja en el medio sólido en forma de pico de flauta picando la base del medio
hasta la mitad y estriando el pico del medio. Observar figura 5.
A B
Figura 5. La inoculación de un pico de flauta de agar se acechón un alambre de inoculación recto.
A.- Primero se atraviesa el agar con el alambre hasta 2-3mm del fondo del tubo. B.- El alambre se
retira del agar con un movimiento en “S” sobre la superficie.
3.- Flamear nuevamente el asa.

4.- Rotular el tubo.
5.- Incubar el tubo a 37ºC.
CONTROL DE CALIDAD EN EL ESTRIADO DE PLACAS.
 Es importante que las asas y las agujas no estén muy usadas o muy quemadas. Es necesario
tener varias asas de diferentes calibres.
 Cuando se esteriliza una asa en el mechero se debe calentar en forma vertical, ya que así se
esteriliza tanto el mango como el asa, esto es importante, ya que el tomar la muestra se
pueden quedar restos del microorganismo en el mango que pueden contaminar otros
cultivos o infectar a la persona que esta trabajando si no se realiza una adecuada
esterilización después de que se utiliza.
 Antes de tomar la muestra debe esperarse a que el asa esté fría ya que en caso contrario se
puede quemar el inóculo evitando un crecimiento en la placa.

 No es necesario tomar una gran cantidad de muestra para inocular un medio, solo basta
tocar con el asa la colonia en estudio.
 Cuando se inocule un medio, se debe tener cuidado de que al estriar no se rompa el medio,
ya que si esto ocurre no se podrá realizar un buen estriado y no se obtendrá un buen
aislamiento de colonias ni una buena observación.
 Todas las cajas y tubos así como todo el material que se utilice y que se guarde en la estufa
o en el refrigerador debe estar correctamente cerrado y rotulado perfectamente.
 Las cajas se incuban boca abajo y los tubos no totalmente cerrados para que halla una
circulación de aire.
CALIBRACIÓN DE ASAS.
1.- Preparar una solución acuosa concentrada de azul de Evans (750 ug /ml). La solución se
conserva en un frasco de vidrio ámbar bien cerrado.
2.- De esta solución se prepara una dilución 1:10 en agua (1 ml de colorante más 9 ml de agua) sol.
estándar. Con esta solución se corre una curva de calibración, por duplicado con los volúmenes 25,
50, 100, 150, 200, 300, 350, 400 y 500 ul, llevando en cada caso a volumen final de 5.0 ml con agua
destilada.
Leer la extinción E 600 nm de cada no de los volúmenes medidos, anotando los valores individuales
en la tabla adjunta. Graficar en papel milimétrico (E en la ordenada, vol. En la abscisa). Como
blanco se emplea agua y celdas de 1 cm.

5.2. CULTIVO DE ANAEROBIOS
INTRODUCCION:
Las bacterias presentan repuestas ante el oxígeno libre clasificándolas en cuatro grupos:
1.- Aerobias: Son aquellas bacterias que se desarrollan en oxígeno libre.

2.- Anaerobias: Son aquellas que se desarrollan en ausencia de oxígeno libre.
3.- Anaerobias facultativas: Estas bacterias tienen la capacidad de desarrollarse en presencia o
ausencia de oxígeno libre.
4.- Microaerófilas: Son aquellas bacterias que se desarrollan en pequeñas cantidades de oxígeno
libre.
Los anaerobios incluyen todas las morfologías bacterianas. Tienen la capacidad de formar
esporas y las características morfológicas con la tinción de Gram están ampliamente clasificadas. Las
infecciones anaerobias en humanos y varios animales pueden afectar cualquier órgano o tejido cuando
las condiciones son apropiadas. Los anaerobios más importantes en infecciones clínicas son:
Bacteroides fragilis, algunas especies de Clostridia y los géneros Peptococos y Peptostreotococos.
Dentro de los anaerobios podemos encontrar una clasificación de acuerdo a la tolerancia de la

bacteria anaerobia con el oxígeno:
a) Anaerobio aerotolerante: Estas bacterias crecen mejor en ausencia de oxígeno que en su

presencia. Son aisladas fácilmente en la mayoría de los laboratorios donde se utilizan métodos
anaeróbicos sencillos. En esta clasificación se encuentra un número limitado de bacterias de
importancia clínica.
b) Anaerobio obligado: Estas bacterias no se desarrollan cuando son expuestas al oxígeno molecular.
En este grupo se encuentran la mayoría de las bacterias de interés clínico.
c) Anaerobios estrictos: Estas bacterias son extremadamente sensibles al oxígeno, requiere

atmósferas libres de este y medios de cultivos reducidos químicamente. En este grupo son escasas las
bacterias de interés clínico.
MÉTODOS PARA PRODUCIR AMBIENTES ANAEROBIOS
Se reconocen básicamente dos formas de producir ambientes anaerobios, en la primera se

utilizan mezclas de gases de hidrógeno, nitrógeno y dióxido de carbono, las cuales desplazan al
oxígeno presente en el área donde se desea tener el ambiente anaeróbico (cámara anaeróbica con
guantes y tubos con medio prereducido).
El segundo es por medio de reacciones químicas en donde se producen atmósferas sin oxígeno
como el Sistema Gas-Pak que es el que se utilizará en esta práctica y que se describirá a continuación.
SISTEMA GAS-PAK

Este sistema es el más utilizado en los laboratorios por su fácil manipulación. Consiste en un
cilindro que puede ser de cristal o de plástico grueso, un sobre generador de H2 y CO2, un catalizador
de paladio y un indicador de anaerobiosis (azul de metileno). Ver figura 8.
Al agregar agua a las sustancias del

sobre (borhidrato de sodio, bicarbonato de
sodio y ácido cítrico), se lleva a cabo una
reacción química que libera H2 y CO2, este
reacciona con el oxígeno presente en la
jarra, que en presencia del catalizador de
paladio produce agua, la atmósfera
alcanzada después que ha sido consumido el
oxígeno es de 90% H2 y 8 a 10% de CO2
esto se pone de manifiesto con el vire del
indicador de azul a blanco en un lapso de 2
a 3 horas. No obstante para obtener un
potencial de óxido reducción adecuado para
el desarrollo de bacterias anaerobias se
requiere de 10 a 12 horas, por lo que las
jarras deben abrirse hasta 48 horas.
.
Figura 6. Sistema Gas-Pak para producir ambiente anaerobio
FUNDAMENTO:
El oxígeno molecular y el dióxido de carbono son los principales gases que afectan al
desarrollote las bacterias.
OBJETIVO:
 Preparar las condiciones adecuadas para obtener un cultivo anaerobio.

MATERIAL Y EQUIPO:
 Asa bacteriológica
 Mechero Bunsen
 2 Cajas Petri con agar sangre de carnero con dos divisiones
 2 Tubos de 13x100 con 5 ml de caldo de tioglicolato.
 Jarra de anaerobiosis
 Sobres generadores
 Catalizadores de paladio
 Indicadores de azul de metileno
 Desinfectante
 Clavos o tornillos oxidados
 Cepas: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli.
TÉCNICA:
1.- Sembrar las cajas con bacterias Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli.
y los Clavos o tornillos oxidados en Tubos de 13x100 con 5 ml de caldo de tioglicolato,
colocarlos en la jarra anaeróbica.
2.- Colocar dentro de la jarra el sobre generador y colocar el indicador dentro de la jarra en un lugar
visible.
3.- Poner el catalizador en el dispositivo colocado en la tapa de la jarra.
4.- Cortar la punta del sobre e introducir 10 ml de agua de la llave y cerrar perfectamente la jarra e
incubar a 35°C durante 48-72 horas.
5. Realizar frotis del caldo de tioglicolato y sembrar en las cajas de Agar sangre, colocarlos en la jarra
anaeróbica y repetir el paso 2-4.
IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA:
Consiste en determinar la morfología colonial y microscópica de las bacterias desarrolladas en
el medio.
Morfología colonial: Se pueden observar por ejemplo en el caso del desarrollo del Clostridium,
colonias grandes mate, rizoide y hemolíticas en agar gelosa sangre. Un dato importante es el olor
desagradable que presenta este tipo de bacterias.
Morfología microscópica: Se deben de hacer frotis, uno se tiñe por medio de la tinción de Gram y
por otro la tinción de Shaeffer- Fulton.

ACTIVIDADES:
I.- OBSERVACIONES:
Tabla 1-Observación del caldo de Tioglicolato:

Cepa: tubo 1) clavo oxidado (tubo 2) alambre oxidado
Color del caldo
Superficie de crecimiento
Precipitado
Turbidez
Tabla 2.- Observación de la morfología colonial en placa:
Pseudomona Escherichia Placa de Agar Placa de Agar

aeruginosa coli Chocolate Agar sangre
(Clavo) ( Clavo)
Elevación:
Forma :
Borde:
OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS Indicando la Tinción usada

Escherichia coli Pseudomona aeruginosa Clavo
Tinción de Gram Tinción de Gram Tinción de Gram
Agar sangre Agar Sangre Caldo de Tioglicolato

Clavo Clavo Clavo
Tinción de Esporas Tinción de Esporas Tinción de Esporas
Agar sangre Agar Sangre Agar Chocolate
II. Contestar el siguiente cuestionario.
1. ¿Qué es una bacteria anaerobia?

2. ¿Cómo se clasifican las bacterias anaerobias?
3. ¿Qué es una anaerobio aereotolerante?
4. ¿Qué tipo de métodos se utilizan para producir ambientes anaerobios?. Explicar cada uno de ellos.
5. Cite cuatro ejemplos de enfermedades causadas por bacterias anaeróbicas.
CONCLUSIÓN:
REFERENCIAS
1. INGRAHAM JOHN, INGRAHAM CATHERINE. Introducción a la microbiología. Reverte,

1998
3. KONEMAN W.F. Diagnóstico Microbiológico texto y atlas en color. 6ª Edición. Editorial

Panamericana. 2008
4. MURRAY, P. R.; ROSENTHAL, K. S; PFALLER, M. H.: Microbiología Médica. (6ª Ed.) Elsevier,
2009.Practica N° 6 MORFOLOGÍA COLONIAL

Práctica No.6. MORFOLOGIA COLONIAL
INTRODUCCION
Las características de un desarrollo bacteriano en un cultivo como son: el color, la forma de
crecimiento, la cantidad, la consistencia, el borde de la colonia, el olor, etc. son importantes para una
buena identificación. Hacer un esquema del desarrollo bacteriano es importante ya que existen
muchas diferencias morfológicas entre las bacterias con relación a su aspecto macroscópico.
Este esquema se puede realizar en base de la observación del desarrollo en diferentes medios.
1.- El desarrollo de colonias en cultivo de placa.

2.- Desarrollo de colonias en agar inclinado.
3.- Desarrollo en caldo.
DESARROLLO DE COLONIAS EN CULTIVO EN PLACA.
En este medio se pueden observar las siguientes características.
 TAMAÑO: Esta característica es bastante constante dentro de las especies, el tamaño de las
colonias de diferentes especies varía desde muy pequeñas midiendo apenas unas micras de
diámetro, hasta colonias muy grandes que miden de 5 hasta 10 mm. Algunas especies como
Proteus se desarrollan sobre toda la superficie de la caja, característica conocida como
swarming.
 BORDE O MARGEN DE LA COLONIA: Los bordes de las colonias bacterianas difieren

en cada especie. Así se pueden encontrar los siguientes tipos: Entero, Lobulado,
Filamentoso, Enrollado y Crenado.
 ELEVACIÓN: Las colonias presentan diferentes elevaciones, pueden ser aplanadas o

elevadas mostrando diferentes grados de convexidad, así se clasifican de la siguiente manera:
Plana, Elevada, Convexa, Pluvinada, Umbonada.
 CROMOGENESIS O PIGMENTACIÓN: Las colonias pueden presentar pigmentación o

pueden ser incoloras, esta característica es una de las más notables de los cultivos. Influye en
la colaboración de la colonia la composición del medio de cultivo y las condiciones de
incubación. No todas las especies de bacterias pueden presentar esta característica. Algunas
bacterias productoras de pigmentación lo retienen coloreándose la masa de células, como
ejemplo de estas bacterias esta Serratia marcesens, Staphylococcus aureus, Sarcina lutea.
Otras bacterias excretan el color y lo que se colorea es el medio de cultivo, como ejemplo
estas: Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens.

CARACTERÍSTICAS ÓPTICAS: Pueden ser opacas, transparentes u opalescentes.
FORMA: La forma de la colonia es muy variable, se pueden observar diferentes formas:

Puntiforme, Circular, Filamentosa, Amiboide, Rizoide y Fusiforme.
Figura 7. Características de los cultivos de bacterias en caja.
DESARROLLO EN AGAR INCLINADO:
 CANTIDAD: Escaso, abundante o moderado.
 BORDE O MARGEN DE DESARROLLO: Puede ser uniforme o presentando diferentes

irregularidades, similares a las que se presentan en caja.
 CONSISTENCIA: Se puede observar una consistencia seca que puede moverse sobre el agar
con el asa, una consistencia viscosa que se pega al asa y que forma filamentos mucosos al
despegarlo del agar.
 COLORACIÓN: Es similar a la que se presenta en la caja.
 FORMA DE CRECIMIENTO EN LA ESTRIA DEL AGAR: El crecimiento en la estría se

puede clasificar como sigue: Filiforme, Equinulada, Perlada, Difusa, Arborescente y Rizoide.
 FORMA DE CRECIMIENTO EN LA LINEA DE PICADURA: Filiforme,

Perlada, Papilar, Vellosa y Arborescente.

Figura 8. Característica de forma de crecimiento en estría en pico de flauta.
Figura 9. Característica de forma de crecimiento en picadura de agar en tubo
DESARROLLO EN EL CALDO NUTRITIVO: En este medio algunas características de la

colonia como la cromogénesis no se observará. Dentro de las características que se pueden clasificar
están:
 CANTIDAD DE DESARROLLO: Escaso, moderado, abundante.
 DISTRIBUCIÓN DEL DESARROLLO: Aquí se observará la turbidez, opacidad

más o menos densa, que es signo de crecimiento.
 SEDIMENTO: Se observa si hay depósito de células en el fondo del tubo.
 CRECIMIENTO EN LA SUPERFICIE DEL CALDO: Se observara si hay un

crecimiento en la superficie clasificándolo de la siguiente manera: Floculenta,
Anillada, Peliculaza y Membranosa.

Figura 10. Característica de cultivos con crecimiento en superficie de caldo nutritivo.
FUNDAMENTO:
La observación macroscópica de la morfología colonial es un dato importante en la

identificación y clasificación de las bacterias. Una colonia es un grupo de bacterias formado por la
reproducción de un solo organismo sobre un medio sólido y generalmente visible.
OBJETIVO:
 Conocer las características macroscópicas de la morfología colonial bacteriana.
MATERIAL Y EQUIPO:
 Mechero Bunsen
 Asas bacteriológicas
MATERIAL BIOLOGICO
Cepas: Proteus vulgaris, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, Pseudomona aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Salmonella tiphy, Shigella
sonnei, Streptococcus piogenes,Bacillus clausii, proporcionadas en tubo inclinado, caldo y
caja.
ACTIVIDADES
I.- Anotar las características de las bacterias proporcionadas.

BACTERIA Medio Elevación Forma Borde Tamaño Superficie Consistencia
Proteus vulgaris
Escherichia coli
Staphylococcus
aureus
Staphylococcuss
epidermidis
Pseudomona
aeruginosa
Klebsiella
pneumoniae
Salmonella tiphy
Shigella sonnei
Streptococcus
piogenes
II.- Responder el siguiente cuestionario:
1.- ¿Qué aspectos distintivos se deben observar para establecer las características coloniales de una
especie?
2.- ¿Qué es un cultivo?
3.- ¿Qué característica debe tener un cultivo para hacer una buena observación macroscópica?
CONCLUSIÓN
REFERENCIAS

Panamericana. 2008
2. SHERRIS, J. C.: Microbiología Médica. Ed. McGraw-Hill, 2004.
3. MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M.; PARKER, J.: Biología de los Microorganismos (12
Ed.). Ed. Pearson, 2009.
4. PRESCOTT, L. M.; HARLEY, J. P.; KLEIN, D. A.: Microbiología (5ª Ed.) Ed.
Interamericana, 2004.

Elsevier, 2009.

Practica No. 7 TECNICAS DE TINCIÓN
INTRODUCCION:
En la mayoría de los casos, las bacterias se observan en frotis teñidos y no en estado vivo, ya
que el tamaño, la forma y la disposición de las células se aprecian mejor si estas se tiñen por medio
de reacciones con ciertos colorantes. Los colorantes pueden usarse como tinciones directas de
material biológico, como indicadores de desviaciones de pH en medios de cultivo, como indicadores
de oxido – reducción para demostrar la presencia o ausencia de condiciones anaerobias. Los
colorantes biológicos son derivados del alquitrán mineral (o de hulla). La estructura química básica
de la mayoría de ellos es el anillo de benceno, en general pueden contener dos o más anillos
conectados por uniones químicas bien definidas (cromóforos) que se asocian con la producción de
color.
En términos químicos los colorantes se denominan ácidos o básicos, lo cual no

necesariamente indican una reacción de pH en solución; un colorante básico es aquel constituido por
un agrupamiento de átomos orgánicos con carga positiva (catiónicos) que será la parte activa del
colorante y que tendrá afinidad por los ácidos nucleicos que se encuentra constituido por átomos
orgánicos con carga negativas (aniónicos) y por lo cual reaccionan con sustancias básicas, como
estructura citoplasmáticas. Un colorante neutro es una sal compuesta de un colorante ácido y un
colorante básico.
CLASIFICACIÓN DE LAS TINCIONES.
TINCIÓN SIMPLE: Una tinción simple se lleva acabo cubriendo con un colorante un frotis seco y
fijado al calor. Esta tinción es usada para teñir una gran variedad de microorganismos. El colorante
más utilizado para esta tinción es el azul de metileno de Loeffler.
TINCIÓN DIFERENCIAL: Las bacterias se diferencian unas de otras tanto física como
químicamente, así su reacción con algunos colorantes también es diferente, dando lugar a grupos
que se caracterizan por sus propiedades tintoriales. Dentro de esta clasificación encontramos a la
tinción de Gram y a la tinción de Ziehl – Neelsen, que se describirán a continuación:
TINCION DE GRAM.
Esta tinción es una de las más comúnmente usadas en microbiología, el mecanismo de

reacción de los colorantes de Gram, actúan en la estructura y composición de la pared celular.
Las bacterias Gramnegativas contienen un porcentaje más alto de lípidos que las bacterias
Grampositivas, la pared celular de las Gramnegativas son también más delgadas que las
Grampositivas por lo que no retienen el colorante inicial cuando se les agrega el alcohol acetona.
Está tinción utiliza cuatro reactivos que son: Cristal Violeta, lugol o yodo de Gram, etanol –
acetona al 95% y safranina. El cristal violeta que es el colorante inicial tiñe a todos los
microorganismos, a que es un colorante básico, en segundo lugar está el yodo que actúa como
mordiente para aumentar la afinidad entre el colorante inicial y la célula. El etanol actúa como
decolorante sobre el microorganismo, lavando el colorante inicial en caso de que no se afín con este.
La safranina es el colorante usado como contraste que teñirá a los microorganismos que no se
colorean con el cristal violeta.
Los microorganismos que retienen el colorante de cristal violeta después de la decoloración y
se ven de color violeta se conocen como microorganismos Grampositivos. Los Gramnegativos no
son capaces de retener el cristal violeta después de la decoloración y se contratiñen de rojo con el
colorante de safranina.
Figura 11.- Membrana de una Bacteria Gram Figura 12. Bacteria Gram negativa
positiva
TINCIÓN DE ZIEHL – NEELSEN.
Los bacilos Acido – resistentes se denominan así por que están rodeados por una envoltura
cérea que es resistente a la tinción. Por eso es necesario calor para que el colorante penetre en la
cápsula, una vez teñidos los microorganismos resisten a la decoloración.
Esta tinción consta de tres reactivos: Carbolfucsina, alcohol ácido al 3% y azul de metileno.
Los carbolfucsina se utiliza para la tinción primaria ya que atraviesa el material céreo de los bacilos
ácido – resistentes. Se aplica calor con la llama de una lámpara de alcohol o de un mechero para que
el colorante penetre en la cápsula. El alcohol ácido se utiliza para decolorar; las bacterias ácido –
resistentes no sufren decoloración mientras que otras bacterias se destiñen. El azul de metileno sirve
como colorante de contraste.
TINCIÓN NEGATIVA.
Los preparados con tinta china o nigrosina se usan para exámenes microscópicos directos de
cápsulas de muchos organismos, los finos gránulos de la tinta china dan un fondo semiopaco contra
el cual pueden verse claramente las cápsulas. Este método colorea fondo, dejando la célula incolora
y transparente. Existe una variante de esta coloración hecha por Bonifaz, donde se utiliza fucsina
para dar coloración a las células dejando incoloras las cápsulas, dando la imagen de un cielo
estrellado. Esta tinción se utiliza para detectar el hongo Cryptococcus neoformans, a las cápsulas de
Klebsiellas y algunas veces también para identificar espiroquetas las cuales no se pueden teñir
fácilmente con colorantes básicos.
RECOMENDACIONES PARA LA ELABORACIÓN DE UN FROTIS BACTERIANO.

Para obtener un frotis bacteriano adecuadamente teñido que permita estudiar e identificar
correctamente los microorganismos, es necesario seguir ciertas recomendaciones.
1. Los portaobjetos para los frotis deben estar limpios, libres de grasa y polvo, sin ralladuras o
despostillados. Un portaobjetos sucio puede ocasionar pérdida de material y dificultad para
la localización del microorganismo en estudio.
2. Las muestras deben tomarse con el asa o la aguja de inoculación.
3. Un frotis de un caldo de cultivo, se aplica directamente al portaobjetos sin dilución. Cuando
se prepara de un medio sólido se debe colocar una gota solución salina isotónica, evitar
tomar una gran cantidad de inóculo, si no se obtendrá un frotis en el cual no se podrá hacer
una buena observación. Se recomienda fijar el frotis con calor, ya que esto ayuda a inactivar
las enzimas y adherir las células al portaobjetos, evitando que se desprendan en el proceso de
tinción. Una vez seco el frotis este deberá tener un color blanquizco.
4. Cuando se lleva a cabo el proceso de tinción, se debe respetar el tiempo indicado para cada
reactivo ya que en caso contrario se obtendrá un frotis que puede tener características
inadecuadas en la colaboración o en la morfología de las células.
5. Al lavar el exceso de tinción del portaobjetos con agua corriente se debe mantener el
portaobjetos en una posición paralela al chorro de agua. De esta manera se pierden menos
organismos que cuando el agua incide directamente.
6. Cuando un frotis está terminado se debe dejar secar antes de observarlo en el microscopio.
7. Los frotis mejor elaborados pueden escogerse para tomarlos como muestras permanentes.
Para su conservación es necesario que después de ser observados el frotis se lave con xilol
para eliminar el aceite de inmersión. Secar al aire. Se le añade al frotis una gota de bálsamo
de Canadá o permount, con cuidado se coloca un cubreobjetos, se hace presión alrededor de
tres minutos, se guarda la preparación de manera horizontal por dos semanas. También se
puede utilizar en caso de no contar con bálsamo de Canadá el barniz de uñas transparente.
FUNDAMENTO:
Los colorantes son preparados acuosos orgánicos que tiñen a los microorganismos de una
gran variedad de colores ayudando a su diferenciación.
OBJETIVO:
 Conocer y aplicar las técnicas de tinción básicas más frecuentes.
PROCEDIMIENTOS

7.1 TINCIÓN SIMPLE
MATERIAL Y EQUIPO:
 Portaobjetos
 Mechero Bunsen
 Microscopio
 Puente de tinción
REACTIVOS:
 Aceite de inmersión
 Solución salina
 Azul de metileno de Loeffler
MATERIAL BIOLÓGICO :
 Cepas: Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
METODOLOGÍA:
1.- Preparar un frotis como se indica en la Figura No.13 dejándolo secar perfectamente.
2.- Cubrir el frotis con azul de metileno de Loeffler por un minuto.
3.- Lavar con agua corriente suavemente y dejar secar.
4.- Observar con el objetivo de inmersión.

Figura 13. Procedimiento para realizar un frotis bacteriano.

7.2 TINCIÓN DE GRAM
MATERIAL Y EQUIPO
 Portaobjetos
 Mechero Bunsen
 Microscopio
REACTIVOS:
 Aceite de inmersión  Cristal violeta
 Desinfectante  Lugol de Gram
 Solución salina  Alcohol-acetona
 Metano  Safranina
MATERIAL BIOLOGICO:
 Cepas: Escherichia coli y Staphylococcus aureus
TÉCNICA:
1.- Se preparan frotis de las cepas proporcionadas de la manera indicada en la figura 13.
2.- Se recomiendan fijar las muestras biológicas con metanol por un minuto.
3.- Los frotis se tiñen con cristal violeta durante un minuto.
4.- Lavar con agua corriente.
5.- Teñir con lugol 30 segundos.
7.- Decolorar con alcohol – acetona 30 segundos.
9.- Se tiñe con safranina de 25 a 30 segundos.
10.- Lavar con agua corriente y dejar secar.
11.- Observar con objetivo 10X para identificar el campo, e inmediatamente pasar a objetivo 100X,
colocando una gota muy pequeña de aceite de inmersión.
INTERPRETACION
Microorganismos color violeta: Gram positivos.
Microorganismos color rosado: Gram negativos

7.3 TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN
MATERIAL Y EQUIPO
 Portaobjetos
 Mechero Bunsen o lámpara de alcohol
 Microscopio
 Desinfectante
 Solución salina
 Fucsina fenicada
 Alcohol-ácido
 Azul de metileno
 Muestra en esputo sospechosa de Mycobacterium tuberculosis.
METODOLOGÍA
1.- Se prepara un frotis de la muestra, dejándola secar.

2.- Se cubre perfectamente con fucsina.
3.- colocar sobre un puente de vidrio el portaobjetos y con una lámpara de alcohol, calentar hasta
que haya emisión de vapores, durante 5 minutos, sin hervir, en caso de que el frotis llegase a secarse
se agrega más fuscina y se sigue el tiempo.
4.- Enjuagar con agua corriente.
5.- Decolorar con alcohol – ácido 30 segundos.
7.- Teñir con Azul de metileno durante 30 segundos. Dejar secar el frotis.
8.- Observar con objetivo 10X para identificar el campo, e inmediatamente pasar a objetivo 100X,
colocando una gota muy pequeña de aceite de inmersión, observar.
INTERPRETACIÓN:
Microorganismos color rosa son conocidos como BAAR (Bacilos Ácido Alcohol Resistentes).
Esta tinción es utilizada principalmente para identificar el agente causal de la tuberculosis.

OBSERVACIONES:
CONCLUSIÓN
BIBLIOGRAFÍA
1. INGRAHAM JOHN, INGRAHAM CATHERINE. Introducción a la microbiología.Reverte,
1998

Panamericana. 2008

Elsevier, 2009.

7.4 TINCIONES ESTRUCTURALES
INTRODUCCION:
CÁPSULAS: Muchas bacterias secretan polímeros de gran tamaño que se adhiere a la

superficie externa de la célula. Tipos de cápsulas: La cápsula mucosa, que es un material gelatinoso
que se encuentra alrededor de la bacteria, este polímero puede retirarse fácilmente por lavado. En el
caso de que el polímero se encuentre bien asociado a la célula y con un espesor bien definido se
llama cápsula. El método más común para observar las cápsulas es por medio de la tinción negativa
con tinta china ya descrita anteriormente, ya que las partículas coloidales de la tinta quedan
excluidas del lugar que ocupa la cápsula.
La composición química de las cápsulas puede variar considerablemente, por lo general están
formadas por polímeros simples de un mismo azúcar o de algunos azúcares diferentes. En una
misma especie de bacteria la composición es diferente. Se sabe que las cápsulas en las bacterias
actúan como un factor de virulencia, ya que protegen a la bacteria de la fagocitosis. Las colonias de
bacterias encapsuladas son lisas, brillantes y húmedas con aspecto mucoide. Como ejemplo de
bacterias formadoras de cápsulas se encuentra el género Klebsiella y el hongo Cryptococcus
neoformans.
ESPORAS: Las esporas son estructuras pequeñas muy resistentes y metabólicamente

latentes. No forman parte del ciclo reproductor de la bacteria si no que son formas de la
supervivencia producidas en respuestas al agotamiento de carbohidratos en el medio. La
característica más importante de las esporas es que son muy resistentes a la mayor parte de los
agentes físicos y químicos, a la desecación inclusive a la luz ultravioleta. Sobreviven por años en las
condiciones normales del suelo. Para eliminar las esporas es necesario utilizar calor húmedo con
presión (Autoclave), o calor seco 150ºC por una hora.
Las esporas que contienen grandes cantidades de calcio y bajo contenido de agua forman un
complejo exclusivo que es el ácido diplicónico. La mayor parte de las bacterias capaces de formar
esporas pertenecen a la flora normal del suelo, y en todos lados se encuentran. Como ejemplos de
bacterias formadoras de esporas están el Género Bacillus y los anaerobios del género Clostridium.
FUNDAMENTO:
Existen diferentes colorantes que de acuerdo a su afinidad celular son utilizados para
identificar ciertas estructuras de la célula microbiana como son las cápsulas, esporas y flagelos.
OBJETIVO
 Observar mediante el uso de tinciones especiales de algunas estructuras que son

características de ciertos microorganismos.

7.5 TINCIÓN DE CÁPSULAS
7.5.1 MÉTODO DE GIN. (TINCIÓN NEGATIVA)
MATERIAL Y EQUIPO: REACTIVOS:

 Portaobjetos  Tinta china
 Asa bacteriológica  Agua destilada
 Mechero Bunsen  Azul de metileno
 Microscopio  Aceite de inmersión
 Cepa: Klebsiella pneumoniae
TÉCNICA:
1.- En un portaobjetos mezclar una gota de agua y una gota de tinta china.
2.- Añadir una asada de la bacteria y hacer una suspensión con la mezcla.
3.- Extender la suspensión suavemente por el portaobjetos.
4.- Secar al aire el frotis. No fijar a la llama.
5.- Contrateñir con azul de metileno.
6.- Lavar con agua corriente y dejar secar. Observar con aceite de inmersión.
INTERPRETACIÓN:
Las cápsulas se observan transparentes en un fondo negro y el cuerpo de la bacteria se
observa de color azul.
7.5.2 MÉTODO DE HISS

 Portaobjetos  Azul de metileno

 Asa bacteriológica  Sulfato de cobre al 20%
 Mechero Bunsen  Aceite de inmersión
 Microscopio
 Puente de tinción  MATERIAL BIOLÓGICO:
 Cepa: Klebsiella pneumoniae
TÉCNICA:
1.- Realizar un frotis.
2.- Teñir con azul de metileno durante un minuto.
4.- Lavar con la solución de sulfato de cobre al 20%.
5.- Dejar secar y observar con aceite de inmersión.
6.- Anotar observaciones.
INTERPRETACIÓN: Las cápsulas se observan de un ligero color café.

7.6 TINCIÓN DE ESPORAS
7.6.1 MÉTODO DE SCHAEFFER – FULTON
MATERIAL Y EQUIPO:
 Portaobjetos
 Mechero Bunsen y lámpara de alcohol
 Microscopio
REACTIVOS:
 Verde de malaquita
 Safranina
 Desinfectante
 Cepa: Bacillus subtilis o Bacillus Clausii.
eñir con verde de malaquita.
2.- Calentar hasta emisión de vapores de 3 a 5 minutos.
3.- Lavar con agua corriente durante 30 segundos.
4.- Contrateñir con safranina durante 1 minuto.
5.- Lavar con agua corriente y dejar secar.
6.- Observar con aceite de inmersión.
INTERPRETACIÓN: Las esporas se observan como una estructura de color verde en el centro o
en la orilla de la bacteria.
7.6.2 Existe otra técnica para teñir las esporas:
MATERIAL Y EQUIPO:
REACTIVOS:
 Portaobjetos  Azul de metileno
 Asa bacteriológica  Aceite de inmersión
 Lámpara de alcohol  Fucsina fenicada
 Microscopio  Desinfectante
 Cepa: Bacillus subtilis o Bacillus
clausii
 Ácido acético al 5%
TÉCNICA:
1.- Hacer un frotis.
2.- Cubrir el frotis con la fucsina fenicada y calentar hasta emisión de vapores.
3.- Decolar con ácido acético al 5%, hasta que el frotis tome un ligero color rosa.
5.- Teñir con azul de metileno de Loeffler durante tres minutos.
6.- Lavar con agua corriente, dejar secar y observar con aceite de inmersión.
INTERPRETACIÓN: Las esporas se observan de una coloración rosa.

ACTIVIDADES:
OBSERVACIONES:
I.- Observar los frotis y realizar dibujos.
Observación de Cápsulas: Observación de Cápsulas: Observación de esporas:

Método de Gin Método de Hiss Método de Schaeffer -Fulton
II.- CONTESTAR LAS SIGUIENTES PREGUNTAS:
1.- Definir que es un colorante.
2.- ¿Qué es un colorante catiónico y qué es un colorante aniónico?
3.- ¿Qué es una tinción?
4.- ¿Cuál es la función del aceite cuando se usa en el objetivo de inmersión?
5.- Señalar una situación donde sea preferente usar una tinción simple en lugar de una diferencial.
III.- CONCLUSIÓN:
REFERENCIAS

Panamericana. 2008
Elsevier, 2009.

Practica No. 8 PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA LA IDENTIFICACION DE BACTERIAS:
8.1. PRUEBA DE ROJO DE METILO Y VOGES PROSKAUER (RM – VP)
INTRODUCCION:
El Medio MR-VP es utilizado para la diferenciación de organismos coliformes en base a las pruebas
de Rojo de metilo y Voges-.Proskauer. Este medio también es conocido como Rojo de Metilo
Voges- Proskauer.
En 1915 Clark y Lubs demostraron que las bacterias del colon de la familia aerogenes podían
dividirse en dos grupos en base a su acción en un medio con dextrosa y peptona. Cuando se
probaron con el Rojo de Metilo como indicador de pH, el grupo de coliformes producía una gran
cantidad de ácido mientras que el grupo de los aerogenos producía una reacción menos ácida. La
prueba para detectar a los altos productores de ácido es conocida como Rojo de Metilo (MR). La
prueba para detectar a los menos productores de ácido está basada en el procedimiento que
describieron Voges y Proskauer en 1898 donde se presenta una reacción colorida cuando los
cultivos se incuban en un medio conteniendo dextrosa y peptona y se les adiciona hidróxido de
potasio exponiéndolos al aire. Esta reacción pone de manifiesto la formación de acetilmetilcarbinol
y es conocida como la prueba de Voges-Proskauer (VP). En este medio las peptonas proporcionan la
fuente de carbono y nitrógeno. La dextrosa es el carbohidrato fermentable y el fosfato actúa como
buffer.
FUNDAMENTO:
En el medio de cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano
y la glucosa es el hidrato de carbono fermentable. La glucosa puede ser metabolizada por los
microorganismos, a través de distintas vías metabólicas. Según la vía utilizada, se originarán
productos finales ácidos (ácido láctico, ácido acético, ácido fórmico), o productos finales neutros
(acetil metil carbinol). Esta diferencia en el metabolismo bacteriano, podría ser reconocida por la
adición de un indicador como rojo de metilo, para revelar la presencia de productos ácidos, y por la
adición de alfa naftol e hidróxido de potasio para evidenciar la presencia de productos finales
neutros. Voges y Proskauer, describieron una coloración rojiza que aparecía después de adicionar
hidróxido de potasio a los cultivos de ciertos microorganismos en medio con glucosa. Esta
coloración se debe a la oxidación del acetilmetil carbinol a diacetilo el cual reacciona con la peptona
del medio para dar un color rojo. El ácido pirúvico es un compuesto formado en la degradación
fermentativa de la glucosa, se metaboliza aun más a través de cierto número de vías metabólicas.
Una de esas vías da como resultado la producción de acetoina (acetil – metil – carbinol) a través de
la acción de KOH y oxígeno atmosférico. El diaceril es convertido en un complejo rojo bajo la
acción catalítica de alfa naftol y creatina.
OBJETIVO:
 Aprender a diferenciar el genero Enterobacter y Klebsiella peumoniae (generalmente

positiva) de Escherichia coli.

MATERIAL Y EQUIPO:
 Tubos con caldo RM-VP

 Indicador rojo de metilo
 Solución de alfa-naftol
 Solución de KOH
 Pipetas estériles
Cepas: Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae.
TÉCNICA:
1.- Inocular dos tubos de caldo de RM – VP con Escherichia coli y dos tubos con Pseudomonas
aeruginosa, incubar a 37ºC por dos días.
2.- Después de incubar se realiza la prueba del rojo de metilo en cada tubo de la siguiente manera:
Añadir 5 gotas de rojo de metilo a dos tubos (uno de cada bacteria) y observar el color obtenido para
cada bacteria.
3.- Con las otras dos probetas (una de cada organismo, llevar a cabo la prueba de Voges –
Proskauer: Añadir 0.5 ml de solución alfa – naftol a cada tubo, luego añadir 0.5 ml de hidróxido de
potasio, agitar y dejar en posición vertical por 1 o 2 horas. Observar si aparece una coloración rosa o
roja, que indica que es una prueba de la presencia del acetil – metil- carbinol.
RESULTADOS VOGES PROSKAUER (VP)

INTERPRETACIÓN:
Reacción VP positiva: color rojo o Rosado en la superficie del medio.

Reacción de VP negativa: color amarillo en la superficie del medio (el mismo color del reactivo)
puede formarse un color cobrizo, pero aun así la reacción es negativa.
APLICACIONES:
 MICROORGANISMOS POSITIVOS
o Klebsiella pneumoniae
o Yersinia enterocolítica
 MICROORGANISMOS NEGATIVOS
o Escherichia coli
o Klebsiella ozaenae
RESULTADOS ROJO DE METILO (RM)

APLICACIONES:
 MICROORGANISMOS POSITIVOS
o Escherichia coli
o Especies de Yersinia
 MICROORGANISMOS NEGATIVOS
o Enterobacter aerogenes
o Enterobacter cloacae
o Klebsiella
ACTIVIDADES:
I.- Contestar:
1.- ¿Por qué es importante la prueba de Voges – Proskauer en el laboratorio de microbiología?
2.- ¿Qué bacterias o especies se pueden identificar por medio de esta prueba?
RESULTADOS:

TABLA DE RESULTADOS POR EQUIPO
BACTERIA RESULTADO
Klebsiella Pneumoniae
Pseudomona aeruginosa
Escherichia coli
CONCLUSIÓN:
BIBLIOGRAFÍA

Panamericana. 2008

Elsevier, 2009.

8.2. REDUCCIÓN DE NITRATOS
INTRODUCCION:
La capacidad de un microorganismo para reducir nitratos a nitritos es una característica

importante en la identificación y diferenciación de microorganismos esto es debido a que estas
bacterias poseen una enzima llamada nitrato reductasa o nitrito reductasa.
La secuencia de producción de nitrito o de nitrógeno a partir del nitrato permite a ciertas

bacterias oxidar la glucosa sin necesidad del oxígeno atmosférico. Esta propiedad permite a algunas
bacterias aerobias de forma obligada desarrollarse minimamente en condiciones anaerobias estrictas,
ya que la energía que se libera de la reducción es casi similar al ATP producida por la respiración
del oxígeno.
Todas las enterobacterias, excepto ciertos tipos de Enterobacter agglomerans y algunas

especies de Erwinia reducen los nitratos. Es útil para la identificación de miembros de los géneros
Haemophilus, Neisseria y Branhamella.
FUNDAMENTO:
Los microorganismos que reducen nitratos tienen la capacidad de extraer oxígeno de nitratos
para formar nitritos y otros productos de reducción.
NO3 + 2e + 2H  NO2 + H2O

Nitrato Nitrito
La presencia de nitritos en el medio se detecta mediante el agregado de alfa – naftilamina y

ácido sulfanilico con la formación de un colorante de diazonio rojo p-sulfobenceno-azo-alfa-
naftilamina.
OBJETIVO:
 Observar la capacidad de ciertos microorganismos de reducir los nitratos en nitritos

así como aprender su utilización en la identificación y diferenciación de
microorganismos.

MATERIAL Y EQUIPO
Asa de inoculación
Mechero Bunsen
REACTIVOS
Tubos con caldo
Alfa-naftilamina (Reactivo A)
Ácido sulfanílico (Reactivo B)
Zinc en polvo
Desinfectante
Cepas: Escherichia coli y Pseudomona aeruginosa.
TÉCNICA:
1.- Inocular asépticamente tres tubos de caldo de nitratos uno con cada uno de los microorganismos
proporcionados. Usar el cuarto tubo como control. Incubar a 37ºC por 24 – 48 horas.
2.- Después de la incubación agregar a cada tubo (incluyendo el control) 1 ml de reactivo A, seguido
de 1 ml de reactivo B. No agitar los tubos ya que puede haber una introducción de oxígeno que
afecte la prueba.
INTERPRETACIÓN
El desarrollo de un color rojo que puede tornarse café rápidamente dentro de los 30 segundos
indica la presencia de nitritos dando una reacción positiva. Si no se produce color la reacción se
considera negativa.
Es necesario a las pruebas negativas de adicionarle una pequeña cantidad de zinc reducen los
nitratos a nitritos y si se forma el color rojo después de la adición del zinc ello indica la presencia de
nitratos residuales con los que se confirma la reacción negativa.
ACTIVIDADES:
A.- Contestar el siguiente cuestionario:
1.- ¿Por qué importante en bacteriología la capacidad de ciertas bacterias de reducir nitratos a
nitritos?
2.- ¿Qué enzima lleva a cabo la reacción de reducción de nitratos a nitritos?
3.- Citar dos ejemplos de bacterias reductoras de nitratos.

B.- RESULTADOS:
Tabla de resultados por equipo:

BACTERIA REDUCCION DE NITRATOS
OBSERVACIÓN DE LA PRUEBA DE NITRATOS:
CONCLUSIÓN:
REFERENCIAS

Panamericana. 2008

Elsevier, 2009.

8.3. REACCIONES EN MEDIOS DE: UREA, SIM, TSI, LIA Y CITRATO
INTRODUCCION:
Todos los microorganismos de importancia clínica, aunque no todas las bacterias necesitan
una fuente de carbono de cuyo metabolismo la bacteria obtiene la mayor parte de toda la energía que
necesita para sintetizar sus elementos y regular los procesos metabólicos.
Las bacterias patógenas normalmente se limitan a metabolizar azúcares simples o

aminoácidos. La demanda energética microbiana se clasifica en tres categorías principales:
quimiotrofia, fototrofias y paratrofias.
La quimiotrofia es aquella donde la energía biológica se obtiene a partir de reacciones que

se llevan a cabo fuera de la luz; se conocen dos tipos fundamentales de quimiotrofia en las bacterias:
La quimioorganotrofia y quimiolitotrofia. La primera de ellas es la que comparten todos los
animales, significa que la energía es obtenida por la oxidación o fermentación de compuestos
orgánicos exógenos. La quimiolitotrofia es un proceso mediante el cual las bacterias producen todos
sus componentes reduciendo el anhídrido carbónico en la energía liberada durante la oxidación
inorgánica.
La fototrofia es aquella donde la energía proviene de las reacciones fotoquímicas. Por

último la paratrofia es aquella donde la energía se obtiene a partir de la célula del huésped ya sea
animal, planta o microorganismos (los virus se encuentran dentro de esta clasificación).
La fermentación es un proceso metabólico de oxidación anaerobia por acción enzimática de

microorganismos en donde el oxígeno gaseoso no participa y en su lugar se encuentra un sustrato
orgánico.
En los sistemas de prueba bacteriológica, este proceso se detecta al observar cambios de

color en indicadores de pH contenidos en los medio cuando la formación de productos ácidos
aumenta.
La acidificación de un medio ocurre generalmente por la degradación de los hidratos de

carbono, sin embargo también pueden ocurrir por vías no fermentativas como es el caso de algunos
medio que no contienen hidratos de carbono en su composición y que también dan como resultado
final compuestos ácidos. Generalmente el proceso que utilizan las bacterias para metabolizar es la
vía de Embden – Meyer Hof, donde la glucosa es dividida en una serie de compuestos de tres
carbonos del cual el más importante es el ácido pirúvico. También utilizan la fermentación mixta en
la cual el ácido pirúvico deriva finalmente en una variedad de ácidos orgánicos.
Las diferencias bioquímicas entre bacterias originan patrones específicos que se utilizan en la
identificación de ellas, ayudando como complemento de otros estudios bacteriológicos.

FUNDAMENTO:
Se identificará a las bacterias mediante la detección de los productos resultantes de la

fermentación o utilización de los hidratos de carbono, polihidroxialcoholes, glucósidos o sales de
ácidos carbónicos, denominados carbohidratos.
OBJETIVO:
 Se ensayarán y observará algunas reacciones bioquímicas útiles en la identificación de

bacterias.
MEDIOS DE CULTIVO COMUNMENTE USADOS EN LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS
AGAR HIERRO TRIPLE AZÚCAR (TSI)

AGAR HIERRO DE KLIGER (KIA)
TSI y KIA son los medios más utilizados para observar la fermentación de carbohidratos en
la familia Enterobacteriaceae. Para su utilización el medio debe estar en forma de pico de flauta.
Se han incorporado a estos medios cuatro derivados proteicos: extracto de carne, extracto de
levadura, peptona y proteosa, que hacen que los medios sean muy ricos nutricionalmente. La
ausencia de inhibidores en el medio permite el crecimiento de todas las especies bacterianas excepto
anaerobios obligados y otras bacterias exigentes. Por su contenido de sulfato ferroso se puede
detectar ácido sulfihídrico.
Figura 14. Fundamento de la prueba bioquímica TSI

De acuerdo a la actividad metabólica del microorganismo se pueden obtener diferentes
posibilidades de fermentación. Como un método para simplificar la interpretación de las reacciones,
se recomienda el uso de las siguientes siglas:
K.- Designa una reacción alcalina. (color rojo).

A.- Designa una reacción ácido. (color amarillo).
G.- Indica formación de gas (burbujas en el medio).
H2S.- Indica producción de Sulfuro de hierro. (color negro).
 Interpretación
Figura 15. Pruebas bioquímicas del medio: TSI

Aplicaciones
Este tipo de pruebas se utilizan principalmente para la identificaión primaria de los miembros de las
enterobacterias.
Aplicaciones de la prueba con TSI

MEDIO DE AGAR – HIERRO LISINA.
Muchas especies de bacterias poseen enzimas capaces de descarboxilar aminoácidos

específicos en el medio, con lo cual liberan aminas de reacción alcalina y dióxido de carbono. En
este caso la enzima lisina descarboxilasa al actuar sobre la lisina produce una diamina llamada
cadaverina.
En este medio se puede detectar la producción de la lisina descarboxilasa, ya que se produce

una reacción coloreada por un cambio en el pH del medio que contiene como indicador púrpura de
bromocresol. Un cambio del color original del medio (púrpura) hacia amarillo en el fondo indica
una reacción ácida por la fermentación de una pequeña cantidad de glucosa en el medio, si el
microorganismo produce lisina descarboxilasa la acción de esta sobre la lisina dará lugar a la
cadaverina la cual producirá un cambio en el pH que sobrepasa la acidez debida a la glucosa dando
un color púrpura, así pues un fondo amarillo indica que no se produce lisina descarboxilasa y un
color púrpura que si es producida.
Indicador de pH: Púrpura de Bromocresol

pH ácido: Vire del indicador a amarillo
pH alcalino: Vire del indicador a púrpura
Descarboxilación positiva: Fondo del tubo púrpura
Descarboxilación negativa: Fondo del tubo amarillo sin cambio
Desaminación positiva: Superficie del tubo rojo vino

Desaminación negativa: Superficie del tubo púrpura o sin cambio
LIA al igual que en TSI o KIA se puede detectar la producción de sulfuro de hierro. El medio se
utilizará en forma de pico de flauta.
Figura 16. Pruebas bioquímicas del medio: LIA

Shigella Salmonella tiphy
Descarboxilacion negativa Descarboxilacion positiva
Figura 17. Ejemplo de bacterias en el medio: LIA
 Interpretación

MEDIO DE CITRATO DE SIMMONS.
Esta prueba se basa en la capacidad de un microorganismo de utilizar citrato de sodio como

única fuente de carbono para metabolismo y crecimiento.
Una prueba positiva está representada por la aparición de un color azul oscuro en 24 o 48
horas, en el medio originalmente de color verde, que indica que el microorganismo ha sido capaz de
utilizar el citrato contenido en el medio, con la producción de productos alcalinos. La prueba
también es considerada positiva si hay crecimiento en la línea de inoculación, si se incube 24 horas
más aparecerá el color azul.
Al inocular el medio se debe tener cuidado de no arrastrar con el inóculo residuos del medio
anterior o que el inóculo sea demasiado grande, ya que se pueden arrastrar compuestos orgánicos del
medio anterior o compuestos orgánicos preformados dentro de la pared celular de las bacterias ya
que se puede liberar suficiente carbono y nitrógeno como para dar un resultado falso – positivo. El
medio se utiliza en forma de pico de flauta.
REACCIÓN:
Citrato - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -  Oxalacetato + Acetato

Oxalacetato - - - - - - - - - - - - - - - - -  Piruvato + CO2
2 Piruvato - - - - - - - - - - - - - - - - - -  Acetato + CO2 + Lactato.
Los ácidos orgánicos son posteriormente utilizados dando como producto final carbonatos y
bicarbonatos alcalinos.
Figura 18. Pruebas bioquímicas de citrato

 Interpretación
POSITIVO: Crecimiento aunque no exista cambio de color.
Crecimiento y el medio de color azúl intenso en pico de flauta.
NEGATIVO: No se observa crecimiento Crecimiento y el medio de color verde.
Si se utiliza carbono a partir de citrato de sodio, también se extrae nitrógeno del fosfato de
amonio contenido en el medio, liberándose amoniaco. En ocaciones se detecta un
crecimiento visible a lo largo de la línea de seimbra antes de la apición de color. Este
crecimiento visible tambén indica resultado positivo.
 Aplicaciones
MEDIO SIM (SULFURO, INDOL Y MOVILIDAD)
Este medio sirve para observar la producción de sulfuro, indol y la movilidad del
microorganismo. El color original del medio es blanco y de consistencia semisólida.

1 PRODUCCIÓN DE INDOL
Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y deaminar
triptófano con la producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco en un medio enriquecido con
triptófano.
La prueba para la identificación de indol se basa en la formación de un complejo rojo cuando

el indol reacciona con el grupo aldehído de p-dimetilaminobenzaldehido. (reactivo de Kovac o de
Erlich).
Figura 19. Medio SIM: Indol
 Interpretación

2 PRODUCCIÓN DE SULFURO DE HIERRO.
El ácido sulfhídrico se detecta por la aparición de un color negro, ya que se produce sulfuro
de hierro debido a la capacidad de ciertas bacterias de liberar azufre de aminoácidos. En este medio
la fuente de azufre es el tiosulfato de sodio.
Figura 20. Medio SIM: Produccion de acido sulfihidrico, movilidad
 Interpretación
POSITIVO: Ennegrecimiento del medio

NEGATIVO: Sin ennegrecimiento
3 MOTILIDAD.
Algunas bacterias se mueven por medio de flagelos, la motilidad es una característica

importante para la identificación final de una especie. La motilidad se interpreta por observación
macroscópica del medio observando si hay una zona difusa de crecimiento que se ensancha a partir
de la línea de inoculación. El medio se utiliza en tubo.
Figura 21. Prueba bioquímica del medio SIM:

 Interpretación
POSITIVO: Los organismos móviles migran de la línea de siembra y se difunden en el
medio provocando turbiedad.
NEGATIVO: Crecimiento bacteriano acentuado siguiendo la línea de la siembra.
 Aplicaciónes
Aplicaciones del medio SIM
PRUEBA DE LA UREASA.
La hidrólisis de la urea es catalizada en algunos microorganismos por una enzima específica,

la ureasa dando lugar a dos moléculas de amonio, agua y dióxido de carbono produciendo un color
rosado mexicano.
REACCIÓN:
O
II
NH – C – NH2 + 2HOH  CO2 + H2O + 2NH3  (NH4)2 CO3
El amoníaco reacciona en solución para formar carbonato de amonio lo que da como

resultado alcalinización y aumento del pH del medio. El caldo urea se inocula con un asa de cultivo
puro del microorganismo.

Sin inocular Positivo Negativo
Figura 22. Pruebas bioquímicas: Urea (agar) Figura . Pruebas bioquímicas: Urea (caldo)
 Interpretación
POSITIVO: Rojo rosado en el pico de flauta

NEGATIVO: Amarillo.
En muchas especies, la reacción positiva de ureasa se detecta primero por un cambio de

color rojo en la parte de pico de flauta, el cual al principio se vuelve rojo porque la aación
alcalina, resultado de la degradación de pequeñas cantidades de urea, es aumnetada por
las aminas formadas a partir de la descarboxilación oxidativa de los aminoácidos en la
parte del medio expuesta al aire.
 Aplicaciones
1. Se usa para diferenciar los organismos Proteus rápidamente ureasa positivos de
otros miembros de las enterobacterias, otros generos pueden ser positivos
retardados.

MATERIAL Y EQUIPO
 Aguja bacteriológica
 Mechero Bunsen
 Gradilla
 Medios de cultivo: TSI, LIA, Citrato de Simmons, SIM y Urea
 Desinfectante
 Cepas: Escherichia coli, Proteus mirabilis, Salmonella tiphy.
TÉCNICA:
1.- Marcar los tubos con sus nombres correspondientes y el de la bacteria en estudio. Acomodarlos
en serie de la siguiente manera: Urea, TSI, LIA, citrato, SIM.
2.- Inocular cada tubo de acuerdo como sigue:

UREA: Inocular el caldo y disolver perfectamente el inóculo. De este tubo se tomará la
muestra para las siguientes inoculaciones.
TSI: Picar el fondo del medio y estriar la superficie.
LIA: Picar el fondo del tubo dos veces y estriar la superficie.
CITRATO: Inocular solo la superficie del medio.
SIM: Hacer una sola picadura recta en el medio.
3.- Tapar los tubos verificando que la rosca de los tapones no estén totalmente cerrados. Incubar a
37ºC por 24 horas.

ACTIVIDADES:
I.- Contestar el siguiente cuestionario.
1. Definir fermentación:
2. ¿Como se clasifican los hidratos de carbono?
3. Cual es el indicador de pH que comúnmente contienen los medios para pruebas bioquímicas
para indicar que un hidrato de carbono ha sido fermentado?
4. En el laboratorio de Microbiología. ¿Cuáles son las tres descarboxilasas utilizadas para la
identificación bacteriana?
5. Buscar las reacciones que se llevan a cabo en los medios TSI, LIA y SIM:
II. RESULTADOS:
III. CONCLUSIONES:
BIBLIOGRAFÍA

Panamericana. 2008

Elsevier, 2009.

8.4. REACCIONES ENZIMÁTICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS
INTRODUCCION:
Dentro de las pruebas para identificación de bacterias de tipo enzimático encontramos las
siguientes.
1. OXIDASA.- Los microorganismos que poseen citocromooxidasa en su cadena respiratoria

son considerados como microorganismo oxidasa positivos. Los citrocromos son
hemoproteinas que contienen hierro, actúan como el último vínculo en la cadena de la
respiración aerobia, transfiriendo electrones (hidrógeno) al oxígeno con la formación de
agua. Todos los microorganismos que son oxidasa positivos son aerobios o anaerobios
facultativos.
En esta prueba se utilizan algunos colorantes reactivos como el clorhidrato de p-fenilendiamina

que sustituyen al oxígeno como aceptores de electrones. El colorante es incoloro pero en presencia
de citocromooxidasa y oxígeno atmosférico la p-fenilendiamina es oxidada y forma azul de
indofenol. Esta prueba es utilizada principalmente para la diferenciación de las Pseudomonas y
Neisserias (oxidas positivo) de Enterobacterias (oxidasa negativo).
2. PRUEBA DE LA CATALASA.-Esta prueba se utiliza para observar la producción de la

enzima catalasa. La catalasa es una enzima que se encuentra en el grupo HEM y que se
puede localizar en los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos. Su función es
descomponer el peróxido de hidrógeno formado durante la oxidación de los azúcares ya que
este puede ser tóxico para la célula si se acumula.
En la descomposición del peróxido de hidrógeno, una molécula actúa como substrato y la otra
como donador; el substrato reducido por los átomos de hidrógeno suministrados por el donador da
como resultado un substrato reducido y un donador oxidado.
Catalasa
H2O2 + H2O2 H2O + O2
3. PRUEBA DE LA COAGULASA.- La coagulasa es una enzima extracelular producida

principalmente por la especie Staphylococcus aureus. Esta enzima reacciona coagulando el
plasma por conversión del fibrinógeno en fibrina. Principalmente se ha utilizado en la
diferenciación de Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) y Staphylococcus epidermidis
(coagulasa negativo).
FUNDAMENTO:
Comprobar la presencia de enzimas en las bacterias, mediante pruebas sencillas que

ayudarán en su identificación.
OBJETIVO:
 Diferenciar géneros o especies de algunas bacterias mediante reacciones enzimáticas.

METODOLOGÍAS
I) DETERMINACIÓN DE OXIDASA:

 Asa bacteriológica  Reactivo de Kovac
 Mechero Bunsen  Desinfectante
 Papel filtro
 Discos comerciales para oxidasa MATERIAL BIOLÓGICO:
 Cepas: Pseudomona aeruginosa,
Escherichia coli.
TÉCNICAS:
1. PRUEBA EN PLACA.- Esta prueba se lleva a cabo en colonias aisladas de la bacteria en

estudio en una caja Petri añadiendo directamente unas gotas del reactivo (2 o 3).
Figura 23. Prueba de oxidasa en Agar Chocolate
INTERPRETACIÓN:
Presencia de un color azul en el medio es positivo

Ausencia de color indica un resultado negativo.

2. PRUEBA CON PAPEL FILTRO:
1.- Humedecer un pedazo de papel filtro con unas gotas del reactivo.
2.- Con un asa tomar una colonia de la bacteria y colocarla en el papel humedecido.
Figura 24. Prueba de oxidasa en papel
INTERPRETACIÓN:
Presencia de un color azul en el papel si es positivo
Ausencia de color indica un resultado negativo.
3. TÉCNICA CON DISCOS COMERCIALES.- Tocar la colonia en estudio con el disco.

Observar.
INTERPRETACIÓN:
Coloración azul oscuro en el sitio de contacto es resultado positivo.
Sin cambio de coloración es un resultado negativo.

II) DETERMINACIÓN DE CATALASA:
MATERIAL: REACTIVOS:
 Peróxido de hidrógeno al 3%
 Asa de inoculación  Desinfectante
 Mechero Bunsen
 Portaobjetos limpios MATERIAL BIOLÓGICO:
 Tubos de ensaye de 13X100  Cepas: Staphylococcus aureus y
Escherichi coli.
TÉCNICAS:
1. EN PORTAOBJETOS
1.- Colocar en un portaobjetos limpio una colonia pura de la bacteria en estudio.

2.- Añadir una gota de Peróxido de hidrógeno al 3% sobre la colonia.
Figura 25. Prueba de catalasa en porta objeto
2. TÉCNICA EN TUBO
1.- Añada directamente 1.0 ml de Peróxido de hidrógeno al 3% a un cultivo puro en agar inclinado.
2.- Observar y anotar.
INTERPRETACIÓN :
Resultado positivo: Producción de efervescencia.
Resultado negativo: No hay reacción.
NOTA: No se deben utilizar colonias que provengan de medios con sangre ya que puede haber la
probabilidad de resultados falsos positivos.
Los tubos y portaobjetos utilizados deben depositarse en un frasco con desinfectante.

III) DETERMINACIÓN DE COAGULASA:
MATERIAL : REACTIVOS:
 Asa de inoculación  Plasma humano citratado o de conejo

 Mechero Bunsen  Solución salina estéril
 Tubos de ensaye de 13X100  Desinfectante
 Portaobjetos
 Cepas: Staphylococcus aureus y S.
epidermidis.
TÉCNICAS
1. EN PORTAOBJETOS
1.- Preparar una suspensión gruesa de cada uno de los microorganismos en solución salina.
2.- En un portaobjetos mezclar una gota de la suspensión y una gota del plasma, homogenizar.
3.- Esperar de 5 a 20 segundos.
INTERPRETACIÓN:
La prueba es positiva si hay coagulación o formación de precipitado en la mezcla.
Si no se observa coagulación la prueba es negativa.
2. TÉCNICA EN TUBO
1.- En un tubo de 13 por 100 se colocan 0.5 ml del plasma y se añade una asada de la colonia en
estudio.
2.- Incubar a 35ºC de 6 a 24 horas.
3.- Con cuidado incline el tubo para observar.
INTERPRETACIÓN:
Si se observan coágulos o fibrinas o formación de un coágulo completo, la prueba es positiva.
Si los coágulos no son totales se pueden dejar incubar por 24 horas. En caso de no haber ninguna
formación el resultado es negativo.
Figura 26. Prueba de coagulasa en tubo

IV) Β-LACTAMASA
Es una enzima extracelular producida por muchas cepas bacterianas, que hidroliza específicamente
la unión amida del β-lactámico de análogos de la penicilina, inactivando al antibiótico. Se forma el
ácido peniciloico.
Método iodometrico
Se puede impregnar tiras de papel filtro con una mezcla igual de solución de almidón al 1% y
solución de penicilina G, y secarlas al aire para uso futuro. Al realizar la prueba , colocar una gota
de iodo en la tira reactiva; inmediatamente aparece un color azul. Usando un asa de inoculación,
extender una porción de colonia del organismo en estudio en el área del reactivo iodado . La
desaparición del color azul al cabo de 3 a 5 minutos indica la producción de β-lactamasa y una
prueba positiva.
Despues de 3 a 5 minutos
Figura 27. Prueba de oxidadasa en papel
 Método iodometrico: EN TUBO
1. Preparar una suspensión del desarrollo bacteriano en la mezcla de penicilina buffer, 0.5 ml.
2. Incubar 1 hora a Temp. Ambiente,
3. Después de incubar añadir dos gotas de almidón indicador y mezclar.
4. Añadir una gota de solución yodo y mezclar
5. Interpretación:
La rápida aparición un color azul se debe a la reacción del Iodo con el almidón. Rotar la mezcla
durante 1 minuto. La persistencia del color azul durante 10 minutos constituye una prueba negativa
( no hay producción de Beta lactamasa). Una rápida decoloración del medio indica, que se ha
formado acido peniciloico y que prueba positiva (producción de β-lactamasa
Figura 28. Donde se muestra la prueba de beta lactamasa, el

primer tubo al ponerle la solución de yodo el segundo se aprecia
inmediatamente como inicia la decoloración y el tercero
decolarado indicando un resultado positivo.

ACTIVIDADES:
I.- Contestar las siguientes preguntas.
1.- ¿Para qué se utilizan las reacciones enzimáticas en la microbiología?
2.- Dar 5 ejemplos de Bacterias oxidasa positivo.
3.- Dar ejemplos de bacterias catalasa positiva.
4.- ¿Qué es la coagulasa, en que casos se utiliza?
II.-RESULTADOS:
1.- OXIDASA :
Papel filtro:
Escherichia coli Pseudomona aeruginosa

En placa:
Escherichia coli Pseudomona aeruginosa
INTERPRETACIÓN:
Coloración azul oscuro en el sitio de contacto es resultado positivo.
Sin cambio de coloración es un resultado negativo.
2.-CATALASA: en portaobjetos
INTERPRETACIÓN:
Resultado positivo: Producción de efervescencia.
Resultado negativo: No hay reacción.
3.- COAGULASA:
INTERPRETACIÓN:
Si se observan coágulos o fibrinas o formación de un coágulo completo, la prueba es positiva.
Si los coágulos no son totales se pueden dejar incubar por 24 horas. En caso de no haber ninguna
formación el resultado es negativo.
4. β-LACTAMASA

INTERPRETACIÓN:
La desaparición del color azul al cabo de 3 a 5 minutos indica la producción de β-lactamasa y una prueba
positiva.
III.- CONCLUSIÓN.-
BIBLIOGRAFÍA
Panamericana. 2008

Elsevier, 2009.

Practica No. 9 ACCIÓN OLIGODINÁMICA DE LOS METALES PESADOS Y DE LOS
DESINFECTANTES
INTRODUCCION:
La mayoría de los metales pesados, ya sea solos o en ciertos compuestos causan daños a los
microorganismos, particularmente la plata, aunque también se utilizan el mercurio y el cobre. Se
cree que la eficacia de estas pequeñas cantidades de metal se debe a la gran afinidad que tienen con
los grupos sulfihidrilos de las proteínas desnaturalizándolas.
El mercurio puede presentarse en compuestos inorgánicos u orgánicos. Dentro de los

compuestos inorgánicos tenemos al cloruro de mercurio, cloruro mercurioso, óxido mercúrico y
mercurio amoniacal, que son bactericidas en dilución de 1:100, se utiliza como ungüento antiséptico
aunque su uso ha sido limitado por su acción corrosiva, alta toxicidad para los animales.
Como compuestos orgánicos se encuentran el mercurocromo, metafeno, mertiolato y

mercresin, se emplean como antisépticos en la piel y mucosas, pueden ser bactericidas y
bacteriostáticos. Son menos irritantes y menos tóxicos que los compuestos orgánicos.
La plata se ha utilizado con el propósito de controlar las poblaciones microbianas como es el

caso del tratamiento de agua y como ungüentos antisépticos. Se utiliza como compuestos coloidales
de plata como el nitrato de plata, lactato de plata y picrato de plata que son una combinación de
proteínas con plata metálica u óxido de plata (sol. coloidal); el efecto bactericida es una función de
los iones de plata libres que se desprenden de la combinación.
El cobre es mucho más activo contra algas y hongos que contra las bacterias, 2 ppm son
suficientes para impedir el desarrollo de las algas, debido a esto se utiliza en albercas y recipientes,
lugares en donde el agua se almacena por un tiempo donde se desarrollan las algas, su utilización es
en forma de sulfato de cobre.
La acción de este tipo de sustancias se considera inespecífica o de tipo general. Actúan

dañando la membrana celular, inactivando las proteínas o dañando los ácidos nucleicos. La
eficiencia de estos agentes depende de diversas variables, como el tiempo de contacto, temperatura,
concentración, cantidad y naturaleza de los microorganismos presentes y tipo de material por
desinfectar.
Algunos principales agentes antimicrobianos son:
a) COMPUESTOS FENOLICOS: Son bactericidas o bacteriostáticos dependiendo de la

concentración en la que se usen, actúan dañando la membrana celular con pérdida de los
componentes celulares. Es muy eficaz para matar todas las células vegetativas aunque no lo
es tanto con las esporas o los virus carentes de membrana. En la actualidad el fenol es muy
poco usado debido a sus propiedades tóxicas; aunque existen derivados fenólicos con mayor
actividad antimicrobiana sin ser tóxicos.
b) DESINFECTANTES TENSOACTIVOS: Los depresores de la tensión superficial o

agentes humectantes empleados principalmente para la limpieza de superficies se llaman
detergentes. Muchos jabones y detergentes son bactericidas pero para el lavado de la piel la
destrucción de los microorganismos no es muy significativa ya que el tiempo de acción es
muy corto.
Se han desarrollado muchos agentes limpiadores más eficaces que el jabón, como los
surfactantes o detergentes sintéticos, pues no forman precipitados con las aguas alcalinas o ácidas, ni
producen depósitos con los minerales de las aguas duras.
Químicamente los detergentes se clasifican en:
1.- Detergentes aniónicos.- Son los que poseen una carga negativa en su molécula, presentan una
rápida actividad bactericida en especial a pH bajo y son eficaces contra la mayor parte de las
bacterias Gramnegativas.
2.- Detergentes catiónicos.- La capacidad de desintegrar la membrana celular de estos compuestos
aumenta probablemente por la atracción entre la carga positiva de la molécula del detergente y la
carga negativa de la membrana citoplasmática, su eficacia aumenta en un pH alcalino. Estas
sustancias actúan más contra bacterias Grampositivas.
3.- Detergentes no iónicos.- No son muy útiles como desinfectantes pero algunos detergentes
iónicos bipolares pueden ser tan eficaces y menos tóxicos que los detergentes catiónicos. Se sabe
que los detergentes catiónicos son más germicidas que los compuestos aniónicos. Entre los agentes
bactericidades tensoactivos, los detergentes de amonio cuaternario son los más importantes.
ALCOHOLES: Los alcoholes son sustancias que se utilizan también como desinfectantes
ya que se desintegran las membranas celulares. El etanol es muy utilizado a una concentración del
70% y destruye todas las células vegetativas, siempre que el tiempo de contacto sea suficiente. Los
alcoholes desnaturalizan las proteínas y esta propiedad puede contar para su actividad
antimicrobiana, aunque no son muy útiles para inactivar las esporas y no son confiables para una
buena esterilización. El alcohol isopropílico y benzílico tienen mayor poder germicida pero son más
tóxicos para el ser humano que el etanol.
HALÓGENOS: Algunos halógenos son utilizados como agentes desinfectantes, tal es el

caso de el Yodo y el cloro. Ambos son bactericidas y actúan probablemente como oxidantes. El
yodo se oxida formando especies reactivas que reaccionan a la vez con las tirosinas y otros
aminoácidos en las proteínas. Su utilización es principalmente en la medicina como desinfectante de
la piel y en heridas. El cloro y sus derivados como es el hipoclorito y las cloraminas reaccionan con
el agua y forman ácido hipocloroso que es un agente oxidante fuerte y desinfectante eficaz. Se ha
utilizado como bactericida en el agua y para la limpieza de objetos.
PEROXIDO DE HIDROGENO: Es un antiséptico débil no tóxico, cuando se utiliza al 3%.

Actúa como agente oxidante, pero su duración en los tejidos es reducido ya que la enzima catalasa
lo convierte en oxígeno y agua.

COLORANTES: El trifenilmetano y algunos derivados de la acridina son compuestos
colorantes que utilizados a concentraciones sirven como antimicrobianos, ya que pueden inhibir la
síntesis de la pared celular como es el caso del trifenilmetano o insertarse en las bases de los ácidos
nucleicos como es el caso de la acridina.
OXIDO DE ETILENO: Este compuesto es utilizado en fase gaseosa, es muy eficaz en la

destrucción de todas las células vegetativas, esporas y virus. Posee un anillo de óxido muy reactivo
que se abre en presencia de grupos amino, carboxilo, sulfhídrico o hidroxilo de las proteínas, a las
que se une por enlace covalente, también reacciona con los ácidos nucleicos y es mutagénico a dosis
letales.
FUNDAMENTO:
La acción oligodinámica es la propiedad que tienen ciertos metales en cantidades sumamente

pequeñas de ejercer efectos letales sobre las bacterias.
Los desinfectantes son agentes químicos que se utilizan con la finalidad de destruir los
microorganismos o reducir su cantidad, generalmente se emplean en los objetos inanimados.
Algunos son bactericidas cuando destruyen a los microorganismos y bacteriostáticos cuando inhiben
el crecimiento.
OBJETIVO:
 Observar el efecto de algunos metales sobre el crecimiento y desarrollo bacteriano.

 Probar algunos desinfectantes comerciales y conocer la acción de estos sobre los
microorganismos.
MATERIAL Y EQUIPO
 Asa de inoculación  2 tubos con agar soya tripticasa (15-20

 Mechero Bunsen ml)
 Hisopos estériles  2 cajas Petri estériles
 Pinzas para sensidiscos  4 antisépticos comerciales
 Discos de papel filtro estériles  Desinfectante
REACTIVOS:
 Solución de cloruro de plata 1:200
 Solución de cloruro mercúrico 1:200
 Cepas: Escherichia coli y Pseudomona
aeruginosa.

TÉCNICA:
1.- Derretir y enfriar el agar nutritivo a una temperatura de 45 – 50ºC.
2.- Inocular un tubo con dos asas llenas de Spseudomona aeruginosa y el otro tubo con la misma
cantidad de Escherichia coli., verter inmediatamente a las cajas Petri evitando que se formen
grumos o que se solidifique antes de verter.
3.- Dejar solidificar en una superficie plana, marcar cada caja con el nombre correspondiente de
cada bacteria.
4.- De la manera más aséptica impregnar un disco con cada uno de los antisépticos (no demasiado
para no estropear el experimento), y colocarlo con cuidado en el medio.
Repetir la operación con los antisépticos restantes, y con la siguiente caja, colocar las cajas ya
tapadas boca arriba y dejar reposar 5 minutos.
6.- Inocular las cajas a 37ºC por 24 horas. Al acabo de este tiempo se deberán observar zonas de
inhibición transparentes alrededor de los discos si el desinfectante actuó en el microorganismo.
7.- Medir los diámetros de los halos de inhibición incluyendo la medida del disco papel.
ACTIVIDADES:
I.- Contestar el siguiente cuestionario:
2.- ¿Cuáles son los metales pesados utilizados en el control Bacteriano?
3.- Dar ejemplos de la utilización de los metales pesados, así como las ventajas y desventajas de su
uso.
4.- ¿Cómo afectan los metales pesados en las bacterias?
5.- ¿Qué es un halo de inhibición?

6.- ¿Cuáles son las principales condiciones que influyen en la actividad de los desinfectantes?
7.- ¿Cómo actúan los desinfectantes en los microorganismos para su inhibición o destrucción?
8.- ¿Qué es detergente?
9.- ¿Cómo se clasifican los detergentes?
10.- ¿En qué casos es recomendable el óxido de etileno como desinfectante?

RESULTADOS de las Mediciones de los halos de inhibición
Oligometales Desinfectante
Equipo Bacteria Cloruro de Cloruro
Mercurio de plata
1
Escherichia
coli
Pseudomona
aeruginosa
2 Escherichia
coli
Pseudomona
aeruginosa
3 Escherichia
coli
Pseudomona
aeruginosa
4 Escherichia
coli
Pseudomona
aeruginosa
5 Escherichia
coli
Pseudomona
aeruginosa
6 Escherichia
coli
Pseudomona
aeruginosa
7 Escherichia
coli
Pseudomona
aeruginosa

CONCLUSIÓN:
BIBLIOGRAFÍA:
Panamericana. 2008

Elsevier, 2009.

Practica No. 10 PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS
INTRODUCCION:
Un antibiótico es un agente antimicrobiano derivado de un microorganismo. Un agente

antimicrobiano es una droga que actúa primeramente contra microorganismos infecciosos, una
droga quimioterapéutica es un compuesto químico que se utiliza en el tratamiento de una
enfermedad, este compuesto puede provenir de fuentes naturales o artificiales. Se han aislado una
gran cantidad de antibióticos, definiendo su acción aunque muchos de ellos no pueden administrarse
debido a su alta toxicidad para las células de los mamíferos. Existen algunos criterios que un
antibiótico ideal debe cumplir, sin embargo no existe aun uno que los cumpla totalmente. Dichos
criterios son:
1.- Debe tener una mínima toxicidad contra el huésped, pero debe destruir al organismo patógeno, es
decir que debe tener una toxicidad selectiva.
2.- Una de las medidas precautorias en empleo del fármaco es que el tratamiento debe llevarse por
tiempo suficiente para que desaparezcan todos los patógenos y no reanuden su proliferación.
3.- No debe causar hipersensibilidad en el huésped, ni algún efecto secundario por el uso de este.
4.- Debe alcanzar niveles eficaces en todo el organismo en un plazo breve después de la
administración, el huésped no debe destruir, neutralizar o excretar con demasiada rapidez en el
fármaco.
5.- Debe ser de amplio espectro antimicrobiano y los microorganismos susceptibles no deben
tornarse resistentes.
Los antibióticos tienen cinco mecanismos básicos de efecto.
1. INHIBICIÓN DE LA SÍNTESIS DE LA PARED CELULAR.- La rígida estructura de la

pared celular permite a las bacterias mantener una presión osmótica interna muy elevada,
cuando las bacterias se exponen al antibiótico (penicilina) y se une a las proteínas de unión a
la penicilina (PBP). Se liberan enzimas autolíticas que degradan la pared celular. También se
inhibe la síntesis de la pared celular, ocasionando la muerte de la bacteria. Como ejemplo de
estos antibióticos están la penicilina, cefalosporinas, antibióticos B –lactámicos.
2. ALTERACIÓN DE LA MEMBRANA CELULAR.- Los antibióticos de esta clase
contienen decapéptidos cíclicos ramificados y catiónicos que destruyen la membrana
citoplasmática de las bacterias susceptibles. Esta actividad no ocurre si el antibiótico no
penetra la pared celular externa y pasa a la membrana citoplasmática interna. Dentro de este
grupo tenemos a las polimixinas.
3. INHIBICIÓN DE LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS.- Cuando el antibiótico entra en la

célula y atraviesa la membrana celular se une a las subunidades ribosómicas, inhibiendo las
síntesis de proteínas mitocondriales, otros detienen la elongación de las proteínas ya
sintetizadas. En este grupo se encuentran los aminoglucósidos, tetraciclinas, cloramfenicol,
eritromicina, clindamicina.

4. INHIBICIÓN DE LA SÍNTESIS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS.-Algunos antibióticos
inhiben la síntesis de los ácidos nucleicos uniéndose al ARN polimerasa o inhibiendo al
ADN girasa. En este grupo se encuentran las quinolonas, la rifamicina y el metronidazol.
5. ACTIVIDAD METABÓLICA O ANTAGONISMO COMPETITIVO.-Determinados

compuestos antibacterianos en el organismo como antimetabolitos por ejemplo la
sulfonamida que compite con el ácido p-aminobenzoico impidiendo la síntesis del ácido
fólico necesario para algunos microorganismos. Los mamíferos no sintetizan ácido fólico,
por lo que las sulfonamidas no interfieren en el metabolismo de las células de los mamíferos.
Otro ejemplo es la Nitrofurantoina.
La resistencia bacteriana a los antibióticos puede ocurrir por mecanismos genéticos o no genéticos
durante el tratamiento.
FUNDAMENTO:
Los antibióticos son derivados biológicos que actúan sobre los microorganismos alterando su
metabolismo o sus caracteres físicos, impidiendo su proliferación y deben tener como característica
principal el que no afecte el huésped.
OBJETIVO:
 Observar el efecto de los antibióticos sobre las bacterias.
MATERIAL Y EQUIPO
 Asa de inoculación
 Mechero Bunsen
 Hisopos estériles
 Sensidiscos de antibióticos acomodados para Gram positivos y Gram negativos.
MEDIOS:
 Tubos con caldo estéril
 Cajas Petri con agar de Müller-Hilton
 colonias resembradas en agar nutritivo de 18-24 horas de Escherichia coli y Staphylococcus
aureus.

TÉCNICA: INOCULACIÓN DIRECTA POR EL MÉTODO DE KIRBY BAUER.
1.- Realizar con el asa flameada y enfriada una suspensión directa en el caldo nutritivo e incubar de
1 a 2 horas, la turbidez del tubo debe igualarse a la del 0.5 en la escala de Mac Farland.
2.- Sumergir un hisopo estéril o el asa en la suspensión bacteriana, presionar sobre la pared del tubo
para quitar el exceso.
3.- Se inocula toda la superficie de la placa, rayando toda la superficie, la operación se repite 2 o
más veces rotando la caja, para obtener una distribución uniforme del inóculo.
4.- Se coloca la tapa de la caja y se deja de 3 a 5 minutos boca arriba para absorber cualquier exceso
de humedad.
5.- Colocar los sensidiscos asépticamente. Incubar a 37ºC de 18 a 24 horas.
6.- Al cabo de este tiempo se examinan las cajas y se miden los halos de inhibición incluyendo la
medida de los discos, las zonas de inhibición por lo general son claras y muy bien delimitadas. La
interpretación se efectúa con la tabla de rangos estándar y se reporta si el microorganismo es
sensible o resistente o moderadamente sensible, según los milímetros medios y comparados con el
cuadro que esta incluido en la práctica.
RECOMENDACIONES PARA REALIZAR UN ANTIBIOGRAMA
1. Verificar que el medio esté bien preparado, checando las instrucciones del marbete. El
espesor del medio en cada caja debe ser 4mm.
2. Los microorganismos en estudio deben venir de un medio nutritivo y estar perfectamente

aislados, para evitar una contaminación.
3. La turbidez de la suspensión de bacterias que se va a inocular debe ajustarse al tubo 0.5 de

la escala de MC Farland.
4. Para obtener un crecimiento uniforme y por lo tanto un buen resultado es necesario que la
inoculación con el hisopo o el asa cubra totalmente la superficie del medio.
5. Es importante también que después de inocular, se deja reposar la caja boca arriba durante 5
minutos para que el exceso de humedad sea absorbida y no afecte en la colocación de los
sensidiscos.
6. La distancia entre un sensidisco y otro debe ser aproximadamente de 24 mm de centro a

centro de cada sensidisco y una vez colocados ya no podrán ser movidos, ya que el
antibiótico se difunde inmediatamente al hacer contacto con el medio. Las zonas de
inhibición deben ser por lo general claras y muy bien delimitadas.

7. Luego del periodo de incubación se miden los halos con una regla de medición común. Los
resultados se interpretan como sensible, sensibilidad media o resistente de acuerdo con el
diámetro del halo de inhibición tomado en mm y usando como referencia la tabla del
NCCLS (tabla ).
Interpretación
TABLA . Lectura e interpretación de las zonas de inhibición
Fuente: Normas CLSI-NCCLS, 2005.

ACTIVIDADES:
I.- Contestar el siguiente cuestionario.
1.- ¿Qué es un antibiótico?
2.- ¿Qué es un antibiótico de amplio espectro?
3.- ¿Por qué es importante determinar la susceptibilidad de un microorganismo patógeno, a los

agentes antimicrobianos?
4.- ¿Qué requisitos debe reunir un antibiótico para su uso?
5.- Explique en qué consiste la resistencia de una bacteria a un antibiótico.
II.- CONCLUSIÓN:
BIBLIOGRAFÍA:
Panamericana. 2008

Elsevier, 2009.

Practica No. 11. PRUEBAS RÁPIDAS
11.1 Antiestreptolisisnas
11.2 Helicobacter pylori
11.3 Rotavirus

Practica No. 12 ANÁLISIS MICROBIOLÓGIC DE AGUA PURIFICADA O PARA USO
Y CONSUMO HUMANO.
INTRODUCCION:
El agua natural contiene nutrientes en suficiente cantidad para el desarrollo de

poblaciones de microorganismos, pocos o ninguno de estos son patógenos para el ser humano. La
presencia de microorganismos patógenos indica que el agua esta contaminada por tierra o por
heces que provienen principalmente del desagüe.
Las heces contienen una gran variedad de microorganismos y formas de resistencia de los
mismos, involucrando organismos patógenos los cuales son un riesgo para la salud publica al
estar en contacto con el ser humano.
Dentro de los organismos patógenos se encuentran los coliformes que es un grupo que
comprende todos los bacilos gram negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados
que fermentan la lactosa con producción de gas en un lapso máximo de 48 horas a 35 ºC.
Cuando las bacterias coniformes están suficientemente diluidas en una gran masa de agua,
sobreviven solo por lapsos cortos, una prueba positiva para tales bacterias puede tomarse por lo
general como evidencia de contaminación reciente. Algunos ríos están en la actualidad tan
contaminados que las bacterias coniformes no solo sobreviven si no que mantienen una población
significativa gracias a las sustancias organistas ahí encontradas
Debido a que la distribución de las bacterias en el agua es muy irregular aun después de
agitación se emplea para su conteo la técnica del número mas probable por medio de tubos
múltiples .E este es un método estadístico muy útil para estimar la cuenta de microorganismo.
Puede ser usada en una variedad de situaciones, en el análisis del agua se incluyen dos pasos : la
prueba presuntiva y la prueba de confirmación.
Los microorganismos mesofilicos son aquellos que crecen a una temperatura de 37 ºC.
Con esta prueba se cuentan todos las colonias desarrolladas en el medio con el contador de
colonias tipo Québec. Este contador se utiliza colocando la caja petri abierta debajo del lente
acomodado en la cuadricula del aparato. El método es contar las colonias de cada cuadro de
izquierda a derecha y de arriba hacia abajo.
TOMA DE MUESTRA
ENVASE: Reutilizan frascos estériles de 125 ml con tapón esmerilado. Para muestras de agua
cloradas, los frascos deberán prepararse depositando .1 ml de una solución de tío sulfato de sodio
al 10% antes de la esterilización.
TOMA DE AGUA ESTANCADA: Introducir el frasco destapado con la boja hacia abajo
sosteniéndolo por la base. Girar el frasco e impulsarlo suavemente hacia arriba de tal manera que
al salir a la superficie se haya llenado ¾ partes de su volumen. Tapar el frasco

TOMAR DE MUESTRA DE LLAVES, FILTRO, ETC. : Limpiar perfectamente la salida del
agua, hasta que no haya suciedad u oxido . Abrir la llave y dejar correr el agua durante un
minuto. Disminuir la velocidad de salida y llenar el frasco 2/3 partes de su capacidad. Al destapar
el frasco y durante toda la practica se debe evitar contaminar la boca del frasco ni el interior del
tapón . Marcar el frasco con los datos de identificación fecha y hora de muestreo y se debe
conservar a una temperatura de 4 a 10 º C
AGUA CORRIENTE: Se efectuara la maniobra ejecutando el desplazamiento del frasco en

dirección opuesta a la corriente
AGUA EMBOTELLADA: Tomar varios envases de agua , de preferencia poco después de haber
sido embotellada.
HIELO: Cualquier forma fraccionada de hielo se toma con pinzas o cucharas estériles
depositando en frascos de boca ancha de 1 lt de capacidad. Es preferible tomar la muestra de
hielo directamente de la maquina que lo esta produciendo.
FUNDAMENTO:
La técnica del número más probable tiene una base estadística para expresar
cuantitativamente la densidad de microorganismos en una muestra. La prueba consiste en
inocular series de tubos que contienen un medio de cultivo y un dispositivo o indicador opcional
que permitía manifestar un microorganismo o grupo de ellos en particular.
El conteo de mesofílicos es un procedimiento donde se realiza un recuento en un medio

de cultivo sólido de todos los microorganismos que crezcan de una muestra a una temperatura de
37 º C.
OBJETIVO:
 Realizar la cuantificaron de bacterias coniformes y mesofílicas en una muestra de agua

MATERIAL:
 Mechero bunsen  Pipetas estériles de 10 , 5, 1 y .1 ml
 Asa bacteriológica  Cajas petri estériles
 tubos con 20 ml de caldo lactosado  100 ml de agar nutritivo
doble concentración estéril  Desinfectante
 2 tubos con 10 ml de caldo lactosado
de concentración sencilla
TECNICA DEL METODO DEL NUMERO MAS PROBABLE
1) Agitar la muestra
2) Transferir 10 ml de la muestra a los 5 tubos con 20 ml de caldo lactosado doble
concentración
3) Transferir 1 ml y .1 ml de muestra respectivamente a los dos tubos con caldo lactosado de
concentración sencilla
4) Incubar a 35 º C . examinar a las 24 horas y observar si hay formación de gas , si no hay
presencia de gas se observa a las 48 horas. Cuando no hay formación de gas al prueba se
considera negativa
PRUEBA CONFIRMATORIA
Se someten a la prueba todos los tubos con cualquier cantidad de gas
1) Agitar suavemente todos los tubos

2) Transferir un inoculo de cada uno de los tubos positivos a un tubo con 10 ml de caldo lactosa
bilis verde brillante estéril con sus respectivas campanillas dirham
3) Incubar a 35 º C durante 24 o 48 horas. La presencia de cualquier cantidad de gas se
considera una prueba confirmatoria positiva
CUENTA DE MESOFILICOS
1) Agitar el frasco conteniendo la muestra mediante 25 movimientos en arcos de 30 cm en un

lapso de 7 segundos.
2) Evitando todo tipo de contaminación transferir 1 ml de la muestra a una caja petri aplicando
la punta de la pipeta al fondo de la caja. Hacerlo por duplicado.
3) Agregar 12-15 ml del aguar nutritivo fundido y conservado a 45 º C en baño maría
4) Mezclar con movimientos rotatorios, hacia la derecha y después hacia la izquierda sobre una
superficie lisa y horizontal. Dejar solidificar.
5) No deben transcurrir mas de 20 minutos desde el deposito de la muestra en la caja y la
adición del medio de cultivo
6) Incubar a 35 ºC durante 24 horas
7) Contar todas las colonias desarrolladas en las placas, no importa las características que
presenten utilizando un contador de colonias tipo Québec

Diagrama de trabajo
10 ml de la muestra muestra
1 ml 0.1 ml
Caldo lactosado
con concentración
Caldo lactosado con doble simple
concentración
1 ml
Incubar a 35+- 2ºC durante 24 horas
Para Mesófilos
Figura 29. Diagrama de trabajo de coliformes totales
Después de 24 horas de incubación

Producción de gas
Pasar un inoculo
Caldo lactosa bilis verde

brillante estéril
Figura 30. Diagrama de trabajo de prueba confirmativa coliformes totales

ACTIVIDADES:
1) Definir los términos agua potable, contaminada y poluta.
2.) Definir: Coliformes y mesofilicos
3) Que significado tienen los microorganismos en las aguas negras?
4) Que enfermedades se pueden adquirir por tomar agua no potable?

5) Cuales son las recomendaciones necesarias para tomar una muestra de agua que se va a
analizar?
RESULTADOS
CONCLUSIÓN
BIBLIOGRAFÍA
1. NOM-112-SSA1-1994. BIENES Y SERVICIOS. DETERMINACIÓN DE BACTERIAS

COLIFORMES. TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE.

Panamericana, 2008.

Panamericana. 2008

Elsevier, 2009.

Practica No. 13 ANALISIS MICROBIOLOGICO DE ALIMENTO (MERMELADA O
LECHE)
INTRODUCCION:
La leche es un alimento que constituye un hábitat ideal para el desarrollo bacteriológico,

ya que consta de grasa emulsionada, de concentración fisiológico, ya que consta de grasa
emulsionada, una concentración fisiológica de azucares, sales, proteínas, vitaminas y minerales
disueltas en agua. Los carbohidratos están representados por la lactosa y galactosa. Su pH es de
6.8 que el limite optimo para la mayoría de las bacterias.
Los microorganismos invaden la leche y la contaminan por medio del polvo de ahí que
pueden desarrollarse todas las especies. El organismo que generalmente invaden primero es el
Streptoccoccus lactis, el cual fermenta la lactosa con producción de acido láctico principalmente.
Cuando el pH baja se desarrollan otras especies como el bacillus acidophilus y el lactobacillus
casei. A una temperatura corporal se desarrolla el Enterobacter aerogenes y Escherichia coli.
ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR LA LECHE.
Existen dos diferentes tipos de transmisión:
1) -Transmisión a partir del animal: Es aquella donde el microorganismo se transmite del

animal al ser humano, siendo capaz de infectar tanto al hombre como a los animales.
Como ejemplos de estas infecciones están la tuberculosis y la brucelosis. Las vacas están
sujetas a infecciones con streptococcus del grupo A, Salmonellas, Staphylococcus y
Coxiella burneti, el agente de la fiebre Q, que puede desprenderse de la ubre directamente
hacia la leche. Staphylococcus aureus es liberado en la leche por las vacas que sufren de
mastitis produciendo una enteró toxina que provoca envenenamiento al ingerir la leche.
2) -Transmision apartir de personas infectadas: Esto se debe a que no se lleva un estricto

control sanitario en las personas que se encargan de manejar la leche y que se encuentren
infectadas con alguna enfermedad y que contaminen la leche. algunas de estas
enfermedades pueden ser: La fiebre tifoidea, la salmonelosis, la disentería. infecciones
por estreptococos y hepatitis. El control bacteriológico de la leche es de suma importancia
ya que con este se evaluara los procedimientos y las condiciones higiénicas en las que se
elaboro la misma.

FUNDAMENTO:
La leche por su gran cantidad de nutrientes ideales para el desarrollo microbiano, es

necesario realizarle frecuentes análisis microbiológicos que den una información de la calidad de
su elaboración.
OBJETIVO:
 Llevar a acabo un análisis bacteriológico en muestras de leche bronca y

pasteurizada, para observar si es apta o no para el consumo
MATERIAL Y EQUIPO:
 Mechero bunsen  125 ml de agar nutritivo estéril,

 Una muestra de leche bronca previamente derretido y conservado
 Una muestra de leche pasteurizada en baño maría a una temperatura de
 Tres tubos con 9ml de solución 45 ºC
tampón de fosfatos en tubos con  8 cajas petri estériles limpias
tapón de rosca para la leche  3 pipetas de 1 ml estériles
pasteurizada. Un frasco de 99 ml de  3 pipetas de .1 ml estériles
solución tampón de fosfatos en  Desinfectantes
botella con tapón de rosca, para la
leche bronca.
TOMA DE MUESTRA
La toma de muestra para análisis bacteriológicos requiere de utensilios e instrumentos que estén
estériles.
La leche bronca es necesario homogeneizarla primero y transferirla por medio de cucharas de

mando largo estériles a frascos estériles de 125ml de boca ancha, la muestra deberá mantenerse a
una temperatura entre 2 y 4 º C hasta su elaboración. Para muestra ya que pasteurizadas la muestra
puede consistir en el paquete o en los envases donde se presenta el producto.
TECNICAS PARA LECHE PASTEURIZADA
1) etiquetar los tubos de los blancos y cajas petri , con las diluciones que se van a trabajar 1:10
y 1:100
2) Agitar el paquete de la leche

3) Tomar 1 ml y vaciar en el tubo con 9 ml de solución tampón de fosfatos marcado con 1:10,
agitar, tomar 1 ml del tubo y vaciar en la caja marcada con 1:10.
4) Tomar 1ml de la dilución 1:10 y transferirlo al tubo con 9 ml de solución tampón de fosfatos
marcado con 1:100 , agitar, tomar dos muestras de 1 ml y transferirlas a las cajas marcadas
con 1:100
5) Vaciar aproximadamente 15-20 ml en cada caja del medio previamente disuelto. Rotar las
cajas 7 veces hacia arriba y hacia abajo y hacia los lados para que quede homogeneizado
6) Incubar a 37ºC por 24ª48 horas.
Diagrama De Trabajo:
DILUCIONES PARA LECHE PASTEURIZADA

1ml
9 ml sol.
Buffer de
Fosfatos
1: 10
9 ml sol.
Buffer d
fosfatos
1 : 100
Figura 31. Diagrama de trabajo para leche pasteurizada
TECNICA PARA LECHE BRONCA
1) Etiquetar los tubos y las cajas con las siguientes diluciones: 1:100 y 1:10000
2) Agitar la muestra de leche , limpiar la superficie de la tapa con alcohol al 70% retirando la
tapa con unas pinzas estériles
3) Transferir asépticamente 1 ml de la leche al envase con 99ml de solución tampón de fosfatos
marcado con 1:100 , agitar, Transferir un ml de esta dilución a cada una de las cajas
marcadas con 1:100.
4) Transferir 0.1 ml de la dilución 1:100 al tubo con 9 ml de solución tampón de fosfatos
marcado con 1:10,000. agitar y colocar en las cajas marcadas con 1:10,000 1 ml de esta
dilución
5) Vaciar el medio de cultivo y rotar las cajas
6) Incubar a 37 ºC por 24- 48 horas.
Observar las cajas y contar las colonias con el contador de colonias tipo Québec

DILUCIONES PARA LECHE BRONCA
1 ml
99 ml
Sol. buffer
de fosfa-
tos
0.1ml
9ml sol. Buffer

de fosfatos
Figura 32. Diagrama de trabajo para leche bronca
ACTIVIDADES
1) Por que la leche es un buen medio para el desarrollo de microorganismos?

2) Cuales son las principales fuentes de contaminación de la leche?
3) Citar cuatro enfermedades provenientes de leches contaminadas y que infecten al ser
humano?
4) Citar cuatro bacterias patógenas que se pueden encontrar en la leche
RESULTADOS
CONCLUSION

BIBLIOGRAFIA
Básicas
1. Adams MR, Moss MO. Microbiología de los alimentos. Editorial Acribia. S.A. España.
1995.
2. Barragán Reynaga D, Bonilla Moreno M, Cabrera Díaz E, Cárdenas Ortega A, Casas
Solís J, Claudio García LE, Domínguez Arias RM, Toledo González Sandra L.
Microbiología. Manual de Prácticas. Editorial Universitaria. Universidad de
Guadalajara. México. 2010.
4. BERNARD D. DAVIS. Tratado de Microbiología, Edit. Masson, Barcelona
España,1996.
5. BURROWS, FREEMAN, Microbiología, Edit. Publicaciones Culturales S.A. México
D.F.
6. COWAN, SAMUEL TERTIRUS. Manual para la Identificación de Bacterias de
Importancia Medica, Edit. CECSA, México D.F.
7. Gamazo C, López Goñi I, Díaz R. Manual Práctico de Microbiología (3ª Ed.). Ed.
Masson. España. 2005.
8. Genaro Torres R. Manual de tratamiento de aguas. Limusa. EUA. 2008.
9. JAWETZ, ERNEST. Manual de Microbiología Medica, Edit. Manual Moderno, México
D.F.
10. KONEMAN. Diag.Microbiologico texto y atlas 6/ed. Panamericana. 2008
11. MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M.; PARKER, J.: Biología de los
Microorganismos (12 Ed.). Ed. Pearson, 2009.
12. MURRAY, P. R.; ROSENTHAL, K. S; PFALLER, M. H.: Microbiología
Médica. (6ª Ed.) Elsvier, 2009.
13. NOM-007-SSA3-2011. Para la organización y funcionamiento de los laboratorios
clínicos. Diario Oficial de la Federación. Secretaría de Salud. México.2012.
14. NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002. Protección ambiental-Salud ambiental-Residuos
peligrosos biológico-infecciosos-Clasificación y especificaciones de manejo. Diario
Oficial de la Federación. Secretaría de Salud. México.2003.
15. Prescott LM, Harley JP, Klein DA. Microbiología (5ª Ed.) Ed. Interamericana. México.
2004.
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Panamericana, México D.F. 2007.
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18. SPICER, W.J.: Microbiología clínica y enfermedades infecciosas. (2ª Ed.).
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21. TORTORA GJ. Introduccion a la Microbiología. (9ª Ed.) Ed. Panamericana.
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23. Zinsser . Microbiología. Edit. Panamericana, Buenos Aires Argentina, 1997.
24. Zulueta Rodríguez R, Lara Capistrán L, TrejoAguilar D. Manual de prácticas generales
de laboratorio de organismos benéficos. Textos Universitarios. Universidad
Veracruzana. México. 2009.
Complementarias
1. Catálogo de prácticas de laboratorio para la docencia en microbiología.

https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-microbiologia/.
2. D. H. Bergey and John G. Holt and Noel R. Krieg and Peter H. A. Sneath Manual
Bergey, editorial Williams & Wilkins, ©1994.novena edición. ISBN 0683006037
9780683006032.
3. David T. Kinsburry. Manual de Microbiología Médica, Edit. Orientación, México D.F.
1998.
4. Dpto. de microbiología y parasitología UNAM.
5. http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/index.html.
6. Laboratorio de microbiología.UAM.www.azc.uam.mx/cbi/quimica/microbiologia.
7. Mc. Fadin. Pruebas bioquímicas para la Identificación de bacterias de Importancia
Clínica, Edit. Panamericana México D.F. 1991.
8. NOM-091-SSA1-1994 Leche pasteurizada de vaca
9. NOM-112-SSA1-1994. BIENES Y SERVICIOS. DETERMINACIÓN DE BACTERIAS
COLIFORMES. TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE
10. NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-115-SSA1-1994
11. Norma Oficial Mexicana NOM-166-SSA1-1997, para la organización y
funcionamiento de los laboratorios clínicos.
12. NORMA Oficial Mexicana NOM-184-SSA1-2002, Productos y
servicios. Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado.
Especificaciones sanitarias
13. Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-087-ECOL-SSA1-2000
14. Revista Latinoamericana de Microbiología Médica 2000-2010.
15. WISTRICH, George a. Prácticas de Laboratorio en Microbiología, Edit. Limusa,
México D.F. 1989
16. www.clinicarviz.com
17. www.dicipa.com.mx/mic2.html.
18. www.microbiologia.com.ar/mapa/
19. www.microbol.udc.es/microgen/figuras.html
100
APENDICE A. PREPARACION DE REACTIVOS UTILIZADOS EN
ESTE MANUAL
ALFA NAFTILAMINA (REACTIVO B)
Alfa-naftilamina... 5 gr
Acido acético 5N... 1 lt
Mezclar perfectamente.
ACIDO SULFANILICO (REACTIVO A)
Acido sulfanílico... 8 g
Acido acético 5N... 1 lt
Mezclar perfectamente.
REACTIVO DE KOVAC PARA INDOL
10 gr de paradimetilaminobenzaldehido.
150 ml de alcohol isoamílico.
50 mI de ácido clorhídrico.
Disolver el aldehido en el alcohol y añadir lentamente el ácido. Protejase de la luz y

refrigerar.
REACTIVO DE KOVAC PARA OXIDASA.
0.1 gr de cloruro de tetrametilparafenilendiamina.

10 ml. de Agua destilada.
Añadir el colorante al agua y dejar reposar por 15 minutos antes de usarse. Preparese nuevo
reactivo cada vez que se vaya a utilizar. El colorante pierde su actividad después de 2 horas.
ESCALA DE MAC. FARLAND
PREPARACION DEL NEFELOMETRO DE Mc FARLAND CON ESTANDAR DE SULFATO DE BARIO

Tubo CLORURO DE BARIO ACIDO SULFURICO DENSIDAD APROXIMADA
AL 1% ( ml) AL 1% (ml) CORRESPONDIENTE DE BACTERIAS
(MILLONES /ml)
1 0.1 9.9 300
2 0.2 9.8 600
3 0.3 9.7 900
4 0.4 9.6 1200
5 0.5 9.5 1500
6 0.6 9.4 1800
7 0.7 9.3 2100
8 0.8 9.2 2400
9 0.9 9.9 2700
10 1 9.0 3000
101
Índices de NMP y límites de confianza de 95 % para variar combinaciones de
resultados positivos y negativos, cuando se utilizan 5 tubos con 10 ml de
muestra.
Nº de tubos positivos Índice NMP/100ml Límite de confianza de 95 %
Inferior Superior
0  2,2 0 6
1 2,2 0,1 12,6
2 5,1 0,5 19,2
3 9,2 1,6 29,4
4 16 3,3 52,9
5  16 8 infinito
102
APENDICE B. PREPARACION DE COLORANTES UTILIZADOS EN
ESTE MANUAL
AZUL DE METILENO.
0.3 gr de azul de metileno.

30 ml de alcohol etílico de 95
Agua destilada.
Disolver el colorante en el alcohol y agregar 100ml de agua destilada.
AZUL DE METILENO DE LöEFFLER.
30 ml de solución saturada de azul de metileno.

0.01 gr de hidróxido de potasio.
100 ml de agua destilada.
Disolver el hidróxido de potasio en el agua y mezclar con la solución de azul de metileno.
COLORANTES PARA TINCION DE GRAM. (MODIFICADO POR HUCKER).
1) SOLUCfON MADRE DE CRISTAL VIOLETA.
Cristal violeta 20 gr%.

Alcohol etílico de 95 .. 1 OOml.
2) SOLUCION MADRE DE OXALATO.
Oxalato de amonio 1.0 gr

Agua destilada 100 ml.
Solución para uso inmediato.
Diluir la solución 1, 1: 10 con agua destilada y mezclar con 4 volúmenes de solución madre
de oxalato. Guardar en frascos con tapa de vidrio o colocados en frascos gotero.
3).- MORDIENTE (YODO DE GRAM)
Yodo………….... 1.0 gr.

Yoduro de potasio 2.0 gr.
Disolver en 5 ml de agua destilada y agregar 250 ml de agua destilada. Mezclar con 60 ml
de bicarbonato de sodio al 5%.Mezclar bien y guardar en frascos de vidrio color ambar.
4).- DECOLORANTE.
Alcohol etílico 95º ..... 250 ml.

Acetona. …………… 250 mI.
Mezclar, guardar en frasco con tapa de vidrio. Colocar en frasco gotero para uso diario.
103
5).- CONTRASTE.
SOLUCION MADRE DE SAFRANINA:
Safranina O………….. 2.5 gr.

Alcohol etílico de 95 ….. 100 ml.
Solución para uso inmediato:
Diluir la solución madre, 1: 10 con agua destilada. Colocar en gotero de plástico o de
vidrio.
TINCION DE ZIEHL-NEELSEN.
1).- FUSCINA FENICADA.
Solución A.
Fuscina básica …………. 0.3 gr.
Alcohol etílico 95º …………. 100ml
Solución B.
Fenol………….. 5 gr.
(o 4.66 ml de fenol fundido, ó 5.7 ml de fenol licuado al 88%).
Agua destilada…. 95 ml.
Mezclar la solución A en la solución B, agitando enérgicamente. Dejar reposar algunos días
y filtrar antes de su empleo.
2).- DECOLORANTE.
Acido clorhídrico concentrado………. 3 ml.

Alcohol etílico de 95º ………………… 97 mI.
3).- CONTRASTE:
Azul de metileno …………. 0.3 gr.

Agua destilada …………. l00 ml.
Mezclar y envasar en goteros de vidrio o plástico.
104
APENDICE C. TABLA PARA LA IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS
POR MEDIO DE PRUEBAS BIOQUIMICAS
105
107
108
109
APENDICE E. MEDIOS DE CULTIVOS
110
vente (agua peptonada, solución amortiguadora de halos de inhibición son bastante grandes y pueden
fosfatos), durante 10 minutos entre entrecruzarse.
70 y 80°C.
3. Recubrir cuidadosamente el inóculo y los discos
Una vez fría la suspensión, inocular 2 placas de Agar con otra capa (capa superior) del mismo medio de
Agar Anaeróbico Anaeróbico e incubar una de ellas en anaerobiosis y cultivo (Agar Anaeróbico, Bioxon 270-1).
atmósfera de CO2 a 35°C durante 18 a 48 horas y la otra
también en anaerobiosis pero sin CO2. Se obtienen me-
Cal. 270.1 450 9 jores resultados utilizando "jarras anaeróbicas" más CO2 4. Una vez solidificado el medio, colocar la
que con la sola anaerobiosis sin di óxido de Carbono. tapa anaeróbica de Brewer (sobre la capa
Para cultivar anaerobios y efectuar pruebas de superior) e incubar aeróbicamente, o bien,
Las placas de Agar Anaeróbico también pueden en anaerobiosis si se emplea la tapa normal
sensibilidad a los mismos. incubarse en atmósfera normal cubriendo la superficie del de la caja Petri.
medio de cultivo con las tapas de Brewer. En este caso,
Medio de cultivo desarrollado por Brewer para
dejar sin sembrar la franja circular externa del medio, co-
cultivar microorganismos anaeróbicos, como mo de 1.5 cm de ancho. Sobre esta franja estéril se
REFERENCIAS:
Brewer. SClence. 95:587. 1942.
Clostridium, sin necesidad de recurrir a aplicará con más o menos firmeza, el reborde interno de
recipientes (jarras) para anaerobiosis. También se la tapa Brewer para obtener un sello hermético. La parte
usa para pruebas de sensibilidad de los mismos. central de la tapa no deberá tocar ningún punto del medio Agar Biggy
de cultivo a fin de dejar una pequeña cámara de aire
como de 5 a 2 mm de altura. Cuando se observe Para aislamiento e identificación de
Fórmula aproximada en gramos por litro: crecimiento, abrir las placas para seleccionar las colonias, Candida.
Peptona de Caseína 17.5
Peptona de Soya 2.5 pudiendo incubarlas después más tiempo, si es preciso. Cato 205-1 450 9
Cloruro de Sodio 2.5
L.Cislina 0.4 El Agar de Glicina, Glucosa, Levadura y Sulfito
Dextrosa 10.0 de Bismuto es útil para el aislamiento y la
Agar 15.0
Tioglicolato de Sodio 2.0
identificacion presuntiva de Candida por medio
Formaldehído Sulloxilato de Sodio Azul de 1.0 de la reacción de sulfuro.
Metileno 0.002
Fórmula aproximada en gramos por litro:
pH tinal 7.2 iO.2
A los medios de cultivo para anaerobios, si no han
Preparación: sido preparados poco antes de su uso, es muy Citrato de Amonio y Bismuto 5.0
conveniente calentarlos y fundirlos para Sullito de Sodio 3.0
Suspender 51 g de polvo en un litro de agua destilada. expulsarles el oxígeno disuelto. Dextrosa 10.0
Remojar de 10 a 15 minutos. Mezclar bien y calentar Glicina 10.0
Extracto de Levadura 1.0
agitando continuamente. Hervir por un minuto o hasta Si por alguna circunstancia no es posible hacer la Agar 16.0
que el medio se disuelva por completo. Esterilizar en siembra del material en estudio en el Agar
autoclave a 15 libras durante 15 minutos. Vaciar en - Anaeróbico, sembrar la muestra en Medio de
pH final 6.8 i 0.2
cajas de Petri a las 3/4 partes de su capacidad, para Tioglicolato sin Indicador (Bioxon 245-1),
obtener así capas más gruesas que las usuales. Una vez previamente calentado y enfriado. Incubar hasta el
que el medio haya sOldificado, depositar sobre él, la día siguiente y resembrar en el Agar Anaeróbico. Preparación:
tapa de Brewer especial para anaerobiosis. La tapa de El Medio de Tioglicolato sin indicador es un
Brewer permite el desarrollo en la superficie de excelente caldo de en Suspender 45 g del medio deshidratado en
gérmenes anaerobios estrictos y microaerofílicos, en riquecimiento y con frecuencia da mejor re un litro de agua destilada. Remojar de 10 a
atmósfera normal. sultado que la siembra directa en placas. 15 minutos. Calentar agitando
frecuentemente y hervir durante no más de
un minuto. Dejar enfriar a 45 - 50°C.
Si la muestra en estudio contiene una mezcla de
gérmenes diferentes para aislar anaerobios, Agitar circularmente y vaciar en placas de
Usos: colocar un disco de papel filtro impregnado con Petri estériles, utilizando aproximadamente
30 mcg de kanamicina en el área de inoculación 20 mi para cada placa. No esterilizar en
Los tres agentes reductores provocan un descenso masiva de una placa de Agar Anaeróbico autoclave.
marcado y bastante estable del potencial del óxido- adicionada con un 5 % de sangre desfibrinada
reducción, asegurando así buenas condiciones de estéril de borrego o de conejo, y un disco de 10 Usos:
anaerobiosis. El azul de metileno funciona como unidades de bacitracina en otra placa de Agar
indicador Redox. Sangre. Dichos antibióticos inhibirán a los El Agar Biggy es útil para aislar C. albicans y C.
gérmenes aerobios en la zona inmediata a su tropicalis y para la diferenciación de especies en
La siembra de la muestra (clínica o alimento) puede alrededor pero no a los microorganismos la forma siguiente según Nickerson:
practicarse por estría superficial o por vaciado, es decir, anaerobios.
inoculando y mezclando el producto eQ estudio con el C. albicans
medio fundido y enfriado entre 45 y 50°C. Casi nunca Para llevar a cabo pruebas de sensibilidad (con
deberá Colonias lisas, hemisféricas o circulares, ca
gérmenes anaeróbicos), proceder de la siguiente
calentarse la muestra para destruir las formas vegetativas
manera:
porque serían destruidos los anaerobios no esporógenos.
Sin embargo, a veces es conveniente hacerlo cuando se
1. Inocular el cultivo puro sobre la superficie del
trata de microorganismos formadores de esporas como
agar (capa inferior).
Clostridium, menos con Clostridium perfringes que
muy pocas veces las forma. Cuando esté indicado el
2. Depositar de 4 a 5 discos de papel im-
calentamiento, calentar la muestra suspendida en líquido
dilu
pregnado con los antibióticos en estudio.
No probar más discos porque los
111
estéril de órganos, heces, raspados de mucosa vaginal, Fórmula en gramos por litro:
etc. . Fostato (5ihidrogenado de Amonio 1.00
Fostato Dipotaslco 1.00
Una buena medida es practicar siembras por duplicado e Cloruro de Sodio 5.00
incubar una placa en ambiente normal y la otra en una Citrato de Sodio
Sulfato de Magnesio
2.00 Agar para Clamidosporas
atmósfera enriquecida con CO2. 0.20
Agar 15.00 Cal. 273-1 450 9
Azul de Bromotimol 0.08
pH tinal 6.9 :!:.. 0.2 Medio especial que promueve y favorece la formación
El Agar Brucella Bioxon puede hacerse más
de Clamidosporas por Candida albicans. .
selectivo y dar un mayor número de aislamientos Preparación:
positivos, si se le agrega a cada 1000 mi del
medio esterilizado y enfriado entre 45 y 50°C, 1.4 Suspender 24.2 g del medio deshidratado en un
mg de violeta de etilo y la siguiente mezcla litro de agua destilada. Dejar remojar durante 5 a
antimicrobiana: 10 minutos. Mezclar bien y calentar agitando Agar 15.00
frecuentemente hasta ebullición y completa Sulfato de Amorlio. Fosfato .1.00
Sulfato de Polimixina B 6000 unidades Monopotasico Azul de Tripan 1.00
disolución. Distribuir volúmenes de 3 mi en tubos 0.10
Bacitracina. Cicloheximida 100 mg Polisacaridos purificados
(actidiona) 100 mg de 13 x 100 mm. Esterilizar a 121°C (15 lb de Blotina 20.0
presión) durante 15 minutos. Los tubos se dejan 5.0 mcg.
Si se desea restringir notablemente la difusión enfriar en posición inclinada de manera que el
(swarming) de los Proteus, agregar de 2 a 3 gramos de medio de cultivo en el fondo del tubo alcance una pH final 5.1 .:!:.. 0.2
agar bacteriológico (Bioxon 150-1 ), por cada litro de profundidad de 1.0 a 1.5 cm. Se puede emplear Preparación:
medio. también como medio en placas.
Suspender 37 g del polvo en un litro de agua destilada de
buena calidad. Dejar remojando el medio deshidratado
Nota: Usos: (agitándolo de cuando en cuando), un lapso de 10
minutos para que se hidraten bien las partículas de Agar.
Si al medio de Agar Brucella se le agregan 5% de sangre
Este medio se puede emplear de la misma manera Calentar con agitación continua y hervir un minuto.
desfibrinada estéril de borrego, más 5 mcg/ml de hemina
que el citrato de Koser para hacer la prueba de Esterilizar en autoclave a 15 libras de presión durante 20
y 10 mcg/ml de menadiona (vitamina K1), se prepara utilización de citrato como una de las reacciones minutos. Vaciar en cajas de Petri (12 mi por caja de 9-1
una excelente base enriquecida no selectiva, de uso delIMViC. Pueden hacerse cultivos en placa, o si O cm de diámetro).
general, para cultivar gérmenes anaerobias, incubando se prefiere el medio inclinado, se inocula Si se desea preparar este medio aún más selectivo:
naturalmente en anaerobiosiso Es más, esta base estriando la superficie y puncionando el fondo. Dejarlo enfriar entre 45 - 50°C Y agréguele 40 unidades
enriquecida de Agar Brucella sangre puede Los cultivos se incuban durante 4 días de 35 a de Penicilina. 40 microgramos de Estreptomicina y de
transformársele en un medio selectivo adicionándole los 37°C. Si no se obtienen resultados precisos, lo 0.1 a 0.5 mg de Cicloheximida por mi de medio de Agar
antibióticos apropiados o algunos otros inhibido res tales cual puede suceder con cepas de Providencia, es para Clamidosporas. Hay que tener en cuenta que un
como 20 mi de bilis (2.0 g en polvo) por litro de medio necesario hacer nuevas pruebas incubando a cierto número de especies de Candida son inhibidas por
(Bioxon 182-2). temperatura ambiente durante 7 días. Solamente 0.5 mg de Cicloheximida. Sin embargo. la mayor parte
los microorganismos que utilizan el citrato como de las cepas de Candida Albicans son resistentes a 5
única fuente de carbono, crecen en el Agar Citrato mg/ml de dicha droga. Pueden utilizarse otras mezclas
Bibliogratia: de Simmons. antimicrobianas como Polimixina B 6000 unidades +
Kzudas y Mor~e. J. Backt 66:502, 1953. Bacitracina 1 00 mg + 100 mg de Cicloheximida en un
Renoux G. Ann. Inst. Pasteur, 87:325, 1954.
litro de medio de cultivo; o bien, 50 mg de Cloranfenicol
Standard Methods for the Examination 01 Dairy Products. 10th.
Ed. APHA, Inc. New York. 1960. La aparición de un crecimiento visible gene- en 1000 mi de medio.
Ed. London.Boston 1977.
Smith Louis Os. The Pathogenic Anaerobic Bacteria. Charles C.
ralmente va acompañado de un cambio alcalina
Thomas Pub. Sprinlield. lIIinois. 1975. Koneman. Allen, Dowell (azul) del indicador.
y Sommers. Color Atlas and Text. book 01 Diagnostic
Microbiology, J.B. Lippinocotl Company.Philadelphia 1979.
Este medio puede ser utilizado especialmente en la
diferenciación de bacilos entéricos como se indica a
continuación:
Negativos Positivos Enterobacter

La adición de antibióticos al medio de cultivo
Escherichia Klebsiella
permite aislar directamente la Candida al bicans
Arizona
Shigella Mima a partir de la muestra clínica en estudio e
Citrobacter Serratia
identificar la formación de Clamidosparas;
(- 0+) Listeria Salmonella
Herella
simultáneamente incubar por duplicado. a 28 y
35°C de 24 a 76 horas.
Agar Citrato de Simmons
Bibliografía: Obtención de Clamidosporas por Candida
Prueba de utilización de citrato de entero Simmons J. Int. Dis. 39:209. 1926. albicans.
bacterias. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater .
11 Th Edition. APHA Inc. New York. 1960. Edwards & Ewing.
Enterobacteriacease. Una tensión ligeramente baja de oxígeno favorece la
Cal. 216.1 450 9 USPHS. Publications 743. Washington. 1972. Torrp.qrosa and formación de Clamidosporas por lo que la resiembra
Ortiz. Pediatrics 59:35. 1961. deberá hacerse por incisión profunda. Véase en este
El Agar Citrato de Simmons se usa para di- mismo manual, Agar de Czapek Dox (Bioxon 251-1).
ferenciar las bacterias entéricas Gramnegativas, Las Clamidosporas son formas-de resistencia,
basándose en la utilización del citrato. globulosas, redondas u ovales que presentan una pared
Recomendable para la diferenciación de doble y gruesa, siendo de ma
coliformes aislados del agua.
112
te por estría superficial y se incuban de 30 Preparación:
a 32°G-durante 48 horas. Cualquier colonia
productora de pigmentos (amarillas o débilmente Suspender 43 g del medio deshidratado en un
anaranjadas), que esten rodeadas por una zona litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15
clara, probablemente serán de estafilococos minutos. Calentar agitando frecuentemente y
patógenos causantes de intoxicaciones por hervir durante un minuto, Esterilizar a 121°C (15
alimentos contaminados. Se recomienda repicar lb de presión) durante 15 minutos.
dichas colonias y emulsionarlas en 0.1 a 0.2 mi de
Caldo Infusión de Cerebro Corazón (Bioxon 112) Una vez esterilizado enfriar a 40 - 45°C, Y vaciar en
y efectuar pruebas de coagulasa. Así mismo, es cajas de Petri estériles.
conveniente agregar una gota de solución de
púrpura de bromocresol al sitio de donde se Usos:
tomaron las colonias para determinar si hubo
fermentación del manito!. Un color amarillo Se puede emplear en análisis microbiológicos de
indica reacción positiva. Las zonas o halos claros productos congelados. para lo.cual es necesario
Agar de Chapman Stone que se observan alrededor de la colonia indican acidificar el medio con 7.1 mi de solución de
degradación (proteólisis de la gelatina) por la ácido tartárico al 10% por cada litro de medio,
enzima gelatinasa. después de que éste ha sido esterilizado, fundido
y enfriado a unos 45°C.
Cal. 297.1 450 g Las colonias de Estafilococos típicamente

productoras de intoxicaciones alimentarias (por Nunca se vuelva a fu!,,\dir después de acidificar el
ingestión de la enterotoxina) son amarillas, medio ya que el agar sufre una hidrólisis que lo vuelve
amarillo-doradas o de color naranja; fermentan el incoagulable. Es un me. dio de uso general pero no es
manitol, son coagulasa positivas, producen beta apto para reacciones de hemólisis por su alto contenido
Para aislar y diferenciar Estafilococos patógenos de la en dextrosa.
leche, productos lácteos y de otros alimentos.
hemólisis en medios como Base de Agar Sangre
(Bioxon 201) Y son gelatinasa positiva (reacción
de Stone positiva).
REFERENCIAS:
Recomended Methods lor the Mlcrobiological Examination 01
Fórmula aproximada en gramos por litro: Las colonias pálidas, prácticamente desprovistas de Foods APHA, Inc. New York, 1958.
color, no productoras de pigmentos, a pesar de que estén
rodeadas por zonas claras no deberán de tomarse en
Extracto de Levadura 2.0 cuenta.
Peptona de Caseína 10.0 Agar de Eosina y Azul de
Gelatina 30.0
D.Manitol 10.0 REFERENCIAS:
Chapman J. Bacl. 1945. 50: 201.
Metileno
Sulfato de Amonio 75.0
Cloruro de Sodio Foslato 55.0 Recomended Methods lor the Microbiological Examination 01
Dipotásico Agar 5.0 Foods A.P.HA Inc. New York, 1958.
Standard Methods lor Examination 01 Dairy Products. la. Ed., Para el aislamiento y diferenciación de coliformes
15.0
A.P HA Inc. New York, 1960. de otras enterobacterias de interés médico y
sanitario.
pH linal 7.0 :t. 0.2 Fórmula aproximada en gramos por litro:
Peptona de Gelatina 10.000

Preparación: Laclosa 5.000
Sacarosa 5.000
Agar de Dextrosa Fosfato Dipotásico
Eosina Y
2.000
0.065
Suspender 202 g del polvo en un litro de agua Azul de Melileno Agar 13.5
destilada. Mezclar correctamente. Remojar de 10 a 15
minutos. Calentar agitando con frecuencia y hervir Recuento y aislamiento de bacterias.
pH final 7.2.:1:..0.2
más o menos un minuto hasta disolución del medio.
Esterilizar en autoclave a 15 libras de presión durante Cal. 125.1 450 g
10 minutos. Vaciar en cajas de Petri aproximadamente Preparación:
25 mi por placa. Es un medio de cultivo rico, que se recomienda para el
recuento de microorganismos presentes en los Suspender 36 g del polvo en un litro de agua
concentrados de jugos de frutas. Al agregársele sangre destilada de buena calidad. Mezclar y remojar
se mejoran las características nutritivas, pudiendo unos 10 minutos para que se hidrate
Usos:
aislarse varios gérmenes como Neisserias patógenas, correctamente el Agar. Calentar agitando con
Neumococos y otros. frecuencia. Hervir un minuto. Esterilizar en
El Agar de Chapman Stone se usa igual que el Agar
para Estafilococos No. 110 (Bioxon 105), autoclave a 15 libras de presión durante 15
distinguiéndose de éste en que ya contiene sulfato de minutos. Dejar que se enfríe la solución a unos
amonio, por lo que se puede apreciar directamente la 50°C. Agitar suavemente, evitando la formación
actividad de la gelatinasa (reacción de Stone). El medio de burbujas, para que la composición del medio
Extracto de Carne 3
tiene un color blanco y aspecto opaco. Las muestras MezclaCal.
de Peptonas
se uniformice y vaciar en cajas de Petri estériles,
106-1 450 g 10
sospechosas de contener estafilococos patógenos Dextrosa 10 Dejar que el medio se solidifique y luego invertir
Cloruro de Sodio Agar 5 las placas para que no se deposite demasiada
(alimentos diversos, especímenes clínicos), se siembran
15 humedad sobre la superficie del mismo.
masivamen
pH linal 6.9 :t. 0.2
USOS:
Este es el medio clásico, que al igual que el Agar

con Eosina y Azul de Metileno de Levine
(Bioxon 223), se utiliza para el estudio de las
enterobacterias. La morfología, aspecto y color
de las colonias e la misma en ambos medios.
113
Agar para Estafilococos No.
110
Medio selectivo para aislamiento de
estafilococos.
Además de emplearse ampliamente en Cal. 105.' 450 9
Bacteriología Médica, se utiliza en las técnicas La microflora acompañante, que entOrpece el
recomendadas por la American Public Health aislamiento de los gérmenes de interés médico, es Es un medio altamente selectivo para el ais-
Association y la Sociedad Americana de ampliamente inhibida por los colorantes de la
lamiento e investigación de estafilococos. El
Bacteriólogos, para la detección y recuento de fórmula, sobre todo la flora Gram positiva.
medio contiene gelatina y manitol facilitando así
microorganismos coliformes, que pueden estar el aislamiento de estafilococos que atacan y
contaminando diversos alimentos yaguas de degradan dichas sustancias.
bebida de diversa índote, destinadas al consumo
humano.
Fórmula aproximada en gramos por litros:
En este medio también es posible la identificación
rápida de Candida albicans (incubado en CO2) y 2.5
a veces se logra aislar a Nocardia. Extracto de Levadura 10.0
Peptona de Caseína Gelatina 30.0
Lactosa 2.0
Por su contenido en lactosa y sacarosa es posible O.Manitol 10.0
diferenciar en el primocultivo: Salmonellas y Shigellas, Cloruro de Sodio 75.0
Bibliografía:
Foslato dipotásico Agar 5.0
Lactosa y Sacarosa negativas de otras enterobacterias American Public Heallh Association. Oiagnostic Procedures and
Reagents. 2nd Ed. APHA Inc. New York. 1950. American Public 15.0
lactosa negativas pero sacarosa positivas, tales como
Heallh Association. Examination ot Oairy Products. 10th Ed.
Proteus vulgaris, Citrobacter y Aeromonas. APHA, Inc. New York. 1953.
pH final 7.0:t. 0.2
Society 01 American Bacteriologists. Manual of Microbiological
Methods McGraw.HiII New York. 1957. Preparación:
Suspender 149 g del medio deshidratado en un litro de
agua destilada. Remojar entre 10 y 15 minutos.
Homogenizar y calentar agitando frecuentemente. Hervir
durante un minuto. Esterilizar a 15 lb durante 15
minutos.
M ICROORGAN ISMOS CARACTERISTICAS DE LAS COLONIAS
Elevadas o ligeramente convexas. De 2 a 3 mm. de Una vez esterilizado homogenizar para suspender el
precipitado y vaciar en cajas de Petri.
diámetro. Presentan a la luz transmitida un centro
azul-negro, rodeado de un borde angosto y claro;
Escherichia coli
y brillo métalico azul verdoso, a la luz reflejada. Al-
gunas cepas no muestran brillo metálico. Poca ten-
dencia al desarrollo confluente. Usos:
COlü¡¡ias grandes de 4 a 6 mm. de diámetro, eleva-
Enterobacter aerogenes das y mucoides con tendencia a unirse. Usualmente El Agar para Estafilococos No. 110 se emplea
Klebsiella no presentan brillo metálico. A la luz transmitida para aislar estafilococos de procesos purulentos,
casos de neumonía, meningitis, forunculosis,
muestran un centro grisáceo café y bordes claros.
uretritis, vaginitis, etc. También se emplea este
Ligeramente elevadas, de tamaño medio, de 1 a 2 medio para aislar estafilococos que contaminan
alimentos diversos y que producen intoxicaciones
Salmonella y Shigella mm. de diámetro. Transparentes, desde incoloras
alimentarias.
hasta ambarinas.
Es posible enriquecer el medio agregando 5% de
Después de 24 a 48 horas de incubación en atmós- sangre con lo que se obtienen buenas reacciones
de hemólisis y formación de pigmento amarillo
fera de un 10% de CO2 ya 35 - 36°C, pueden
dorado. Si se agrega a las colonias seleccionadas
presentar colonias plumosas semejantes a tela- unas gotas de azul de bromotimol, podemos
Candida albicans
rañas (miceliales). Las colonias no siempre pre- apreciar la fermentación del manitol apareciendo
sentan un aspecto típico. alrededor de ellas un halo amarillo. Por último,
las placas se pueden cubrir con 5 mi de una
Estafilococos Muy pequeños, puntiformes, incoloros y bastante solución saturada de sulfato de amonio, o mejor
Coagulasa Positivos inhibidos. aún, con una gota de solución de ácido Sulfosali-
cílico al 20 %, e incubarlas durante 12 minutos
Cuando no hay swarming, semejantes a Salmone- para apreciar la hidrólisis de la gelatina: Se
lIa y Shigella. Puede evitarse la difusión del Proteus observan zonas claras (Reacción de Stone).
Proteus Sp.
agregando al Medio de Cultivo huellas de alta-p-
nitrofenil-glicerol.
Bibliografía:
Chapman J. Bacl. 51.409. 1946.
Chapman J. Bacl. 63:147. 1952.
114
Los gérmenes Gram positivos son inhibidos por
Usos: las sales biliares y el cristal violeta. Las
enterobacterias fermentadoras de la lactosa bajan
El especimen puede sembrarse directamente en la placa el pH del medio que es detectado por el indicador
por estría superficial. o bien inocularlo en medios rojo neutro dando colonias rojas o rosadas. Las
Agar de MacConkey líquidos de enriquecimiento, tales como Caldo
no fementadoras de la lactosa dan colonias
Tetrationato, Caldo Selenito Cistina o Caldo GN.
transparentes, incoloras o ambarinas.
Incubar placas y caldos a 35°C de 18 a 24 horas. Hacer
resiembras de estas últimas en placas de Agar de
MacConkey y volver a incubar.
En el agar de MacConkey crecen también bacilos Gram
negativos que no pertenecen a la familia
Se recomienda sembrar simultáneamente las muestras en Enterobacteriaceae, como Pseudomonas y Aeromonas.
otros medios más selectivos tales como Eosina y Azul Asimismo, pueden desarrollarse en número reducido
Medio empleado amp1iamente para colonias puntiformes de Streptococcus fecalis (enteroco-
aislar e identificar selectivamente a de Metileno, Agar SS, Agar Tergitol 7, Agar XLD, Agar
Entérico Hektoen, Agar Sulfito de Bismuto (altamente cos) de color rojo y de algunos estafilococos cuyas
enterobacterias como Salmonellas, colonias son pequeñas, opacas de color rosa pálido.
Shigellas y coliformes a partir de heces específico para SalmoneJ/a typhi), Agar Verde
fecales, orinas, aguas negras Brillante, especial para Salmonellas. Véase en
y diversos alimentos este mismo manual las indicaciones y usos de
esos medios.
Por último, este medio puede usarse en la
diferenciación de especies de Mycobacterium.
Cal. 109.1 450 9
CARACTERISTICAS DE LAS COLONIAS GERMENES

De rojas o rosadas. No son mucoides. Pueden
rodearse de un precipitado opaco de sales Escherichia coli
biliares.
Peptona de Gelatina
Mezcla de Peptonas 17.0 Grandes. rosadas, mucoides. Klebsiella
Lactosa 3.0
Mezcla de Sales Biliares 10.0
Cloruro de Sodio 1.5 Grandes, rosadas, No son mucoides. Enterobacter
Agar 5.0
Rojo Neutro 13.5
Cristal Violeta 0.03 Rojas o rosa. No son mucoides. Serratia
0.001
Incoloras, transparentes. Rojas si fermenta a
Arizona
la lactosa.
pH final 7.1 :L 0.2
Incoloras, transparentes, rojas si fermentan la
Citrobacter
lactosa.
Preparación: Incoloras y transparentes Proteus
Suspender 50 gramos del medio en un litro de Incoloras. hasta café verdosas. Olor dljlzaino
agua destilada o desionizada de buena calidad. Pseudomonas
Remojar bien entre 1 O a 15 minutos y calentar a característico.
ebullición agitando continuamente. Hervir durante
un minuto. Esterilizar en autoclave a 121°C (15 Incoloras, transparentes o ambarinas. Salmonella
lb) durante 15 minutos. Enfriar a 45-50°C'y vaciar
en cajas de Petri unos 20 mi por placa. Dejar Incoloras, transparentes o rosa muy tenue. Shigella
solidificar y luego invertir las cajas para evitar que
se deposite tlr¡ exceso de humedad en la superficie Puntiformes, rosa pálido, opacas y escasas. Estafilococos
del medio.
Escasas, puntiformes, rojas, opacas y con un
Enterococos
halo claro como de 1 mm de diámetro alrede-
dor de la colonia.
Bibliografía: MacConkey J. Híg. 5:33, 1905.

Joseph Md. Sta/e. Dep/- Heal/. Procedures. 1960.
115
Para bajar el pH del medio a 4.0 se agregarán 15 Después de este tiempo se tendrán que revisar
mi de solución de ácido láctico al 10%, por cada periódicamente las zonas de inhibición ya que el
litro del mismo. Una vez acidificado éste, no se microorganismo puede desarrollar cuando la
vuelva a calentar porque el agar sufre un proceso concentración del agente antimicrobiano comienza a
de hidrólisis y pierde su capacidad gelificadora. disminuir.
Se obtienen mejores resulados para aislar

Bibliografía: Neisserias patógenas preparando un agar
Huppert y Walker, A.J. Clin. Path 29:291. 1958. Neauralh y
Berliner Seienee, 146:648. 1956.
chocolate con el Mueller Hinton adicionándole a
Bridges, Olivo y Chandler, Applied, Mierobiol, 4:147,1956. cada 100 mi del medio terminado y flÚido 1.0 mi
de la suspensión VCN (Bioxon 303), más 1.0 mi
Agar Micológico del poli enriquecimiento (Bioxon 304).
(Agar Micofil)
REFERENCIAS:
Harris and Coleman Diagnoslie, Proeedures and Reagents. 4th
Agar de Mueller Hinton Edition APHA. Ine. New York, 1963.
Cal. 247- Mueller and Hinton A. protein-free medium for primary ;satation
1 450 9 Pruebas de sensibilidad a 01 the Gonoeoeeus and meningoeoeeus. Proe. Soe. Exp. Biol.
antibióticos y cultivo de Neisseria and Med. 49:330, 1941.
Cal. 110,1 450 9

Para el cultivo, recuento, conservación, identificación y
producción de pigmentos por diversos hongos presentes En un medio muy rico en nutrientes que se
en bebidas, alimentos, materiales clínicos y productos recomienda para el aislamiento y desarrollo de
farmacéuticos. gonococos y meningococos. También se emplea,
sobre todo, en las pruebas de sensibilidad Agar Nutritivo
(antibiogramas).
Uso general en bacteriología
Fórmula aproximada en gramos p'" lilro: Cat.104.1 450 9
Peptona de Soya Infusión de Carne de Res Peptona .300.0
Dextrosa 10.0 de Caseina Aeida '. Almidón 17.5 El Agar Nutritivo es un medio de uso general en
Agar 10.0 Agar 1.5 el laboratorio, no selectivo y adecuado para el
16.0 17.0
cultivo de microorganismos poco exigentes.
pH fínal 7.4 .:!:.. 0.2 Puede emplearse en bacteriología sanitaria,
pH final 7.0 .:!:.. 0.2 médica e industrial.
Preparación:
Preparación:
Fórmula aproximada en gramos por fítro:
Suspender 38 g del medio deshidratado en un
Suspender 36 g del polvo en un litro de agua destilada. litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 Peplona de Gelafína Extracto 5.0
Remojar de 10 a 15 minutos y mezclar bien. Calentar minutos. Mezclar bien agitando frecuentemente. de Carne de Res Agar 3.0
agitando con frecuencia y hervir durante un minuto. 15.0
Hervir durante un minuto, yesterilizar a 121°C
Esterilizar en autoclave a 12 libras de presión (118°C) (15 lb de presión) por un tiempo no mayor de 15 pH final 6.8 .:!:.. 0.2
durante 15 minutos. minutos.
Preparación:
Enfriar a 40-45°C y vaciar en cajas de Petri. Si se desea,
En Microbiología Médica se le utiliza para aislar hongos pueden prepararse placas o tubos de agar "chocolate", Suspender 23 g del medio deshidratado en un
patógenos causantes tanto de micosis superficiales como previa adición de sangre de carnero o humana, litro de agua destilada. Remojar unos 15 minutos,
de micosis profundas. Al mismo tiempo, se aconseja preferiblemente la primera, calentando en baño maría a mezclar y calentar a ebullición de 1 a 2 minutos
hacer cultivos simultáneos con médios que contienen 80° C 10 minutos. No sobrecalentar el medio en ningún hasta disolver el producto. Distribuir y esterilizar
antibióticos como el Agar para Selección de Hongos momento. a 121°C (151b de presión) durante 15 minutos.
(Bioxon 259). De cualquier modo, al Agar Micológico
se le pueden agregar 0.5 g de cicloheximida por litro de
medio para evitar el desarrollo de hongos saprófitos Usos: Usos:
(mohos) y 0.05 g de cloranfenicol, que impide el
crecimiento de las bacterias contaminantes. Muy empleado en los análisis bacteriológicos de aguas
Es un medio útil para el desarrollo de bacterias del
potables, de uso industrial y residuales, leches y otros
género Neisseria. Se recomienda incubar las cajas a
35°C, en atmósfera de CO2 (técnica de la vela). El alimentos. Se le emplea también en la multiplicación de
medio deberá mantenerse húmedo en su superficie; esto microorganismos para producir vacunas y antígenos en
El Agar Micológico se usa también para valorar la puede lograrse si dentro de la jarra, envases de hojalata, general; en las pruebas de sensibilidad y resistencia, y
actividad fungicida de medicamentos farmacéuticos. frasco de vidrio de boca ancha, etc., se coloca una como base para preparar medios de cultivo más ricos
También para efectuar recuentos de levaduras, mohos y esponja o algodón húmedo y una vela encendida, adicionados de líquido ascitico, etc. Lo mismo que en
bacterias (recuento total de microorganismos) en diver- cerrando luego herméticamente. pruebas bioquímicas, por ejemplo indoldescarboxilasa y
sos preparados de la industria farmacéutica, Para lisina-descarboxilasa.
obtener solamente el número de levaduras y mohos,
deberá bajarse el pH del medio de 4.0 a 4.7. Lo anterior
también es válido para la industria de bebidas y Para realizar las pruebas de sensibilidad con
alimentos. sulfonamidas, las cajas deben examinarse Bibliografía.
Wetmore and Goehenour J. Bael. 72:79, 1956. Greenberg and
después de 12 a 18 horas de incubación. Cooper Can. Med. Assn. J. 83:143, 1960.
116
Agar Proteosa No. 3 Agar de Sal y Manitol Agar para Salmonella y
Aislamiento de bacterias Aislamiento de estafilococos Shigella (Agar SS)
patógenas
Cal. 146.1 450 g Aislamiento de enterobacterias
Cal. 204.1 450 g patógenas
Es un medio selectivo muy empleado para aislar Cal. 144.1
El Agar Proteosa No. 3 ha sido utilizado para el 450 g
estafilococos patógenos de materiales clínicos
aislamiento y cultivo de gérmenes patógenos exigentes, diversos (orina, genitales, heridas, exudados
especialmente Neisseria gonorrhoeae. faríngeos, etc.). También se utiliza en la industria Medio diferencial selectivo muy empleado en
alimenticia con los mismos fines, el aislamiento e bacteriología sanitaria para aislar Salmonella y Shigella,
indentificación de Estafilococos que se a partir de heces, orina y alimentos diversos. tanto
Fórmula aproximada en gramos por litro: encuentran en la leche y productos lácteos, carnes frescos como enlatados. La inhibición de bacterias
y derivados cárnicos incluyendo conservas de Gram positivas se obtiene por una mezcla de sales
Mezcla de Peptenas 20.0 biliares.
Dextrosa pescado.
0.5
Cloruro de Sodio. 5.0
Fosfato de Sodio. Agar Fórmula aproximada en gramos por litro:
5.0 Fórmula aproximada en gramos por litro:
15.0 Extracto de Carne 5.0
Extracto de Carne Mezcla de Peptonas Lactosa 5.0
1.0
pH final 7.3 lO.2 Mezcla de Peptonas Mezcla de Sales Billares 10.0
10.0
Cloruro de Sodio Citrato de Sodio 8.5
75.0
Preparación: D.Manitol Tiosulfato de Sodio 8.5
10.0
Agar Citrato Férrico 8.5
15.0
Rojo de Fenol. Agar 1.0
Suspender 45 g del medio deshidratado en un litro de 0.025
Rojo Neutro 13.5
agua destilada. Mezclar bien. Remojar de 10 a 15 Verde Brillante 0.025
pH final 7.4 lO.2
minutos. Calentar agitando frecuentemente y hervir 0.330 mg
durante un minuto. Distribuir y esterilizar en autoclave Preparación:
a 121°C (15 lb de presión) durante 15 minutos. Enfriar pH final 7.0 lO.2
y añadir 5% de sangre de cordero desfibrinada y estéril. Suspender 111 g del medio deshidratado en un litro de Preparación:
Si el medio va a usarse para el cultivo de Neisseria, agua destilada y remojar unos 15 minutos. Mezclar bien Suspender 60 9 del medio deshidratado en un
calentar la mezcla a 80°C, durante 10 minutos o hasta y calentar a ebullición durante un minuto. Esterilizar en litro de agua destilada. Remojar unos 15 minutos.
que adquiera un color café chocolate; enfriar y vaciar autoclave a 121°C (15 lb de presión) durante 15 minutos. Agitar para obtener una suspensión homogénea,
en cajas de Petri sin dejar de agitarla. Agregar Vaciar en cajas de Petri. calentar con agitación frecuente y hervir durante
antibióticos VCN (Bioxon 303) y polienriquecimiento un minuto. No deberá esterilizarse en autoclave.
(Bioxon 304), si se desea. Verter en placas. Evítese la congelación.
Usos:
La degradación del manitol con producción de ácido
Usos:
Usos: cambia el color del medio, de rosado a amarillo. Debido a
su alto contenido de cloruro de sOdio, puede hacerse una
siembra masiva del material en estudio. Generalmente se
Debido a su gran poder de inhibición, este medio
El agar "chocolate" se utiliza en diversas formas. Para puede sembrarse con una buena cantidad del
obtener un desarrollo satisfactorio de Gonococos, se incuban las placas unas 36 hrs., apareciendo las colonias
de estafilococos no patógenos de tamaño pequeño y
material en estudio, pero además deberán
pueden añadir materiales de enriquecimiento tales inocularse paralelamente otros medios menos
como plasma de caballo, hemoglobina y azul nilo o al- rodeadas de una zona roja; en cambio, las colonias de
estafilococos patógenos fermentadores del manitol, dan inhibidores como Agar de Desoxicolato, Agar de
midón y sangre. MacConkey, Agar de Eosina y Azul de Metileno,
colonias más grandes y rodeadas de una zona amarilla. Si
agregamos a cada litro del medio, una yema de huevo en
Agar Tergitol7, Agar XLD y Agar Entérico
Al incubar placas para el cultivo de Neisseria deberá Hektoen.
condiciones de esterilidad, los estafilococos, que además
usarse una atmósfera reforzada con bióxido de Las bacterias no fermentado ras de la lactosa
de fermentar el manitol producen lipasa, darán un
carbono, en un tarro con bujía o vela encendida. (supuestamente patógenas) dan colonias claras,
precipitado amarillento de ácidos grasos alrededor de la
Incubar a 35°C pero no a más de 37°C. transparentes e incoloras, en cambio los
colonia. Este fenómeno concuerda bastante bien con la
propiedad de coagular el plasma que presentan los
coliformes que son bastante inhibidos, forman
Se obtienen mejores resultados para aislar Neisserias estafilococos patógenos coagulasa positivos. colonias pequeñas que varían del rosa al rojo.
patógenas, agregando a cada 100 mi de agar
chocolate, 1.0 mi de la mezcla antimicrobiana VCN BACTERIAS COLONIAS
Bioxon más 1.0 mi de solución de
Shigel:a y la mayor
Polienriquecimiento Bioxon. Claras, incoloras,
Bibliografía: parte de las
transpa[entes.
Me. Cutloch Am. J. Vel. Research 8:173. 1947. Salmonellas
Bibliografía: Velilla. Faber and Pelczar Am. J. Vel. Research 8:275. 1947 Pequeñas que van del rosa al
Escherichia cofi
Pelzer and Steffen J. Ven. Dis. Inl. 23;224, 1942. Steinberg rojo.
and Mollov J. Bacl. Clin. Med. 27:56, 1942. De mayor tamaño que las de
E. cofi.
Enterobacter, mucosas, opacas de crema
Klebsiella pálido hasta
rosa.
Incoloras, transparentes; con
Proteus y algunas
un centro
Las bacterias formadoras de sulfuros dan co- Salmonellas
negro si producen H2S.
lonias que presentan un centro negro y un halo
Paper Read Al
claro alrededor cOmo Proteus y algunas especies Microbiological Congress,
de Salmonella. 1950.
Proc. 22 nd. Ann. Meet.
Las placas del medio se conservan en buenas Bibliografía: Normeastern Cont. Lab.
condiciones de trabajo durante una semana en el Workers
refrigerador. Pub. Health Reporls. in Pullorum Dlsease Control
65: 1075, 1950. Burlington. Vermont. June
20-21, 1950.
117
Agar de Soya Tripticaseína
Aislamiento y cultivo de
gérmenes exigentes
Una lista somera de microorganismos que se desarrollan
Cal. 108.1 en este medio es la siguiente:
450 g
Estreptococos, Neumococos, Neisseria, Brucella,
Es un medio sólido, muy rico en nutrientes por Corynebacterium, Listeria, Pasteurella, Vibrio,
lo que tiene un "uso general" en los labo Haemophilus vaginalis, Candida, etc.
Bibliogralía:
Altord, Wiese and Gunter J. Bacl., 69:516. 1955.
Ctapper and Parker J. Bacl. 70:125. 1955. Standard
ratorios de Microbiología. Permite la multipli- Methods for the Examination of Dairy Products 11th Ed.
cación abundante y satisfactoria de gérmenes de A.P.H.A" Inc. New York, 1960. Hentges A.J. Clin. Path.
desarrollo difícil y exigentes, como Neumococos, 38:304, 1962.
Hereluk and Gunderson. Appleid Microbiot. 22:299.
Estreptococos, Neisserias, elc. Muy útil para 1959.
pruebas de hemólisis y de sensibilidad a los
antibióticos (antibiogramas).
Fórmula aproximada de gramos por litro:
Peptona de Caseína 15
Peptona de Soya 5
Cloruro de Sodio Agar 5
15
pH final 7.3 1:... 0.2
Preparación:
Suspender y remojar de 10 a 15 minutos 40 g del medio

deshidratado en un litro de agua destilada. Calentar
agitando frecuentemente durante un minuto para que se
disuelva. Esterilizar en autoclave entre 118 y 121°C ya
una presión no mayor de 15 lb por 15 minutos. En caso
de preparar volúmenes grandes, aumentar el tiempo de
esterilización pero no la presión ni la temperatura.
Enfriar y vaciar en placas de Petri. Si se preparan placas
de agar sangre para estudios de hemólisis, agregar de 5 a
10% de sangre de conejo o de carnero, preferiblemente
de esta última.
Usos:
Por contener dos P1ptonas obtenidas por hi

drólisis enzimática a partir de caseína y soya, en este
medio se desarrollan ampliamente una gran variedad de
microorganismos, incluyendo aquellos de cultivo difícil
y delicado, tanto aerobios como anaerobios. Como
carece de carbohidratos es muy útil para estudiar
reacciones de hemólisis y también para preparar agar-
chocolate.
Si se desea puede agregársele antibióticos.
También se le pueden agregar otros nutrientes o bien

inhibores para usos especiales.
118
como Agar Eosina y Azul.de Metileno, Agar Mac
Agar Sulfito y Bismuto La selectividad del medio depende en gran parte
Conkey, Agar Tergitol7, Agar XLD, Agar Entérico
de la dispersión uniforme del precipitado del
Hektoen, Agar SS, etc.
sulfito de bismuto en el gel final. Es por esta
razón que el medio debe mantenerse bien Por lo común, el Agar Sulfito de Bismuto se siembra por
mezclado y no vaciarse mientras estédemasiado estría superficial tratando de obtener colonias muy bien
caliente. En el medio caliente una vez depositado aisladas. Pueden hacerse inoculaciones por vaciado de
en las placas, tiende a precipitarse el sulfito de una suspensión de heces como del 10% en agua
bismuto en forma irregular y desordenada destilada o en solución salina estériles. Vaciar
Es un medio de Wilson y Blair* modificado y
altamente selectivo para aislar Salmonella
propiciando que en unas zonas se encuentre aproximadamente. 5 mi de la suspensión en no menos de
demasiado concentrado y en otras casi sin nada o 20 mi del medio previamente fundido y enfriado a unos
typhi, así como otros baCilos entéricos,
ausente. 45-50°C. Mezclar perfectamente, dejar que solidifique
de heces, aguas negras, aguas de bebidas y
diversos alimentos (que se forme un gel) e incube de 24 a 48 hrs.
Las placas delgadas con poco medio, se desecan prontoLas placas una vez solidificadas deberán pre-
y dan reacciones retardadas, sentar una opacidad crema uniforme, y gra-
dualmente un color verde muy pálido. Si se
inhibiendo el ennegrecimiento de las colonias' productoras
Cal. 212-1 450 9
guarda en refrigeración, el medio que está en
de sulfuros, debido a la concentración de los ingredientes.
forma reducida, se irá oxidando poco a poco
hasta adquirir un color francamente verde. Al
llegar a este momento descártelo. Cook (1952)
recomienda dejarlo p.n refrigeración durante 4
Fórmula aproximada en gramos por litro: * No confundirlo con el medio de Wilson y Blair días antes de usarlo para aislar Salmonella
para aislar C/ostridium perfringes. typhimurium con el fin de hacerlo menos
inhtbidor. En presencia de H2S, las Salmonellas
reducen las sales de hierro y bismuto a sulfuro de
Mezcla de Peptonas 10.000 Usos: hierro negro que se deposita en la colonia, y, a
Extracto de Carne 5.000
Dextrosa 5.000 Junto a este medio, por ser fuertemente inhibidor, bismuto metálico (Mac-Coy, 1962) que se
Fosfato Disódico 4.000
Sulfato Ferroso
se aconseja inocular también otros medios precipita en el medio de cultivo, formando un
0.300 halo brillante pero menos obscuro alrededor de la
Indicador de Sulfito de Bismuto 8.000 selectivos menos inhibidores, tales
Verde Brillante 0.025 misma.
Agar 20.000
CARACTERISTICAS DE LAS COLONIAS
Elevadas con centro negro, bordes claros y trans-

pH final 7.5 :!:.. 0.2
lúcidos. Colonias en "ojo de pescado o de conejo"
Se vuelven uniformemente negras a las 48 horas.
Salmonella typhi
Entre las 18 a 24 horas se forma en el medio de
cultivo un halo negro grisáceo y con brillo metálico
Preparación:
rodeando a la colonia.
Elevadas y generalmente más pequeñas que las de

Suspender 52 g del polvo en un litro de agua destilada,
aunque en general, los autores ingleses recomiendan no S. typhi. Negras si producen H2S. Halo negro gri-
reconstituir más de 400 mi en un solo matraz para lograr sáceo con brillo metálico después de 36 a 48 ho-
una mejor uniformidad de mezclado. Mezclar muy bien Otras Salmonellas
ras de incubación.
y remojar el medio deshidratado de 10 a 15 minutos
Verdosas si no son productoras de sulfuros como
para obtener un .buen gel. Hervir no más de un minuto
agitando continuamente para que se disuelva S. paratyphi A. Pequeñas y pardas como S. chole-
completamente el Agar. Dejar que el medio se enfríe a
45°C raesuis y S. gallinarum, que son bastante inhibidas.
Grandes elevadas, negras gisáceas, como gotas de

plomo. Halo gris negro y con brillo metálico. Las ce-
Arizona y Citrobacter
Esto es muy importante) y sin dejar de pas no fermentadoras de la lactosa varían del ver-
agitarlo, vacíe en cajas de Petri no menos de 20 de al café.
mi del medio fluido. Las placas deben
Desarrollo ocasional. Colonias que pueden ser ver-
permanecer parcialmente descubiertas hasta que
se seque la superficie del medio y usarlos el COllformes, Proteus
des, cafés y aún negras. Estas últimas más peque-
mismo día. Evite el sobrecalentamiento. ñas que S. typhi y por lo general sin brillo metálico
en el medio que rodea a la colonia.
Casi todas inhibidas. En el caso de crecer. Sh. flex-

Shigella neri y Sh. sonnei son de color café, deprimidas en
el centro y con bordes elevados (crateriformes).
119
Recomendado especialmente en la detección ae Tiosullato de Sodio Cllrato de 6.80
Hierro y Amonio 0.80
portadores y para estudios de control sanitario.
pH finat 7.4 :t. 0.2
Excelente para la determinación de estafilococos Preparación:

Agar de Vogel Johnson coagulasa-positivos en los alimentos.
Suspender 55 9 del medio deshidratado en un litro de
Aislamiento y diferenciación de Bibliografía: agua destilada y dejar que se remoje durante 10 a 15
Staphylococcus aureus Vogel and Johnson, Public. Health lab. 18:131, 1960. minutos. Calentar con todo cuidado y agitando con
Zabovitx, Evars and Niven J. Bacl. 70:687, 1955.
frecuencia justamente hasta que el medio hierva. No so-
Cal. 217-1
450 g brecalentar. Dejar de calentar en cuanto se obtenga la
disolución completa del polvo. Una vez disuelto, enfriar
El Agar de Vogel Johnson permite una rápidamente en agua o en baño maría a 50°C y verter.en
determinación temprana de las colonias de cajas de Petri. El medio debe ser transparente o casi
estafilococos coagulasa positivos y manitol transparente y tener un color rojo rubí anaranjado.
positivos. AgarXLD
Xilosa-Lisina Desoxicolato
Cal. 211-1 450 g
Peptona de Caseina. 10
Extracto de levadura 5 El calentamiento excesivo o el mantener el medio
Manitol . .10 Para aislamiento de bacterias enteropatóge-
Fosfato Dipotásico. 5 nas, especialmente de los géneros Shigella, demasiado tiempo en baño maría a 50°C puede
Cloruro de Litio. 5 Salmonella y Arizona. ocasionar que se formen precipitados. En este
Glicina. Agar. ... 10 caso se corre el riesgo de que las colonias sean de
Rojo de Fenol . 16 menor tamaño y presenten reacciones menos
.25 mg Fórmula aproximada en gramos por litro:
nítidas. Sin embargo, el precipitado no perjudica
pH final 7.2 :t. 0.2 Xilosa 3.50 el desarrollo bacteriano y puede eliminarse por
l-Lisina. 5.0 filtración con papel filtro.
lactosa . . 7.50
Preparación: Sacarosa.. . 7.50
Cloruro de Sodio. Extracto 5.0
Suspender 61 g del medio deshidratado en un de ~c'.'cdura. Rojo de Fenol. 3.0 Usos:
litro de agua destilada. Mezclar bien. Remojar Agar .. ... .. Desoxicolato de 0.08
Sodio. 13.50
de 5 a 10 minutos. Calentar agitando 2.50 En el Agar XLD es posible obtener las si
frecuentemente y hervir durante un minuto.
Distribuir y esterilizar en autoclave a 121°C (15
lb de presión) durante 15 minutos.
CARACTERISTICAS DE LAS COLONIAS
Enfriar a 45-50°C y agregar 20 mi de una
solución de telurito de potasio al1 %. Agitar Arizona Rojas y transparentes con 31 c¡ntro negro
vigorosamente y vaciar en placas, utilizan
do unos 20 mi para cajas de Petri de viar;:) y 15 Amarillas y opacas. Pueden presentar un
mi ¡:Jara las de plástico. Citrobacter
centro negro y orillas claras.
Usos:
Edwarsiella Rojas con el centro negro y bordes claros.
Las placas de agar pueden inocularse inten-
Amarillas y opacas. Halo de precipitado
samente estriando con hisopos y se incuban a E. cofi. Enterobacter, Serratia
35°-37°C. Las placas se examinan entre 24 y 30 amarillo alrededor de las colonias.
horas, y generalmente también después de 48
horas en busca de colonias negras con zonas Grandes amarillas pálidas, mucoide y
amarillas. Durante las primeras 24 horas la Klebsiella opacas. Halo de precipitado amarillo
mayor parte de los microorganismos, excepto los rodeando a la colonia.
estafilococos coagulasa-positivos están total o
marcadamente inhibidos. A las 48 horas aparecen
en P. vulgaris Amarillas transparentes con bordes claros.
el medio numerosos estafilococos coagulasa-
negativos fermentadores y no fermentadores del Proteus morganii y P. rettgeri Rojas y transparentes
manitol.Staph. Epidermidis, casi siempre
inhibido, forma pequeñas colonias negro.
Providencia y Shigella Rojas y transparentes
grisáceas sin halo amarillo.
Rojas transparentes y bordes amarillos con
Los estafilococos coagulasa-positivos, for- Salmonella
man pequeñas colonias negras en las placas centro negro si producen H2S. Sin centro
rojas. Si hay fermentación de manitol, las
colonias aparecen rodeadas por zonas negro si no son productoras de H2S.
amarillas debido a la formación del ácido
del manitol. Si no hay fermentación del Bibliografía:
manitol, no se observa ninguna zona
amarilla y el color del medio alrededor de Taylor A.J. Clin. Path 44:471, 1965
las colonias puede ser aún más roio de lo
Taylor and Harris A.J. Clin. Path. 44:476. 1965.
normal.
120
Con la adición de uno por ciento de glicerol y de 15 a 20
Preparación: % de sangre humana de banco de sangre, se obtiene un
buen desarrollo de bacilos tuberculosos.
Suspender 40 g del medio deshidratado en
un litro de agua destilada. Remojar entre 5 y
10 minutos. Hervir durante un minuto. Los Fórmula aproximada en gramos p'or litro:
matraces pueden taparse y colocarse direc-
tamente en autoclave. Esterilizar a 121°C Inlusión de Músculo Cardiaco
375
(15 lb de presión) durante 15 minutos. Peplona de Carne
10
Cloruro de Sodio
Después de esto enfriar a 45-50°C y añadir
de 5 a 10% de sangre desfibrinada estéril,
Agar . 5
15
homogen izar y vaciar en cajas de Petri pH final 6.8 .:t.0.2
estériles. No es recomendable emplear
sangre humana. De preferencia utilice Preparación:
sangre de cordero o de conejo.
También es posible inocular el fondo de una Suspender '40 g del medio deshidratado en
caja de Petri estéril con un pequeño inóculo, un litro de agua destilada. Dejar reposar du-
y vaciar posteriormente el medio fundido a rante 5 minutos y mezclar bien. Calentar
unos 50°C; la caja se hace girar suavemente agitando frecuentemente y hervir durante un
para homogenizar la muestra. minuto. Los matraces pueden taparse y
colocarse directamente en el autoclave.
Base de Agar Sangre En algunos laboratorios se emplea el medio Esterilizar a 121°C (15 lb de presión)
de cultivo preparado en tubos con tapón de durante 15 minutos. Después de esterilizar
Aislamiento, cultivo y actividad rosca que se pueden inocular (a 45°C) y pos- hacer rotar los matraces y enfriar a unos
hemolltica de gérmenes difíciles teriormente vaciar en cajas de Petri estériles. 45°C. Añadir de 5 a 10% de sangre estéril
desfibrinada
de carnero o de conejo, y vaciar en cajas de
Petri estériles.
Cal. 201.1
450 9
Usos Usos:
Para el aislamiento del Mycobacterium
tuberculosis, la Base de Agar Sangre con La Base de Agar con bajo pH se recomien-
0.1 % de glicerol, 2.5 % de sangre humana da como un medio para el cultivo de
La Base de Agar Sangre es adecuada para aislar y de banco de sangre y 100 unidades de varios microorganismos de dificil
cultivar diversos microorganismos de difícil Penicilina por mililitro ha dado resultados crecimiento. La adición de 5 a 10% de
crecimiento. Al añadir sangre, puede usarse para comparables con los del medio de sangre estéril desfibrinada proporciona un
descubrir la actividad hemolítica y para aislar bacilos Lowenstein-Jensen(Tarshis). medio excelente para el aislamiento de
tuberculosos.
pneumococos, gonococos, meningococos.
También está indicado para estudiar
reacciones de hemólisis.
fórmula aproximada en gramos por litro:

Bibliografía:
Bibliografía: Frisch and Tarshis A. Rew. Tuberc. 64:55, 1951.
Snavelyanél Brahier A.J. Clin. Path. 33:511, 1960. Hosty, Tarshis and Weed A. Rev. Tuberc. 67:391, 1953.
freeman and Irwin. Public. Heallh. Lab.. 1953. Schubert, Tarshis J. Bacl. 67: 117, 1954.
Infusión de Músculo Cardiaco 375 Edwards and Ramsey J. Bacl. 77:648, 1959. APHA Diagnostic
Peptona de Carne. 10 Procedures and Reagents
Agar 15 3rd edition. 1951.
Cloruro de Sodio. 5 Tharshis and Frish AM. J. Clin. Path. 21:101,1951.
pH final 7.3 .:t.0.2
Otra forma que ha sido propuesta por Tarshis y Base de Agar Sangre con bajo
Frisch consiste en preparar gelosa sangre con
25% de sangre de banco y 1 % de glicerol. Este pH
medio era satisfactorio para el cultivo de M.
tuberculosis a partir de inóculos pequeños y daba
Aislamiento y diferenciación de bacterias
resultados equiparables a otros tres medios
exigentes con actividad hemolítica.
usualmente empleados para este propósito. Cal. 219.1 450 g
La Base de Agar Sangre también puede usarse La Base de Agar de Sangre con bajo pH es un agar de
para la preparación de antígenos. infusión de corazón con un pH de 6.8. Se usa en la
misma forma y para los mismos fines que la Base de
Agar Sangre.
121
Fó'
Usos:
Para obtener mejores resultados debe prepararse

sólo unos días antes de usarlo, ya que es
realmente inestable y se oxida rápidamente.
Está elaborado de acuerdo a la fórmula del

Caldo Tioglicolato (NIH) "Nationallnstitute of Health ,; y de la USP. Caldo de Tripticaseína y
Bibliogralia:
Fosfato
U.S. Pharmacopea XVI. 1960.
Prueba de esterilidad de
productos biológicos Hemocultivo de bacterias
y farmacéuticos exigentes
Cat 225-1 450 9
Cal 132-1 450 9 El Caldo de Tripticaseína y Fosfato es un!rel

Caldo de Todd - Hewitt dio que se recomienda para el desarrollo de'
estreptococos, pneumococos, meningoco-I cos y
Cultivo de Estreptococos B- otros microorganismos de difíci crecimiento.
hemolíticos para tipificación
También se conoce como caldo para pruebas de serológica
esterilidad y se puede usar en lugar del Medio Fórmula aproximada en gramos por litro:
Líquido de Tioglicolato, para el análisis de Cal 206-1 450 9
Peplona de Caseina 20
esterilidad de productos farmacéuticos. Dextrosa ~
El Caldo de Todd-Hewitt fue originalmente desarrollado Cloruro de Sodio 2r
Fosfalo Disódico 5,
para la producción de hemolisina estreptocócica. El 0
caldo modificado por Updyke y Nikle se emplea de 2,;
pH final 7.3 .:t. 0,2
preferencia para el cultivo de estreptococos beta
hemolíticos. especialmente para estudios de tipificación
Preparación:
Fórmula aproximada en gramos por litro: serológica.
Disolver 29.5 9 del medio deshidratado en un
litro de agua destilada. Distribuir en tubos. Esterilizar
Fórmula aproximada en gramos por litro: en autoclave a 121°C (151b de presión) durante 15
Infusión de músculo cardiaco 500,0
minutos.
Peptona de Caseína Peptona 20,0
Extracto de Levadura 15.0 Dextrosa 2,0 Usos:
Dextrosa 5.0 Cloruro de Sodio 2,0
Cloruro de Sodio 5.0 Fosfato disódico Carbonato de 0.4
Tioglicolato de Sodio 2.5 Sodio 2.5 Este medio está especialmente adaptado para
L.Cistina 0.5
0.5 hemocultivos: un procedimiento frecuente es la
pH final 7.8 .:t. 0.2 inoculación de 1 O mi de sangre a un frasco o matraz
con 150 mi del medio de cultivo. El frasco se incuba a
Preparación: 35-37°C, se observa a diferentes intervalos de tiempo.
Cuando se obtiene el desarrollo, se transfieren los
pH final 7.1 .:t. 0.2 Disolver 30 9 del medio deshidratado en un litro microorganismos a un medio sólido para hacer el
de agua destilada. Distribuir y esterilizar en aislamiento e identificación de los mismos.
autoclave a 121°C (15 lb de presión) durante 15
minutos.
Preparación:
Usos: Bibliografía:
Diagnostic, Procedures and Reagents. 3rd. Edition.
Suspender 28.5 9 del medio deshidratado en un litro de

El Caldo de Todd Hewitt se usa en los estudios de 16:1950. J. Milk and Food Tech. 13:226. 1950.
agua destilada. Mezclar bien. Calentar agitando

agrupamiento y tipificación serológicas de
frecuentemente. Hervir hasla disolución. Distribuir en
estreptococos beta hemolíticos. para su
tubos de fermenlación o en recipientes adecuados.
identificación en estudios clinicos y
Esterili~ar a 121°C (15 lb de presión) durante 18
epidemiológicos.
Iflinulos.
Para la elaboración del agar de Todd Hewitt se añaden
de 13 a 15 9 de Agar Bacteriológico por litro de medio
de cultivo.
Bibliogralia:
Todd and Hewitt J. Path. 1. Bacl. 35:973. 1932.
Updyke and Nlckle. Applled. Microbio!. 2:117. 1954.
Diagnostic Procedures and Reagenls.
Cuarta Edition APHA, Inc. New York, 1963.
Noody. Slegel. Plttman and Winler. AJPH. 53:1083. 1962.
122
ANEXO 1. REGLAMENTO DEL LABORATORIO
1. No se permitirá la entrada al laboratorio al alumno que llegue 15 minutos después de la
hora de entrada.
2. No se permitirá la entrada al laboratorio a ningún alumno si no trae puesta y abrochada
debidamente la bata.
3. Todos los objetos personales deberán ser guardados en sus gavetas de las mesas de
trabajo.
4. El alumno deberá estar provisto del material personal asignado o de lo contrario no podrá
permanecer en el laboratorio.
5. Queda ESTRICTAMENTE PROHIBIDO comer, beber, fumar y en general, llevarse
cosas a la boca dentro del laboratorio.
6. Debe evitarse entablar conversaciones, así como comunicarse a voces con los vecinos
de otras mesas.
7. Todo el material no contaminado tal como: algodón, papeles, cerillos, etc., deben ser
depositados en los botes de basura destinados para este uso. No se debe tirar basura al
suelo ni guardarla en los cajones, ni tirarla en los vertederos.
8. Debe limpiarse con solución de fenol o benzal, la mesa de trabajo ANTES de empezar y
al TERMINAR la práctica.
9. En caso de romper o derramar material contaminado debe verterse fenol o benzal sobre
él y déjelo cuando menos10 minutos antes de limpiar. AVISE AL PROFESOR.
10. El material que se rompa o extravíe debe ser pagado en la siguiente práctica en el
cubiculo de preparadores.
11. Incubar el material el tiempo que se indique, en caso contrario, éste será desechado.
12. No almacenar material en el refrigerador.
13. Al finalizar cada práctica, guardar el material empleado debidamente separado: material
sucio para esterilizar, quitarle las etiquetas; material sucio para lavar, colocarlo en otro
sitio; reactivos debidamente ordenados y cerrados.
14. Los bancos deben dejarse en su sitio.
15. Los informes de las prácticas deberán ser revisados por el profesor y ayudarán a mejorar
o a bajar la calificación al final del curso.
123
ANEXO 2. MATERIAL Y EQUIPO NECESARIO PARA EL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIA
INCUBADORA
REFRIGERADOR
BAÑOS MARIA ELECTRICO
HORNO DE SECADO
AUTOCLAVE
MICROSCOPIO COMPUESTO
CONTADOR DE COLONIAS
BALANZA ANALITICA
BALANZA GRANATARIA
PARRILLA DE CALENTAMIENTO
AGUA
GAS
ASA DE PLATINO
GUANTES DE ASBESTO
MECHERO
MATRACES E.M. 1000, 500, 250
TUBOS DE ENSAYO DE 13X100 CON TAPON DE ROSCA
TUBOS DE ENSAYO DE 15X150 CON TAPON DE ROSCA
PIPETAS DE 10, 5, 1 ml
CAJAS PETRI DESECHABLES UNA Y DOS DIVISIONES
PORTA OBJETOS
CUBREOBJETOS
GRADILLA
JERINGA DE 10 ml
LIGADURA
ALCOHOL
DESINFECTANTE
BENZAL
124

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UNIVERSIDAD VERACRUZANA

M.C. Juana Ramírez Aguilera

Manual de Laboratorio De Microbiología i

INTRODUCCION ........................................................................................................................ iii

Manual de Laboratorio De Microbiología i

Manual de Laboratorio De Microbiología ii

Lo anterior habla de por sí, de la necesidad de contar con el profesional especializado en

Esta Experiencia Educativa corresponde al Área de Iniciación a la Disciplina del Plan de

Manual de Laboratorio De Microbiología iii

El Manual se ha diseñado, siguiendo el orden sistemático del programa de la experiencia

Manual de Laboratorio De Microbiología iv

La realización de las pruebas utilizando métodos manuales, semiautomatizados o automatizados

Manual de Laboratorio De Microbiología v

Manual de Laboratorio De Microbiología vi

Ámbito(s) de Evidencia (s) de Criterios de desempeño Porcentaje

Laboratorio Guía de observación 30

Laboratorio Bitácoras personales 5

Laboratorio * Reporte de práctica 20

Laboratorio Examen escrito (2) 25

Manual de Laboratorio De Microbiología vii

100% de asistencia al curso de laboratorio.

de los reportes de las prácticas de laboratorio solicitados.

% equivale a la teoría y el 40 % al laboratorio.

Manual de Laboratorio De Microbiología viii

Un programa de control de calidad debe incluir además un Manual de Procedimientos, validación

El Aseguramiento de la Calidad, es un concepto un tanto más difícil de cuantificar que el control

Las pruebas y los procedimientos.

Manual de Laboratorio De Microbiología 1

El factor más importante en la generación de reportes microbiológicos de calidad corresponde al

El control de calidad en resumen, es un elemento vital en el laboratorio, ya que ayuda en la

 Establecer de acuerdo a la normatividad y legislación vigente cuales son las medidas de

a) Control de calidad de los medios de cultivo.

Manual de Laboratorio De Microbiología 2

Diario oficial. Lunes 17 de febrero de 2003. Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-

Manual de Laboratorio De Microbiología 3

Oxido de etileno.- Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógenos

Glutaraldehídos.- Consiste en preparar una solución alcalina al 2% en la cual se debe

Formaldehído.- Se utilizan las pastillas de paraformaldehído, las cuales pueden

Esterilización por gas-plasma de Peróxido de Hidrógeno.- Es proceso de esterilización

Posee como ventajas:

1. No deja ningún residuo tóxico.

Manual de Laboratorio De Microbiología 4

Radiación.- la luz ultravioleta es bactericida desde la longitud de onda de 633 nm y su actividad

La utilización de este método y su eficacia depende de dos factores: el tiempo de

Manual de Laboratorio De Microbiología 5

Quemado.- se usa para esterilizar espátulas y asas de inoculación manteniendo el objeto en la

Ventajas del calor seco:

 No es corrosivo para metales e instrumentos.

 Requiere mayor tiempo de esterilización, respecto al calor húmedo, debido a la baja

El calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de proteínas. Estos efectos se

Se realiza la esterilización por el vapor de agua a presión. El modelo más usado es el de

Manual de Laboratorio De Microbiología 6

Ventajas del calor húmedo:

 Rápido calentamiento y penetración

Manual de Laboratorio De Microbiología 7

Control de calidad de la autoclave

El autoclave es un aparato que requiere de gran cuidado, es recomendable que siempre

La esterilización es el proceso físico o químico que destruye a todas las formas de

Manual de Laboratorio De Microbiología 8