FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y

LA SALUD
CARRERA DE MEDICINA HUMANA
Taller Práctico de Biología Celular
Informe N° “05”
Tema: Extracción de ADN, fundamentos de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) y fundamentos de
electroforesis

GRUPO N°: “01”

Integrantes Apellidos y nombres Porcentaje de

participación 1

2
Nota :

1. El porcentaje de participación de cada integrante debe ser asignado por el grupo y colocado en un
rango de 0% a 100%. La nota de cada integrante será calculada de acuerdo con el porcentaje de
participación y la nota del informe. Por ej.: Si la nota del informe es 20 y el porcentaje de participación
del integrante es del 100%, la nota que le corresponde al integrante es de 20.

2. En caso no completar correctamente los diversos ítems de la carátula, se descontará 1 punto de la nota
obtenida en el informe.
 Extracción de ADN, fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fundamentos de
electroforesis

1. Introducción

El ADN, también conocido como ácido desoxirribonucleico, es una molécula de

vital importancia que almacena la información genética de los organismos. Su
estudio y manipulación tienen una gran relevancia en numerosos campos de
investigación científica, incluyendo la genética, medicina, biología molecular y
biotecnología. En este informe, presentaremos los resultados obtenidos a través
de tres experimentos relacionados con la extracción del ADN, la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) y la electroforesis, con un enfoque específico en
la búsqueda del gen citocromo B.

Los resultados de estos tres experimentos han sido fundamentales para nuestro
entendimiento de la extracción del ADN, la técnica de PCR y la electroforesis,
así como para nuestro avance en la investigación relacionada con la proteína
citocromo B. Como equipo, hemos experimentado cómo estas técnicas nos han
proporcionado herramientas para analizar y manipular el ADN, ampliando así
nuestros conocimientos sobre esta molécula y su relación con el gen citocromo
B.

A lo largo de este informe de laboratorio, presentaremos en detalle los

procedimientos seguidos en cada experimento, así como los resultados
obtenidos, resaltando su relevancia en el ámbito científico y específicamente en
la comprensión del gen citocromo B.

1
Extracción de ADN, fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fundamentos de
electroforesis

1.1. Marco Teórico

Las técnicas de biología molecular son herramientas fundamentales en el

estudio y comprensión de los componentes moleculares que conforman los
seres vivos. Estas técnicas permiten investigar y manipular el ADN, ARN y
proteínas, brindando información invaluable sobre la estructura, función y
regulación de los genes. Tal y como nos confirman Luque & Herráez (2010),
"Las técnicas de biología molecular son un conjunto de tecnologías
utilizadas para investigar la estructura y función de los ácidos nucleicos y
proteínas, así como para manipular su secuencia, expresión y regulación"
(p.13).

El ADN es el material genético que se encuentra en todos los organismos

vivos y es responsable de la herencia biológica. Se compone de
nucleótidos, que consisten en una base nitrogenada (adenina, timina,
citosina o guanina), un grupo fosfato y un azúcar desoxirribosa. El ADN se
organiza en estructuras llamadas cromosomas y es fundamental para la
transmisión y expresión de los genes, que determinan las características y
funciones de un organismo. Además, el ADN tiene la capacidad de
replicarse y transmitir información genética a través de generaciones
sucesivas. (Watson & Berry, 2003).

Para realizar la extracción de ADN, se deben romper las células, liberar el

ADN y luego purificarlo para poder analizarlo. Según Smith (2019), nos
confirma que "para extraer ADN de una muestra celular, se debe romper la
membrana celular y separar el ADN de las demás moléculas celulares. Esto
se puede lograr mediante la adición de una solución que contenga
detergente y una enzima que degrada las proteínas. Después de la adición
de la solución, se agita la muestra para romper la membrana celular y liberar
el contenido celular. Luego, se agrega una solución salina que precipita las
proteínas y las moléculas de ARN, dejando el ADN en solución. La solución
de ADN se puede purificar aún más mediante la adición de alcohol y
centrifugación, lo que permite la separación del ADN del resto de la
solución" (p. 45).

2
Extracción de ADN, fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fundamentos de
electroforesis

De esta manera, para poder amplificar exponencialmente fragmentos de

ADN, se usa la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Según Russell
y Sambrook (2001), la PCR “es una técnica de amplificación de ADN in vitro
que permite la generación de grandes cantidades de secuencias específicas
de ADN a partir de cantidades mínimas de material genético" (p. 8). Esta
técnica se utiliza en investigación biomédica y medicina para detectar
enfermedades genéticas e identificar patógenos, con el uso de cebadores y
enzimas de polimerasa específicas.

La técnica de PCR consta de tres etapas: desnaturalización, apareamiento

de cebadores y extensión de la cadena. Durante la desnaturalización, el
ADN se calienta a una temperatura alta para permitir el fácil acceso de los
cebadores al ADN molde. En la etapa de apareamiento de los cebadores,
los cebadores se unen a las secuencias complementarias específicas del
ADN que se desea amplificar. Por último, durante la extensión de la cadena,
el ADN polimerasa sintetiza una nueva cadena de ADN a partir de los
cebadores unidos y las dos cadenas de ADN desnaturalizadas.

Para separar los fragmentos de ADN según su tamaño y carga eléctrica, se

usa la técnica de electroforesis. Según Berg et al. (2015), "en la
electroforesis, las moléculas se mueven a través de un campo eléctrico y se
separan en función de su velocidad de migración relativa, que depende de
sus cargas y tamaños" (p. 133). Para realizar la electroforesis, se coloca una
muestra de moléculas en un gel de agarosa y se aplica un campo eléctrico a
través del gel. Las moléculas se mueven a través del gel a diferentes
velocidades, dependiendo de su tamaño y carga, y se separan en bandas
distintas. Estas bandas pueden ser visualizadas utilizando tintes específicos
o etiquetas fluorescentes.

3
Extracción de ADN, fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fundamentos de
electroforesis

1.2. Objetivos

● Describir los pasos para la extracción de ADN usando el kit

Purelink-genomic (Invitrogen).

● Entender la replicación in vitro de un fragmento del ADN humano

genómico con la técnica del PCR (Reacción en cadena de la polimerasa).

● Amplificar el gen citocromo B durante el proceso del PCR.

● Detectar y analizar el gen citocromo B mediante electroforesis en gel de

agarosa.

● Comprender la necesidad de las pruebas diagnósticas con técnicas de

biología molecular.

4
 Extracción de ADN, fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fundamentos de
electroforesis

2. Procedimiento experimental

2.1. Materiales del laboratorio

2.1.1. Extracción del ADN

● 1 lancetas de punción
● Alcohol yodado
● Paquete de algodón
● Guantes estériles
● Caja de punzocortantes
● 1 kit de extracción de ADN
● Frasco de 100 mL de Alcohol 96 – 100%
● Micropipetas de 0.5 – 10 µL, 10 – 100 µL, 100 - 1000 µL
● 1 caja de puntas de 0.5 – 10 µL, 10 -100 µl y de 100 - 1000 µL
(esterilizadas)
● 1 microtubos de 1.5 mL (esterilizados)
● Microcentrífuga 16000 rpm
● Vórtex
● Termómetro
● Espectrofotómetro Lambda (cuantificación de ADN)
● 1 tubo de PCR (250 µL)

2.1.2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

● Micropipetas de 10 – 100 µL
● 50 puntas de 10 -100 µL y de 100 -1 000 µl
● 1 microcentrífuga16000 rpm
● 1 termociclador
● 1.5 mL de agua estéril
● 1 muestra de ADN
● 1 kit - Mix de PCR (taq polimerasa, dNTPs, primer, Mg, agua)
● 1 kit (Primers)

5
Extracción de ADN, fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fundamentos de
electroforesis

2.1.3. Electroforesis

● Muestra de ADN obtenida de la práctica anterior.

● 5 µL Marcador de peso molecular (100-1000 pb).
● 1 cámara de electroforesis y accesorios (peines, soporte, tabla
niveladora, etc.)
● 1 Fuente de poder
● Micropipetas para volúmenes de 0.5 - 10 μL
● 4 juegos de guantes
● 1 gradilla para tubos de 1.5 mL
● 50 puntas para volúmenes de 0.5 - 10 μL
● 70 mL de agarosa al 2 %
● 1 L de Buffer Tris – acetato – EDTA 1X (TAE) pH 8-8.3.
● 1.5 mL de Buffer carga para ADN
● 20 µL Colorante Sybr green
● 1 Transiluminador de luz UV (fotodocumentador)

6
Extracción de ADN, fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fundamentos de
electroforesis

2.2. Procedimientos

2.2.1. Extracción de ADN

Para comenzar con la extracción del ADN, primero se realizó la extracción de

entre 50 a 100 µL de sangre a en un tubo eppendorf. Luego, se transfirió
dicha muestra a un tubo el cual contenía 20 µL de proteinasa K, después de
ello se le añadió 20 µL de ARNasa a nuestra muestra para luego someterlo al
vórtex por 15 segundos aproximadamente e incubarlo a temperatura
ambiente por 2 minutos.

Después se le agregó 100 µL de Buffer lisis para luego homogenizarlo

mediante el uso del vórtex por 15 segundos, luego se incubó a 55° por 10
minutos. Después de ello, se le añadió 100 µL de etanol de una
concentración entre 96% a 100% y se homogeniza en el vórtex por
aproximadamente 15 segundos. Finalmente, se incubó la lisis por 5 minutos a
temperatura ambiente.

Luego de realizar este procedimiento, se ejecutó el proceso de purificación,

primero se colocó 260 µL de la lisis del procedimiento previo en la columna
de extracción, para luego centrifugar la columna a 8500 revoluciones por
minuto en la columna de extracción durante 1 minuto, en este paso se tendrá
que descartar el filtrado de la columna y después colocar la columna en un
tubo de lavado. Una vez hecho lo anterior, se lavó la columna con 200 µL de
buffer de lavado y se centrifugó a 8500 revoluciones por minuto durante 1
minuto y se eliminó el filtrado.

Después, se colocó la columna en un tubo de lavado nuevo, en el cual se

adicionó 200 µL de buffer de lavado para luego centrifugar la columna a
velocidad máxima por 3 minutos, ello se realizó para filtrar algún residuo del
buffer de lavado. Además, se tuvo que colocar la columna en un nuevo tubo
de recolección de 1.5 mililitros, en donde se le añadió 100 µL de buffer de
elución a la columna. Después de ello, se incubó a temperatura ambiente por
1 minuto, posteriormente se centrifugó la columna a velocidad máxima
durante 1 min a temperatura ambiente.

7
Extracción de ADN, fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fundamentos de
electroforesis

Seguidamente se tuvo que incubar a temperatura ambiente por 1 min, luego

de pasado el minuto centrifugamos a velocidad máxima por 1 min. En este
tubo, finalmente se encontrará el ADN genómico purificado.

Después de ello, se realizó la cuantificación de ácidos nucleicos con el

espectrofotómetro el cual nos permite medir el ADN, en donde primero se
tuvo que seleccionar el tipo de muestra que se va a medir en el
espectrofotómetro Lambda. Una vez realizado lo anterior, se colocó 2 µL de la
muestra de ADN extraída en el sensor del espectrofotómetro y se leerá a 260
nm para poder, finalmente, se guarda la muestra a -16 °C ya que la muestra
se volverá a utilizar en una semana.

8
Extracción de ADN, fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fundamentos de
electroforesis

2.2.2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

En este procedimiento se tomó una muestra de master mix que contiene 17

µL y entre 50 a 100 µL de ADN molde. Luego, se cerró el termociclador y se
eligió el programa, la configuración de PCR y los ciclos de temperatura. Se
inició la primera etapa a 96 °C, que era la desnaturalización inicial. Después
de 10 minutos, pasamos a la segunda etapa de ciclaje, que se repitió 32
veces en total. Cada ciclo constaba de tres pasos: desnaturalización a 94 °C
durante 30 segundos, luego se bajó la temperatura a 56 °C para llevar a cabo
la hibridación y, finalmente, se subió la temperatura a 72 °C para la extensión
del ADN. Una vez completados los 32 ciclos, se pasó a la tercera etapa, que
era la extensión final. Se mantuvo la temperatura a 72 °C durante 5 minutos
para asegurar la polimerización completa. Luego, se bajó la temperatura a 4
°C para mantener las muestras de ADN frías. Retiramos los tubos PCR del
termociclador y guardamos la muestra a -16 °C para su conservación.

9
Extracción de ADN, fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fundamentos de
electroforesis

2.2.3. Electroforesis

Para la preparación del gel de agarosa, primero se tuvo que certificar que se
esté utilizando los guantes al manipular las muestras, los reactivos y el
equipo. Luego, se colocó 70 mL de agarosa al 2% en un matraz aforado y
luego se agregó 20 uL de colorante Sybyr green para luego esperar por 10
minutos el polimerizado. Después, se sumergió el sistema que contenía el gel
de agarosa en un tanque con el buffer TAE 1x para el ADN, cabe recalcar que
se debe asegurar de que los pocillos del gel en la superficie estén
completamente saturados por el buffer. Después, en una lámina de parafilm
se preparó 4 μL de ADN con 3 μL de buffer de carga (glicerol y sacarosa) en
pequeñas proporciones de acuerdo al número de muestras en cada pocillo,
asimismo es necesario considerar un marcador para el peso molecular
estándar del ADN. Luego, con ayuda de la micropipeta y puntas con las
proporciones adecuadas, se procedió a cargar la muestra en los pocillos del
gel de agarosa evitando la contaminación del pocillo. Finalizamos con la
inyección de la muestra de ADN en los pocillos. Posteriormente, se cubrió el
tanque con la tapa y se conectaron los cables de los electrodos a la fuente de
poder. A continuación, se encendió la fuente de poder y se seleccionó un
voltaje entre 75-150 voltios. Ahí es cuando comienza el proceso de
electroforesis. Transcurrido el tiempo de corrida de la electroforesis, se
procedió a desmontar el equipo, iniciando por la desconexión de los
electrodos de la fuente de poder. Asimismo, se removió el gel del soporte con
mucho cuidado, para luego desplazar el gel hacia el transiluminador para el
revelado, encender el equipo y verificar si tiene una longitud de onda de
420nm hasta que aparezca las bandas y analizar los resultados.

10
 Extracción de ADN, fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fundamentos de
electroforesis

3. Resultados

3.1. Extracción de ADN

Tabla N° 01: Rendimiento y pureza del ADN

ESTUDIANTE SANGRE ng/ul A260/A280 A260/A230

TOTAL

ALUMNO #1 μL 13,7 μL 1,93 0,62

El cuadro presenta los resultados de la extracción de ADN de muestra de

sangre total realizada en el laboratorio. En la presente tabla se muestran
los datos del (Alumno #1), junto con los valores obtenidos en la medición
de concentración de ADN en ng/ul, A260/A280, y a su vez la relación
(A260/A230). El estudiante #1 obtuvo una concentración de ADN de 13,7
ng/ul. La relación A260/A280 fue de 1,93 , y la relación A260/A230 fue de
0,62. Esos datos representan el resultado en la extracción de ADN de la
sangre total. La concentración de ADN indica la cantidad de ADN presente
en la muestra por μL, mientras que las relaciones A260/A280 y A260/A230
son medidas espectrofotométricas utilizadas para evaluar la pureza y la
calidad del ADN extraído.

- A260/280: Relación de absorbancia de la cantidad de ADN medida a 260 nm

sobre la cantidad de proteína media a 280 nm.
- A260/230: Relación de absorbancia de la cantidad de ADN medida a 260 nm
sobre la cantidad de ARN medida a 230 nm. Esta relación es utilizada para
evaluar la pureza en un extracto de ADN.

11
Extracción de ADN, fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fundamentos de
electroforesis

3.2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Figura N°01: Perfil de temperatura para la PCR en el termociclador

En la imagen se muestra la etapa #1 de la desnaturalización inicial, donde la

muestra de ADN se calienta a una temperatura de 96°C con 1 ciclaje. En la etapa #2
se puede evidenciar un proceso que consta de tres fases. En cada ciclo, se realiza
la desnaturalización a una temperatura de 94°C, seguida de la hibridación a 56°C y
finalmente la extensión a 72°C. Este proceso se repite 32 veces, es decir, se llevan
a cabo 32 ciclos en total. En la etapa #3, se lleva a cabo la extensión final a una
temperatura de 72°C con un ciclaje. Una vez completada la extensión final, la
temperatura se reduce a 4°C.

12
Extracción de ADN, fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fundamentos de
electroforesis

3.3. Electroforesis

Figura N°02: Resultado de la muestra de ADN por medio de la electroforesis

En la imagen proyectada desde el equipo de análisis de geles por medio de un

transiluminador, se pudo observar los resultados de la electroforesis realizada
en clase. Se obtuvo tras el proceso, las bandas de ADN genómico, que en
nuestro grupo, fue el de la muestra #17 junto con el amplicón. De igual forma,
observamos el marcador de peso molecular que fue de 750 pb. Finalmente,
pudimos apreciar la banda correspondiente al gen citocromo B.

13
 Extracción de ADN, fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fundamentos de
electroforesis

4. Análisis y discusión de los resultados

4.1. Extracción de ADN Total

Este experimento se realizó con la ayuda de un kit modelo “purelink-

genomic”, en la extracción del ADN. Para comenzar se tuvo alumnos
voluntarios a quienes se les extrajo entre 50 y 100 µl de sangre. Luego de
ello, se transfirió 20 µl de sangre a un tubo con proteinasa K, que según
González (2011) “digiere proteínas y remueve las contaminaciones proteicas
de las preparaciones de ácidos nucleicos, la cual inactiva rápidamente
nucleasas que degradan el ADN o el ácido ribonucleico (ARN) durante la
extracción” (p.8). Esta rompe enlace peptídicos, y degrada las proteínas
estructurales unidas al ácido desoxirribonucleico, como por ejemplo las
histonas. Después, se agregó ARNasa a la muestra, de tal manera de que
se pudiera romper el ARN. También usamos el buffer de lisis, lo cual según
Carbajal A. (2019) menciona que “el buffer de lisis contiene detergente para
disociar membranas, lo cual facilita la función de las enzimas al tener los
componentes de la muestra ya separados”. Posteriormente, incubamos la
muestra a 55°C por 10 minutos para poder mantener activa la proteinasa K
y ARNasa, debido a que son enzimas obtenidas de bacterias termófilas.
Eventualmente, se agregó 100 ul de etanol con el propósito de detener toda
la acción enzimática dentro de la muestra. Luego durante la centrifugación
de la columna a 8000 rpm por 1 minuto, se eliminaron los contaminantes
que podrían interferir con la posterior amplificación y análisis del ADN. El
filtrado descartado contenía proteínas y otras moléculas no deseadas que
se separaron de la muestra.

También se usó el buffer de lavado I (con etanol añadido), esencial para

eliminar cualquier residuo y contaminante, junto con la centrifugación a 8500
rpm durante el lavado permitió la separación efectiva de los contaminantes
de la columna. Según Dávila, indica que “tras la centrifugación se obtienen
dos fracciones el material sedimentado llamado pellet y una muestra líquida
que no contiene material sedimentado llamado sobrenadante, el método es

14
Extracción de ADN, fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fundamentos de
electroforesis

bastante empírico, y a priori no se puede saber si la partícula buscada

quedará en el sobrenadante, en el pellet o repartido entre ambos; sin
embargo es una técnica muy útil, sobre todo para el aislamiento de células y
orgánulos subcelulares” (p. 16).

Además, se realizó un paso adicional de lavado con buffer de lavado II (con

etanol añadido) y centrifugación a velocidad máxima durante 3 minutos para
asegurar la eliminación completa de cualquier residuo del buffer de lavado.
Esta etapa fue crucial para obtener un ADN libre de contaminantes, lo que
garantiza la calidad y la confiabilidad de los resultados obtenidos. Según
Stulning y Amberger (1994) mencionan que “la fase acuosa y la orgánica se
separan por centrifugación lo que permite aislar al ADN. Los solventes que
se usan frecuentemente son el fenol, el cloroformo y el alcohol isoamílico”
(p. 11). En este caso, el buffer de lavado ,debido a su alta concentración de
etanol promoverá la precipitación del ADN en la columna, mientras que las
proteínas se depositarán en el fondo del microtubo.

Por último, se utilizó el buffer de elusión en la columna de purificación de

ADN, ya que este ayuda a liberar el ADN de la membrana de la columna,
permitiendo que pase a través de ella una vez se realice la centrifugación
durante el procedimiento. Según Sambrook y Russell (2001), nos confirman
que "el eluyente es un buffer que se utiliza para liberar el ADN de la matriz
de unión mediante la disociación de las moléculas de ADN unidas a la
columna" (p. 640). Asimismo, el autor Bertolini (2018) confirma que “el buffer
de elución permite cambiar la polaridad del polímero dentro del tubo
eppendorf, después de haber eliminado los restos de proteínas y ARN,
logrando así el paso del ADN a través del polímero, sedimentándolo” (p. 8).
Es por eso que es necesario el buffer de elusión puesto que libera el ADN y
lo separa de las impurezas y contaminantes, permitiendo finalmente obtener
el ADN genómico purificado.

Finalmente, el proceso de cuantificación nos sirvió mediante el

espectrofotómetro para medir un ADN de alta calidad y pureza, y comprobar
que esté libre de proteínas, enzimas y otros contaminantes. Según
Sambrook y Russell (2001), nos confirman que “Para ello, se debe medir la

15
Extracción de ADN, fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fundamentos de
electroforesis

absorbancia del ADN a una longitud de onda de 260 nm y luego calcular la

concentración utilizando la ley de Beer-Lambert. Es importante tener en
cuenta que la presencia de proteínas y otros contaminantes pueden afectar
la lectura en el espectrofotómetro, por lo que se recomienda utilizar un kit de
purificación de ADN antes de la medición. Además, se debe verificar la
pureza del ADN midiendo su relación de absorbancia a 260 nm y 280 nm,
siendo una relación de 1,8 considerada como ADN de alta pureza” (p.161).

16
Extracción de ADN, fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fundamentos de
electroforesis

4.2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

El proceso de la reacción en cadena de la polimerasa nos sirvió para producir

múltiples copias de un segmento de ADN. Como nos confirman Wittwer y Miles
(2015), "la PCR ha revolucionado la biología molecular y ha permitido la
amplificación de material genético a partir de cantidades muy pequeñas de
ADN". Sabiendo esto, la muestra de ADN que se obtuvo de una compañera de
nuestro grupo, tuvo que pasar por diversas etapas para llegar a esa finalidad,
por lo que luego de llevar el tubo de PCR que contenía el mix de PCR junto con
el ADN molde a un termociclador, se procedió a iniciar la primera etapa llamada
“desnaturalización inicial”, en donde debido a la temperatura de 96°C, se
separaron las dos hebras de ADN complementarias, produciendo la ruptura de
los enlaces puente de hidrógeno. Y por consiguiente, en la segunda etapa
llamada “desnaturalización”, durante los 32 ciclos repetitivos de la PCR y a la
temperatura de 96°C, a los pocos segundos se produjo la activación de la
enzima Taq polimerasa, esta enzima es capaz de soportar altas temperaturas
sin desnaturalizarse, lo que la hace ideal para la amplificación de ADN a través
de múltiples ciclos de temperatura. De acuerdo con Tamay de Dios et al. (2013),
“la ADN polimerasa se encarga de la catálisis de la reacción, sintetizando las
nuevas cadenas de ADN que llevan la secuencia blanco. La enzima más usada
con frecuencia se llama Taq ADN polimerasa, que proviene de una bacteria
termófila llamada Thermus aquaticus, la cual vive en condiciones de
temperatura muy altas y por eso su ADN polimerasa es capaz de soportar ese
tipo de temperaturas” (p. 71). Es por eso, que al unirse a los cebadores , nos
permitió sintetizar las nuevas cadenas de ADN. Posteriormente, en la etapa de
“hibridación” bajamos la temperatura a 56°C y allí se produjo el proceso de
unión de los cebadores (primers) al ADN molde.

Durante cada ciclo de amplificación de la PCR convencional, la etapa de la

extensión jugó un papel crucial en la síntesis de nuevas cadenas de ADN
complementarias. Durante esta etapa, la temperatura era de 72° C (Fig. N° 01),
lo que permitió que la Taq polimerasa, una enzima termoestable ampliamente
usada en la PCR, se activará y comenzará a sintetizar nuevas cadenas de ADN
a partir de los cebadores (primers) previamente unidos a las secuencias de ADN

17
Extracción de ADN, fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fundamentos de
electroforesis

objetivo. Según Velásquez et al. (2014) confirma que “esta etapa, también
conocida como elongación, amplificación o polimerización, consiste en la
síntesis de la nueva cadena de ADN, a partir del extremo 3’ del iniciador por
acción de la ADN polimerasa, empleando como sustrato los cuatro dNTPs” (p.
63).

Utilizando el método de PCR convencional en un termociclador, llevamos a cabo

una etapa llamada “extensión final” después de completar los ciclos de
amplificación. Durante esta etapa, mantuvimos la temperatura a alrededor de
72°C (Fig. N° 01) durante unos 5 minutos, para permitir que la Taq polimerasa
sintetizara completamente todas las cadenas de ADN presentes en nuestra
muestra.

En nuestro experimento, nos centramos en la amplificación selectiva del gen de

la proteína citocromo B mediante la realización de todas las etapas del proceso
de PCR (desnaturalización, hibridación y extensión).

El citocromo B es un gen mitocondrial que codifica para una proteína que forma
parte de la cadena de transporte de electrones en la mitocondria. Esta cadena,
a su vez, está intrínsecamente ligada al ADN mitocondrial. El gen que codifica el
citocromo B se encuentra en el ADN mitocondrial, y su expresión es esencial
para el correcto funcionamiento de la cadena respiratoria mitocondrial.
(Guevara, 2006).

18
Extracción de ADN, fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fundamentos de
electroforesis

4.3. Electroforesis

El proceso de electroforesis es una técnica valiosa para la separación y

análisis de moléculas en función de su carga y tamaño. Para llevar a cabo
este procedimiento, usamos un gel de agarosa que ha sido previamente
diluido con el Buffer Tris - acetato - EDTA 1X (TAE), ya que este separa las
moléculas en función de su tamaño y a medida que las moléculas se
mueven a través del gel bajo la influencia de un campo eléctrico, las más
grandes se retrasan y quedan atrapadas en la matriz del gel, mientras que
las más pequeñas se mueven más rápido y avanzan más lejos. (Alberts et
al., 2014). Sabiendo eso, cuando colocamos el gel de agarosa en la cámara
de electroforesis alrededor del peine, se crearon pozos para cargar las
muestras de ADN y junto con el buffer de carga, que nos sirvió para para
facilitar la migración de las moléculas, ya que este proporcionaba los iones
necesarios para una buena conductividad eléctrica. Esto nos aseguró que
las moléculas se movieran a través del gel de manera eficiente durante la
electroforesis, permitiendo su separación y análisis. Tal y como lo confirma
Russel (2002), “el buffer de carga también ayuda a mantener un pH
constante en el gel, lo que contribuye a la separación correcta de las
muestras” (p. 79).

En nuestro experimento, se observaron bandas bien definidas en el gel de

agarosa, lo que indicó una buena resolución de las muestras de ADN. Las
bandas correspondientes a los fragmentos de ADN se distribuyeron de
manera ordenada en función de su tamaño, lo cual concuerda con los
principios fundamentales de la electroforesis en gel de agarosa. Tal como
confirma Alberts et al. (2014), "la movilidad de las moléculas de ADN a
través del gel de agarosa se rige principalmente por su tamaño y forma, lo
que permite la separación de fragmentos de ADN de diferentes tamaños" (p.
342). Nuestros resultados respaldan esta afirmación, ya que observamos
una clara relación entre la posición de las bandas y el tamaño de los
fragmentos de ADN.

19
Extracción de ADN, fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fundamentos de
electroforesis

En los resultados de la electroforesis pudimos observar en las bandas, el

marcador de peso molecular (Fig. N°02), el cual es esencial para estimar el
tamaño de los fragmentos de ADN desconocidos. Tal y como nos confirman
Miller & Witherow (2018), "el marcador de peso molecular es una mezcla de
ADN de fragmentos conocidos de diferentes tamaños que se ejecutan junto
con las muestras desconocidas en una electroforesis en gel. Los fragmentos
de ADN de las muestras desconocidas se comparan con los fragmentos en
el marcador de peso molecular para determinar su tamaño" (p. 78).

También pudimos visualizar la aparición de una banda única y clara

correspondiente a la muestra de ADN genómico (Fig. N°02) intacta en la
electroforesis, lo cual nos indica que la muestra no fue manipulada y que fue
de alta pureza (Miller y Witherow, 2013).

De la misma forma, observamos el control negativo de PCR (Fig. N°02), el

cual es esencial para garantizar la precisión de los resultados. Según
Bouchard (2003), “Estos controles se llevaron a cabo sin el ADN molde para
asegurarnos de que no se produzcan amplificaciones no específicas.
Además, se realizan controles negativos de reactivos para detectar la
contaminación de los reactivos utilizados” (p.123). Es por eso, que el control
negativo es crucial para detectar la presencia de contaminantes y asegurar
la precisión de los resultados.

Por último, al visualizar y analizar los resultados de la electroforesis en gel

de agarosa, pudimos observar la amplificación esperada del gen citocromo
B. Según Ballard (2004) nos indica que "El gen citocromo B es un gen
mitocondrial que se encuentra en la mayoría de los organismos eucariotas y
que codifica una proteína que forma parte de la cadena de transporte de
electrones en la mitocondria".

20
 Extracción de ADN, fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fundamentos de
electroforesis

5. Conclusiones

● Comprendimos que la extracción de ADN utilizando el kit Purelink-genomic

de Invitrogen es un método confiable para obtener ADN genómico de alta
calidad. Este proceso implica lisis celular y la precipitación de proteínas, lo
que permite la liberación y purificación del ADN de las muestras biológicas.

● Entendimos que la técnica del PCR es una herramienta poderosa a nivel

molecular. Asimismo, la técnica del PCR permite amplificar selectivamente
una región objetiva de ADN, lo que facilita su análisis y estudio.

● Logramos amplificar de manera exitosa el gen citocromo B mediante la

técnica de PCR, obteniendo una mayor cantidad de material genético.

● Detectamos exitosamente el gen citocromo B mediante electroforesis en gel

de agarosa evidenciando la presencia de la banda esperada, confirmando la
presencia del fragmento amplificado y comprobando la efectividad de la
amplificación lograda en el proceso de PCR.

● Las técnicas de biología molecular nos permitieron comprender la

información genética de un individuo, lo que desempeña un papel importante
en el diagnóstico de enfermedades genéticas y la identificación de
marcadores genéticos de riesgo.

21
 Extracción de ADN, fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fundamentos de
electroforesis

6. Referencias bibliográficas

❖ Luque, J. and Herráez, Á. (2010). Texto ilustrado de Biología Molecular e

Ingeniería Genética. Editorial Médica Panamericana.

❖ Watson, J. D., & Berry, A. (2003). ADN: El secreto de la vida. Madrid, Taurus.

❖ Smith, J. (2019). Introducción a la biología molecular (2da ed.). Ciudad de

México: Editorial Médica Panamericana.

❖ Russell, L. M., & Sambrook, J. (2001). Molecular biology techniques: A

classroom laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

❖ Berg, J. M., Tymoczko, J. L., & Stryer, L. (2015). Bioquímica (8a ed.). Reverté.

❖ González N, Rodríguez N, Torres W, O'Callaghan J y De Jesús R. (2011). A

Simple Protocol for Molecular Analysis with DNA Extrated from Ear Tissue of

Laboratory. Revista Científica, 21 (3), 233-238.

❖ Dávila Ochoa, H. F. (2007). Desarrollo de un control digital para una

centrífuga de análisis clínico. URP

❖ Stulnig, T. M., & Amberger, A. (1994). Exposing contaminating phenol in

nucleic acid preparations. BioTechniques, 16(3), 402–404.

❖ Russell, L. M., & Sambrook, J. (2001). Molecular biology techniques: A

classroom laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press

❖ Farrar, J. S., & Wittwer, C. T. (2015). Extreme PCR: efficient and specific DNA

amplification in 15-60 seconds. Clinical chemistry, 61(1), 145–153

❖ Tamay de Dios, L., Ibarra, C., & Velasquillo, C. (2013). Fundamentos de la

reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de la PCR en tiempo real.

Investigación en discapacidad, 2(2), 70-78.

22
Extracción de ADN, fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fundamentos de
electroforesis

❖ Velázquez, L. P. A., Martínez, M. D. C. A., & Romero, A. C. (2014). Extracción

y purificación de ADN. Herramientas moleculares aplicadas en ecología:

aspectos teóricos y prácticos, 1.

❖ Guevara-Chumacero, L. M., López-Wilchis, R., Pedroche, F. F., &

Barriga-Sosa, I. de los A. (2006). Análisis estructural del gen mitocondrial

citocromo b y de la región control de Cynomys mexicanus y Spermophilus

spilosoma (Rodentia: Sciuridae). Acta mexicana, 22(1), 123-125.

http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0065-173720060

00100010&lng=es&tlng=es

❖ Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., & Walter, P. (2014).

Molecular Biology of the Cell (6th ed.). Garland Science.

❖ Miller, H., & Witherow, D. S. (2018). Molecular biology techniques: A

classroom laboratory manual. Academic Press.

❖ Bouchard, L. A. (2003). PCR methods and applications. Nova Science

Publishers.

❖ Ballard, J. W. O., & Whitlock, M. C. (2004). The incomplete natural history of

mitochondria. Molecular Ecology, 13(4), 729-744.

https://doi.org/10.1046/j.1365-294X.2003.02063.x

23
Extracción de ADN, fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fundamentos de
electroforesis

Criterios de evaluación

Informe de Laboratorio 1, 2, 3, 4
y 5: Rúbrica

COMPETENCIAS: desarrolla el nivel de comprensión de lo realizado en las sesiones de práctica en

laboratorio y discutir los resultados obtenidos.

CRITERIO LOGRADO EN PROCESO NO LOGRADO

Se ajusta completamente al Se ajusta al formato No incluye todos los

formato institucional y establecido, pero omite datos solicitados y los
posee toda la información datos relevantes de la presentados están
requerida para la presentación. desordenados. No se
presentación del informe. ajusta al formato de
presentación.
1.CARÁTULA Y
PRESENTACIÓN

1 puntos 0.5 puntos 0 puntos

Las fuentes de información La mayoría de los Algunos supuestos

están excelentemente conceptos están están evidenciados y
integradas con el material sustentados. justificados. Las citas
práctico, coherente Presentan alguna se integran de modo
redacción. Muy buen uso de desconexión en la deficiente, pobre o débil
las fuentes secundarias. Lo redacción y no están integración de fuentes
presentado argumenta del todo claras secundarias.
totalmente el tema. respecto a lo Redacción insuficiente
Redacción de los objetivos desarrollado en el de objetivos, se omite
completamente ajustada al laboratorio. Objetivos algunos propósitos del
2. INTRODUCCIÓN desarrollo experimental de del experimento laboratorio.
(marco teórico y la práctica de laboratorio. redactados con Uso no adecuado de
objetivos de la pequeños omisiones y verbos.
práctica) Correcto uso de verbos. errores de redacción.

1 puntos 0.5 puntos 0 puntos

24
Extracción de ADN, fundamentos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fundamentos de
electroforesis

Describe en tiempo Describe en primera No utiliza el tiempo

pasado y en primera persona los pasado ni redacta en
3. PROCEDIMIENTO persona los materiales y materiales y primera persona los
EXPERIMENTAL metodología utilizadas metodología materiales y metodología
(materiales y métodos en el desarrollo de sus utilizadas en el utilizada en el desarrollo
usados) experiencias. desarrollo de sus de sus experiencias, la
experiencias sin información es
utilizar el tiempo incompleta.
pasado.

1 puntos 0.5 puntos 0 puntos

Todas las figuras, Figuras, tablas y La mayor parte de las

gráficos y tablas gráficos son en figuras, gráficos y tablas
están bien general correctos, son correctas, pero en
4. RESULTADOS diseñadas, aunque presentan varios casos presentan
numeradas y algún problema limitaciones
tituladas. menor que podría de
ser mejorado. importancia.

5 puntos 4 a 1 punto 0 puntos

Todos los resultados Casi todos los Parte de los datos se

comparativos y las resultados han sido han interpretado y
tendencias presentes en interpretados y discutido
5. ANÁLISIS Y los datos han sido discutidos correctamente, pero se
DISCUSIÓN DE LOS interpretados y correctamente. Se identifican errores e
RESULTADOS discutidos identifican imprecisiones de
correctamente. Buena imprecisiones importancia.
comprensión de lo menores.
indicado por
los resultados.

5 puntos 4 a 1 punto 0 puntos

Se exponen con Se exponen todas Aunque recojan los

claridad, concisión y las conclusiones principales aspectos
acierto todas las básicas, pero se estudiados, se explican y
6. CONCLUSIONES conclusiones podría mejorar la comentan errónea o
importantes. Excelente formulación. ambiguamente. Pobre
comprensión. Algunos aspectos comprensión.
vagos.

5 puntos 4 a 1 punto 0 puntos

7. REFERENCIAS Referencias Presenta una

BIBLIOGRÁFICAS Referencias bibliográficas bibliografía incompleta,
Redacta según bibliográfica completa y completa, pero sin obviando algunas
sistema APA las bien formulada, con utilizar dentr referencias obligatorias
referencias citadas excelentes citas en el o del marco teórico. (guías y apuntes
en el informe informe de laboratorio. personales, etc.)

2 punto 1 punto 0 puntos

25