PG 409

UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS
FACULTAD DE CIENCIAS PURAS Y NATURALES

CARRERA DE CIENCIAS QUÍMICAS
TRABAJO PARA OPTAR AL GRADO DE LICENCIADA EN CIENCIAS QUÍMICAS
VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO PARA LA

DETERMINACIÓN DE CLOROFILA-A EN MUESTRAS
NATURALES DE AGUA POR ESPECTROSCOPÍA UV-VIS
POR: DANIELA QUISPE HUANCA

TUTOR: PhD. OSWALDO EDUARDO RAMOS RAMOS
LA PAZ – BOLIVIA
Diciembre, 2022
AGRADECIMIENTOS
Primeramente a mi mamá Beatriz Basilia por todo su apoyo incondicional y

esfuerzo proporcionándome todo y cada cosa que he necesitado y por darme siempre
aliento para seguir adelante, a mi papá Filiberto siendo el ángel de mi vida y desde donde
esté me cuida y me bendice, a mi madrina Ana María de Col y al Embajador Gonzalo
Montenegro por el cariño y el apoyo incondicional en cada etapa de mi formación
académica y personal.
A mi tutor Ph.D. Oswaldo Eduardo Ramos Ramos y a mí tribunal a Ph.D.

Leonardo Guzmán Alegría, por el apoyo y su valiosa orientación y el tiempo de revisar el
presente trabajo, gracias por asesorarme, guiarme y mejorar el mismo hasta lo que es
ahora.
A la Universidad Mayor de San Andrés, a la carrera de Ciencias Químicas y a todo

el panel docente quienes con su enseñanza y vasto conocimiento constituyen la base de
mi formación profesional.
Al Ph.D. Xavier Lazarro Investigador de la Cooperación Francesa (IRD), por su

valiosa orientación en los parámetros de la ecología acuática para el presente trabajo.
Al Ing. Efraín Ramos por la colaboración brindada en la obtención de muestras de

agua natural para el estudio del presente trabajo.
A todo el personal de la Unidad de Metrología Química, perteneciente al Instituto

Boliviano de Metrología (IBMETRO) por darme la oportunidad de realizar mis primeros
pasos como Química, apoyarme, capacitarme y orientarme en todo el proceso de mi
pasantía, además de darme la oportunidad de apoyar en el proyecto “Accurate
measurements of Dissolved Oxygen, Phosphorus and Chlorophyll in several aquatic
environments for the correct assessment of Biodiversity Monitoring” siempre con el
asesoramiento y la guía incondicional brindada por todo el equipo del Laboratorio de
Calibraciones Químicas y Materiales de Referencia, en especial al Lic. José Luis
Gonzales y M.Sc. Julian Morales por los consejos, pautas y correcciones en el desarrollo
de mi trabajo de grado y mi desempeño en el laboratorio.
ÍNDICE
RESUMEN 1
CAPÍTULO 1 2
1. INTRODUCCIÓN 2
1.1. ANTECEDENTES Y TRABAJOS REALIZADOS 3
1.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 4
1.3. OBJETIVOS 5
1.3.1. Objetivo General 5
1.3.2. Objetivo específico 5
1.4. JUSTIFICACIÓN 6
CAPÍTULO 2 8
2.1. AGUAS NATURALES 8
2.1.1. Clasificaciones tróficas 8
2.1.1.1. Oligotrófico 8
2.1.1.2. Mesotrófico 8
2.1.1.3. Eutrófico 9
2.1.1.4. Hipertrófico 9
2.2. COMUNIDADES FITOPLANCTÓNICAS 10
2.2.1. Fitoplancton 10
2.2.2. Factores ambientales 10
2.2.2.1. Luz 10
2.2.2.2. Calor 11
2.2.2.3. Gases Disueltos 11
2.2.2.3.1. Oxígeno 11
2.2.2.3.2. Dióxido de Carbono 11
2.2.2.4. Nutrientes 12
2.2.2.5. Suspensión 12
2.3. CLOROFILA-A 12
2.4. EUTROFIZACIÓN 14
2.5. ESPECTROMETRÍA UV-VIS 15
2.5.1. Ley de Beer 16
2.6. VALIDACION DE METODOS ANALITICOS 16
2.6.1. Importancia de Validar un método 18
2.6.2. Cuando realizar una validación 18
2.6.2.1. Un nuevo método 18
2.6.2.2. Métodos no normalizados 18
2.6.2.3. Métodos normalizados 18
2.7. PARÁMETROS DE VALIDACIÓN 19
2.7.1. Linealidad 19
2.7.1.1. Evaluar los resultados y eliminar los resultados anómalos 21
2.7.2. Límite de detección (LOD) 22
2.7.3. Límite de cuantificación (LOQ) 22
2.7.5. Intervalo de trabajo 23
2.7.6. Selectividad 24
2.7.7. Precisión 24
2.7.8. Precisión intermedia 24
2.7.9. Repetibilidad 25
2.7.10. Reproducibilidad 25
2.7.11. Exactitud 26
2.7.12. Sesgo 27
2.7.12.1. Porcentaje de Recuperación 28
2.7.13. Robustez 29
2.7.13.1. Test Youden y Steiner 29
2.7.14. Incertidumbre 31
CAPÍTULO 3 33
3. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL 33
3.1. MUESTREO 33
3.1.1. Tratamiento de la muestra 34
3.1.2. Toma de muestra 35
3.2. TIPO DE INVESTIGACIÓN 35
3.3. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS 36
3.4. METODOLOGÍA ANALÍTICA 38
3.4.1. Preparación de la solución patrón de Clorofila-a 39
3.4.2. Preparación de la muestra para la extracción. 39
3.4.3. Obtención de solución clarificada. 39
3.4.4. Determinación de clorofila a por espectroscopia UV-VIS. 39
3.4.5. Determinación de linealidad 40
3.4.6. Determinación de sensibilidad analítica 40
3.4.7. Determinación de límite de detección y cuantificación. 40
3.4.8. Determinación de selectividad 41
3.4.9. Determinación de repetibilidad y precisión 41
3.4.10. Determinación de precisión intermedia 41
3.4.11. Determinación de reproducibilidad 41
3.4.12. Determinación de sesgo y exactitud 42
3.4.13. Determinación de robustez 42
3.4.14. Determinación de Incertidumbre 42
CAPÍTULO 4 43
4. RESULTADOS Y DISCUSIONES 43
4.1. Resultados de la Linealidad 43
4.2. Límite de detección, cuantificación y sensibilidad analítica 50
4.3. Selectividad 52
4.4. Precisión / Repetibilidad 57
4.5. Reproducibilidad 58
4.6. Precisión intermedia 60
4.7. Exactitud y Sesgo 62
4.8. Robustez 63
4.9. Incertidumbre 64
CAPÍTULO V 67
CONCLUSIONES 67
CAPÍTULO VI 68
RECOMENDACIONES 68
CAPITULO VII 69
BIBLIOGRAFÍA 69
ANEXOS 74
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Clasificaciones tróficas en lagos de agua natural .............................................. 9

Figura 2. Estructura Molecular de la clorofila-a ............................................................. 13
Figura 3. Diagrama de comparación de una muestra natural y un proceso de Eutrofización
.......................................................................................................................................... 14
Figura 4. Espectro de absorción y cuantificación colorimétrica ..................................... 16
Figura 5. Curva de calibración, concentración vs respuesta ........................................... 19
Figura 6. Intervalo de trabajo, rango dinámico y rango lineal ........................................ 23
Figura 7. Diferencia entre Precisión y Exactitud ............................................................ 24
.Figura 8. Diagrama de exactitud en función de la veracidad ......................................... 27
Figura 9. Imagen Satelital de la Laguna Alalay en la Ciudad de Cochabamba-Bolivia . 33
Figura 10. Punto de muestreo.......................................................................................... 34
Figura 11. Curva de calibración de Chl-a con respecto a la linealidad ........................... 49
Figura 12. Residuos vs. Concentración de la curva de calibración ................................. 49
Figura 13. Linealidad de la muestra sin matriz ............................................................... 54
Figura 14. Linealidad de la muestra con la matriz .......................................................... 55
Figura 15. Selectividad del método de determinación de clorofila-a.............................. 57
Figura 16. Curva de calibración e intervalo de confianza ............................................... 65
Figura 17. Contribución de la incertidumbre en la medición de Clorofila-a .................. 65
Figura 18. Estudio de clorofila-a mediante la acidificación en función del tiempo ....... 66
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Rango de Concentración de valores maximos de clorofila-a en aguas naturales,

establecido por la OECD para valores límites para sistemas de clasificación trófica abierta
............................................................................................................................................ 6
Tabla 2. Prueba de robustez de Youden y Steiner ........................................................... 30
Tabla 3. Equipos y materiales utilizados.......................................................................... 36
Tabla 4. Reactivos utilizados ........................................................................................... 38
Tabla 5. Datos experimentales de Absorbancia de 5 g Chl-a/L, cálculo del estadístico
test de Grubbs ................................................................................................................... 43
test de Grubbs ................................................................................................................... 44
test de Grubbs ................................................................................................................... 44
test de Grubbs ................................................................................................................... 45
test de Grubbs ................................................................................................................... 45
test de Grubbs ................................................................................................................... 46
test de Grubbs ................................................................................................................... 46
test de Grubbs ................................................................................................................... 47
Tabla 13. Datos experimentales de Absorbancia de 1000 g Chl-a/L, cálculo del
estadístico test de Grubbs ................................................................................................. 47
Tabla 14. Resultados de la linealidad y rango de trabajo para la clorofila a.................... 48
Tabla 15. Residuos vs. Concentración de la curva de calibración ................................... 51
Tabla 16. Resultados de límite de detección, límite de cuantificación y sensibilidad
analítica ............................................................................................................................ 52
Tabla 17. Análisis de los mínimos cuadrados de datos de la muestra sin matriz ............ 53
Tabla 18. Análisis de los mínimos cuadrados de datos de la muestra con matriz ........... 54
Tabla 19. Comparación de Resultados obtenidos del estudio de repetibilidad Chl-a (g/L)
.......................................................................................................................................... 57
Tabla 20. Resultados obtenidos del estudio de Repetibilidad Chl-a (g/L) .................... 58
Tabla 21. Comparación de Resultados obtenidos del estudio de Reproducibilidad Chl-a
(g/L) ............................................................................................................................... 59
Tabla 22. Resultados obtenidos del estudio de reproducibilidad Chl-a (g/L) ............... 59
Tabla 23. Datos obtenidos en función a los resultados de precisión intermedia Chl-a (g/L)
.......................................................................................................................................... 61
Tabla 24. Valores correspondientes de medición de muestra y solución patrón ............. 62
Tabla 25. Diseño experimental de Youden Steiner .......................................................... 63
Tabla 26. Variables influyentes en función de la robustez en el análisis de clorofila-a .. 63
Tabla 27. Resultados obtenidos del estudio de Robustez ................................................ 64
Tabla 28. Coeficientes obtenidos mediante la curva de calibración ajustada Chl-a (g/L)
.......................................................................................................................................... 65
INDICE DE ANEXOS
ANEXO 1. Datos obtenidos y resultados del estudio de repetibilidad de Chl-a (g/L) .. 74

ANEXO 2. Datos obtenidos y resultados del estudio de reproducibilidad de Chl-a (g/L)
.......................................................................................................................................... 76
ANEXO 3. Datos obtenidos y resultados del estudio de precisión intermedia de Chl-a
(ug/L)................................................................................................................................ 77
ANEXO 4. Datos y resultados obtenidos del estudio de sesgo y exactitud ..................... 78
ANEXO 5. Datos y resultados del estudio de selectividad .............................................. 79
ANEXO 6. Valores críticos para la distribución de t-Student. ........................................ 81
ANEXO 7. Valores críticos para la distribución de test de F .......................................... 82
ANEXO 8. Valores críticos para la distribución de test de Grubbs ................................. 83
ANEXO 9. Fotografías de equipos y preparación de la muestra ..................................... 84
ANEXO 10. Documentación brindada por el Instituto Boliviano de Metrología
(IBMETRO) ..................................................................................................................... 87
RESUMEN
En el presente trabajo se realizó la validación de un método para la determinación

espectrofotométrica de clorofila-a (Magnesium[methyl(3S,4S,21R)-14-ethyl-4,8,13,18-
tetramethyl-20-oxo-3-(3-oxo-3-{[(2E,7R,11R)-3,7,11,15-tetramethyl-2-hexadecen-1-
yl]oxy}propyl)-9-vinyl-21-phorbinecarboxylatato(2−)-κ2N,N′]), en muestras naturales de
agua, trabajo perteneciente al proyecto “Accurate measurements of Dissolved Oxygen,
Phosphorus and Chlorophyll in several aquatic environments for the correct assessment
of Biodiversity Monitoring” con el apoyo PTB (Physikalisch-Technische Bundesanstalt)
y la participación de diferentes Institutos de Metrología.
La clorofila-a está presente en las comunidades fitoplanctónicas entre ellos

diversos grupos de protistas, denominados algas, provenientes de cuerpos de agua. El
principio de determinación se basa en la absorción molecular de la clorofila-a en solución
extraída y acidificada en solución etanólica a 665 y 750 nm. El método fue validado y
cumple con todos los requerimientos de control y aseguramiento de calidad por la norma
ISO/IEC 17025:2018 y recomendado y establecido por la norma ISO 10260:1992.
El método es sensible, con respuestas lineales hasta 1000 Chl-a (g/L) y un rango
de trabajo de 5 a 1000 Chl-a (g/L), con un r2= 0,9999972 y límites de detección y
cuantificación de 0,3419 y 1,0361 Chl-a (g/L) respectivamente, lo cual hace posible su
cuantificación en muestras con presencia de comunidades planctónicas, en especial para
aguas mesotróficas, eutróficas e hipertróficas.
Se verificó la precisión, selectividad y robustez del método analítico,

determinando el contenido en muestras naturales de agua con presencia significativa de
fitoplancton, en todos los casos, se encontraron porcentajes de recuperación de 99,9-
101,1%.
Palabras clave: clorofila-a, espectroscopia UV-VIS, feofitina, fitoplancton,

validación.
1
CAPÍTULO 1
1. INTRODUCCIÓN
La clorofila-a es un pigmento fotosintético responsable de la vida existente de las
plantas. Es una molécula que se encuentra en orgánulos específicos como los cloroplastos,
así como también en cianobacterias, en común en todo organismo que contienen plastos
en sus células.
La clorofila-a está presente en el fitoplancton entre ellos diversos grupos de
protistas, denominados algas, organismos básicamente acuáticos, provenientes de cuerpos
de agua. Esta molécula es fundamental en el proceso de la fotosíntesis, que permite a los
organismos absorber energía a partir de la luz solar y transformar en energía química
dependiendo fundamentalmente su concentración de la cantidad de luz y nutrientes que
puede llegar a absorber.
Las comunidades fitoplanctónicas son los principales productores primarios de
cuerpos de agua natural, determinar la concentración de clorofila-a en cuerpos de agua
nos permite conocer una estimación de la concentración de fitoplancton, la productividad
de procesos de eutrofización y, por lo tanto, de la actividad biológica.
La concentración de clorofila-a puede detectarse a través de la medición óptica,
permitiendo una estimación suficiente de la concentración del fitoplancton y la vigilancia
de la clasificación trófica. Los pigmentos de la clorofila-a tienen una firma espectral
específica y distintiva, pues absorben en las longitudes de onda correspondientes a los
colores azul (455- 492 nm) y rojo (622-700 nm) del espectro, así como una reflectancia
fuerte en el verde (492-577 nm), afectando por lo tanto al color del cuerpo de agua.
(Somoza et al., 2007).
Existen varias técnicas para realizar el análisis de clorofila-a en muestras de agua
natural y una de ellas es la técnica de espectrometría UV-VIS. El presente estudio emplea
la técnica de espectrometría de UV-VIS para realizar la validación de un método de
análisis para la determinación de clorofila-a en muestras naturales de agua, teniendo en
cuenta la norma ISO 10260:1992 y la norma ISO/IEC 17025:2018. Se desarrolla a través
de una serie de parámetros experimentales: linealidad, límite de detección, límite de
cuantificación, sensibilidad analítica, selectividad, repetibilidad, precisión intermedia,
2
sesgo, robustez, rango de trabajo, reproducibilidad e incertidumbre, por medio de una
comparación con una solución patrón de concentración conocida.
1.1. ANTECEDENTES Y TRABAJOS REALIZADOS

Las investigaciones realizadas en favor al medio ambiente en sistemas acuáticos
son muy diversas, entre ellos en análisis de clorofila-a que ha logrado brindar información
clave en la calidad de agua, específicamente a la vigilancia de los procesos de
eutrofización y como llega a influir y afectar al medio acuático. A pesar del avance de
leyes y de políticas públicas en beneficio al medio ambiente, los estudios encontrados
detallan como la determinación de clorofila-a ha sido de valor significativo para el cuidado
del medio ambiente en sistemas acuáticos.
El estudio del Instituto del Mar de Perú (Perú) entre el año 1976 hasta el 2000
realizaron una variación estacional e interanual de la biomasa fitoplanctónicas y
concentración de clorofila-a frente a la costa peruana, donde se logró obtener que en
condiciones normales, la biomasa planctónica cerca de la costa es alta con una
predominancia del fitoplancton del 80%, concentración que va disminuyendo
gradualmente conforme se aleja de la costa, en el año 1982 alcanzó un valor de clorofila-
a de 3 ug/L, los picos altos de fitoplancton se registraban en primavera debido a
condiciones favorables de luz y nutrientes, se concluyó que la presencia de menor
producción primaria fitoplanctónicas se dio entre 1976 a 1987 y de alta producción
primaria 1988 a 1999.
El estudio en la Universidad Federal do Ceará, Fortaleza, CE (Argentina),
realizaron la determinación de indicadores de eutrofización en el embalse Río Terceros de
Córdoba-Argentina, donde se determinó el estado trófico del reservorio, se demostró que
existe correlación positiva entre la clorofila- a y las variables fósforo total (r = 0.83),
oxígeno disuelto (r = 0.51) y temperatura (r = 0.43). El 65,6% de la variabilidad total de
los datos. El análisis multivariado estableció que las variables más significativas para
explicar la variabilidad en el reservorio fueron clorofila-a, fósforo total y temperatura.
El estudio de "Al. Universidad "I. Cuza" Iași, Facultad de Biología (Rumania)
realizaron un estudio de la concentración de clorofila-a en el embalse de Izvoru Muntelui-
Bicaz en el contexto de establecer el estado trófico del lago de la presa utilizando las
muestras mensuales de fitoplancton de septiembre de 2006 a julio de 2007, utilizando
3
como indicador de concentración de clorofila-a, según la norma rumana S. R. ISO
10260/1997, las concentraciones de clorofila-a (μg/l) fueron mayores en todos los sitios,
desde el horizonte de agua. Según la decisión gubernamental H.G no. 161/2006, utilizando
la clorofila como indicador (3,05 μg/l), el estado del embalse de Izvoru Muntelui-Bicaz
lograron clasificar a la categoría oligomesotrófica.
En el trabajo de (Yupanqui Poma, 2012), Determinación de clorofila-a y ensayos
fisicoquímicos en aguas del lago Titicaca, el estudio fue realizado en diferentes puntos del
lago Titicaca, empleando la técnica de Colorimetría, además de una serie de análisis
fisicoquímico de pH, conductividad, turbidez, demanda bioquímica de oxígeno (DBO),
demanda química de oxígeno (DQO), cloruros, fosfatos, sulfuros, sulfatos; utilizando
patrones de referencia obtenidos a partir de espinaca, logrando realizar pruebas de análisis
de clorofila en las muestras de agua recolectadas de diferentes puntos del lago Titicaca
obteniendo la cuantificación de clorofila-a y la determinación del control de calidad.
1.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Uno de los mayores problemas medio ambientales está relacionado con los
desechos a los cuerpos de agua natural, a partir de la agricultura, ganadería, residuos
urbanos, actividad industrial y forestal generando efluentes y alterando de manera
significativa a los cuerpos de agua, en la mayoría de casos provocando el exceso de
nutrientes en el agua principalmente nitrógeno y fósforo, procedentes mayoritariamente
de la actividad humana, ocasionando el incremento de reproducibilidad excesiva de
fitoplancton, un proceso de contaminación denominado eutrofización afectando a la
calidad de agua.
En la actualidad existen procedimiento para el análisis de clorofila-a en muestras
de agua natural, como ser entre ellas Fluorometria, Colorimetría, distribución espacial
satelital, Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC) y espectroscopía (UV-VIS),
cada uno de los métodos mencionados se diferencian con el uso de equipos, reactivos,
condiciones ambientales, de manera que dan a conocer la concentración del analito de
interés. Ninguno de los métodos mencionados cuenta con una validación para la
determinación de clorofila-a, que garantice que se cumplen los requisitos particulares,
para su uso previsto mediante fundamento estadístico.
4
Las investigaciones realizadas en el análisis de clorofila-a en muestras de agua
natural son muy poco frecuentes en nuestro país, además de ser un estudio fácil, rápido y
accesible que puede llegar a proporcionar mayor información sobre un análisis de estudio
de aguas debido a la contaminación de aguas naturales, sin embargo, en nuestra Norma
dictada bajo el amparo de la ley de Gestión Ambiental N.º 1333 tiene como objetivo la
Prevención y Control de la Contaminación Ambiental, para salvaguardar y preservar la
integridad de las personas, de los ecosistemas, mantener la vida natural, para la
reproducción, supervivencia, crecimiento y aprovechamiento de especies bioacuáticas,
pero no cuenta con el control de la eutrofización de los límites máximos que permita la
correcta toma de decisiones por parte de nuestras autoridades.
La importancia de estos problemas, demuestran la necesidad de contar con una
metodología confiable para el análisis de clorofila-a en cuerpos de agua natural. El
instituto Boliviano de Metrología (IBMETRO) no cuenta con un método validado, en el
presente trabajo se pretende validar el análisis de clorofila-a por espectroscopia UV-VIS,
en muestras naturales de agua.
1.3. OBJETIVOS
1.3.1. Objetivo General
Validar el método de análisis de clorofila-a por Espectroscopia UV-VIS en
muestras naturales de agua, en el Instituto Boliviano de Metrología (IBMETRO).
1.3.2. Objetivo específico
● Validar el método de análisis de clorofila-a mediante el protocolo de validación
definidos en la norma ISO/IEC 17025 referidos a linealidad, rango de trabajo,
límite de detección, límite de cuantificación, sensibilidad analítica, selectividad
repetitividad, reproducibilidad, precisión intermedia, sesgo, robustez,
incertidumbre.
● Establecer las condiciones experimentales, instrumentales para el correcto
desempeño del método para la cuantificación de clorofila-a por espectroscopia
UV-VIS en aguas naturales.
● Determinar la concentración de clorofila-a, por el método de espectroscopia UV-
VIS, aplicando una solución patrón a partir de un modelo validado.
5
1.4. JUSTIFICACIÓN
El agua representa una gran diversidad de vida, desempeña un importante papel
en la fotosíntesis de las plantas y sirve de hábitat a una gran parte de los seres vivos en
medios acuáticos, contribuye a la estabilidad y regularización, por lo cual se debe prevenir
y controlar todo tipo de contaminación y buscar nuevas formas de evaluación de análisis
y emplear metodologías de análisis que pueden desempeñar maneras favorables de
evaluación en favor al cuidado del medio ambiente.
La clorofila-a se usa con frecuencia como una medida representativa directa y
adecuada de la calidad del agua y de esta manera mejorar el nivel de vida de la población,
de la salud animal y humana, los ecosistemas acuáticos, el uso eficiente de los recursos
económicos destinados a la potabilización del agua y el desarrollo de la industria pesquera,
agrícola y ganadera.
Conocer la concentración de Clorofila a en aguas nos brindara la información
correcta de la clasificación trófica y el grado de riesgo, en la siguiente tabla se demuestra
el rango aceptable de concentración de clorofila-a que debería de considerarse para el
cuidado del medio ambiente.
Tabla 1. Rango de Concentración de valores maximos de clorofila-a en aguas naturales,
establecido por la OECD para valores límites para sistemas de clasificación trófica abierta
Clorofila-a Oligotrófico Mesotrófico Eutrófico Hipertrófico
Rango (ug/L) 1,3-10,6 4,9-49,5 9,5-275 > 275
Fuente: Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OECD)
De esta manera es posible realizar la correcta evaluación de los recursos acuáticos

sujetos a procesos de eutrofización y sus efectos en la biodiversidad, de manera que nos
permitirá la correcta toma de decisiones por parte de las autoridades en función del
cuidado de nuestro medio ambiente
Además es de gran importancia realizar la validación de un método analítico ya
que nos permite confirmar y evidenciar que se cumplen los requisitos particulares para su
6
uso previsto mediante fundamento estadístico y demostrar que la determinación de
clorofila-a en aguas naturales sean reproducibles, confiables y que cumplan requisitos que
establecen la norma ISO/IEC 17025:2018 y la norma ISO 10260:1992, normas que
indican procedimientos y etapas que se deben seguir para realizar una validación
metodología analítica.
La importancia de validar el método es permitir la efectividad del análisis, siendo
un método de determinación para un servicio de análisis a la sociedad, que presta el
Instituto Boliviano de Metrología (IBMETRO).
7
CAPÍTULO 2
2.1. AGUAS NATURALES

Las aguas naturales son aquellas que mantienen sus propiedades originales sin
haber sufrido modificaciones por el ser humano, se pueden clasificar en superficiales y
subterráneas como ser entre ellas, lagos, manantiales, arroyos, ríos, glaciares y más. El
cuidado de las aguas naturales es de vital importancia para la preservación del medio
ambiente y para los seres vivos y de esta manera preservar la calidad del agua y el grado
de contaminación.
La calidad de las aguas está íntimamente asociada a las características geoquímicas
del terreno y las actividades del manejo del suelo ya sea para fines agrícolas,
deforestación, desmonte, construcción, urbanización u otro uso. Esto significa que para la
protección preventiva de la calidad de las aguas depende esencialmente del uso controlado
del suelo en el área de la cuenca correspondiente (Branco, Rocha, 1977)
2.1.1. Clasificaciones tróficas
Entre las aguas naturales podemos encontrar diversidad de lagos, vertientes y ríos
donde encontramos comunidades bióticas y se establece un equilibrio trófico en relación
a la cantidad de nutrientes que contienen estas aguas, por lo cual este grado se puede
clasificar de tres formas oligotrófico, mesotrófico y eutrófico.
2.1.1.1. Oligotrófico
Debido al bajo contenido de nutrientes de los cuerpos de agua, su productividad
es relativamente baja. Los cuerpos de agua de esta clasificación de nutrientes a menudo
son transparentes debido al crecimiento limitado de algas o biomas. Las bajas
concentraciones de algas permiten una penetración más profunda de la luz y una menor
descomposición.
2.1.1.2. Mesotrófico
Son conocidas por ser medianamente productivas, contienen niveles moderados
de nutrientes, y a simple vista suelen ser de agua clara, pero tienen plantas subacuáticas.
Los lagos mesotróficos pueden ser en su mayoría de agua clara, pero pueden ocurrir
floraciones de algas según la época del año. La diferencia entre los lagos mesotróficos y
8
los oligotróficos es que están estratificados, lo que significa que se dividen en capas según
la estación del año.
2.1.1.3. Eutrófico
Son conocidos por tener aguas verdes, turbias y fondos fangosos y blandos,
también tienen muchas plantas y/o algas. Contienen niveles altos de productividad
biológica, esto se debe a que contienen una gran cantidad de plantas debido a la cantidad
de nutrientes, en especial nitrógeno y fósforo. La clasificación trófica de cuerpos de agua
en etapa eutrófico tiene una relación bien establecida entre las concentraciones de
nutrientes y el aumento de la biomasa de fitoplancton. Se considera que en esta
clasificación el cuerpo de agua empieza una etapa de riesgo de eutrofización
Una de las primeras definiciones es que la eutrofización es el aumento de la tasa
de crecimiento de las algas, como consecuencia de una mayor taza de nutrientes en el
medio marino, así como las consecuencias (Steele, 1974).
2.1.1.4. Hipertrófico
Son conocidos por tener una elevada productividad de nutrientes y ausencia de
oxígeno, además tienen un nivel bajo de profundidad y un contenido de exceso de algas,
se considera la clasificación trófica con más riesgo y en una etapa alta en el proceso de
eutrofización.
Figura 1. Clasificaciones tróficas en lagos de agua natural

Fuente: Manual del Programa de Monitoreo Laico de Vermont
9
2.2. COMUNIDADES FITOPLANCTÓNICAS
Algunos lagos y otros cuerpos de agua incluyen una flora lacustre además de una
gran variedad de formas de vida, entre las que podemos encontrar la comunidad del
fitoplancton.
La comunidad conocida como plancton vive suspendida en el agua y se distingue
por su pequeño tamaño, que puede ir desde microscópico hasta milímetros. La palabra
"plancton" es de origen griego y significa "errante". Su rica terminología se caracteriza
por su naturaleza, tamaño, permanencia y origen.
El plancton es la unidad fundamental de producción de materia orgánica en los
ecosistemas acuáticos. Cada lago tiene una colección de formas planctónicas cuya
variedad, abundancia y distribución son exclusivas de esta comunidad y, además,
dependen de qué tan bien se hayan adaptado a factores bióticos y abióticos.
2.2.1. Fitoplancton
El fitoplancton es un plancton vegetal, son microalgas que obtienen su energía y
nutrientes a través de la energía solar por el proceso conocido como fotosíntesis y por ello,
casi siempre se encuentran cerca de la superficie del agua. El fitoplancton constituye el
primer eslabón de la cadena alimenticia de los sistemas acuáticos. Los principales grupos
de algas que forman el fitoplancton son las diatomeas, las clorofitas, las cianobacterias,
los dinoflagelados, los euglenoides entre otros.
2.2.2. Factores ambientales
Se considera que el desarrollo de las comunidades fitoplanctónicas depende de
factores físicos y químicos y cómo estos se distribuyen dentro de este sistema, lo que a su
vez se relaciona con la geomorfología de la cuenca. Estos factores ambientales son los
siguientes:
2.2.2.1. Luz
Las comunidades fitoplanctónicas necesitan de fuentes de energía externas, la luz
es uno de los principales factores para el desarrollo del fitoplancton. Se desarrolla
mediante la fotosíntesis en donde la luz se absorbe en dos zonas, la zona trofogénica y la
zona trofolítica, siendo una zona superior a comparación de la otra donde llega a tener una
absorción selectiva, donde algunas longitudes de onda penetraran más profundamente que
10
otras, por lo cual influirá en el crecimiento y población de las algas y las comunidades
fitoplanctónicas.
2.2.2.2. Calor
Las temperaturas y el calor pueden llegar a influir en la biodiversidad y el proceso
de fotosíntesis del fitoplancton, cuando el calor específico del agua es elevado, las
fluctuaciones de temperatura son más pronunciadas en la primera capa de superficie de un
cuerpo de agua, debido a la acción mecánica del viento el calor específico de un cuerpo
de agua se llega a distribuir en las profundidades. La capa superficial en un lago se
denomina epilimnion, la capa intermedia en la cual la temperatura cambia rápidamente se
denomina termoclina o metalimnion y la capa profunda es denominada hipolimnion. El
plancton suele concentrarse en la capa superficial de termoclina por el calor específico y
la densidad del agua en temperaturas normales, todo depende de la estación del año en su
biodiversidad.
2.2.2.3. Gases Disueltos
2.2.2.3.1. Oxígeno
El oxígeno en agua es indispensable para la respiración de los organismos
anaeróbicos. El oxígeno disuelto es la cantidad de oxígeno gaseoso que está disuelto en el
agua, es fundamental para la vida de los peces, plantas, algas y otros organismos, por lo
cual es considerado como un indicador de la capacidad de un cuerpo de agua para
mantener una vida acuática. La fuente principal del oxígeno disuelto en el agua es la
atmósfera y su solubilidad depende de la temperatura. En épocas frías o cuando se pierde
la esterificación térmica el agua disuelve una mayor cantidad de oxígeno disuelto y las
épocas de calor una menor cantidad de oxígeno disuelto.
Además, el oxígeno constituye una parte importante en el agua en el proceso de
fotosíntesis de las comunidades fitoplanctónicas, la respiración y descomposición de la
materia orgánica puede consumir una fracción importante de oxígeno disuelto y llegar a
terminar en la capa superficial en el hipolimnion.
2.2.2.3.2. Dióxido de Carbono
El dióxido de carbono es un gas de gran importancia para el metabolismo en los
lagos y para los organismos anaeróbicos. Se puede llegar a intercambiar a través de la
superficie o se genera en el proceso respiratorio dentro del mismo cuerpo de agua. Cuando
11
el dióxido de carbono reacciona con el agua se forma ácido carbónico, el cual se disocia
y aumenta la concentración de H+, además puede llegar a producir bicarbonatos y
carbonatos. La proporción relativa de las diferentes formas de dióxido de carbono en el
agua va a depender del pH, a valores altos de pH en lagos predominan los carbonatos y en
valores bajos el dióxido de carbono, hay que considerar que una muestra de agua natural
tiene un pH entre 6 y 8.
2.2.2.4. Nutrientes
Para las comunidades fitoplanctónicas los nutrientes inorgánicos de mayor
importancia para la producción del fitoplancton son los compuestos de nitrógeno y de
fósforo. Los fosfatos y nitratos se consumen con rapidez en la primera capa superficial de
los lagos, principalmente en el periodo de proliferación del fitoplancton, en la capa
superficial más profunda se puede encontrar mayor concentración debido a la
composición de la materia orgánica y los sedimentos regenerados.
2.2.2.5. Suspensión
Las comunidades planctónicas se encuentran en suspensión, estas comunidades
tienden a hundirse en aguas quietas esto debido a los componentes del protoplasma, las
formas móviles del plancton mantienen cierta posición en el agua. Para el fitoplancton es
esencial no salir del cuerpo de agua por más tiempo que el necesario para fijar
fotosintéticamente una cantidad tal de carbono que compense la que se pierde por
respiración y excreción. Cuando más tiempo permanezca el alga en la zona fótica mayor
será el incremento de biomasa, la salida definitiva de esa zona significa la muerte del alga.
2.3. CLOROFILA-A
La clorofila-a, cuyo nombre químico es (Magnesium[methyl(3S,4S,21R)-14-
ethyl-4,8,13,18-tetramethyl-20-oxo-3-(3-oxo-3-{[(2E,7R,11R)-3,7,11,15-tetramethyl-2-
hexadecen-1-yl]oxy}propyl)-9-vinyl-21-phorbinecarboxylatato(2-)-κ2N,N′]), es un
complejo magnesio-porfirínico compuesto por un tetrapirrol ciclico que posee un anillo
de ciclopentanona, los cuatro átomos de N de los anillos pirrólicos están coordinados con
un átomo de magnesio formando un complejo planar estable, además posee una cadena
de terpenoides constituida por un fitol, que se encuentra esterificado a un residuo de
propianato, sustituyente de uno de los anillos pirrólicos, este fitol de cadena larga,
12
compuesto de cuatro unidades de isopreno, confiere a la molécula de clorofila-a la
característica de ser altamente hidrofóbica, por lo cual se encuentra su presencia en
comunidades fitoplanctónicas en aguas naturales en forma de suspensión.
La clorofila-a es un pigmento fotosintético de las comunidades fitoplanctónicas
predominantes en las plantas y algas verdes en las comunidades acuáticas, principalmente
por su gran eficiencia como fotorreceptores con relacionándose por la presencia alternante
de enlaces simples y dobles en su estructura, existen también pigmentos que presentan
máximos de absorción a longitudes de ondas distintas de la clorofila a y que actúan como
moléculas receptoras de luz suplementarias en regiones del espectro en que las clorofilas
no tienen absorción entre ellos se nombra a los carotenos y a la feofitina molécula de
estructura similar a la clorofila
Figura 2. Estructura Molecular de la clorofila-a

Fuente: Chris P. Schaller, Ph.D.
13
2.4. EUTROFIZACIÓN
La eutrofización es el proceso en el que un cuerpo de agua se enriquece demasiado
con nutrientes, lo que lleva a un crecimiento abundante de comunidades bióticas. El
crecimiento excesivo (o floración) de algas y plancton en un cuerpo de agua son
indicadores de este proceso. La eutrofización se considera una preocupación ambiental
grave, ya que a menudo da como resultado el deterioro de la calidad del agua y el
agotamiento del oxígeno disuelto en los cuerpos de agua.
Figura 3. Diagrama de comparación de una muestra natural y un proceso de

Eutrofización
Fuente: Coial
La eutrofización se puede definir como el enriquecimiento de nutrientes
inorgánicos de las aguas naturales, lo que conduce a una mayor producción de algas y
macrófitos.
El fósforo se considera uno de los principales factores limitantes para el
crecimiento de la vida vegetal en los ecosistemas de agua dulce. Varias fuentes también
afirman que la disponibilidad de nitrógeno es un factor limitante importante para el
crecimiento de las algas.
14
Los fosfatos tienden a adherirse al suelo y son transportados junto con él. Por lo
tanto, la erosión del suelo es uno de los principales contribuyentes al enriquecimiento de
fósforo de los cuerpos de agua. Algunas otras fuentes ricas en fósforo que enriquecen los
cuerpos de agua con el nutriente incluyen:
● Fertilizantes
● Aguas residuales no tratadas
● Detergentes que contienen fósforo
● Vertido de residuos industriales.
Entre estas fuentes, los principales contribuyentes a la eutrofización incluyen la

agricultura y los desechos industriales. El crecimiento excesivo de algas en aguas
eutróficas va acompañado de la generación de una gran biomasa de algas muertas. Estas
algas muertas se hunden hasta el fondo del cuerpo de agua, donde las bacterias las
descomponen y consumen oxígeno en el proceso.
2.5. ESPECTROMETRÍA UV-VIS

La espectrofotometría UV-Visible es una técnica analítica que permite determinar
la concentración de un compuesto en solución, la espectroscopia se debe a la capacidad
de las moléculas para absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro
UV-visible. Las longitudes de onda de las radiaciones que una molécula puede absorber
y la eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura atómica y de las
condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza iónica, constante dieléctrica), por lo que
dicha técnica constituye un valioso instrumento para la determinación y caracterización
de biomoléculas (Díaz, 2005).
La espectroscopia visible es una de las técnicas más extendidas y utilizadas en el
análisis químico. Para que una sustancia sea activa en la luz visible, debe estar coloreada:
una sustancia tiene color porque absorbe ciertas frecuencias o longitudes de onda del
espectro visible y transmite otras. En la espectrofotometría de absorbancia, se utilizan las
regiones ultravioletas (ultravioleta cercano, 195-400 nm) y visible (400-780 nm).
15
Figura 4. Espectro de absorción y cuantificación colorimétrica
Fuente: Mettler Toledo
2.5.1. Ley de Beer
La Ley de Beer es una ecuación que relaciona la atenuación de la luz con las
propiedades de un material. La ley establece que la concentración de una sustancia
química es directamente proporcional a la absorbancia de una solución. La relación se
puede usar para determinar la concentración de una especie química en una solución
usando un colorímetro o un espectrofotómetro. La relación se usa con mayor frecuencia
en la espectroscopia de absorción UV-visible.
La ley de Beer se puede escribir simplemente como:
A = εbc
donde A es la absorbancia (sin unidades)
ε es la absortividad molar con unidades de L mol - 1* cm -1 (anteriormente
denominado coeficiente de extinción).
b es la longitud del camino de la muestra, generalmente expresada en cm.
c es la concentración del compuesto en solución, expresado en mol L-1.
2.6. VALIDACION DE METODOS ANALITICOS

La validación del método Analítico parte del concepto de la norma NTC/ISO/IEC
17025:2018 que es la, “La confirmación, a través del examen y el aporte de evidencias
objetivas, de que se cumplen los requisitos particulares para un uso específico previsto”.
Confirmación mediante examen y suministro de evidencia objetiva de que se cumplen los
requisitos particulares para su uso específico previsto (ISO 8402). La validación de un
16
método analítico es un paso fundamental para asegurar que los resultados son confiables.
Cuando se realiza la validación de un método por parte del laboratorio, lo que se busca es
poder determinar con fundamento estadístico que el método es adecuado para los fines
previstos.
Un método debe validarse cuando es necesario verificar que sus parámetros de
desempeño cumplen en su totalidad la calidad deseada proporcionando seguridad y
respaldo a una investigación analítica, de manera que la validación se efectué en forma
metódica, ordenada, trazable y confiable.
En ese sentido es importante que el laboratorio tenga claridad antes de iniciar la
validación de cuáles son los requerimientos del método para establecer el alcance de la
validación. A partir del concepto de la validación como la confirmación, surgen cuatro
motivos por lo que es necesaria la validación (Duffau et al., 2010):
● Cumplir la normativa NTC/ISO/IEC 17025:2018
● Optimizar los procesos.
● Asegurar la calidad/mejorar la productividad.
● Reducir costos
Al momento de validar un método analítico se requiere actuar mediante
procedimientos correctos entre los que se incluyen; una buena organización funcional;
personal adecuadamente adiestrado en la aplicación del método; instalaciones adecuadas
y suficientes; equipos, reactivos y material de laboratorio apropiado y en perfectas
condiciones para su uso; métodos escritos, actualizados y aprobados. De esta forma se
puede garantizar la calidad de los resultados obtenidos en el laboratorio.
En general, para validar existen 3 tipos de validación:
● Validación Prospectiva: es aquella validación realizada a métodos
analíticos nuevos.
● Validación Retrospectiva: Para métodos analíticos antiguos, pero
que se usan en forma rutinaria y que no han sido validados.
● Revalidación: repetición parcial o total de una validación debido a
cambios efectuados, que puedan afectar a la capacidad del método validado.
De la misma forma el operador que realiza los estudios debe ser técnicamente
competente en el campo de trabajo bajo estudio y debe poseer suficiente conocimiento
17
sobre el trabajo bajo estudio a realizar con el fin de que sea capaz de tomar decisiones
apropiadas de las observaciones hechas mientras proceda el estudio. (Guerrero H, DTA,
2007)
2.6.1. Importancia de Validar un método
El laboratorio debe validar métodos no normalizados, desarrollados o diseñados
por el laboratorio, métodos normalizados usados fuera de su alcance propuesta y
modificaciones de método normalizados para confirmar que los métodos se ajustan al uso
propuesto. La validación del método es necesaria ya que permite conocer los parámetros
del desempeño y proporciona un alto grado de confianza y seguridad en los resultados que
se obtienen.
2.6.2. Cuando realizar una validación
Un método debe validarse cuando sea necesario verificar que los parámetros de
desempeño son adecuados para el uso en un problema analítico específico. Pueden ser de
la siguiente forma:
2.6.2.1. Un nuevo método
Un método establecido usado en un laboratorio diferente o con diferentes analistas
o con diferente instrumentación, para demostrar la equivalencia para dos métodos, es
decir: un método nuevo y uno de referencia.
2.6.2.2. Métodos no normalizados
Corresponden a métodos desarrollados por el laboratorio o método nuevos (por
ejemplo: publicado en revista científica), o bien a métodos que tradicionalmente se han
utilizado en el laboratorio pero que no están normalizados (Duffau et al., 2010).
2.6.2.3. Métodos normalizados
Si bien la norma ISO/IEC 17025 no requiere la validación de los métodos
normalizados aplicados en un laboratorio específico, se establece que se deberán obtener
datos sobre el rendimiento de su propio uso, es decir que resulta apropiado contar con
algún grado de validación.
Para métodos normalizados se debe verificar si la información existente sobre su
validación es adecuada para el propósito requerido y si el laboratorio es capaz de alcanzar
el nivel de rendimiento que se reporta como posible.
18
2.7. PARÁMETROS DE VALIDACIÓN
Para realizar una validación de un método analítico el laboratorio se debe evaluar
cuáles de los parámetros de desempeño del método necesitan ser evaluados con el fin de
validar su método. Los parámetros estudiados para un mejor desempeño del método se
mencionan a continuación
2.7.1. Linealidad
La linealidad es la capacidad de un método de análisis dentro de un determinado
intervalo de dar una respuesta o resultado instrumental que sean proporcionales a la
cantidad de analito que se habrá determinar en la muestra de laboratorio. Se la puede
realizar mediante un gráfico de concentración versus respuesta también llamado curva de
calibración. Se establece cada día con una cierta cantidad de valores formados por un
blanco y los patrones de valores teóricos conocidos en este sentido se recomienda partir
de valores de cero o cercanos al cero y valores superiores.
Después de establecer el comportamiento lineal del método se debe realizar la
curva de calibración graficando los datos de concentración de los estándares (X) versus la
lectura observada (Y) (Duffau et al., 2010).
Figura 5. Curva de calibración, concentración vs respuesta

Fuente: Universidad Autónoma de México (UNAM)
y=ax+b
Para evaluar los estimadores de regresión lineal del gráfico: la pendiente (b), el
coeficiente de correlación (r) y el punto de corte (a) con el eje de las (y).
19
El coeficiente de correlación indica el grado de relación entre la variable
concentración (x) y la variable respuesta (y) de la curva de calibración. Los valores
máximos que puede alcanzar son de -1 y 1, el valor máximo de 1 indica una correlación
positiva perfecta (entre x e y). En la práctica si r tiene un valor cercano a 1 esto significa
que existe correlación con una probabilidad elevada. Para una curva de calibración es
recomendable que el coeficiente de correlación obtenida sea mayor o igual a 0,999 aunque
para trazas se admite un valor igual o mayor que 0,99 (Duffau et al., 2010).
𝑆𝑥𝑦
𝑟= 𝐸𝑐. 1
𝑆𝑥 ∗ 𝑆𝑦
Dónde:
∑𝑛𝑖=1 𝑥𝑖 × 𝑦𝑖
𝑆𝑥𝑦 = − (𝑥 × 𝑦)
𝑛
Para Sx y Sy es:
𝑥𝑖2
𝑆𝑥 = √(( ) − 𝑥 2)
𝑛
𝑦2
𝑆𝑦 = √(( 𝑖 ) − 𝑦 2 )
𝑛
La sensibilidad es el cociente entre el cambio en la indicación de un sistema de

medición y el cambio correspondiente en el valor de la cantidad objeto de la medición.
En una regresión lineal la sensibilidad corresponde a la pendiente (b) de la recta
de calibración se calcula a través de la siguiente fórmula (Duffau et al., 2010).
∑(𝑋𝑖 −𝑋)(𝑌𝑖 −𝑌)
𝑏= ∑(𝑋𝑖 −𝑋)2
𝐸𝑐. 2
Evaluación de la linealidad se realiza con la prueba de t-Student

[𝑟]√(𝑛 − 2)
𝑡𝑟 = 𝐸𝑐. 3
√(1 − 𝑟 2 )
Para probar la correlación lineal se determina con el fin de evaluar la linealidad
del método de estudio.
Para comprobar el Tr con el valor tabulado T tab con un grado de significación del
95% y (n-2) grados de libertad.
20
● Si T r ≥ T tab existe correlación entre los valores de referencia y la respuesta del
método, y el intervalo estudiado no lineal.
● Si T r < T tab no existe correlación entre los valores de referencia y la respuesta del
método, y el intervalo estudiado no lineal.
Para las desviaciones estándar de la pendiente y del interceptó vienen dado por:
𝑆𝑦 ∑𝑖 𝑋𝑖2
𝑥
𝑆𝑏 = 𝑦 𝑆𝑎 = 𝑆𝑦 ∗ √ 𝐸𝑐. 04
√∑𝑖 (𝑋𝑖 − 𝑋)2 𝑥 𝑛 ∗ ∑𝑖(𝑋𝑖 − 𝑋)2
Para determinar los límites de confianza de la media de la curva de calibración se

utiliza la siguiente ecuación, para hallar la desviación estándar de la muestra:
2
𝑆𝑦𝑥 1 (𝐴𝑏𝑠𝑜 − 𝐴𝑏𝑠)
𝑆𝐶𝑜 = ∗√ + 𝐸𝑐. 5
𝑏 𝑛 𝑏 2 ∗ ∑𝑛(𝐶 − 𝐶)2
1 𝑖
Para determinar los límites de confianza de la predicción de la curva de

calibración se utiliza la siguiente ecuación:
2
𝑆𝑦𝑥 1 1 (𝐴𝑏𝑠𝑜 − 𝐴𝑏𝑠)
𝑆𝐶𝑜 = ∗√ + + 𝐸𝑐. 6
𝑏 𝑚 𝑛 𝑏 2 ∗ ∑𝑛(𝐶 − 𝐶)2
1 𝑖
2.7.1.1. Evaluar los resultados y eliminar los resultados anómalos

Para poder garantizar los resultados de mediciones se realiza una evaluación en
este caso la prueba de Grubbs. En una base de datos es probable que se encuentren
resultados inconsistentes comparados con el resto de resultados, a veces se pueden
identificar graficando los datos, aunque es conveniente obtener ensayos estadísticos
objetivos que permitan evaluar si realmente son resultados inconsistentes. La
identificación de estos datos anómalos es importante ya que alteran la estimación de la
media y la desviación estándar.
Una prueba robusta que compara valores extremos con el valor medio y no con
sus valores vecinos es la prueba de Grubbs que utiliza la desviación estándar, la cual es
una medida de variabilidad más eficiente que el rango.
21
𝑋𝑛 − 𝑋
𝐺1,𝑛 = 𝐸𝑐. 7
𝑆
Se calcula un valor G1 para el valor más bajo X1 o más alto de la serie Xn.
● Si G1cal > G1crit el resultado de la prueba es significativo y el dato
evaluado es inconsistente.
● Si G1cal < G1crit se acepta los datos.
2.7.2. Límite de detección (LOD)
De acuerdo a la Guía EURACHEM (2005), bajo la AOAC, el límite de detección
es: “El menor contenido que puede medirse con una certeza estadística razonable. O bien
el menor contenido de analito, si está presente, que será detectado y que puede ser
identificado”.
La ISO utiliza como un término general “valor mínimo detectable de la variable
de estado definida”, de acuerdo a la Guía EURACHEM (2005). El límite de detección no
tiene un criterio de aceptación, ya que depende del propósito de la metodología empleada,
pero se puede determinar con la muestra en concentración cercana al blanco
Se determina a partir de la pendiente de la recta de calibración y de la desviación
estándar de la respuesta Sa.
𝑆𝑎
𝐿𝑂𝐷 = 3,3 ∗ 𝐸𝑐. 8
𝑏
2.7.3. Límite de cuantificación (LOQ)
El límite de cuantificación se puede definir como la cantidad más pequeña de un
analito que se pueda cuantificar confiablemente por el instrumento. Generalmente se
acuerda la cuantificación como la señal para una concentración igual a 10 veces la
desviación estándar del blanco.
También se define por diversas convenciones como la menor concentración de
analito en una muestra que puede ser determinada con un aceptable nivel de incertidumbre
(Guía EURACHEM, 2005).
Se determina a partir de la pendiente de la recta de calibración y de la desviación
estándar de la respuesta (Sa).
𝑆𝑎
𝐿𝑂𝑄 = 10 ∗ 𝐸𝑐. 9
𝑏
22
2.7.4. Sensibilidad Analítica
La sensibilidad analítica es la variación de la respuesta del instrumento que
corresponde a una variación de la magnitud medida (por ejemplo, una concentración de
analito), es decir, el gradiente de la curva de respuesta.
Según las diferentes guías de validación la sensibilidad está dada por la pendiente
de la curva de calibración y representa la variación de la respuesta del instrumento que
corresponde a una variación de la concentración de analito.
𝑦 = 𝑎 + 𝑏𝐶
𝑑𝑦 ∆𝑦
𝑏= 𝑏=
𝑑𝐶 ∆𝐶
Mientras la pendiente de la curva de calibración permanece constante la
sensibilidad es constante, mayor pendiente significa mayor sensibilidad.
Se dice, que un método es sensible cuando una pequeña variación de concentración
determina una gran variación de respuesta. La sensibilidad permite observar la capacidad
de respuesta instrumental frente a una determinada cantidad de analito. En el tiempo,
visualiza cómo se comporta el instrumento.
2.7.5. Intervalo de trabajo
Es el intervalo en el cual el método proporciona resultados con una incertidumbre
aceptable, de acuerdo con los propósitos de aplicación del método. Es el intervalo entre el
nivel más bajo y más alto de concentración que ha sido demostrado que puede ser
determinado con la precisión y exactitud requeridas para una determinada matriz. Se
expresa en el siguiente gráfico.
Figura 6. Intervalo de trabajo, rango dinámico y rango lineal

Fuente: https://www.secyta.es/es/node/37
23
2.7.6. Selectividad
Capacidad de un método para cuantificar exactamente un analito en presencia de
interferencias (OAA – IUPAC). La selectividad es validada por la comparación de las
inclinaciones de las curvas de adición de patrón. Se dice que un método es selectivo
cuando es sensible a varios componentes.
Un interferente es una sustancia que causa un error sistemático en la determinación
del analito. Este error sistemático puede ser constante o proporcional. En la Selectividad
se puede evaluar o minimizar el efecto del interferente. Es necesario distinguir entre el
analito e interferente, como ser:
● Separación
● Enmascaramiento
● Optimización de condiciones
● Evaluar el efecto matriz (recuperación)
● Analizar blancos, Analizar muestras con agregado del analito,
Analizar muestras con el agregado del/de los interferente/s.
● Examinar los efectos de la supresión o agregado de interferentes.
2.7.7. Precisión
Grado de concordancia entre resultados obtenidos en mediciones repetidas de un
mismo objeto o de objetos similares, bajo condiciones especificadas. La precisión de un
método puede establecerse a partir de la repetibilidad y reproducibilidad de los resultados.
Figura 7. Diferencia entre Precisión y Exactitud

Fuente: Iván Pérez Olguin
2.7.8. Precisión intermedia
La precisión intermedia es donde se varía las condiciones de variación intermedia,
entre ellas mismo laboratorio, mismo método, mismas muestras. Puede variar equipos,
analista o tiempo (distintos días y condiciones ambientales).
24
2.7.9. Repetibilidad
Es la precisión bajo las condiciones de repetibilidad, es decir, condiciones donde
los resultados de análisis independientes se obtienen con el mismo método, mismo
laboratorio por el mismo operador utilizando el mismo equipamiento dentro de los
intervalos cortos de tiempo (Rodríguez, 2010).
La repetibilidad de un método es la proximidad de concordancia entre los
resultados de mediciones sucesivas del mismo mensurando realizadas bajo las mismas
condiciones de medición.
El cálculo para la determinación de repetibilidad es a través de las siguientes
fórmulas:
1
𝑆𝑟 = √𝑛−1 ∑𝑛𝑘=1(𝑥𝑘 − 𝑥𝑖 )2 Ec. 11
Dónde:
𝑆𝑟 = desviación estándar de la repetibilidad; 𝑥 = Promedio de lecturas realizadas;
n = número de lecturas realizadas; x = muestra.
Para comparar la dispersión (variación) de los conjuntos de datos de medidas,
utilizamos la siguiente ecuación:
𝑆𝑟
%𝐶𝑉𝑟 = ∗ 100% 𝐸𝑐. 12
𝑥
Dónde:
%𝐶𝑉𝑟 = coeficiente de variación; 𝑆𝑟 = desviación estándar de la repetibilidad; 𝑥=
promedio
2.7.10. Reproducibilidad
La reproducibilidad puede ser expresada cuantitativamente como la desviación
estándar de los resultados obtenidos por distintos laboratorios en los resultados de los
mismos ensayos, prueba o análisis o por el mismo analista, pero en distintos días variando
el instrumento de medición, patrón de referencia, distinto laboratorio, condiciones
ambientales (Mamani, 2016; ISO 17025).
El cálculo para determinar la reproducibilidad es a través de la siguiente ecuación:
𝑛
1
𝑆𝑅 = √ ∑(𝑥𝑘 − 𝑥𝑖 )2 𝐸𝑐. 13
𝑛−1
𝑘=1
25
Dónde:
𝑆𝑅 = desviación estándar de la repetibilidad; 𝑆𝑅2 = Reproducibilidad.
Para comparar la dispersión (variación) de los conjuntos de datos de medidas,
utilizamos la siguiente ecuación:
𝑆𝑟
%𝐶𝑉𝑟 = ∗ 100% 𝐸𝑐. 14
𝑥
Dónde:
%𝐶𝑉𝑟 = coeficiente de variación; 𝑆𝑟 = desviación estándar de la repetibilidad; 𝑥=
promedio
Para el porcentaje de la relación entre la repetibilidad y la reproducibilidad es
calculada mediante la siguiente ecuación: (llamosa et. al. 2007/ISO 17025)
𝑟&𝑅 = √%𝐶𝑉𝑟 2 + %𝐶𝑉𝑅 2 𝐸𝑐. 15
Dónde:
r&R = Porcentaje de relación entre la reproducibilidad y repetibilidad; %𝐶𝑉𝑟 2 =
coeficiente de variación de la repetibilidad; %𝐶𝑉𝑅 2 = coeficiente de variación de la
reproducibilidad.
Los resultados obtenidos se interpretan según Llamosa et.al. (2007) por medio de
los siguientes criterios:
● Si %R&R < 10% el sistema de medición es aceptable
● Si 10% ≤ %r&R <30% el sistema de medición puede ser aceptable
según su uso, aplicación, costo, costo del instrumento de medición y costo de
reparación.
● Si %r&R > 30% el sistema de medición es considerado como no
aceptable y requiere de mejoras en cuanto al operador, equipo, método,
condiciones y otros.
2.7.11. Exactitud
El término “exactitud” está aplicado a un conjunto de resultados de un ensayo, y
supone una combinación de componentes aleatorios y un componente común de error
sistemático o sesgo.
Al ser aplicado a un método de ensayo, la exactitud se refiere a la combinación de
veracidad y precisión. Se puede ejemplificar de acuerdo a la figura 8, los círculos
26
equivalen al rango en que se espera el valor de referencia, y los puntos a los resultados
analíticos. Mientras más veraz y preciso sea, el método tendrá una exactitud alta.
EURACHEM (2005)
.Figura 8. Diagrama de exactitud en función de la veracidad

Fuente: Dr. Shoury Kuttappa
2.7.12. Sesgo
Es la diferencia entre la expectativa relativa a los resultados de un ensayo o una
medición y un valor verdadero. En la práctica el valor convencional de cantidad puede
sustituir el valor verdadero. El sesgo es el error sistemático total en contraposición al error
aleatorio.
Para determinar el sesgo puede utilizarse material de referencia, material
fortificado, material de control, material ensayo de aptitud: Para este fin se debe medir un
analito de concentración conocido y se determina la diferencia en valor absoluto entre el
valor conocido y la media del valor obtenido una diferencia sistemática importante en
relación al valor de referencia aceptado se refleja en un mayor valor del sesgo, cuanto más
pequeño es el sesgo, mayor veracidad indica el método (Duffau et al., 2010).
Para calcular el sesgo es a través de la siguiente ecuación:

𝑆 = 𝑥 − 𝑥𝑎 𝐸𝑐. 16
Dónde:
S = Es el sesgo, 𝑥 =Es valor promedio de las lecturas, 𝑥𝑎 Es el valor asignado,
valor de material de referencia certificado o valor esperado.
27
Para evaluar el valor del sesgo se debe se debe realizar la prueba t Student, en el
cual el 𝑡𝑐𝑎𝑙 ˂𝑡𝑡𝑎𝑏 .
[𝑥𝑎 − 𝑥]
𝑡𝑐𝑎𝑙 = 𝐸𝑐. 17
𝑠 ∗ √𝑛
Dónde:
𝑡𝑐𝑎𝑙 = Valor calculado; 𝑥 = Es valor promedio de las lecturas; 𝑥𝑎 = Es el valor
asignado, valor de material de referencia certificado o valor esperado; s = Desviación
estándar; n =Numero de lecturas realizadas
2.7.12.1. Porcentaje de Recuperación
Es la fracción de la sustancia agregada a la muestra antes del análisis, al ser
analizadas muestras fortificadas y sin fortificar.
La recuperación permite ver el rendimiento de un método analítico en cuanto al
proceso de extracción y la cantidad de analito existente en la muestra original. Por lo cual
la recuperación está intrínsecamente relacionada a las características de la matriz de la
muestra (Duffau et al., 2010).
Se la calcula a través de la siguiente ecuación:
𝐶𝑒 − 𝐶𝑜
𝑅= 𝐸𝑐. 18
𝐶𝑎
Dónde:
R =recuperación; 𝐶𝑒 = Es concentración de analito de la muestra enriquecida; 𝐶𝑜
= Es la concentración del analito medido en la muestra sin adicionar; 𝐶𝑎 = Es la
concentración del analito adicionado a la muestra enriquecido.
Se puede igualmente expresar en porcentaje de recuperación (%R) y se la calcula
de la siguiente manera:
%𝑅 = 𝑅 × 100% 𝐸𝑐. 19
Para evaluar la recuperación se realiza la prueba t, en la cual 𝑡𝑐𝑎𝑙 ˂𝑡𝑡𝑎𝑏 .
[100−%𝑅]
𝑡𝑐𝑎𝑙 = 𝐸𝑐. 20
𝑠×√𝑛
Dónde:
𝑡𝑐𝑎𝑙 = Valor calculado; R = recuperación; s = Desviación estándar; n =Número de
lecturas realizadas.
28
También se puede realizar el cálculo para la determinación del error relativo, la
ecuación es la siguiente:
(𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑑𝑜 − 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑎𝑙)
% 𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 = 𝑥 100 𝐸𝑐. 21
𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑟𝑒𝑎𝑙
Para el criterio de aceptación, consideramos la siguiente hipótesis:

● Si 𝑡𝑐𝑎𝑙 ˃𝑡𝑡𝑎𝑏 hay diferencia estadísticamente significativa, los
resultados reportados deberán ser corregidos.
● Si 𝑡𝑐𝑎𝑙 ≤ 𝑡𝑡𝑎𝑏 No hay diferencia estadísticamente significativa, no
es necesario hacer una corrección.
2.7.13. Robustez
Es una medida de la capacidad de un procedimiento analítico de no ser afectado
por variaciones pequeñas pero deliberadas de los parámetros del método proporciona una
indicación de la fiabilidad del procedimiento en un uso normal. En este sentido la prueba
de la robustez es optimizar el método analítico desarrollado o implementado por el
laboratorio y describir bajo qué condiciones analíticas (incluidas sus tolerancias) se
pueden obtener a través de estos resultados confiables. Un método de ensayo es más
robusto entre menos se vean afectados sus resultados frente a una modificación de las
condiciones analíticas. (Mamani, 2016; ISO 17025)
Para su determinación se puede considerar lo siguiente:
● Conocer las condiciones ambientales.
● Definir las condiciones que afectan al método de ensayo.
● Seleccionar el objetivo de evaluación de la conformidad a ser
utilizado, muestras referencia y las muestras a determinar.
● Realizar mediciones bajo las condiciones modificadas.
2.7.13.1. Test Youden y Steiner
Para realizar la determinación de la robustez de un método analítico químico se
aplica el test Youden y Steiner. Este procedimiento permite evaluar el efecto de siete
variables con solo ocho análisis de una muestra. Para proceder a realizar el estudio de
robustez se debe identificar aquellos factores del método que posiblemente afectarían los
resultados finales obtenidos a través de estas.
29
Para estudiar la robustez se procede a exponer a cada factor a un estudio variable,
cada variable se estudia mediante un valor alto (A, B, C) y otro bajo (a, b, c). Los factores
a estudiar no deben ser necesariamente siete, puede considerarse un número menor de
variables, esto no afectará el balance del diseño del experimento, pero es importante
considerar que siempre se deben llevar a cabo las ocho pruebas de ensayo indicadas. Los
resultados de la experiencia analítica obtenidos con las variaciones realizadas en estas
ocho pruebas se representan con las letras s hasta la z (JI Pacheco Conde, 2018).
A partir de los resultados puede calcularse el efecto de cada una de las variables haciendo
la media de los cuatro análisis que contienen la variable en su valor más alto (mayúscula).
Así para evaluar el efecto de la primera variable obsérvese que:
(𝑠 + 𝑡 + 𝑢 + 𝑣) 4𝐴
= = 𝐴 𝐸𝑐. 22
4 4
(𝑤 + 𝑥 + 𝑦 + 𝑧) 4𝑎
= = 𝑎 𝐸𝑐. 23
4 4
Es decir, la medida de los resultados (s+t+u+v) equivalen a “A” porque las seis
restantes variables presentes en estos cuatro resultados se anulan entre sí como
consecuencia de que existen siempre dos mayúsculas y dos minúsculas de cada variable.
Análogamente la media de los resultados (w+x+y+z) equivalen “a”. Para cualquier otra
variable se puede proceder de manera similar, tal como muestra la tabla siguiente:
Tabla 2. Prueba de robustez de Youden y Steiner
Nro. de Nro. de análisis experimentales
variable 1 2 3 4 5 6 7 8
1 A A A A a a a a
2 B B B b B b b b
3 C c C c C c C c
4 D D d d d d D D
Resultado s t u v w x y z
Fuente: Lutz Grohmann

Se deben establecer las siete comparaciones posibles, es decir las diferencias entre
la variable de mayor valor versus la de menor valor.
(𝐴 − 𝑎), (𝐵 − 𝑏), (𝐶 − 𝑐), (𝐷 − 𝑑),
30
De este modo se puede conocer el efecto de cada variable. En este sentido cuanto
mayor sea la diferencia de los resultados entre el valor mayor y el valor menor (∆= X-x),
mayor influencia tendrá dicha variable en el método analítico.
Como criterio de aceptación para la robustez del método se considera que la
diferencia entre el valor alto y valor bajo sea superior a √2 de la desviación estándar de la
precisión del método (𝑆), es decir:
(𝑋 − 𝑥) < √2 ∗ 𝑠 𝐸𝑐. 24
2.7.14. Incertidumbre
Es la duda razonable que se tiene sobre los resultados de una medición. Se
considera como un parámetro asociado con el resultado de una medición, que caracteriza
la dispersión de los valores que podrían ser razonablemente atribuibles al mesurando
(GUM) (WOÁ Garcés, 2018).
Es importante que, para un método validado o verificado por el laboratorio, se
realice la determinación de las diferentes fuentes o componentes de la incertidumbre de la
medición presentes:
● Muestreo
● Efectos de la muestra: tipo de matriz, almacenamiento, etc.
● Sesgos Instrumentales: Características de los equipos utilizados
para realizar las medidas.
● Pureza de Reactivos: materiales de referencia, preparación de
estándares.
● Analista: Las debidas a la serie de mediciones.
● Condiciones de medición: Las debidas al certificado de calibración:
en él se establecen las correcciones y las incertidumbres asociadas a ellas, para un
valor de k determinado, en las condiciones de calibración. Ejemplo: material
volumétrico, etc.
● Condiciones de medición: temperatura, humedad, etc.
● Otras: Método (por ejemplo, al interpolar en una recta), tablas (por
ejemplo, las constantes), pesada, alícuota, efectos computacionales, etc.
31
2.7.14.1. Incertidumbre Tipo A: Es la “evaluación de la incertidumbre de una
medición mediante un análisis estadístico de los valores de las cantidades
medidas obtenidas en condiciones definidas”, no se conoce el valor verdadero
o de referencia del mensurando, éste se determina con la media de la serie de
medidas y la incertidumbre está sobre la base de la desviación estándar.
2.7.14.2. Incertidumbre Tipo B: No se obtiene por mediciones repetidas, este tipo de
incertidumbre se basa en información externa (manuales, certificados, etc.) u
obtenida por experiencias tales como:
• Resultados de mediciones anteriores.
• Experiencia o conocimientos generales sobre el comportamiento y las
propiedades de los materiales e instrumentos utilizados.
• Especificaciones del fabricante.
• Datos suministrados por certificados de calibración u otros tipos de
certificados.
• Incertidumbres asignadas a valores de referencias procedentes de libros y
manuales.
2.7.14.3. Incertidumbre combinada: Es una estimación de la desviación estándar
total, y es igual a la raíz de la varianza total obtenida por combinación de todos
los componentes de la incertidumbre, se obtiene por reglas de propagación de
errores.
2.7.14.4. Incertidumbre expandida: Proporciona el intervalo en el cual el valor de la
medida (valor verdadero) se encontrará con un alto nivel de confianza. Se
obtiene por la multiplicación de la incertidumbre estándar combinada por un
factor de cubrimiento k (k = 68,7%; k = 95%; k = 99,7%).
𝑥 = 𝑥 ± 𝑘𝑆𝑐 𝐸. 25
32
CAPÍTULO 3
3. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
3.1. MUESTREO
La muestra fue recolectada de la laguna Alalay del departamento de Cochabamba,
es una laguna de agua subandina de Bolivia situada en el este de la ciudad de Cochabamba
en el departamento homónimo perteneciente a la cuenca del Rio Rocha, a 17°24′27″
latitud sur y 66°08′20″ longitud oeste.
Figura 9. Imagen Satelital de la Laguna Alalay en la Ciudad de Cochabamba-Bolivia

Fuente: Google Earth enero 2020
33
Figura 10. Punto de muestreo
Fuente: Elaboración Propia
3.1.1. Tratamiento de la muestra
El protocolo de muestreo es un proceso determinado para la selección, extracción,
preservación, transporte y preparación de las porciones a ser removidas de una población
para que se empleen como muestras de estudio.
La manera correcta de muestreo y medición de campo de ciertos parámetros
fisicoquímicos son criterios fundamentales en los resultados de gestión de calidad y una
interpretación confiable de datos.
Los instrumentos necesarios para realizar el muestreo son:

● Botellas Ámbar de vidrio para muestras
● Container para las muestras
● Refrigerantes
● Hoja para tomar datos
● pH metro y termómetro
● GPS
34
La importancia del muestreo en aguas se especifica en la localización del sitio
donde se va a recolectar la muestra, donde debe ser registrada usando un sistema de
posicionamiento global (GPS), indicando puntos de referencia de muestreo para poder
proceder a las mediciones correspondientes de pH y temperatura, además del correcto
almacenamiento mediante refrigeración evitando de esta manera el deterioro de la
muestra.
3.1.2. Toma de muestra
Una toma de muestra de agua se debe realizar con delicadeza y mucho cuidado,
dado que una toma inadecuada puede alterar los resultados analíticos y su interpretación,
la muestra debe ser recolectada en envases que cumplan un tratamiento previo de limpieza
y esterilización siguiendo los protocolos de laboratorio, protocolos que tiene establecido
el Instituto Boliviano de Metrología (IBMETRO)
Los envases utilizados tenían una capacidad volumétrica de 1 L aproximadamente,
de material de vidrio ámbar y de esta manera evitar que la adsorción ejercida por sus
paredes sea mínima sobre cualquiera de los componentes presentes en la muestra, además
del cuidado de la degradación de la clorofila-a en la muestra recolectada, el tipo de muestra
que se realizó fue simple en un lugar determinado para su análisis individual.
En el momento de tomar la muestra, los envases deben ser enjuagados tres veces
con el agua a analizar y ser llenados completamente sin cámara de aire para no alterar la
muestra y controlando el intervalo de pH para aguas naturales en un rango de 6-8. Todas
las muestras en el proceso de traslado se conservaron en refrigeración para evitar su
deterioro y fueron recolectadas en frascos de vidrio Ámbar. Las mediciones de clorofila-
a se realizaron en los laboratorios de la Unidad de Metrología Química del Instituto
Boliviano de Metrología (IBMETRO).
3.2. TIPO DE INVESTIGACIÓN

El presente estudio presenta una investigación de tipo experimental cuantitativa y
estadística.
Previamente se realizó un estudio teórico en temas de validación y la metodología
correspondiente a la norma ISO 10260:1992 protocolo establecido para la determinación
espectrofotométrica de clorofila-a en aguas naturales, normas con protocolos de
35
validación como la ISO/IEC 17025:2018, la norma NB/ISO 5725 e indicadores de
ambientales de la OECD, además del tratamiento estadístico correspondiente. Los
cálculos y tratamientos estadísticos fueron realizados en el programa Microsoft Excel para
la elaboración de las tablas y gráficos, de esta manera se validó el método para el análisis
de clorofila-a por espectroscopia UV-VIS en aguas naturales e implementarlo en el
laboratorio de la Unidad Metrológica de Química perteneciente a la Dirección
Metrológica Industrial y Científica (DMIC) en el Instituto Boliviano de Metrología
(IBMETRO).
3.3. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS

Los equipos y reactivos empleados durante el desarrollo de investigación, se
presenta en la siguiente tabla detalladamente.
Tabla 3. Equipos y materiales utilizados
EQUIPO CARACTERÍSTICA UBICACIÓN

Cary 100 Agilent Technologies,
fuente de luz Halógeno de
Espectrofotómetro UV-VIS IBMETRO
tungsteno, Alcance 280-800 nm
C.I. Q-PT-06
Starna Scientific alcance 400-640
Set 7 filtros de densidad neutra IBMETRO
nm C.I. Q-PR-27
Meter Toledo XS 204 alcance
Balanza Analítica IBMETRO
máximo 220 g C.I. Q-EM-01
EXTECH INSTRUMENTS
Termohigrobarómetro IBMETRO
SD700 C.I. Q-EA-12
HAFNER EA Alcance 50g/100g
Set de pesas IBMETRO
C.I. Q-PR-01
Sartorius STAT-PEN-dc/ystp01
Desmagnetizador IBMETRO
C.I. Q-EA-20
GENERAL ELECTRIC
Refrigerador GTE17HBWMRWW C.I. Q-EA- IBMETRO
10
36
LMC-Alemania, Gay Lussac, C.I.
Picnómetro 25 mL IBMETRO
IBM-QMC-149
LMS-Alemania, Clase B, C.I.
Probeta graduada de 100 mL IBMETRO
IBM-QMC-087
ISOLAB-Alemania, C.I. IBM-
Matraz Aforado de 100 mL IBMETRO
QMC-163
ISOLAB-Alemania, Clase A, C.I.
IBM-QMC-007
IBM-QMC-008
IBM-QMC-012
IBM-QMC-014
Matraz aforado de 25 mL IBM-QMC-020 IBMETRO
IBM-QMC-020
IBM-QMC-139
IBM-QMC-140
IBM-QMC-145
IBM-QMC-148
EPPENDORF-Alemania, Clase
Micropipeta de 5000 uL IBMETRO
A, C.I. IBM-QMC-161
BRAND-Alemania, Clase A, C.I.
Micropipeta de 100 uL IBMETRO
IBM-QMC-162
Vasos de precipitado BOECO-Alemania, Boro 3.3 IBMETRO
ISOLAB-Alemania, Boro 3.3-
Matraz Erlenmeyer de 250 mL IBMETRO
EuroLab-Alemania Boro 3.3
Frascos ámbar de 50 y 100 mL No aplica IBMETRO
Corning™ 352099 capacidad de
Tubos Falcon IBMETRO
50 mL y 15 mL
Bomba de vacío de diafragma,
Bomba de vacío IBMETRO
modelo TC-100A, C.I. Q-OE-11
Sistema de filtración No Aplica IBMETRO
37
Centurion Scientific PRO-
Centrifugadora RESEARCH.K2015 Alcance 0- IBMETRO
4000 RPM C.I. Q-EA-44
PolyScience 8006A12E C.I. Q-
Baño termostático IBMETRO
EA-01
ELGA LabWater MICXXXXM1
Purificador de Agua IBMETRO
C.I. Q-EA-09
No indica, Alcance de Medición -
Termómetro 10◦C hasta 250◦C, C.I. IBM- IBMETRO
QMC-170
Tabla 4. Reactivos utilizados
REACTIVO CARACTERÍSTICA UBICACIÓN
Alcohol etílico al 96 % EASBA IBMETRO
0,45 µ tamaño de poro y

Filtros de membrana IBMETRO
47 mm de diámetro
MERCK, pureza al 37%
Ácido clorhídrico IBMETRO
p.a.
Sistema de purificación
Agua destilada IBMETRO
de agua
Sistema de purificación
Agua tipo 1 IBMETRO
de agua
3.4. METODOLOGÍA ANALÍTICA

Para el procedimiento analítico todos los materiales de vidrio utilizados en el
laboratorio fueron lavados con agua destilada y antes de ser usados se lavaron tres veces
con agua destilada y tres veces con solución de alcohol etílico al 90%, concentración del
solvente que se utiliza en el método de análisis.
38
3.4.1. Preparación de la solución patrón de Clorofila-a
Para la preparación de la solución patrón de clorofila-a se utilizó alga unicelular
azul verdosa sólida disolviendo en etanol al 90%. Se pesó con exactitud una masa de
1,0001 g ± 0,0001 g de alga unicelular azul verdosa sólida y se disolvió en 0,25 L de
etanol al 90% en un matraz aforado del mismo volumen hasta el aforo, por cada gramo de
este sólido contenía 0,075 g de clorofila-a. Obteniendo así una concentración madre de
clorofila-a de 3000 ug/L.
3.4.2. Preparación de la muestra para la extracción.
Se prepara una solución de etanol al 90%, posteriormente se filtra las muestras de
agua recolectadas con suspensiones de algas y cianobacterias con filtros de membrana de
0,45 µ tamaño de poro y 47 mm de diámetro. Una vez obtenido el filtrado se trasladó a un
tubo falcón, recubierto con papel aluminio y se añadió 15 mL de etanol al 90%, se llevó a
un agitador vortex en un tiempo de 5 seg, posteriormente se lleva a un baño termostático
a una temperatura de 70 ℃ por un tiempo de 5 min.
3.4.3. Obtención de solución clarificada.
la solución extraída se deja reposar por un tiempo de 15 min, se retira el filtro y
posteriormente el tubo falcón se traslada a un centrifugado a 3000 rpm por un tiempo de
5 min, una vez la solución clarificada se filtra y se traslada a otro tubo falcón.
3.4.4. Determinación de clorofila a por espectroscopia UV-VIS.
Las lecturas en el espectrofotómetro de UV-VIS se realiza a absorbancias de 665
y 750 nm, para la obtención del zero se realiza con la solución de solvente de etanol al
90%, primeramente, se realiza la lectura de la solución clarificada y posteriormente se
acidifica la muestra añadiendo 3,5 L de ácido clorhídrico 3M y se realiza la lectura
después de 5 min de la acidificación de la solución clarificada.
Para realizar los cálculos y encontrar la cantidad cuantitativa de clorofila en
muestras de agua natural, utilizamos la siguiente fórmula:
(𝐴 − 𝐴𝑎 ) 𝑅 1000 ∗ 𝑉𝑒
𝐶𝐶ℎ𝑙𝑜𝑟𝑜𝑝ℎ𝑦𝑙𝑙−𝑎 = ∗ ∗
𝐾𝑐 𝑅−1 𝑉𝑠 ∗ 𝑑
39
Donde:
o C chlorophyll-a: Concentración de clorofila hallada
o 𝑨 = 𝑨𝟔𝟔𝟓 − 𝑨𝟕𝟓𝟎 Diferencia de absorbancias de los extractos antes de la
acidificación.
o 𝑨𝒂 = 𝑨𝟔𝟔𝟓 − 𝑨𝟕𝟓𝟎 Diferencia de absorbancias del extracto después de la
acidificación.
o Kc: Coeficiente de absorción espectral de la clorofila-a, con un valor de 82
I/𝜇𝑔*cm
o R: Es la relación de transferencia de clorofila-a a feofitina por
acidificación, con un valor de 1,7.
o Ve: Volumen del extracto, en unidades de mL.
o Vs: Volumen del filtrado, en unidades de L.
o d: Longitud del recorrido de la celda óptica.
3.4.5. Determinación de linealidad
Para determinar la linealidad del método se realizaron los siguientes pasos.
● Se prepara una curva de calibración de un rango de concentración
de (5-300 g/L de Chl-a), con el objetivo de obtener un coeficiente de
correlación mayor o igual a 0,999.
● Se calcula el coeficiente de correlación, intercepto, pendiente,
Test de Grubbs y gráfica de residuos.
3.4.6. Determinación de sensibilidad analítica
● Para determinar la sensibilidad analítica del método
espectrofotométrico para el análisis de clorofila-a, se empleó mediante la
determinación de regresión lineal y la pendiente de la curva y se calculó a partir
de los datos de estudio de linealidad.
3.4.7. Determinación de límite de detección y cuantificación.
● Para determinar el límite de detección y de cuantificación del
método espectrofotométrico para el análisis de clorofila-a, se empleó mediante la
determinación de regresión lineal y se calculó a partir de los datos de estudio de
linealidad.
40
3.4.8. Determinación de selectividad
Para determinar la selectividad, se efectúa si es selectivo el método para la
determinación de clorofila en presencia de varios componentes en la matriz.
● Se preparó una muestra de feopigmentos de concentración
conocida.
● Se realizó mediante el método de adición de estándar por una curva
de calibración, una muestra con la adición de una solución de feopigmentos en
clorofila-a y una solución de clorofila-a.
● Se realizaron tres réplicas por nivel de concentración en cada
grupo.
● La selectividad es validada por la comparación de inclinaciones de
las curvas de adición y el factor de recuperación.
● Para los cálculos se realizó en la T-Student mediante el factor de
recuperación, como criterio de aceptación.
3.4.9. Determinación de repetibilidad y precisión
Para la determinación de precisión se realizó, en función de la repetibilidad.
● Se determinó la concentración de la muestra realizando 7 réplicas
en diferentes horas.
● Se consideró para la repetibilidad la misma muestra, el mismo
laboratorio, el mismo material, los mismos reactivos, las mismas condiciones
ambientales y el mismo analista.
● Los cálculos que se realizó fueron mediante el análisis de prueba F,
además de hallar el límite de repetibilidad.
3.4.10. Determinación de precisión intermedia
● Para determinar la precisión intermedia del método de análisis por
espectroscopia, se realizó mediciones en dos diferentes días, utilizando un cambio
en el tiempo de acidificación y las condiciones ambientales.
3.4.11. Determinación de reproducibilidad
● Para determinar la Reproducibilidad en la metodología del análisis
de clorofila-a se realizó mediciones en diferentes días, en un total de 4 días, con la
41
misma muestra, el mismo laboratorio, el mismo material, los mismos reactivos, el
mismo analista, pero diferentes condiciones ambientales.
● Para el criterio de aceptación se empleó la norma IATF 16949
3.4.12. Determinación de sesgo y exactitud
Para la determinación de la exactitud, se realizó en función del sesgo.
● Preparamos un grupo de muestra que contiene la matriz en 3 puntos
dentro de nuestra curva de linealidad y determinamos su concentración.
● Preparamos otro grupo de muestra que contiene la matriz a una
concentración conocida al primer grupo y determinamos sus concentraciones.
● Calculamos el porcentaje de recuperación y recuperación aparente.
3.4.13. Determinación de robustez
Para el estudio de robustez se plantea un estudio de cuatro variables, es decir se
realiza una variación respecto a la establecida en el método analítico con ocho pruebas de
ensayo para cada variable, para realizar este análisis se aplica el Test Youden y Steiner y
se determina, si las diferencias empleadas tienen un efecto significativo. Las variables
seleccionadas para el estudio son:
● Volumen de Solvente
● Temperatura del baño Termostático
● Tiempo de acidificación en la muestra clarificada
● Cantidad de Volumen de HCl (solución que se utiliza para la
acidificación)
3.4.14. Determinación de Incertidumbre
● Para determinar la incertidumbre de tipo A, se realizó a partir de
cálculos obtenidos de las muestras del rango de trabajo mediante el intervalo de
confianza con los resultados y mínimos obtenidos.
● Para determinar la incertidumbre tipo B, se consideró toda variable
en la metodología de análisis y determinar las variables que llegan a influir.
● Finalmente se calcula la incertidumbre expandida de la
concentración de clorofila.
42
CAPÍTULO 4
4. RESULTADOS Y DISCUSIONES
La validación del método analítico comprende la realización de varias pruebas con
la muestra recolectada de la laguna Alalay de Cochabamba y una solución patrón de
Clorofila a partir de una sal de alga unicelular azul verdosa sólida.
Para demostrar el alcance y las limitaciones del método analítico, se desarrollaron
utilizando análisis estadísticos para determinar los parámetros de validación del método.
4.1. Resultados de la Linealidad
La siguiente tabla resume los resultados estadísticos hallados para determinar la
linealidad a través de la pendiente (b), intercepto (a), coeficiente de correlación r2.
Se realizó la evaluación de la precisión de los puntos de calibración usando el
estadístico Test de Grubbs, para el test de Grubbs se utilizó la ecuación 7 del capítulo II.
Para el test de Grubbs (G) utilizamos la ecuación 07.
𝑋𝑛 − 𝑋
𝐺1,𝑛 = 𝐸𝑐. 7
𝑆
Se calcula un valor G1 para el valor más bajo X1 o más alto de la serie Xn.
Los resultados fueron los siguientes.
test de Grubbs
Concentración 5 g Chl-a/L
Muestra Muestra
Abs
Clarificada Acidificada Tabla
Grubbs Grubbs Evaluación
Abs Abs Abs Abs 95%
A Aa A-Aa
(665) (750) (665) (750)
0,002 0,000 0,001 0,002 Valor

0,0002 0,0013 0,0009 1,155 1,155
5 3 5 2 aceptado
0,002 0,000 0,001 0,002 Valor

0,0002 0,0012 0,0008 0,577 1,155
4 4 4 0 aceptado
0,002 0,000 0,001 0,002 Valor

0,0001 0,0014 0,0008 0,577 1,155
6 4 5 2 aceptado
promedio 0,0008
desviación
0,0001
estándar
43
test de Grubbs
Muestra Muestra
Abs
Abs Abs Abs Abs 95%
A Aa A-Aa
(665) (750) (665) (750)
Valor
0,0138 0,0013 0,0090 0,0003 0,0125 0,0087 0,0038 1,072 1,155
aceptado
Valor
0,0137 0,0012 0,0082 0,0003 0,0125 0,0079 0,0046 0,907 1,155
aceptado
Valor
0,0136 0,0012 0,0082 0,0001 0,0124 0,0081 0,0043 0,165 1,155
aceptado
promedio 0,0042
desviación
0,0004
estándar

test de Grubbs
Muestra Muestra
Abs
Abs Abs Abs Abs 95%
A Aa A-Aa
(665) (750) (665) (750)
Valor
0,0257 0,0004 0,0183 0,0015 0,0253 0,0168 0,0085 1,155 1,155
aceptado
Valor
0,0260 0,0004 0,0188 0,0015 0,0256 0,0173 0,0083 0,577 1,155
aceptado
Valor
0,0258 0,0004 0,0187 0,0016 0,0254 0,0171 0,0083 0,577 1,155
aceptado
promedio 0,0084
desviació
n 0,00012
estándar
44
test de Grubbs

Muestra Muestra
Abs
Abs Abs Abs Abs 95%
A Aa A-Aa
(665) (750) (665) (750)
Valor
0,0548 0,0048 0,0377 0,0046 0,0500 0,0331 0,0169 0,577 1,155
aceptado
Valor
0,0547 0,0045 0,0376 0,0042 0,0502 0,0334 0,0168 1,155 1,155
aceptado
Valor
0,0550 0,0047 0,0378 0,0044 0,0503 0,0334 0,0169 0,577 1,155
aceptado
promedio 0,0169
desviación
5,8E-05
estándar

test de Grubbs

Muestra Muestra
Abs Tabla
Clarificada Acidificada
Abs Abs Abs Abs 95%
A Aa A-Aa
(665) (750) (665) (750)
Valor
0,0812 0,0025 0,0554 0,0020 0,0787 0,0534 0,0253 0,577 1,155
aceptado
Valor
0,0811 0,0024 0,0554 0,0020 0,0787 0,0534 0,0253 0,577 1,155
aceptado
Valor
0,0810 0,0026 0,0552 0,0022 0,0784 0,0530 0,0254 1,155 1,155
aceptado
promedio 0,0253
desviació
n 5,8E-05
estándar
45
test de Grubbs

Muestra Muestra
Abs
Abs Abs Abs Abs 95%
A Aa A-Aa
(665) (750) (665) (750)
Valor
0,1143 0,0103 0,0789 0,0086 0,1040 0,0703 0,0337 0,577 1,155
aceptado
Valor
0,1144 0,0105 0,0786 0,0084 0,1039 0,0702 0,0337 0,577 1,155
aceptado
Valor
0,1142 0,0103 0,0785 0,0085 0,1039 0,0700 0,0339 1,155 1,155
aceptado
promedio 0,0338
desviación
0,00012
estándar
test de Grubbs

Muestra Muestra
Abs
Abs Abs Abs Abs 95%
A Aa A-Aa
(665) (750) (665) (750)
Valor
0,1630 0,0139 0,1118 0,0134 0,1491 0,0984 0,0507 0,577 1,155
aceptado
Valor
0,1632 0,0140 0,1119 0,0133 0,1492 0,0986 0,0506 1,155 1,155
aceptado
Valor
0,1634 0,0138 0,1118 0,0129 0,1496 0,0989 0,0507 0,577 1,155
aceptado
promedio 0,0507
desviación
5,8E-05
estándar
46
test de Grubbs

Muestra Muestra
Abs Tabla
Abs Abs Abs Abs 95%
A Aa A-Aa
(665) (750) (665) (750)
Valor
0,2674 0,0094 0,1842 0,0107 0,258 0,1735 0,0845 0,577 1,155
aceptado
Valor
0,2671 0,0096 0,1843 0,0109 0,2575 0,1734 0,0841 1,155 1,155
aceptado
Valor
0,2675 0,0093 0,1845 0,0108 0,2582 0,1737 0,0845 0,577 1,155
aceptado
promedio 0,0844
desviación
2,31E-04
estándar
Tabla 13. Datos experimentales de Absorbancia de 1000 g Chl-a/L, cálculo del

estadístico test de Grubbs

Muestra Muestra
Abs Tabla
Abs Abs Abs Abs 95%
A Aa A-Aa
(665) (750) (665) (750)
Valor
0,5344 0,0185 0,3685 0,0216 0,5159 0,3469 0,169 0,320 1,155
aceptado
Valor
0,5343 0,0182 0,3684 0,0214 0,5161 0,347 0,1691 0,801 1,155
aceptado
Valor
0,5341 0,0183 0,3686 0,0215 0,5158 0,3471 0,1687 1,121 1,155
aceptado
promedio 0,1689
desviación
2,08E-04
estándar
47
La evaluación del estadística del test de Grubbs (Tabla 5-13) Gcal < Gtab indica que
el conjunto de datos individuales para la construcción de la recta de calibración, no detecta
valores discrepantes de su valor medio, por lo tanto son aceptados y pertenecen al conjunto
de la muestra estadística.
Para la evaluación de la linealidad y rango de trabajo se preparó 9 soluciones de
Chl-a (5, 25, 50, 100, 150, 200, 300, 500, 1000 g /L) obteniendo el siguiente resultado
en la tabla 14, se preparó una solución patrón y se realizó el procedimiento mencionado
en el capítulo 3.
Tabla 14. Resultados de la linealidad y rango de trabajo para la clorofila a
Concentración
Absorbancia
n Chl-a (g/L)
X Y
1 5 0,0008
2 25 0,0042
3 50 0,0084
4 100 0,0169
5 150 0,0253
6 200 0,0338
7 300 0,0507
8 500 0,0844
9 1000 0,1689
Coeficiente de correlación
0,9999998
múltiple
Coeficiente de determinación
0,9999995
R2
R2 ajustado 0,9999995
Error típico 0,0000399
Pendiente 0,0001689
Intercepto -0,0000272
Fuente: Elaboración propia
48
La tabla resume los resultados estadísticos de la linealidad a través de la
pendiente (b), intercepto (a) y el coeficiente de correlación r2.
0,1800
0,1600 y = 0,0002x - 3E-05
R² = 1
0,1400
0,1200
Absorbancia
0,1000
0,0800
0,0600
0,0400
0,0200
0,0000
0 200 400 600 800 1000 1200
Concentración
Figura 11. Curva de calibración de Chl-a con respecto a la linealidad

Por lo tanto, la ecuación de la curva de calibración, se expresa de la siguiente
manera
Y= 0,0002x-3E-05 con r = 0,9999 y r2 = 0.9999.
Se utilizó el método de los mínimos cuadrados (Tabla 14), que consiste en ajustar
estos parámetros para minimizar la suma de los cuadrados de los residuales y obtener
funciones lineales (Figura 12)
0,00006
0,00004
0,00002
Residuos
0
0 200 400 600 800 1000 1200
-0,00002
-0,00004
-0,00006
-0,00008
Concentración X
Figura 12. Residuos vs. Concentración de la curva de calibración

49
La distribución de los puntos es aleatoria y no refleja ningún patrón demostrando
que no son correlacionados (Figura 12), a partir de residuales se puede ver que se ajusta a
los datos, por lo tanto, el sistema es válido.
Para demostrar que existe una pendiente significativamente distinta de cero se
aplicó la prueba de t-Student, para n-2 grados de libertad = 7 en un nivel de confianza del
95% con un grado de significación α = 0.05, el valor crítico en la tabla de la distribución
t-Student es tcrit =1,8946.
Hipótesis:
Ho: b = 0 Si texp < tcrit
H1: b ≠ 0 Si texp > tcrit
Primeramente se calcula el estadístico Sy/x (Error típico o desviación estándar
residual o de la regresión) que estima los errores aleatorios en la dirección de Y. el valor
correspondiente es Sy/x= 0,0000399
Se toma en cuenta el valor de la desviación estándar de la pendiente (S b) con
respecto a los resultados obtenidos del estudio de linealidad
𝑆𝑦
𝑥
𝑆𝑏 =
√∑(𝑥𝑖 − 𝑥)2
El valor de la desviación estándar de la pendiente es 4,4230*E-08
Calculamos el estadístico t-Student experimental con la fórmula: t exp = b/Sb
Texp=3821,27
Como T exp= 3821,27> tcrit =1,8946 aceptamos la hipótesis nula comprobando
estadísticamente que existe una pendiente diferente de cero, lo que demuestra que existen
diferencias significativas.
El intervalo de confianza (IC) para la pendiente se calcula:
ICb= b +/- tcrit * Sb
IC= 0,000169 +/- (1,8946 *4,4230*E-08) IC = 1,6908*E-04 y 1,6891*E-04
El intervalo de confianza de la pendiente demuestra que no pasa por el punto cero.
4.2. Límite de detección, cuantificación y sensibilidad analítica
El límite de detección y cuantificación se realizó mediante la curva de calibración
del estudio de linealidad y rango de trabajo (Figura 11). Los resultados se muestran en la
tabla 16.
50
Tabla 15. Residuos vs. Concentración de la curva de calibración
Concentración
Absorbancia
n Chl-a (mg /L)
X Y
1 5 0,0008
2 25 0,0042
3 50 0,0084
4 100 0,0169
5 150 0,0253
6 200 0,0338
7 300 0,0507
8 500 0,0844
9 1000 0,1689
Coeficiente de
correlación 0,9999998
múltiple
Pendiente 0,000169
Intercepto -0,0000272
desviación
estándar del 0,0000175
intercepto

El límite de detección (LOD) se determina a partir de la pendiente de la recta de
calibración y de la desviación estándar de la respuesta Sa.
El resultado es el siguiente:
𝑆𝑎 0,0000175
𝐿𝑂𝐷 = 3,3 ∗ = 3,3 ∗ = 0,3419
𝑏 0,0001689
Nos indica que la concentración mínima detectable que es de 0,3419 g Chl-a/L.
El límite de cuantificación (LOQ) se determina a partir de la pendiente de la recta
de calibración y de la desviación estándar de la respuesta Sa.
𝑆𝑎 0,0000175
𝐿𝑂𝑄 = 10 ∗ = 10 ∗ = 1,0361
𝑏 0,0001689
51
Este resultado nos indica que la concentración más baja del analito que puede ser
determinada a un nivel aceptable de precisión y repetibilidad es 1,0361 ug Chl-a/L.
La sensibilidad analítica se determina a partir de la pendiente de la recta de
calibración y de la desviación estándar de las respuestas (𝑆𝑐𝑜 ) (Castillo, González, 1996),
multiplicado por el T Student en un nivel de confianza del 95% y con un grado de
significación α = 0.05, nuestro T Student es igual a 1.8595.
Para determinar la desviación estándar (𝑆𝑐𝑜 ), utilizamos la ec. 6.
2
𝑆𝑦𝑥 1 1 (𝐴𝑏𝑠𝑜 − 𝐴𝑏𝑠)
𝑆𝐶𝑜 = ∗√ + +
𝑏 𝑚 𝑛 𝑏 2 ∗ ∑𝑛(𝐶 − 𝐶)2
1 𝑖
Obteniendo un valor de 𝑆𝐶𝑜 : 4,652 ∗ 102

𝑏 0,0001689
𝛾 = 𝑇𝑠𝑡𝑢𝑑𝑒𝑛𝑡 ∗ = 1,8595 ∗ = 6,74 ∗ 10−7
𝑆𝐶𝑜 4,652 ∗ 102
Tabla 16. Resultados de límite de detección, límite de cuantificación y sensibilidad

analítica
Límite de detección 0,3419 g Chl-a /L

Límite de cuantificación 1,0361 g Chl-a /L
Sensibilidad Analítica 6,74 ∗ 10−7 g Chl-a/L
4.3.Selectividad
Se realizó mediante el método de adición de estándar, una muestra con la adición
de una solución de feopigmentos en clorofila-a y una solución de clorofila-a. Para el
cálculo de la concentración de feopigmentos se utilizó la siguiente ecuación.
𝑉𝑒
𝐶𝑝ℎ𝑒𝑜𝑝𝑖𝑔𝑚𝑒𝑛𝑡𝑠 = 𝐴𝑎 ∗ 20,8 ∗ − 𝐶𝑐ℎ𝑙
𝑉𝑠 ∗ 𝑑
Donde: Cpheopigments: Concentración de feopigmentos hallada; (𝐴𝑎 = 𝐴665 − 𝐴750 )
Diferencia de absorbancias del extracto después de la acidificación; Ve: Volumen del
extracto, en unidades de mL; Vs: Volumen del filtrado, en unidades de L; d: longitud del
recorrido de la celda óptica y Cchl concentración de clorofila-a en la muestra.
52
Para la evaluación de la selectividad preparamos dos grupos de muestra uno que
tiene la matriz y otro que no contiene la matriz, para realizar la evaluación se realizó el
análisis de los mínimos cuadrados.
Tabla 17. Análisis de los mínimos cuadrados de datos de la muestra sin matriz
Concentración Absorbancia Concentración (𝑿𝒊 − 𝑿)𝟐 (𝒀𝒊 − 𝒀)𝟐

Chl-a (g /L) Xi Yi real Xi
200 0,032 199,3 8891,7 0,00023
200 0,032 198,1 8660,5 0,00103
200 0,033 201,1 9244,2 0,00106
200 0,032 199,9 9008,5 0,00105
150 0,024 149,9 2019,1 0,00059
150 0,024 149,3 1964,1 0,00059
150 0,024 149,3 1964,1 0,00059
150 0,024 146,8 1751,4 0,00057
100 0,016 99,3 32,0 0,00026
100 0,016 100,6 19,6 0,00027
100 0,017 101,8 10,2 0,00027
100 0,016 99,3 32,0 0,00026
50 0,008 51,2 2893,1 0,00007
50 0,008 51,2 2893,1 0,00007
50 0,008 51,8 2827,1 0,00007
50 0,009 52,4 2761,9 0,00007
25 0,005 27,8 5965,1 0,00002
25 0,004 24,1 6550,7 0,00002
25 0,004 24,7 6451,2 0,00002
25 0,004 27,1 6060,8 0,00002
Promedio Promedio Promedio ∑(𝑿𝒊 − 𝑿)𝟐 ∑(𝒀𝒊 − 𝒀)𝟐
105 0,01706 105,262776 80000,5 0,0071

53
La linealidad de la muestra sin la matriz, se expresa en la figura 13.
0,0350
y = 0,0002x + 0,0003
0,0300
R² = 0,9999
0,0250
Absorbancia
0,0200
0,0150
0,0100
0,0050
0,0000
0 50 100 150 200 250
Concentración
Figura 13. Linealidad de la muestra sin matriz

Calculamos la desviación estándar relativa (RSD 1) con los valores de la tabla 17
y la ecuación:
∑(𝑌𝑖 − 𝑌𝑖 )̌2
𝑅𝑆𝐷 = √
𝑛−2
RSD1: 0,01986
Tabla 18. Análisis de los mínimos cuadrados de datos de la muestra con matriz
Concentración Absorbancia Concentración (𝑿𝒊 − 𝑿)𝟐 (𝒀𝒊 − 𝒀)𝟐

Chl-a (g/L) Xi Yi real Xi
200 0,045 199,0 8840,6 0,00044
200 0,045 199,5 8924,3 0,00202
200 0,045 199,0 8840,6 0,00201
200 0,045 199,0 8840,6 0,00201
150 0,035 154,2 2416,2 0,00120
150 0,035 154,6 2460,1 0,00121
150 0,035 155,0 2504,4 0,00122
150 0,035 153,3 2329,7 0,00119
54
100 0,022 98,6 40,7 0,00049
100 0,022 99,5 30,1 0,00050
100 0,023 100,4 21,2 0,00051
100 0,022 99,5 30,1 0,00050
50 0,012 51,5 2858,7 0,00013
50 0,011 49,3 3101,2 0,00012
50 0,011 48,0 3251,4 0,00012
50 0,011 49,3 3101,2 0,00012
25 0,006 24,4 6490,9 0,00003
25 0,006 24,4 6490,9 0,00003
25 0,006 24,9 6419,5 0,00003
25 0,005 23,1 6707,4 0,00003
Promedio Promedio Promedio ∑(𝑿𝒊 − 𝑿)𝟐 ∑(𝒀𝒊 − 𝒀)𝟐
105 0,02371 105,331882 83699,7 0,0139

La linealidad de la muestra con la matriz, se expresa en la figura 14.
0,050
0,045 y = 0,0002x - 0,0002
R² = 0,9992
0,040
0,035
Absorbancia
0,030
0,025
0,020
0,015
0,010
0,005
0,000
0,000 50,000 100,000 150,000 200,000 250,000
Concentración
Figura 14. Linealidad de la muestra con la matriz

55
Calculamos la desviación estándar relativa (RSD 2) con los valores de la tabla 18
y la ecuación:
∑(𝑌𝑖 − 𝑌𝑖 )̌2
𝑅𝑆𝐷 = √
𝑛−2
RSD2: 0,02778
El error estándar (ESD) es calculado a partir del RSD de cada curva con la
ecuación.
𝐺𝐿1 (𝑅𝑆𝐷1 )2 + 𝐺𝐿2 (𝑅𝑆𝐷2 )2

𝐸𝑆𝐷 = √
𝐺𝐿1 + 𝐺𝐿1
19 ∗ (0,01986)2 + 19 ∗ (0,02778)2
𝐸𝑆𝐷 = √
19 + 19
𝐸𝑆𝐷 = 0,02415
La selectividad es evaluada por la comparación de las inclinaciones de las curvas
de adición patrón, los cálculos que realizamos es la t- Student para igualdad de
inclinaciones.
Para demostrar que existe igualdad de inclinaciones se aplicó la prueba de t-
Student, para n1=20 y n2=20 con datos totales Nt= 30 y los grados de libertad (n-2) GL
1= 18 y GL2= 18 con grados de libertad totales GLT= 36 en un nivel de confianza del
95% y con un grado de significación α = 0.05, el valor crítico en la tabla de la distribución
t-Student es tcrit = 1.6883.
Hipótesis:
Ho: b1= b2 Si texp < tcrit
H1: b1≠ b2 Si texp > tcrit
Determinamos el Texp con la siguiente ecuación:
|𝑏1 − 𝑏2 |
𝑇𝑒𝑥𝑝 =
1 1
𝐸𝑆𝐷 ∗ √𝑆 +𝑆
𝑋𝑋 𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑑𝑜 𝑋𝑋 𝑝𝑎𝑡𝑟𝑜𝑛
𝑇𝑒𝑥𝑝 = 0,14964
56
Como T exp = 0,14964 < tcrit = 1,6883 aceptamos la hipótesis nula, comprobando
que las pendientes son iguales, que no hay efecto de matriz y el método es selectivo.
0,050
0,045 y = 0,0002x - 0,0002
R² = 0,9992
0,040
0,035
Absorbancia
0,030
0,025
0,020 y = 0,0002x + 0,0003
R² = 0,9999
0,015
0,010
0,005
0,000
0,000 50,000 100,000 150,000 200,000 250,000
Concentración
Figura 15. Selectividad del método de determinación de clorofila-a

4.4. Precisión / Repetibilidad
Los estudios de precisión y repetibilidad fueron llevados a cabo por el mismo
ensayista, en cuatro días en diferentes horas. Se preparo una solución y se hizo la lectura
por espectrofotometría UV-VIS observando la repetibilidad de las lecturas.
Con los datos obtenidos (Anexo 1) se calcula los valores de la media, la desviación
estándar y el porcentaje de coeficiente de variación. Los siguientes valores se encuentran
en la tabla 19.
Tabla 19. Comparación de Resultados obtenidos del estudio de repetibilidad Chl-a (g/L)
Muestra Hr. 1 Hr.2 Hr.3 Hr. 4 Hr. 5 Hr. 6 Hr. 7

Chl-a (g/L)
1 479,42 484,15 480,61 480,61 480,61 481,20 481,79
2 481,78 483,56 482,38 482,38 482,97 478,83 484,15
3 480,02 478,83 482,97 480,02 477,65 480,02 484,15
Promedio 480,41 482,18 481,99 481,00 480,41 480,02 483,36
SD 1,23057 2,91606 1,23058 1,23058 2,66562 1,18230 1,36520
%C.V. 0,3% 0,6% 0,3% 0,3% 0,6% 0,2% 0,3%
57
Se demuestra que él % C.V. no pasa el 5%.
Para demostrar si existe una diferencia de varianzas entre los datos obtenidos se
realiza la prueba de Fischer, para n-1 grados de libertad = 20 en un nivel de confianza del
es Fcrit= 2,8477.
Hipótesis:
Ho: Si Fexp < Fcrit
Hi: Si Fexp > Fcrit
Los resultados obtenidos se expresan en la tabla 20.
Tabla 20. Resultados obtenidos del estudio de Repetibilidad Chl-a (g/L)
Entre Dentro
Total
grupos de los grupos
Origen
de las variaciones
26,492 46,828 73,32
Grados
6 14 20
de libertad
Promedio
de los cuadrados
4,415 3,345
valor crítico para F 2,8477

valor exp de F 0,3114

Como Fexp = 0,3114 < tcrit = 2,8477 aceptamos la hipótesis nula, comprobando
que las varianzas no son significativamente diferentes.
4.5. Reproducibilidad
Se prepararon 3 soluciones de la misma concentración 930 Chl-a (g/L), para
todas las muestras y se hizo la lectura de estas soluciones por espectrofotometría UV-VIS
observando la reproducibilidad de las lecturas. Para el análisis en este parámetro se realizó
con el mismo analista pero en diferentes días.
Con los datos obtenidos (Anexo 2), se calcula los valores de la media, la desviación
en la tabla 21.
58
Tabla 21. Comparación de Resultados obtenidos del estudio de Reproducibilidad Chl-a
(g/L)
Muestra Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
Chl-a (g/L)
1 927,15 918,71 923,15 920,04
2 924,93 919,60 920,93 924,04
3 926,71 917,38 919,60 918,71
promedio 926,26 918,56 921,23 920,93
SD 1,17566 1,11791 1,79539 2,77430
%C.V. 0,1% 0,1% 0,2% 0,3%
Para demostrar si existe una diferencia de varianzas entre los datos obtenidos se
es Fcrit= 4,0661.
Hipótesis:
Ho: Si Fexp < Fcrit
Hi: Si Fexp > Fcrit
Los resultados obtenidos se expresan en la tabla 22.
Tabla 22. Resultados obtenidos del estudio de reproducibilidad Chl-a (g/L)
Dentro de
Entre grupos Total
los grupos
Suma de
6,95*E-06 1,13*E-05 1,82*E-05
cuadrados
Grados de
3 8 11
libertad
Promedio
de los 2,3163*E-06 1,41*E-06
cuadrados
Valor crítico para F 4,0661
F 1,6428

que las varianzas no son significativamente diferentes.
59
Para el porcentaje de la relación entre la repetibilidad y la reproducibilidad
(llamosa et. al. 2007/ISO 17025), es calculada mediante la siguiente ecuación:
𝑟&𝑅 = √%𝐶𝑉𝑟 2 + %𝐶𝑉𝑅 2 𝐸𝑐. 15
Dónde:
r de repetibilidad tiene un valor de 0,25%
R de reproducibilidad tiene un valor de 0,15%
El resultado de 𝑟&𝑅 es de 0,29 % siendo un valor aceptable según los siguientes
criterios:
● Si %R&R < 10% el sistema de medición es aceptable
● Si 10% ≤ % r&R <30% el sistema de medición puede ser aceptable
según su uso, aplicación, costo, costo del instrumento de medición y costo de
reparación.
● Si % r&R > 30% el sistema de medición es considerado como no
aceptable y requiere de mejoras en cuanto al operador, equipo, método,
condiciones y otros.
El criterio de aceptación de (llamosa et. al. 2007/ISO 17025) es a partir del 10%
siendo un valor alto para el criterio de aceptación en validaciones analíticas, por lo cual
se plantea un criterio del 5%, de tal forma el resultado obtenido de 𝑟&𝑅 continúa siendo
un valor aceptable con el criterio establecido internamente.
También se realiza la variación porcentual mediante el criterio de aceptación de
Horwitz es
2 ∗ 2(1−0,5)𝑙𝑜𝑔0,0000010
𝐶𝑉ℎ𝑅𝐼 % = = 10,67%
3
De acuerdo a Horwitz el CV% para reproducibilidad es de 10,67%. Por lo cual se
cumple el criterio de aceptabilidad establecido, ya que . CVR% < CVhRi%
4.6. Precisión intermedia
Se prepararon 5 soluciones de la misma concentración 65 Chl-a (g/L) para todas
las muestras se incluyó el tiempo de acidificación y las condiciones ambientales y se hizo
la lectura de estas soluciones por espectrofotometría UV-VIS observando la repetibilidad
de las lecturas.
60
Con los datos del Anexo 3. calculamos los valores de la media, la desviación
en la tabla 23. Para comparar la dispersión (variación) de los conjuntos de datos de
medidas, utilizamos la ecuación 12.
𝑆𝑟
%𝐶𝑉𝑟 = ∗ 100%
𝑥
Tabla 23. Datos obtenidos en función a los resultados de precisión intermedia Chl-
a (g/L)
Concentración
Nro. Chl-a (g/L)
Cond. 1 Cond. 2
1 68,8589 65,7491
2 67,9704 65,7491
3 66,6376 64,4164
4 66,1934 62,6394
5 66,1934 59,9739
Promedio 67,1707 63,7056
SD 1,192050176 2,445398279
C.V 1,77% 3,84%
Para demostrar si existe una diferencia de varianzas entre las series de muestras se
es Fcrit = 6,388.
Hipótesis:
Ho: S21 = S22
Si Fexp < Fcrit
H1: S21 ≠ S22
Si Fexp > Fcrit
Calculamos el F exp con los datos obtenidos de la tabla 24 y la siguiente ecuación:
𝑆12
𝐹𝑒𝑥𝑝 = = 0,2376
𝑆22
que las varianzas no son significativamente diferentes
61
4.7. Exactitud y Sesgo
Se prepararon patrones de 200, 100 y 25 Chl-a (g/L) de alga unicelular azul
verdosa sólida. Las muestras se prepararon a la misma concentración obteniendo la
recuperación de cada analito aplicando la ecuación 18 y descrita los datos en la Tabla 24.
Tabla 24. Valores correspondientes de medición de muestra y solución patrón
Solución patrón Solución muestra Abs Concentración

Sesgo Porcentaje de
Concentración A-Aa Concentración A-Aa S s
relativo recuperación
Chl-a (g/L) (nm) Chl-a (g/L) (nm)
200,0 0,045 199,8 0,034 0,011 0,186 -0,09% 99,9%

100,0 0,022 100,3 0,017 0,006 -0,302 0,30% 100,3%
25,0 0,006 25,3 0,004 0,001 -0,273 1,09% 101,1%
Para evaluar la recuperación se realiza la prueba t como criterio de aceptación, por
lo cual 𝑡𝑐𝑎𝑙 ˂ 𝑡𝑡𝑎𝑏 , se evalua en un nivel de confianza del 95% y con un grado de
significación α = 0.05, el valor crítico en la tabla de la distribución es Ttab = 4,3026
Utilizamos la ecuación 20, para el cálculo del Tcal los resultados son los siguientes:
[100 − %𝑅]
𝑡𝑐𝑎𝑙 =
𝑠 × √𝑛
En la concentración de 200 Chl-a (g/L) el Tcal tiene un valor de 3,4435.
Para el criterio de aceptación, consideramos la siguiente hipótesis:
● Si 𝑡𝑐𝑎𝑙 ˃𝑡𝑡𝑎𝑏 hay diferencia estadísticamente significativa, los
resultados reportados deberán ser corregidos.
● Si 𝑡𝑐𝑎𝑙 ≤ 𝑡𝑡𝑎𝑏 No hay diferencia estadísticamente significativa, no
es necesario hacer una corrección.
Se comprueba que en todas las concentraciones el 𝑡𝑐𝑎𝑙 ˂ 𝑡𝑡𝑎𝑏 , por lo cual se acepta
el criterio de aceptacion, además se considera que el porcentaje de recuperación para
métodos espectrofotométricos en Chl-a (g/L) es del 90 - 110 %, obteniendo dentro del
rango como se muestra en la tabla 26.
62
4.8. Robustez
Para el estudio de robustez se realizó un diseño experimental de cuatro variables
para ocho experimentos mediante el test Youden Steiner. El diseño se muestra en la tabla
25.
Tabla 25. Diseño experimental de Youden Steiner

variable 1 2 3 4 5 6 7 8
1 A A A A a a a a
2 B B B b B b b b
3 C c C c C c C c
4 D D d d d d D D
Resultado s t u v w x y z
Fuente: Lutz Grohmann

Las variables correspondientes se muestran en la tabla 26.
Tabla 26. Variables influyentes en función de la robustez en el análisis de

clorofila-a
Nro. de
Nro. De Variable ALTO BAJO
variable
1 cantidad de solvente (A, a) 20 mL 10 mL

2 temperatura del baño (B, b) 75℃ 65℃
3 tiempo de acidificación (C, c) 3 min 8 min
cantidad de volumen 4,5
4 3 L
acidificación (D, d) L
63
Los resultados se expresan en la tabla 27.
Tabla 27. Resultados obtenidos del estudio de Robustez

variable 1 2 3 4 5 6 7 8
1029,7 Chl- 1029,7 Chl-a 1029,7 Chl-a 1029,7 Chl- 1179,5 Chl- 1179,5 Chl- 1179,5 Chl- 1179,5 Chl-a
1
a (g/L) (g/L) (g/L) a (g/L) a (g/L) a (g/L) a (g/L) (g/L)
2
3
4
1211,9 Chl- 1305,7 Chl-a 682,2 Chl-a 919,0 Chl-a 1251,9 Chl- 1216,2 Chl- 1311,0 Chl- 938,9 Chl-a
Resultado
a (g/L) (g/L) (g/L) (g/L) a (g/L) a (g/L) a (g/L) (g/L)

Para determinar los efectos producidos por las variaciones en los parámetros, se
determina SD*√2 mediante los resultados obtenidos de la tabla 30, se obtiene un valor de
SD*√2 = 87,47.
Para demostrar si el método es robusto entre las series de muestras se plantea la
siguiente hipótesis:
Si el valor de │A-a│…│D-d│> SD*√2 ; existe diferencia significativa
si el valor de │A-a│...│D-d│< SD*√2 ; no existe diferencia significativa.
Mediante el cálculo de las variables de │A-a│, │B-b│,│C-c│ y │D-d│, se
demuestra que existe diferencia significativa en las variables │A-a│ y │D-d│ y no existe
diferencia significativa en las variables │B-b│ y │C-c│, concluyendo que existe mayor
influencia en la adición de solvente y la cantidad de volumen de acidificación, dos
variables que influyen en la cuantificación del método analítico.
4.9.Incertidumbre
Una de las formas que hay para determinar la incertidumbre es utilizando para
estimar un intervalo de confianza, en este caso se toma los datos de la muestra del rango
de trabajo de la tabla 14 utilizando la ecuación 6 y sé realiza un ajuste a la curva de
calibración obteniendo con los límites de confianza que la incertidumbre es constante, se
expresa en la figura 16.
64
Figura 16. Curva de calibración e intervalo de confianza
Fuente: Elaboración propia - Minitab
Mediante el análisis de regresión ajustada de concentración vs absorbancia se

obtiene los siguientes coeficientes, se expresa en la tabla 28.
Tabla 28. Coeficientes obtenidos mediante la curva de calibración ajustada Chl-a
(g/L)
Termino Coef EE del coef IC de 95% Valor de T
Constante 0,163 0,239 (-0,330; 0,656) 0,68
Absorbancia 5919,5 3,57 (5912,14; 5926,85) 1656,94

También se identificó la contribuciones de las fuentes de Incertidumbre del
método de análisis, se expresa en la figura 17.
MAGNITUD
Vf
Ve
Abs acidificada
Abs extraída
0% 20% 40% 60% 80% 100%

CONTRIBUCIÓN (%)
Figura 17. Contribución de la incertidumbre en la medición de Clorofila-a

65
Además se realizó un barrido de la muestra de clorofila-a en función al tiempo
mediante la acidificación de la solución extraída, se expresa en la figura 18.
Figura 18. Estudio de clorofila-a mediante la acidificación en función del

tiempo
66
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES
Este trabajo con los resultados experimentales obtenidos en el Laboratorio de
Unidad de Metrología Química en el Instituto Boliviano de Metrología (IBMETRO) ha
demostrado la validez del método mediante Espectrofotometría ultravioleta–visible (UV-
VIS) para la determinación de clorofila-a en aguas naturales,
El método utilizado en la determinación clorofila-a rápido, sencillo y cuantitativo,
posee precisión y exactitud, por lo cual se constituye en un método muy apropiado para
ser empleado en diferentes muestras de agua, especialmente en muestras con riesgo de
agua mesotróficas y eutróficas.
Se demostró la linealidad del método cuyo coeficiente de correlación de 0,999
como valor mínimo en las diferentes pruebas comprobando que existe una correlación
entre los ejes X, Y. Adicionalmente se verifico la selectividad del método, con límites de
detección de 0,3419 y 1,0361 μg Chl-a/L respectivamente y una sensibilidad analítica de
6,74 ∗ 10−7 Chl − a/L , lo cual nos muestra la factibilidad técnica del método.
La recuperación de los analitos en las muestras es alta con un rango del 99,9% al
101,1% al igual que la precisión determinada como repetibilidad, reproducibilidad y
precisión intermedia de resultados con un %CV menor al 5%.
Se establece que la concentración mínima de HCl a emplearse en la determinación,
es de 3 M, teniendo en cuenta la cantidad de volumen de acidificación que se vaya a
utilizar, además se concluye a partir del estudio de robustez que la temperatura del baño
termostático y el tiempo de acidificación no influye en los resultados de la medición, pero
si influye la cantidad de volumen de acidificación y la cantidad de solvente respecto a la
cantidad de filtrado, lo más recomendable es trabajar con parámetros ya establecidos
según el procedimiento validado para la determinación de clorofila-a por
espectrofotometría UV-VIS en aguas naturales.
Finalmente se concluye que el método es validado tomando en cuenta la ISO/IEC
17025:2018.
67
CAPÍTULO VI
RECOMENDACIONES
Se recomienda realizar el trabajo con las pautas y modificaciones ya establecidas
según el procedimiento validado para la determinación de clorofila-a por
espectrofotometría UV-VIS en aguas naturales del mismo trabajo y realizar el análisis una
vez que se tenga la muestra para evitar el deterioro de la misma.
Mantener en almacenamiento de refrigeración una vez extraída la muestra de la
matriz de agua natural en condiciones ambientales controladas de manera que no se altere
la concentración de Clorofila-a en la muestra a analizar.
Considerar el cuidado en la preparación de la solución de etanol a 90% de manera
que se obtenga satisfactoriamente la extracción de la clorofila-a en matrices de agua
natural, así como también la concentración de Ácido Clorhídrico 3M el volumen y el
tiempo de acidificación, todo estos factores influyen en la determinación cualitativa de
clorofila-a por espectroscopia UV-VIS en aguas naturales.
Trabajar en una condición ambiental que no supere los 25◦C, realizar la extracción
en un ambiente donde no vea la presencia de fluidos de aire fuertes y mucha luz, en
combinación de ambos la clorofila-a puede llegar a descomponerse, lo recomendable para
evitar es usar láminas de aluminio y de esta manera proteger la muestra extraída.
Elaborar un material de referencia interno en la medida de las posibilidades,
debido al alto costo del material de referencia certificado (MRC).
68
CAPITULO VII
BIBLIOGRAFÍA
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73
ANEXOS
ANEXO 1. Datos obtenidos y resultados del estudio de repetibilidad de Chl-a (g/L)
Muestra Muestra Concentración Abs

Clarificada Acidificada Chl-a (g/L) (665 y 750 nm)
A Aa Concentración A-Aa
0,2167 0,1356 479,4244 0,0811
Hr. 1 0,2167 0,1352 481,7890 0,0815
0,2167 0,1355 480,0156 0,0812
0,2189 0,1370 484,1536 0,0819
Hr. 2 0,2191 0,1373 483,5625 0,0818
0,2188 0,1378 478,8333 0,0810
0,2231 0,1418 480,6067 0,0813
Hr. 3 0,2235 0,1419 482,3802 0,0816
0,2229 0,1412 482,9713 0,0817
0,2167 0,1354 480,6067 0,0813
Hr. 4 0,2163 0,1347 482,3802 0,0816
0,2168 0,1356 480,0156 0,0812
0,2191 0,1378 480,6067 0,0813
Hr.5 0,2189 0,1372 482,9713 0,0817
0,2188 0,1380 477,6510 0,0808
0,2173 0,1359 481,1979 0,0814
Hr.6 0,2173 0,1363 478,8333 0,0810
0,2168 0,1356 480,0156 0,0812
0,2168 0,1353 481,7890 0,0815
Hr. 7 0,2169 0,1350 484,1536 0,0819
0,2165 0,1346 484,1536 0,0819
74
Evaluamos de valores discrepantes de su valor medio con el test de Grubbs (G) de los
resultados obtenidos del estudio de repetibilidad.
TABLA
concentración Abs
GRUBBS GRUBBS EVALUACION
Chl-a (g/L) A-Aa
95%
479,42 0,0811 1,000 2,745 valor aceptado
481,79 0,0815 0,235 2,745 valor aceptado
480,02 0,0812 0,691 2,745 valor aceptado
484,15 0,0819 1,470 2,745 valor aceptado
483,56 0,0818 1,161 2,745 valor aceptado
478,83 0,0810 1,308 2,745 valor aceptado
480,61 0,0813 0,382 2,745 valor aceptado
482,38 0,0816 0,544 2,745 valor aceptado
482,97 0,0817 0,853 2,745 valor aceptado
480,61 0,0813 0,382 2,745 valor aceptado
482,38 0,0816 0,544 2,745 valor aceptado
480,02 0,0812 0,691 2,745 valor aceptado
480,61 0,0813 0,382 2,745 valor aceptado
482,97 0,0817 0,853 2,745 valor aceptado
477,65 0,0808 1,926 2,745 valor aceptado
481,20 0,0814 0,074 2,745 valor aceptado
478,83 0,0810 1,308 2,745 valor aceptado
480,02 0,0812 0,691 2,745 valor aceptado
481,79 0,0815 0,235 2,745 valor aceptado
484,15 0,0819 1,470 2,745 valor aceptado
484,15 0,0819 1,470 2,745 valor aceptado
75
ANEXO 2. Datos obtenidos y resultados del estudio de reproducibilidad de Chl-a (g/L)
Muestra
Muestra
Clarificad Concentración Abs (665 y 750 nm)
n◦ Acidificada
a Chl-a (g/L) A-Aa
Aa
A
0,5576 0,3489 927,152 0,2087
día 1 0,5572 0,3490 924,930 0,2082
0,5571 0,3485 926,707 0,2086
0,5562 0,3494 918,711 0,2068
día 2 0,5560 0,3490 919,599 0,207
0,5559 0,3494 917,378 0,2065
0,5556 0,3478 923,153 0,2078
día 3 0,5552 0,3479 920,932 0,2073
0,5549 0,3479 919,599 0,207
0,5557 0,3486 920,044 0,2041
día 4 0,5564 0,3484 924,042 0,2087
0,5562 0,3494 918,711 0,2068
Condiciones Ambientales reportadas en el estudio de reproducibilidad
condiciones ambientales iniciales condiciones ambientales finales
T(°C) %H hPa T(°C) %H hPa
19,5 38,4 663,5 19,8 38,7 663
20,7 35,6 665 21,2 35,3 664,8
19,4 35,3 661,7 19,2 35,2 661,5
20,4 37,8 664,1 21,1 40,1 662,9
76
ANEXO 3. Datos obtenidos y resultados del estudio de precisión intermedia de Chl-a
(ug/L)
Muestra
Muestra
Acidifica Concentración Abs (665 y 750 nm)
n◦ Clarificada
da Chl-a (g/L) A-Aa
A
Aa
1 0,4345 0,4190 68,859 0,0155
2 0,4345 0,4192 67,970 0,0153
3 0,4344 0,4194 66,638 0,0150
4 0,4359 0,4210 66,193 0,0149
5 0,4350 0,4201 66,193 0,0149
6 0,4348 0,4200 65,749 0,0148
7 0,4358 0,4210 65,749 0,0148
8 0,4356 0,4211 64,416 0,0145
9 0,4345 0,4204 62,639 0,0141
10 0,6626 0,6491 59,974 0,0135
Condiciones establecidas para el estudio de precisión intermedia
Cond 1 Cond 2
El tiempo de acidificación fue de 8 min Condiciones ambientales a 25 ℃
77
ANEXO 4. Datos y resultados obtenidos del estudio de sesgo y exactitud
Datos de la solución patrón

Muestra Muestra Concentración Abs (665 y 750 nm)
Clarificada Acidificada Chl-a (g/L) A-Aa
A Aa Promedio
0,2203 0,1753
0,2203 0,1753 200 Chl-a (g/L) 0,0450
0,2204 0,1753
0,2226 0,2002
0,2227 0,2003 100 Chl-a (g/L) 0,0224
0,2226 0,2002
0,0789 0,0733
0,0789 0,0734 25 Chl-a (g/L) 0,0056
0,0789 0,0733
Datos de la muestra
Muestra Muestra Concentración Abs (665 y 750 nm)
Clarificada Acidificada Chl-a (g/L) A-Aa
A Aa Promedio
0,1127 0,0788
199,8 Chl-a
0,1124 0,0788 0,034
(g/L)
0,1126 0,0789
0,0465 0,0297
100,3 Chl-a
0,0466 0,0296 0,017
(g/L)
0,0467 0,0297
0,0107 0,0065
0,0107 0,0063 25,3 Chl-a (g/L) 0,004
0,0107 0,0065
78
ANEXO 5. Datos y resultados del estudio de selectividad
Condiciones Ambientales
Condiciones
Iniciales Finales
ambientales
T ºC 20,3 20,8
P (hPa) 668,3 667,1
HR(%) 42,6 45,4
Datos de la preparación de soluciones de la matriz mas la adición de feopigmentos
Preparación de
25 ug/L 50 ug/L 100 ug/L 150 ug/L 200 ug/L
Soluciones
Unidad g g g g g
Peso del matraz 27,313 27,5071 27,9859 27,6574 27,7733
Peso de la muestra 1,9778 3,929 7,859 11,7991 15,7184
Peso de la muestra +
2,3833 4,3385 8,2683 12,2118 16,1256
adición estándar
Peso del matraz
21,0011 20,9447 21,0643 20,9488 20,9627
aforado
Peso total 48,3134 48,449 49,0458 48,6027 48,6027
Balanza utilizada Q-EM-01 Q-EM-01 Q-EM-01 Q-EM-01 Q-EM-01
79
Valores correspondientes a la medición en espectroscopia UV-VIS de la solución
de feopigmentos
Muestra clarificada Muestra acidificada
Abs(665) Abs(750) Abs(665) Abs(750)

0,1646 0,0037 0,1624 0,0014
0,1642 0,0032 0,1626 0,0016
0,1647 0,0041 0,1623 0,0015
Valores correspondientes a la preparación en espectroscopia UV-VIS de la

solución de feopigmentos
Muestra Muestra Concentración de Concentración de

A-Aa
clarificada acidificada clorofila feopigmentos
A Aa ug/L A-Aa ug/L

0,1609 0,161 -0,444 -0,0001 502,32
0,1610 0,161 0,000 0,0000 502,32
0,1606 0,1608 -0,889 -0,0002 501,70
80
ANEXO 6. Valores críticos para la distribución de t-Student.
81
ANEXO 7. Valores críticos para la distribución de test de F
82
ANEXO 8. Valores críticos para la distribución de test de Grubbs
83
ANEXO 9. Fotografías de equipos y preparación de la muestra
Bomba de vacío de membrana
Espectrofotómetro UV-VIS Cary 100 Agilent Technologies
84
Las condiciones de laboratorio fueron controladas mediante un Termohigrobarómetro
La solución extraída se protegía de la luz para su degradación
85
Muestras de clorofila
Curva de calibración
86
ANEXO 10. Documentación brindada por el Instituto Boliviano de Metrología
(IBMETRO)
87
88

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UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS

FACULTAD DE CIENCIAS PURAS Y NATURALES

TRABAJO PARA OPTAR AL GRADO DE LICENCIADA EN CIENCIAS QUÍMICAS

VALIDACIÓN DE UN MÉTODO ANALÍTICO PARA LA

POR: DANIELA QUISPE HUANCA

Primeramente a mi mamá Beatriz Basilia por todo su apoyo incondicional y

A mi tutor Ph.D. Oswaldo Eduardo Ramos Ramos y a mí tribunal a Ph.D.

A la Universidad Mayor de San Andrés, a la carrera de Ciencias Químicas y a todo

Al Ph.D. Xavier Lazarro Investigador de la Cooperación Francesa (IRD), por su

Al Ing. Efraín Ramos por la colaboración brindada en la obtención de muestras de

A todo el personal de la Unidad de Metrología Química, perteneciente al Instituto

Figura 1. Clasificaciones tróficas en lagos de agua natural .............................................. 9

Tabla 1. Rango de Concentración de valores maximos de clorofila-a en aguas naturales,

ANEXO 1. Datos obtenidos y resultados del estudio de repetibilidad de Chl-a (g/L) .. 74

En el presente trabajo se realizó la validación de un método para la determinación

La clorofila-a está presente en las comunidades fitoplanctónicas entre ellos

Se verificó la precisión, selectividad y robustez del método analítico,

Palabras clave: clorofila-a, espectroscopia UV-VIS, feofitina, fitoplancton,

1.1. ANTECEDENTES Y TRABAJOS REALIZADOS

1.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Clorofila-a Oligotrófico Mesotrófico Eutrófico Hipertrófico

Rango (ug/L) 1,3-10,6 4,9-49,5 9,5-275 > 275

Fuente: Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OECD)

De esta manera es posible realizar la correcta evaluación de los recursos acuáticos

2.1. AGUAS NATURALES

Figura 1. Clasificaciones tróficas en lagos de agua natural

Figura 2. Estructura Molecular de la clorofila-a

Figura 3. Diagrama de comparación de una muestra natural y un proceso de

Entre estas fuentes, los principales contribuyentes a la eutrofización incluyen la

2.5. ESPECTROMETRÍA UV-VIS

2.6. VALIDACION DE METODOS ANALITICOS

Figura 5. Curva de calibración, concentración vs respuesta

La sensibilidad es el cociente entre el cambio en la indicación de un sistema de

Evaluación de la linealidad se realiza con la prueba de t-Student

Para determinar los límites de confianza de la media de la curva de calibración se

Para determinar los límites de confianza de la predicción de la curva de

2.7.1.1. Evaluar los resultados y eliminar los resultados anómalos

Figura 6. Intervalo de trabajo, rango dinámico y rango lineal

Figura 7. Diferencia entre Precisión y Exactitud

𝑟&𝑅 = √%𝐶𝑉𝑟 2 + %𝐶𝑉𝑅 2 𝐸𝑐. 15

.Figura 8. Diagrama de exactitud en función de la veracidad

Para calcular el sesgo es a través de la siguiente ecuación:

Para el criterio de aceptación, consideramos la siguiente hipótesis:

Fuente: Lutz Grohmann

Figura 9. Imagen Satelital de la Laguna Alalay en la Ciudad de Cochabamba-Bolivia

Los instrumentos necesarios para realizar el muestreo son:

3.2. TIPO DE INVESTIGACIÓN

3.3. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS

EQUIPO CARACTERÍSTICA UBICACIÓN

Tabla 4. Reactivos utilizados

REACTIVO CARACTERÍSTICA UBICACIÓN

Alcohol etílico al 96 % EASBA IBMETRO

0,45 µ tamaño de poro y

3.4. METODOLOGÍA ANALÍTICA

0,002 0,000 0,001 0,002 Valor

0,002 0,000 0,001 0,002 Valor

0,002 0,000 0,001 0,002 Valor

Tabla 7. Datos experimentales de Absorbancia de 50 g Chl-a/L, cálculo del estadístico

Concentración 100 g Chl-a/L