T-76907 Consuegra-Medina

Escuela Superior Politécnica del Litoral
Facultad de Ingeniería Marítima y Ciencias del Mar
Determinación in vitro de dosis óptimas de 3 productos experimentales para inhibir
crecimiento en una cepa patógena de Vibrio parahaemolyticus causante de AHPND
Proyecto Integrador
Previo a la obtención del Título de:
Ingeniero Acuícola
Presentado por:
Saray Elizabeth Consuegra Villao
Yumi Ariana Medina Lam
Guayaquil – Ecuador
2023
I
Dedicatoria
El presente proyecto se lo dedico a Dios,
quien me ha sostenido hasta el día de hoy,
quien con su infinito amor y misericordia me
ha permitido disfrutar de este logro, quien me
ha alentado cada día con su santa palabra,
motivándome a esforzarme y ser valiente
cada día, y a no desmayar en el proceso,
prometiéndome que él estará conmigo a
dondequiera que vaya.
A mi familia, a quienes amo y estoy
perpetuamente agradecida, quienes han sido
mi inspiración en cada logro de mis metas.
Saray Consuegra Villao
II
Dedicatoria
Con gran amor...
A Dios, por permitirme terminar con éxito mi
carrera, darme salud y fortaleza en todo
momento.
A mis padres, Christian y Yumi, por su amor,
sacrificio y por enseñarme a ser constante y
nunca rendirme frente a los obstáculos de la
vida.
A mis hermanos, abuelos y demás familia,
por el apoyo incondicional y por siempre
impulsarme a ser mejor.
A mi novio Ariel, por estar conmigo en todo
este proceso, motivándome, ayudándome y
celebrando mis victorias. Te amo
A mis amigos, futuros colegas y demás
Por último, en honor a la memoria de Daniel,
su amor, su legado y su espíritu viven en mi
corazón y me impulsan hacia delante.
III
Agradecimientos
Agradezco a Dios quien es y será mi
fortaleza, a mi amada familia quienes en todo
momento estuvieron apoyándome, a todos los
docentes que contribuyeron en mi formación
universitaria, a nuestros tutores el Dr. Jorge
Cuéllar- Anjel y Dr. Jerry Landívar, por su
tiempo y guía en este proyecto integrador, a
mi coordinador de carrera MSc. Patricia
Urdiales, quien nos brindó amablemente su
apoyo y aliento en todo el proceso de nuestro
proyecto, de igual manera a MSc. Sonnia
Guartatanga por su ayuda y guía en la parte
experimental en el presente proyecto
integrador.
Saray Consuegra Villao
IV
Agradecimientos
Mi agradecimiento sincero…
A Dios, por brindarme fortaleza, sabiduría y
su inmenso amor en todo momento
A toda mi familia, por siempre apoyarme,
sostenerme e impulsarme a lograr mis metas
A mi compañera de tesis, Saray, por ser parte
de este proyecto, por su paciencia y su ayuda
A nuestros tutores, Dr. Jorge Cuéllar-Anjel y
Dr. Jerry Landívar por su orientación, apoyo
y paciencia.
A mis maestros quienes aportaron en la
realización de este proyecto, Dra. Calles,
MSc. Urdiales, Dr. Osorio y MSc.
Guartatanga.
A mi alma mater ESPOL, por su compromiso
continuo en mi formación como profesional
V
Declaración Expresa
Nosotros, Saray Elizabeth Consuegra Villao y Yumi Ariana Medina Lam acordamos y
reconocemos que: La titularidad de los derechos patrimoniales de autor (derechos de autor) del
proyecto de graduación corresponderá al autor o autores, sin perjuicio de lo cual la ESPOL recibe
en este acto una licencia gratuita de plazo indefinido para el uso no comercial y comercial de la
obra con facultad de sublicenciar, incluyendo la autorización para su divulgación, así como para
la creación y uso de obras derivadas. En el caso de usos comerciales se respetará el porcentaje de
participación en beneficios que corresponda a favor del autor o autores. La titularidad total y
exclusiva sobre los derechos patrimoniales de patente de invención, modelo de utilidad, diseño
industrial, secreto industrial, software o información no divulgada que corresponda o pueda
corresponder respecto de cualquier investigación, desarrollo tecnológico o invención realizada por
mí/nosotros durante el desarrollo del proyecto de graduación, pertenecerán de forma total,
exclusiva e indivisible a la ESPOL, sin perjuicio del porcentaje que me/nos corresponda de los
beneficios económicos que la ESPOL reciba por la explotación de mi/nuestra innovación, de ser
el caso. En los casos donde la Oficina de Transferencia de Resultados de Investigación (OTRI) de
la ESPOL comunique los autores que existe una innovación potencialmente patentable sobre los
resultados del proyecto de graduación, no se realizará publicación o divulgación alguna, sin la
autorización expresa y previa de la ESPOL.
Guayaquil, 7 de febrero del 2023.
Saray Elizabeth Consuegra Villao Yumi Ariana Medina Lam
VI
Evaluadores
Firmado electrónicamente por:

JOSE JERRY LANDIVAR
ZAMBRANO
Dr. Jerry Landívar Z Dr. Jorge Cuéllar-Anjel
Profesor de Materia Tutor de proyecto
VII
Resumen
Este proyecto se centra en la determinación in vitro de las dosis óptimas de 3 productos
experimentales para inhibir el crecimiento de Vibrio parahaemolyticus, agente causante de la
Enfermedad de la Necrosis Hepatopancreática Aguda (AHPND), en camarones Penaeus
vannamei. La investigación se desarrolló en dos fases: in vitro e in vivo. En la fase in vitro, se
utilizaron pruebas de Concentración Mínima Inhibitoria (MIC) y pruebas de competencia
bacteriana para establecer las mejores dosis de los productos, qué son una proteína de plasma
bovino, una lisozima de origen animal y un simbiótico. Los resultados indicaron concentraciones
óptimas para cada producto lo que proporciona información valiosa para el desarrollo de medidas
preventivas y de control contra AHPND. Las concentraciones efectivas para inhibir el crecimiento
fueron: lisozima 1000 y 2000 ppm, proteína de plasma bovino 3000 ppm y el simbiótico 800000
ppm. En la fase in vivo, se llevó un bioensayo con camarones para evaluar la eficacia de los
tratamientos mediante la ganancia de peso. Los animales fueron alimentados con balanceados
fabricados adaptando un protocolo de molienda y reconstitución de pellets donde incorporamos
los productos experimentales en base a las dosis obtenidas in vitro. La conclusión principal es que
todos los productos inhibieron el desarrollo del V. parahaemolyticus. Sin embargo, el tratamiento
con proteína de plasma bovino mostró mejores resultados en términos de crecimiento en
comparación con los otros tratamientos, sugiriendo una alternativa prometedora al uso de
antibióticos y abriendo nuevas posibilidades para la industria acuícola. Esta investigación
contribuye a la búsqueda de soluciones sostenibles y sentará las bases para futuras investigaciones
en la optimización de procesos de producción.
Palabras clave: AHPND, lisozima, in vitro, in vivo, proteína de plasma bovino, simbiótico,
Penaeus vannamei, Vibrio parahaemolyticus.
VIII
Abstract
This project focuses on determining the in vitro optimal doses of 3 experimental products to inhibit
the growth of Vibrio parahaemolyticus, the agent causing Acute Hepatopancreatic Necrosis
Disease (AHPND) in Penaeus vannamei shrimps. The research was developed in two phases: in
vitro and in vivo. In the in vitro phase, Minimum Inhibitory Concentrations (MIC) tests and
bacterial competition tests were used to establish the best doses of the products, which include a
bovine plasma protein, an animal origin lysosome, and symbiotic. The results indicated specific
optimal concentrations for each product, providing valuable information for the development of
preventive and control measures against AHPND. The effective concentrations to inhibit growth
were, for the lysosome, 1000 and 2000 ppm; for the bovine plasma protein, 3000 ppm; and for the
symbiotic, 800000 ppm. In the in vivo phase, a bioassay with shrimps was carried out to evaluate
the efficacy of the treatments through weight gain. The animals were fed with formulated feeds,
adapting a milling and pellet reconstitution protocol where we incorporated the experimental
products based on the in vitro obtained doses. The main conclusion is that all products inhibited
the development of V. parahaemolyticus. However, the treatment with bovine plasma protein
showed better results in terms of growth compared to the other treatments, suggesting a promising
alternative to the use of antibiotics, and opening new possibilities for the aquaculture industry. This
research contributes to the search for sustainable solutions and lays the groundwork for future
research in the optimization of production processes.
Keywords: AHPND, lysozyme, in vitro, in vivo, bovine plasma protein, symbiotic, Penaeus
vannamei, Vibrio parahaemolyticus.
IX
Índice general
Resumen ..................................................................................................................................... VIII
Abstract ......................................................................................................................................... IX
Índice general ................................................................................................................................. X
Abreviaturas ............................................................................................................................... XIII
Simbología ................................................................................................................................. XIV
Índice de ilustraciones..................................................................................................................XV
Índice de tablas ........................................................................................................................XVIII
Capítulo 1 ........................................................................................................................................ 1
1. Introducción ............................................................................................................................ 2
1.1. Descripción del problema ............................................................................................... 3
1.2. Justificación del problema .............................................................................................. 4
1.3. Objetivos ......................................................................................................................... 5
1.3.1. Objetivo general ...................................................................................................... 5
1.3.2. Objetivos específicos .............................................................................................. 5
1.4. Marco teórico .................................................................................................................. 5
1.4.1. Acuicultura mundial................................................................................................ 5
1.4.2. Acuicultura de Penaeus vannamei en Ecuador ....................................................... 6
1.4.3. Vibrio parahaemolyticus como agente patógeno causante de AHPND .................. 7
1.4.4. Sistema inmunológico en camarones P. vannamei ................................................. 8
X
1.4.5. Principios activos sometidos contra el Vibrio parahaemolyticus.......................... 10
Capítulo 2 ...................................................................................................................................... 15
2. Metodología .......................................................................................................................... 16
2.1 Pruebas in vitro ............................................................................................................. 16
2.1.1 Reactivación de la bacteria ................................................................................... 16
2.1.2 Crecimiento de la bacteria .................................................................................... 18
2.1.3 Concentración Mínima Inhibitoria (MIC) ............................................................ 18
2.1.4 Pruebas de antagonismo ........................................................................................ 24
2.2 Bioensayo ...................................................................................................................... 28
2.2.1 Montaje del sistema para las pruebas de crecimiento ........................................... 28
2.2.2 Preparación de dietas experimentales ................................................................... 32
2.2.3 Origen y aclimatación de camarones .................................................................... 37
2.2.4 Fase de alimentación con tratamientos experimentales ........................................ 38
2.2.5 Registro de peso .................................................................................................... 38
2.2.6 Análisis de resultados de pruebas in vitro y de crecimiento ................................. 39
Capítulo 3 ...................................................................................................................................... 40
3. Resultados y análisis ............................................................................................................. 41
3.1 Pruebas in vitro ............................................................................................................. 41
3.1.1 Lisozima ................................................................................................................ 41
3.1.2 Plasma bovino ....................................................................................................... 46
XI
3.1.3 Enzimas ................................................................................................................. 49
3.1.4 Simbiótico ............................................................................................................. 51
3.1.5 Suero de leche ....................................................................................................... 52
3.2 Bioensayo ...................................................................................................................... 54
3.2.1 Parámetros fisicoquímicos .................................................................................... 54
3.2.2 Pruebas de crecimiento ......................................................................................... 65
3.2.3 Alimentación ......................................................................................................... 69
3.2.4 Pruebas físicas del alimento .................................................................................. 70
Capítulo 4 ...................................................................................................................................... 72
4. Conclusiones y recomendaciones ......................................................................................... 73
4.1. Conclusiones ................................................................................................................. 73
4.2. Recomendaciones ......................................................................................................... 74
5. Referencias ............................................................................................................................ 75
XII
Abreviaturas
AHPND Enfermedad de la Necrosis Aguda del Hepatopáncreas
ANOVA Análisis de la varianza
CENAIM Centro Nacional de Acuicultura e Investigaciones Marinas
ELISA Enzimoinmunoanálisis de adsorción
EMS Síndrome de mortalidad temprana
ESPOL Escuela Superior Politécnica del Litoral
FAO Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación
IHHNV Virus de la Necrosis Infecciosa Hipodérmica y Hematopoyética
LB Medio Luria-Bertani
MIC Concentración Mínima Inhibitoria
mL Mililitros
ppm Partes por millón
UFC Unidades formadoras de colonia
UV Radiación ultravioleta
vs. Versus
WSSV Virus del Síndrome de la Mancha Blanca
𝛍𝐋 Microlitros
XIII
Simbología
mg Miligramo
pH Potencial de Hidrógeno
m Metro
XIV
Índice de ilustraciones
Figura 1. Siembra de bacteria patógena de V. parahaemolyticus en agar LB empleando técnica de
siembra por agotamiento ............................................................................................................... 17
Figura 2. Incubación de bacteria patógena de V. parahaemolyticus en agar LB a 35°C .............. 17
Figura 3. Preparación de las concentraciones de lisozima que se utilizó en el MIC .................... 19
Figura 4. Preparación del Florfenicol (antibiótico) que se usó como tratamiento control en los
MIC ............................................................................................................................................... 20
Figura 5. Incubación de la microplaca de ELISA previos a la lectura de estas ............................ 20
Figura 6.Lectura de las microplacas ELISA en el lector de microplacas ..................................... 21
Figura 7.Llenado de la microplaca de ELISA con las diferentes concentraciones del tratamiento,
un blanco (medio líquido LB puro) y un control (antibiótico) ..................................................... 22
Figura 8.Microplaca de ELISA con enzimas a diferentes concentraciones antes de realizar la
primera lectura .............................................................................................................................. 23
Figura 9.Siembra de bacteria patógena V. parahaemolyticus con hisopos esterilizados aplicando
la técnica de siembra por barrido .................................................................................................. 25
Figura 10.Perforación del agar en 4 pocillos para colocar las diferentes concentraciones a probar
del simbiótico ................................................................................................................................ 26
Figura 11.Introducción de las distintas concentraciones de simbiótico ........................................ 27
Figura 12.Elaboración de pruebas de sensibilidad para suero de leche ........................................ 28
Figura 13Limpieza y desinfección de las peceras previo al montaje del bioensayo .................... 29
Figura 14. Montaje del bioensayo para las pruebas de crecimiento ............................................. 30
Figura 15.Preparación del agua a utilizar en las pruebas de crecimiento ..................................... 31
XV
Figura 16. Llenado de las peceras para las pruebas de crecimiento con 4 tratamientos y 1 control
....................................................................................................................................................... 31
Figura 17. Esterilización del balanceado comercial triturado ....................................................... 33
Figura 18. Pesaje del alimento triturado y previamente esterilizado ............................................ 33
Figura 19. Hidratación del pellet con agua destilada .................................................................... 34
Figura 20. Proceso de reconstitución del alimento balanceado .................................................... 35
Figura 21. Proceso de horneado del balanceado por tratamiento experimental ........................... 36
Figura 22. Producto final del balanceado con proteína de plasma bovino ................................... 36
Figura 23. Pesaje de los camarones por pecera de tratamiento.................................................... 37
Figura 24. Alimentación de camarones por tratamiento experimental ......................................... 38
Figura 25.Concentración vs Absorbancia del producto experimental Lisozima en 4 h de
incubación. .................................................................................................................................... 41
Figura 26. Concentración vs Absorbancia del producto experimental Lisozima en 4 h de
incubación a diferentes concentraciones y en ausencia de producto experimental. ..................... 43
Figura 27. Concentración vs Absorbancia de la proteína de plasma bovino en 5 h de incubación
....................................................................................................................................................... 46
Figura 28. Comparación concentración vs Absorbancia de la proteína de plasma bovino en 5 h de
incubación a diferentes concentraciones y con un grupo de control. ........................................... 47
Figura 29. Crecimiento bacteriano en 3 concentraciones de Plasma bovino en función de la
absorbancia. .................................................................................................................................. 48
Figura 30. Comparación de concentración vs Absorbancia de Enzimas en 4 h de incubación, a
diferentes concentraciones y con un grupo de control. ................................................................. 49
XVI
Figura 31. Crecimiento bacteriano en 3 concentraciones de Enzimas en función de la
absorbancia. .................................................................................................................................. 51
Figura 32. Efecto de la concentración de simbiótico en la longitud de halo (promedio ±
desviación estándar). ..................................................................................................................... 52
Figura 33. Efecto de la concentración de simbiótico en la longitud de halo (promedio ±
desviación estándar). ..................................................................................................................... 53
Figura 34. Cantidad de oxígeno disuelto (mg/L) en cada uno de los tratamientos experimentales.
....................................................................................................................................................... 54
Figura 35.Temperatura (oC) en cada uno de los tratamientos experimentales. ............................. 57
Figura 36. Medición de pH en cada uno de los tratamientos por semana experimentación. ........ 59
Figura 37. Medición de Amonio en cada uno de los tratamientos por semana experimentación. 61
Figura 38. Medición de nitrito en cada uno de los tratamientos por semana experimentación. ... 62
Figura 39. Medición de nitrato en cada uno de los tratamientos por semana experimentación. .. 63
Figura 40. Peso semanal de los tratamientos experimentales en los 34 días de experimentación.65
Figura 41. Crecimiento semanal de los tratamientos experimentales en los 34 días de
experimentación. ........................................................................................................................... 66
Figura 42. ...................................................................................................................................... 68
Figura 43. Dosis de alimentación semanal para cada uno de los tratamientos experimentales en 5
semanas. ........................................................................................................................................ 69
Figura 44. Tiempo de respuesta en camarones entre los tratamientos experimentales y el control.
....................................................................................................................................................... 70
XVII
Índice de tablas
Tabla 1. Concentración vs. Absorbancia del producto experimental Lisozima en 4 h de
incubación a diferentes concentraciones y en ausencia de producto experimental. ..................... 42
XVIII
Capítulo 1
1. Introducción
El cultivo de camarones es una actividad económica importante para varias regiones del
mundo debido a su alta demanda en el mercado global. A nivel mundial, el camarón es cultivado
en más de 50 países desde hace varias décadas, la mayor concentración se encuentra en dos
regiones principales: Asia y América latina (Jory, 2018). La mayor parte del suministro
producido va dirigido a consumidores de altos ingresos en países como Estados Unidos, Japón,
China y la Unión Europea, principalmente.
Con el tiempo, las exportaciones de camarones han aumentado de forma imparable,
ocupando una proporción creciente en el mercado de exportaciones de productos acuáticos del
mundo. En 1976, el valor por exportaciones de camarones rodeaba los 1200 millones de dólares
(USD), lo que representaba el 15,4% del valor de las exportaciones mundiales de productos
acuáticos. Mientras que, en 2020, esta cifra alcanzó los 24.700 millones de dólares (USD),
representando el 16,4% del total (FAO, 2022).
El camarón blanco del pacífico (Penaeus vannamei) es la especie de camarón comercial más
importante en el mundo, representando más del 76% de todos los camarones cultivados y más
del 45% de todos los camarones producidos, incluyendo la acuicultura y la pesca (Jory, 2018).
Ecuador es uno de los principales productores de P. vannamei en el mundo y esta industria es
una importante fuente de ingresos y empleo para el país. Se estima que la camaronicultura genera
180 mil plazas de empleo, directo e indirecto y, en conjunto con la pesca, representan el 5% de
las plazas de trabajo en el país (Ávila et al., 2021).
Pese a la importancia que tiene este sector en la economía del país, la producción de
camarones ha enfrentado varios desafíos. Entre estos se destaca la aparición de enfermedades de
2
origen viral como: la Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV), el Virus del Síndrome
de Taura (TSV), Virus de la Necrosis Infecciosa Hipodérmica y Hematopoyética (IHHNV) y las
enfermedades de origen bacteriano como: el Síndrome de la Gaviota y la Enfermedad de la
Necrosis Aguda del Hepatopáncreas (AHPND) (Ministerio de Agricultura y Ganadería, 2023).
Esta última ha causado un impacto devastador en la economía de la industria acuícola del
mundo, con cifras que alcanzan los 12 mil millones de dólares (USD) (Aranguren et al., 2020).
En este contexto, la investigación y el desarrollo de productos comerciales para el control de
vibrios se han convertido en un tema de gran interés para la industria camaronera en Ecuador y el
mundo. Debido a esto, se propone una metodología para la determinación in vitro de dosis
óptimas de 3 productos experimentales para inhibir crecimiento en una cepa patógena de Vibrio
parahaemolyticus causante de AHPND. Al mismo tiempo, la metodología propuesta incluye la
realización de pruebas de crecimiento experimentales en condiciones controladas, utilizando un
grupo de control y un tratamiento por cada producto experimental evaluado.
Se espera que los resultados de este trabajo contribuyan al desarrollo de productos
comerciales más eficaces y seguros para el control de AHPND en el cultivo de camarones en
Ecuador. De esta manera, se busca mejorar la producción y la rentabilidad de esta importante
industria para el país.
1.1. Descripción del problema
En Ecuador, la producción de camarón blanco (Penaeus vannamei) se ve frecuentemente
afectada por enfermedades bacterianas como la Enfermedad de la Necrosis Aguda del
Hepatopáncreas (AHPND), causada por una cepa patógena de V. parahaemolyticus (Tran et al.,
2013ª). Esta enfermedad puede resultar en tasas de mortalidad de hasta el 100% en los primeros
10 - 30 días de cultivo después de la siembra (Cuéllar-Anjel, 2013), traduciéndose en grandes
3
pérdidas para la industria del camarón, que desde enero del presente año (2023) es reconocida
como la principal fuente de ingreso por exportaciones superando por primera vez al petróleo
crudo (El Comercio, 2023).
Actualmente, los métodos convencionales para el control de AHPND, como desinfectantes y
antibióticos, han demostrado poca eficiencia. Además, estos últimos pueden generar resistencia
antimicrobiana y aportar residuos a los cuerpos de agua de descarga. Por lo anterior, se buscó que
los productos experimentales que se evaluaron en este estudio fueran alternativas a los
antibióticos para el control de AHPND.
1.2. Justificación del problema
El sector de la acuicultura en Ecuador ha experimentado un crecimiento acelerado en los
últimos años, gracias a la implementación de políticas públicas que han impulsado el desarrollo
de la industria y a la adopción de tecnologías de producción avanzadas. Sin embargo, la
producción de camarones también enfrenta desafíos, como la presencia de enfermedades y la
necesidad de utilizar técnicas de manejo ambientalmente sostenibles. Con estos antecedentes, es
importante seguir investigando y desarrollando estrategias innovadoras para mejorar la
producción de camarones, asegurando su calidad y sostenibilidad en el tiempo (Jory, 2018).
La evaluación de productos comerciales para controlar vibrios en camarones es una iniciativa
relevante que contribuye a la mejora de la producción y a la protección del medio ambiente, al
reemplazar la utilización de los antibióticos en toda la cadena productiva. Los productos pueden
llegar a reducir mortalidades y mejorar las supervivencias de camarón en las piscinas
productoras, luego de infecciones naturales con cepas patógenas de vibrios, consiguiendo
aumentar las ganancias económicas de los camaroneros ecuatorianos.
4
1.3. Objetivos
1.3.1. Objetivo general
• Determinar la dosis óptima de 3 productos experimentales mediante pruebas in vitro para
inhibir el crecimiento de una cepa patógena de V. parahaemolyticus causante de AHPND
1.3.2. Objetivos específicos
• Determinar la dosificación óptima de 3 productos experimentales para inhibir el
crecimiento de una cepa patógena de V. parahaemolyticus causante de AHPND en
camarones P. vannamei
• Adaptar un protocolo de molienda, mezclado y reconstitución de pellets comerciales para
camarones, incorporando 3 productos experimentales y sometiéndolos a pruebas físicas de
calidad
• Evaluar la tasa de crecimiento en camarones juveniles P. vannamei sometidos a 3
tratamientos experimentales
1.4. Marco teórico
1.4.1. Acuicultura mundial
La acuicultura se define como todo conjunto de actividades, técnicas y conocimientos del
cultivo de especies acuáticas (vegetales y animales) de interés acuícola desde peces hasta
crustáceos, moluscos y algas, para fines comerciales y de repoblación (Rueda, 2011). La
acuicultura proporciona proteínas de alta calidad, ácidos grasos esenciales y nutrientes clave, por
lo que la seguridad alimenticia y la nutrición a nivel mundial son complementadas por esta
actividad y el consumo de alimentos acuáticos ha ido aumentando a un ritmo anual del 3% desde
1961 hasta la actualidad. De la producción total de especies acuáticas, más del 89% (157
millones) es destinado al consumo humano (FAO, 2022).
5
La producción acuícola ha experimentado crecimientos significativos durante las últimas
décadas, convirtiéndose en una de las principales fuerzas en la producción mundial de alimento.
Tanto así, que la producción de especies acuícolas en 2020 fue superior en 30% a la media
producida durante la década de los 2000 y 60% mayor a la media de la década de los 90 (FAO,
2022). Sin embargo, la creciente expansión de esta industria se ha visto obstaculizada por
diversos factores como las repercusiones de la enfermedad COVID-19 (2019 – 2021), nuevos
brotes de enfermedades virales y bacterianas, y cuestiones políticas, ambientales y sociales.
1.4.2. Acuicultura de Penaeus vannamei en Ecuador
La producción de camarón blanco P. vannamei en Ecuador tuvo sus inicios hace más de
cinco décadas en el cantón de Santa Rosa, provincia de El Oro. Desde entonces, se han
desarrollado cerca de 220 mil hectáreas de piscinas de producción (Piedrahita, 2018).
Inicialmente los cultivos se realizaban de manera extensiva (densidades de 8-10 camarones/m2) y
alcanzaban un máximo de dos ciclos por año. En cambio, en la actualidad se realiza mayormente
cultivos semi-intensivos (densidades de 12-25 camarones/m2) y se alcanza hasta 3 ciclos de
producción al año.
Para la economía interna del Ecuador, la industria camaronera es considerada una base
sustancial para el desarrollo económico debido a que el camarón se convirtió en el principal
producto de exportación superando al petróleo. El cultivo de camarón blanco se convirtió en la
principal fuente de ingresos por exportaciones del país con 4.396 millones de dólares (USD),
superando por primera vez al petróleo crudo que consiguió un valor de 4.082 millones de dólares
(USD) en el periodo de enero a julio del presente año (El Universo, 2023).
La acuicultura ecuatoriana debe gran parte de su éxito a las condiciones climáticas del país,
que favorece el desarrollo del camarón y a la implementación de nuevas tecnologías que
6
optimizan la producción de este crustáceo. Además, el camarón ecuatoriano es considerado como
un producto destacado de consumo gracias a sus altos estándares de calidad y trazabilidad (Ávila
et al., 2021).
1.4.3. Vibrio parahaemolyticus como agente patógeno causante de AHPND
A inicios del año 2009, el cultivo de camarón al sureste de China era considerada la industria
camaronera más productiva del mundo. Sin embargo, una enfermedad emergente conocida como
el Síndrome de la Mortalidad Temprana (EMS) causó altas perdidas en la producción de este
sector. Actualmente, está enfermedad fue renombrada como la Enfermedad de la Necrosis Aguda
del Hepatopáncreas (AHPND) ya que se demostró que esta enfermedad afecta principalmente las
células epiteliales de hepatopáncreas (Cuéllar-Anjel et al., 2012; Varela & Peña, 2014).
Para el 2012, el AHPND se había expandido a países como Vietnam, Malasia y Tailandia. Al
inicio, la etiología de esta enfermedad era desconocida. Después de varios estudios realizados
por Lightner et al. en el 2012, se demostró que la naturaleza de esta enfermedad está mediada por
toxinas.
En otros estudios, se consiguió determinar que el AHPND se origina tras la colonización del
tracto digestivo del camarón por una cepa patógena de V. parahaemolyticus que libera las toxinas
PirA y PirB mediante genes que codifican para éstas, las cuales afectan el hepatopáncreas
(Cuéllar-Anjel et al., 2012; Tran et al., 2013); González-Gómez et al., 2023. Por su lado, Cuéllar-
Anjel y Brock (2018) propusieron una nueva hipótesis sobre la patogénesis de esta enfermedad.
Estos investigadores sugieren que partículas orgánicas en suspensión y en el fondo de reservorios
y piscinas de cultivo de camarón, son colonizadas por cepas bacterianas patógenas causantes de
AHPND, las cuales liberan toxinas mediante el proceso de quorum sensing e impregnan la
7
partícula orgánica con altas cantidades de toxinas. El camarón ingiere estas partículas cargadas
de toxinas y se enfermad muy rápidamente, especialmente si está en estadio de postlarva.
Los signos clínicos que aparecen con a esta enfermedad son: hepatopáncreas pálido a blanco
y atrofiado, nado errático, crecimiento reducido en un 50%, textura blanda del exoesqueleto,
anorexia y contenido intestinal interrumpido (Varela & Peña, 2014).
Durante el desarrollo de la enfermedad se presentan tres fases: aguda, intermedia y terminal.
Mediante cortes histopatológicos podemos describir las características que diferencian las fases.
En la fase aguda, se observan anomalías que producen pérdidas en el funcionamiento de las
células epiteliales de almacenamiento y digestión de los túbulos del hepatopáncreas. Además, se
detiene la división de las células germinales y existe un gran desprendimiento de las células
hacia el intestino, lo que causa la atrofia del hepatopáncreas. En la fase intermedia, se empiezan
a presentar túbulos melanizados por necrosis en zonas proximales y avanzando hacia zonas
distales mientras continua el desprendimiento celular. Por último, durante la fase terminal de la
enfermedad, se alcanza la destrucción del hepatopáncreas por acción bacteriana primaria y
secundaria. Existe una fuerte infiltración hemocítica intra y extra tubular en conjunto con
melanosis y necrosis severa (Lightner et al., 2012).
Esta enfermedad aparece en los criaderos de postlarva en los primeros 20 a 30 días de
cultivo. Las mortalidades pueden alcanzar el 100% en estanques severamente afectados (Cuéllar-
Anjel, 2013).
1.4.4. Sistema inmunológico en camarones P. vannamei
El sistema inmune tiene como función principal preservar la individualidad biológica, pues
diferencia y elimina todo material o cuerpo no identificado en los tejidos del animal por medio
8
de la conjugación de los efectores celulares y humorales, los crustáceos como los camarones
poseen un sistema inmune muy diferente a los de los vertebrados, esto se debe a que en ellos hay
una ausencia tanto de células linfoides como de inmunoglobulinas (Rendón & Balcázar, 2003).
El sistema inmune del camarón está conformado por las barreras físicas y por las células
humorales, y aunque no tengan respuestas inmunes específicas para identificar agentes
infecciosos, su sistema inespecífico es muy desarrollado. Este es un sistema que está basado en
hemocitos, enzimas antioxidantes y varias células proteicas antimicrobianas que sirven de
defensa (Moreno et al., 2013; Morales y Cuéllar-Anjel, 2014).
Por otra parte, existen factores que pueden repercutir a este sistema inmune, estos factores
pueden ser tanto de carácter ambiental, que involucra los factores bióticos y abióticos,
nutricionales y energéticos. Específicamente los abióticos son los que más influyen al camarón
para resistir las enfermedades dentro de un estanque acuícola, entre estos factores se encuentran:
la salinidad, la temperatura, el oxígeno, el pH, y los compuestos nitrogenados(Martín et al.,
1985).
Para evaluar la respuesta inmune del camarón se realiza una medición de parámetros
inmunológicos, recuento total de hemocitos (hemograma), actividad fagocítica, actividad
bactericida, actividad lisozimática y la actividad superóxido dismutasa, todas estas mediciones se
realizan mediante la toma de muestra de la hemolinfa del camarón (Luna-González et al., 2013).
9
1.4.5. Principios activos sometidos contra el Vibrio parahaemolyticus
1.4.5.1. Lisozima. Es una enzima presente en diversos organismos, incluyendo animales y
plantas, que tiene actividad antimicrobiana. La lisozima recombinante del camarón tigre
japonés y del camarón blanco ha mostrado actividad lítica contra varios tipos de bacterias
patógenas en sistemas acuícolas, incluyendo especies de Vibrio (Hikima et al., 2003).
Además, se ha demostrado que su aplicación en combinación con bacteriófagos puede
mejorar la actividad in vitro del fago y potenciar su uso en sistemas acuícolas. También se
ha investigado el efecto de la lisozima en la salud y productividad del camarón blanco del
Pacífico, mostrando una mejora en la tasa de crecimiento, capacidad antioxidante y
parámetros inmunes de la hemolinfa (Javahery et al., 2019). Además, se ha planteado la
hipótesis de que la suplementación con lisozima reduce el número de vibrios y promueve
la expresión de genes relacionados con actividad inmune y antioxidante, lo que resulta en
resistencia a la infección con vibrios y brotes del Síndrome de Heces Blancas
(Woraprayote et al., 2020). La actividad enzimática a nivel gastrointestinal, el incremento
en los niveles de lisozima en la hemolinfa y la mejora en la actividad de las enzimas
digestivas sugieren que la lisozima estimula la expresión de genes en el borde de cepillo
del tracto gastrointestinal del camarón, mejorando la utilización de nutrientes de la ración
y promoviendo una mejor salud del tracto gastrointestinal (Javahery et al., 2019). De esta
manera se cree que la lisozima puede ser un compuesto con un gran potencial de
aplicación en sistemas acuícolas principalmente como medida para el control de
patógenos y la mejora de la salud y productividad de los camarones.
10
1.4.5.2. Simbiótico El simbiótico hace referencia a la combinación de un probiótico y un
prebiótico. El término simbiótico hace referencia a un suplemento dietético conformado
tanto por prebióticos y por probióticos. Los prebióticos son suplementos que ayudan al
crecimiento y supervivencia de los probióticos dentro del tracto intestinal del huésped,
alterando la comunidad de bacterias que se encuentran presenten en el intestino (Mondal
et al., 2017). Para la conformación de un simbiótico es importante considerar la
capacidad que poseen estos compuestos. En el caso particular del probiótico, su elección
depende de la capacidad que posee el mismo para promover el crecimiento de bacterias
beneficiosas en el huésped (Kolida & Gibson, 2011). Mientras que, en los prebióticos la
elección se basa en la capacidad que tienen los mismos para optimar el crecimiento de los
probióticos. Pese a esto, la composición de un simbiótico depende netamente del
mecanismo de acción del prebiótico en la especie huésped (Mazzola et al., 2015). Es por
esto por lo que los prebióticos más optados para formar parte de los simbióticos son los
que poseen un bajo grado de polimerización, puesto a que hidrolizan cepas beneficiosas y
producen metabolitos que pueden ser provechosos para el huésped (Grimoud et al.,
2010). La administración de simbióticos en camarones ha resultado en gran manera
efectiva en comparación de los probióticos o prebióticos suministrados individualmente,
mejorando la supervivencia y calidad de agua (Merrifield et al., 2010; Sekhon & Jairath,
2010; Zubaidah et al., 2015). Además, ha mejorado la eficiencia de las bacterias
probióticas, y proliferado varios parámetros inmunológicos que aumentan la capacidad de
competitividad contra infecciones de origen bacteriano y viral (Huynh et al., 2018;
Nurhayati et al., 2014).
11
1.4.5.3 Bacteriófago. También conocidos como “fagos”, son virus predadores naturales
específicos de bacterias, se auto limitan y se autoreplican en una célula hospedera y
se pueden adaptar a cualquier bacteria resistente (Subhashini & Kumar, 2020). La
terapia con bacteriófagos es considerada como una de las alternativas más viables a
los antibióticos para el tratamiento de infecciones bacterianas en los sistemas de
acuicultura. El uso de bacteriófagos para controlar infecciones bacterianas en
producción de alimento acuático tiene gran potencial para combatir dos problemas:
las infecciones bacterianas y la contaminación por residuos.
La aplicación de fagos en la acuicultura ha demostrado tener buenos avances por
sobre el uso de antibióticos. El uso de fagos para el control biológico de patógenos
en camarones cultivados ha generado un creciente interés en los últimos años, ya
que, no existen residuos de antibióticos o toxicidad asociadas con esta terapia. Su
modo de accionar implica unirse a la bacteria hospedera específica y matar por
replicación interna y posterior lisis bacteriológica.
1.4.5.4 Proteína suero de leche. Es un producto de origen orgánico que está compuesto por
bacterias ácido-lácticas enriquecidas con nutrientes importantes como nitrógeno,
calcio, proteínas y carbohidratos (Nindalgo & Grupograndes, 2023). Estas bacterias
tienen la capacidad de transformar azúcares en ácido láctico, controlar patógenos y
enfermedades, solubilizar el fósforo en la tierra y modificar el pH en el área que se
aplica. Asimismo, activa los mecanismos de defensa de la planta y mejora las
condiciones para el desarrollo del cultivo, promoviendo la formación de clorofila, el
metabolismo de la planta y la división celular. En adición a esto, mejora la estructura
física de los suelos, aumenta la utilización de nutrientes y la calidad del cultivo,
12
retiene el agua, aumenta la fertilidad y permeabilidad del suelo y promueve el
crecimiento robusto de las plantas (Nindalgo & Grupograndes, 2023).
1.4.5.5 Proteína de plasma bovino. Es un producto alimenticio funcional obtenido a partir
de la fracción plasmática de la sangre bovina. Este producto en polvo seco por
atomización se compone principalmente de proteínas y cuenta con un alto porcentaje
de digestibilidad. Además, su contenido de ceniza, humedad y grasa es bajo, lo que
lo hace ideal para su uso en la alimentación de animales. Incluye varias proteínas de
alto índice de digestibilidad y valor nutricional, principalmente albúmina e
inmunoglobulina, obtenidas a través de un proceso tecnológico que asegura la
preservación de sus características bioquímicas originales, en conjunto con la
seguridad alimentaria a lo largo del proceso de trazabilidad integral (Chuchird et al.,
2021). El uso de este producto se da principalmente como método de prevención de
vibrios. Su inclusión en la dieta de los animales ha demostrado reducir la mortalidad
y prevenir la infección intestinal por bacterias patógenas. Este producto es utilizado
como alimento para acuicultura, alimento para mascotas, alimento para cerdos y
alimento para aves de corral. Su uso ha demostrado mejorar la conversión
alimenticia, aumentar el incremento diario de peso de los animales y reducir el uso
de antibióticos en los animales jóvenes.
1.4.5.6 Enzimas. En el campo de la acuicultura, son utilizadas para mejorar la calidad de
agua y el suelo en los estanques acuícolas, pues estas cumplen con un papel
catalizador, apresurando las reacciones bioquímicas que se dan tanto en el agua como
13
en el suelo, degradando cada uno de los compuestos orgánicos en la superficie o en el
lugar donde se disperse (Santos, 2020). Cada enzima posee un modo de acción
individual y es muy específica al realizar las reacciones químicas catalíticas. Las
enzimas son producidas por diversos microorganismos entre los más populares se
encuentran las especies de los Bacillus, los cuales producen enzimas extracelulares
dadas por la fermentación aeróbica tales como la proteasa, la amilasa y la celulasa,
que aceleran tanto la descomposición de la materia orgánica como la degradación del
amoníaco, el cual es un compuesto tóxico presente en los tanques acuícolas (Mayer,
2016).
14
Capítulo 2
15
2. Metodología
Dentro de este capítulo se describirán la realización de pruebas in vitro que permitirán
determinar la concentración optima de cada producto que inhiba el crecimiento del V.
parahaemolyticus entre las pruebas realizadas se encuentran MIC, y pruebas de sensibilidad. Por
otra parte, también se describen el proceso de montaje, ejecución y toma de datos del bioensayo
y de la elaboración del balanceado.
2.1 Pruebas in vitro
Las pruebas in vitro se realizaron para determinar las mejores dosis de los productos para
inhibir el crecimiento de V. parahaemolyticus en camarones. A pesar de que el título del proyecto
aclara que se trabajara con 3 productos, al final pudimos obtener resultados con 5 productos:
lisozima, proteína de plasma bovino, enzimas, simbiótico y suero de leche.
2.1.1 Reactivación de la bacteria
Se obtuvo a través de una fuente de la ESPOL, una cepa patógena de V. parahaemolyticus
que estaba almacenada a una temperatura de -80°C, la cual fue cuidadosamente reactivada
protegiendo su patogenicidad, con el fin de ser utilizada en este estudio. El proceso implicó
cultivo en agar LB (Luria-Bertani), el cual proporcionó condiciones adecuadas para su
recuperación, utilizando una técnica de siembra por agotamiento. La incubación se realizó bajo
una temperatura controlada de 35°C durante un periodo de 24 horas, lo que permitió un buen
crecimiento bacteriano. La bacteria fue repicada diariamente en medio LB durante una semana
de acuerdo con los análisis in vitro planificados para mantener la cepa.
16
Figura 1. Siembra de bacteria patógena de V. parahaemolyticus en agar LB empleando técnica de siembra por agotamiento
Siembra de bacteria patógena de V. parahaemolyticus en agar LB empleando técnica de siembra
por agotamiento
Nota. En la figura se observa el proceso de siembra de bacteria patógena que es primordial para
la reactivación de esta, haciéndola apta para usarse en pruebas in vitro.
Figura 2. Incubación de bacteria patógena de V. parahaemolyticus en agar LB a 35°C
Incubación de bacteria patógena de V. parahaemolyticus en agar LB a 35°C
17
Nota. En la figura se observa la bacteria patógena sembrada en agar e incubada durante 24
horas a una temperatura de 35°C con el fin de promover el crecimiento bacteriano.
2.1.2 Crecimiento de la bacteria
Para el crecimiento de la bacteria se emplearon tubos de ensayo estériles de 20 ml, los
cuales fueron llenados con 9 ml de medio líquido LB. En cada tubo se inoculó una colonia de
bacterias de la cepa patógena de V. parahaemolyticus. Posteriormente estos tubos fueron colocados
en el Shaker dentro de la incubadora por un periodo de 2 horas. De cada tubo de ensayo se llenaron
3 pozos de una microplaca de ELISA (se trabajó por triplicado) poniendo en cada uno 200 µL de
medio LB con bacterias. Se midió concentración bacteriana de cada tubo empleando un lector de
microplacas de ELISA (SYNERGY HTX) con una longitud de onda de 600 nm, con el fin de
confirmar que se obtuvo una concentración de 1x108 (1.0E+08) UFC/ml. Finalmente, se realizaron
varias diluciones de las bacterias con el objetivo de obtener las concentraciones ideales para las
pruebas in vitro que se realizaron posteriormente.
2.1.3 Concentración Mínima Inhibitoria (MIC)
Esta prueba se realizó con lisozima, enzimas y proteína de plasma bovino. Partiendo de una
colonia bacteriana de V. parahaemolyticus cultivada por 24 horas a 34°C en medio LB, se
inoculó en medio líquido LB y se dejó creciendo por 2 horas a 30°C. Simultáneamente, se
prepararon los productos experimentales a las concentraciones seleccionadas para este estudio en
microtubos de 2 ml, que fueron las siguientes: lisozima: 500, 1000 y 2000 ppm; enzimas: 10%,
20%, 40%, 50%, 70% y 100% y proteína de plasma bovino: 3000, 6000 y 10000 ppm.
Asimismo, se preparó el antibiótico Florfenicol a 300 ppm y se realizaron diluciones con
solución salina al 2%, con el fin de obtener una concentración de 50 ppm, la cual fue utilizada
como control. En una microplaca de ELISA, se probaron las diferentes concentraciones del
18
producto frente a una concentración de bacteria de 1x105 (1.0E+05). Una vez llenos los pozos de
la microplaca, esta fue incubada a 35°C durante 6 horas con lecturas cada hora, con el fin de
monitorear inhibición del crecimiento bacteriano en función del tiempo.
Figura 3. Preparación de las concentraciones de lisozima que se utilizó en el MIC

Preparación de las concentraciones de lisozima que se utilizó en el MIC
Nota. En el proceso se muestra cómo se realizó la dilución del producto (previamente pesado y
colocado en los microtubos de 2000 µL) con medio líquido LB.
19
Figura 4. Preparación del Florfenicol (antibiótico) que se usó como tratamiento control en
los MIC
Preparación del Florfenicol (antibiótico) que se usó como tratamiento control en los MIC
Nota. La imagen muestra la preparación del antibiótico que tuvo que ser disuelto con etanol al
99% y luego con solución salina al 2% para que llegue a la concentración deseada.
Figura 5. Incubación de la microplaca de ELISA previos a la lectura de estas

Incubación de la microplaca de ELISA previos a la lectura de las mismas
Nota. Se realizó la incubación a 35oC, por un tiempo de 24 a 48 h.
20
Figura 6.Lectura de las microplacas ELISA en el lector de microplacas
Lectura de las microplacas ELISA en el lector de microplacas
Nota. El lector fue desinfectado antes y después de cada lectura.
2.1.3.1 Lisozima
En este proceso, se partió de una solución inicial de medio LB + lisozima con una
concentración de 10000 ppm, de donde se obtuvieron las dosis a evaluarse de 500, 1000 y 2000
ppm. Cada dosis tuvo 10 réplicas, en donde se colocó 180 uL de las dosis experimentales + 0.20
uL de bacteria con una concentración de 1x105 UFC/ml (1.0E+05).
Además, se tuvo un control de 180 uL de medio + 0.20 uL de bacteria y un segundo
control donde se aplicó 180 uL florfenicol a 50 ppm + 20 uL de la misma bacteria, un blanco, en
donde se colocó 200 uL de medio puro LB. Una vez llena la placa ELISA, se realizó la lectura
inicial y se colocó en la incubadora a 35 °C. Se realizaron las lecturas cada hora durante 6 horas.
21
Figura 7.Llenado de la microplaca de ELISA con las diferentes concentraciones del
tratamiento, un blanco (medio líquido LB puro) y un control (antibiótico)
Llenado de la microplaca de ELISA con las diferentes concentraciones del tratamiento, un blanco
(medio líquido LB puro) y un control (antibiótico)
Nota. Todas las diluciones fueron realizadas con solución salina al 2% y esta solución abarco 10
réplicas para cada concentración.
2.1.3.2 Enzimas
En este proceso, se utiliza una metodología muy similar a la descrita previamente, con
concentraciones distintas en los tratamientos. De la misma manera, se partió de una solución
inicial de medio LB + enzimas. Para las enzimas se utilizó el 10%, 20%, 40%, 50%, 70% y el
90% de concentración. Cada tratamiento tuvo 10 réplicas en dónde se colocó 180 uL del
tratamiento + 20 uL de bacteria con una concentración de 1x105 UFC/ml (1.0E+05).
Además, se utilizó un control con 180 uL de medio líquido LB + 20 uL de bacteria a la
misma concentración y un segundo control de 180 uL florfenicol a 50 ppm + 20 uL de la misma
bacteria. Por último, se empleó un blanco con 200 uL de medio líquido LB puro. Una vez llena la
22
microplaca ELISA, se realizó la lectura inicial y se colocó en la incubadora a 35°C. Se realizaron
las lecturas cada hora durante 5 horas.
Figura 8.Microplaca de ELISA con enzimas a diferentes concentraciones antes de realizar la primera lectura
Microplaca de ELISA con enzimas a diferentes concentraciones antes de realizar la primera
lectura.
Nota. Las lecturas se realizaron cada dos horas para observar el comportamiento enzimático
2.1.3.3 Proteína de plasma bovino
En esta prueba se probaron 3 dosis distintas, 3000, 6000 y 10000 ppm. Siguiendo la
metodología mencionada anteriormente, cada dosis evaluada tuvo 10 réplicas, en donde se
colocó 180 uL de las dosis experimentales + 0.20 uL de la bacteria con una concentración de
1x105 UFC/ml (1.0E+05). También, se usó un control de 180 uL de medio LB + 20 uL de la
bacteria y un segundo control donde se usó 180 uL de florfenicol a 50 ppm + 20 uL de la misma
bacteria, un blanco, en donde se colocó 200 uL de medio LB puro y se utilizó florfenicol a 50
23
ppm. Una vez llena la placa, se realizó la lectura inicial y se colocó en la incubadora a 35°C. Se
realizaron las lecturas cada hora durante 6 horas
2.1.4 Pruebas de antagonismo
Esta prueba se realizó para el simbiótico y el suero de leche. Partiendo de una colonia
bacteriana de V. parahaemolyticus cultivada por 24 horas a 35°C en medio LB, se inoculó en
medio líquido LB y se dejó creciendo por 2 horas a 32°C en el Shaker. Simultáneamente, se
prepararon los productos experimentales a las concentraciones seleccionadas para este estudio en
microtubos de 2 ml, que fueron las siguientes: simbiótico 150000 ppm, 250000 ppm y 800000
ppm; suero de leche: 10000 ppm, 20000 ppm y 30000 ppm.
Anteriormente, se prepararon cajas de agar Müeller Hinton, en las cajas se sembró la
bacteria con una técnica de barrido a una concentración de 1x106 UFC (1.0E+06). Posterior a
esto, se realizaron 4 perforaciones en el agar para introducir 200 µL de las diferentes
concentraciones de los productos experimentales a probar, en este caso 4 para cada producto,
frente al control (Florfenicol a 50 ppm).
Una vez llenas, las cajas Petri fueron encubadas durante 24 horas a una temperatura contante
de 35°C. Ya cumplido el tiempo de incubación se procedió a medir los halos de inhibición
alrededor de las perforaciones. Esto permitió determinar cuál fue la concentración más efectiva
para inhibir el crecimiento de la bacteria patógena.
Para avalar la precisión y reproducibilidad de esta prueba se efectuaron 3 réplicas, evaluando
la efectividad de estas concentraciones frente a la bacteria.
24
Figura 9.Siembra de bacteria patógena V. parahaemolyticus con hisopos esterilizados aplicando la técnica de siembra por barrido
Siembra de bacteria patógena V. parahaemolyticus con hisopos esterilizados aplicando la
técnica de siembra por barrido
Nota. El crecimiento de bacterias se observó 24 horas después de la siembra.
25
Figura 10.Perforación del agar en 4 pocillos para colocar las diferentes concentraciones a probar del simbiótico
Perforación del agar en 4 pocillos para colocar las diferentes concentraciones a probar del
simbiótico
Nota. Las puntas fueron esterilizadas en autoclave antes de ser usadas en los procesos.
2.1.4.1 Simbiótico
En esta prueba se testearon 3 concentraciones distintas: 150000 ppm, 250000 ppm y 800000
ppm, contra la bacteria patógena a una concentración de 1x106 UFC (1.0E+06). Esta fue
sembrada por barrido con hisopos esterilizados por calor. Posterior a esto, con el reverso de
puntas estériles de micropipetas, se realizaron los agujeros (4) en donde se introdujo el producto
experimental. El producto fue pesado y diluido en solución salina al 2%, para luego ser
introducido con ayuda de la micropipeta hasta llenar el agujero hasta el ras. Se utilizó un control
de antibiótico con florfenicol a una concentración de 150 ppm. Cada producto tuvo 4 réplicas.
26
Figura 11.Introducción de las distintas concentraciones de simbiótico
Introducción de las distintas concentraciones de simbiótico
Nota. Los agujeros eran llenados hasta el ras con aproximadamente 200 uL.
2.1.4.2 Suero de leche
En esta prueba se probaron 3 concentraciones distintas: 10000 ppm, 20000 ppm y 30000
ppm, contra la bacteria patógena a una concentración de 1x106 UFC (1.0E+06). Misma que fue
sembrada por barrido con hisopos esterilizados por calor. Posterior a esto, con el reverso de
puntas estériles de micropipetas, se realizaron los agujeros (4) en donde se introdujo el producto
experimental. El producto fue pesado y diluido en solución salina al 2%, para luego ser
introducido con ayuda de la micropipeta hasta llenar el agujero hasta el ras. Se utilizó un control
de antibiótico con florfenicol a una concentración de 150 ppm. Cada producto tuvo 4 réplicas.
27
Figura 12.Elaboración de pruebas de sensibilidad para suero de leche
Elaboración de pruebas de sensibilidad para simbiótico y suero de leche.
Nota. Las cajas fueron incubadas a 35°C por 24 horas para posteriormente medir halos de
inhibición bacteriana.
2.2 Bioensayo
2.2.1 Montaje del sistema para las pruebas de crecimiento
Para comenzar el bioensayo se limpiaron, desinfectaron y llenaron las peceras con 20 L de
agua a una salinidad de 30 ppt y se proporcionó aireación a cada una de ellas, a fin de medir la
eficiencia del sistema. El agua que se utilizó fue proporcionada por el Centro Nacional de
Investigaciones Marinas (CENAIM), ubicado en San Pedro, Santa Elena. El agua tenía una
salinidad inicial de 35 ppt y con el fin de disminuir la salinidad se diluyó con agua potable
previamente declorinada. Adicionalmente, se colocaron termostatos para subir la temperatura en
28
las peceras y que todas estuvieran en un promedio de 28 °C. El diseño incluía a los 5
tratamientos (lisozima, proteína de plasma bovino, simbiótico, bacteriófago y el control), cada
uno contó con 3 réplicas. Cada pecera tenía aireación por una bomba de aire (JAC®) y un
termostato (JAC®).
Figura 13Limpieza y desinfección de las peceras previo al montaje del bioensayo

Limpieza y desinfección de las peceras previo al montaje del bioensayo
Nota. Las peceras fueron desinfectadas con etanol 70% y cloro al 2%, luego se ventilaron por 48
horas.
29
Figura 14. Montaje del bioensayo para las pruebas de crecimiento
Montaje del bioensayo para las pruebas de crecimiento
Nota. Cada uno de los tratamientos fueron llevados a las mismas condiciones, teniendo 3 réplicas
por cada tratamiento.
Dado esto, se efectuaron pruebas iniciales en todas las peceras para medir pH, temperatura,
oxígeno disuelto, salinidad, así como también amonio, nitritos y nitratos. Se determinó que todos
los parámetros estaban dentro de los rangos óptimos para el inicio de las pruebas.
30
Figura 15.Preparación del agua a utilizar en las pruebas de crecimiento
Preparación del agua a utilizar en las pruebas de crecimiento
Nota. La imagen presenta el proceso de filtración del agua preparada para la experimentación.
Tomado por Yumi Medina, 2023
Figura 16. Llenado de las peceras para las pruebas de crecimiento con 4 tratamientos y 1 control
Llenado de las peceras para las pruebas de crecimiento con 4 tratamientos y 1 control
Nota. La imagen presenta el diseño experimental fijado para las pruebas de cada tratamiento
experimental tuvo 3 réplicas. Tomado por Yumi Medina, 2023.
31
2.2.2 Preparación de dietas experimentales
Para la preparación de los tratamientos experimentales se utilizó un balanceado peletizado de
2 mm de diámetro y 27% de proteína marca Agripac®. En total, se prepararon 4 dietas
experimentales, cada una representaba un tratamiento con el producto experimental, lo que
permitió la comparación entre diversos tratamientos y el grupo control.
La preparación de las dietas implicó un proceso cuidadoso que permitió garantizar la eficacia
de la dieta experimental. Se empleó 250 g de balanceado sin aditivo, que fue esterilizado y
expuesto a rayos UV para eliminar contaminantes durante el proceso de elaboración. Una vez
esterilizado, el balanceado fue triturado con ayuda de un procesador.
Por cada 50 g de balanceado se utilizaron 50 mL de agua destilada, teniendo una relación 1:1.
Para la reconstrucción de los pellets, se utilizó una moledora manual. Para el tiempo de secado,
se utilizó un horno con rejillas (ISUZU) y temperatura modificable según se requirió. Por otro
lado, se suministró un control, que consistía en el balanceado sin aditivos. Este proceso fue
realizado 3 veces para garantizar el suministro de alimento en buen estado.
32
Figura 17. Esterilización del balanceado comercial triturado
Esterilización del balanceado comercial triturado
Nota. La imagen presenta el proceso de esterilización mediante rayos UV en una cámara de flujo
laminar. Tomado por Yumi Medina, 2023.
Figura 18. Pesaje del alimento triturado y previamente esterilizado

Pesaje del alimento triturado y previamente esterilizado
Nota. El balanceado utilizado, fue previamente esterilizado por rayos UV, y fue almacenado
correctamente para no perder cualidades físicas del mismo.
33
Figura 19. Hidratación del pellet con agua destilada
Hidratación del pellet con agua destilada
Nota. Se utilizaron vasos de precipitación que se cubrieron con aluminio y reposó durante
aproximadamente 1 hora hasta que el pellet absorbió el agua.
2.2.2.1 Bacteriófagos. Para este tratamiento, 50 g del balanceado triturado fueron hidratados
con 50 ml de agua destilada y 0.5 g del bacteriófago. Esta mezcla fue moldeada y
reconstituida para su posterior secado a 30o C durante 4 h con el objetivo de no
inactivar el agente biológico del producto. El balanceado tenía una concentración de
10 g de bacteriófagos por kg de alimento.
2.2.2.2 Lisozimas. Para la dieta con la lisozima, se utilizaron 50 g de alimento esterilizado y
molido, el cual fue hidratado con 50 mL de agua destilada y 0.5 g de lisozima, para
posteriormente ser reconstruido. Luego de la reconstrucción, este fue secado a 30oC
en un horno por un lapso de 4 h. El balanceado tenía una concentración de 10 g de
lisozima por kg de alimento.
34
2.2.2.3 Simbiótico. Para el simbiótico, se utilizaron 50 g de alimento esterilizado y triturado,
hidratado con 50 ml de agua destilada y 7.5 g de simbiótico y luego fue reconstruido
para posteriormente ser secado en el horno a 50 °C em 2 horas. En el caso del
simbiótico se utilizó una dosis de 150 g de simbiótico por kilogramo de alimento.
2.2.2.4 Proteína de plasma bovino. Por último, en la proteína de plasma bovino se empleó
la misma metodología, 50 g de alimento estéril y triturado con 50 mL de agua
destilada. Se añadieron 1.5 g de la proteína. Luego se secó en el horno a 50°C en un
tiempo de 2 horas. La concentración final del alimento fue de 30 g de proteína de
plasma bovino por kg de alimento.
Figura 20. Proceso de reconstitución del alimento balanceado

Proceso de reconstitución del alimento balanceado
Nota. Se utilizó un molino manual y el alimento era procesado y esparcido en una bandeja de
aluminio.
35
Figura 21. Proceso de horneado del balanceado por tratamiento experimental
Proceso de horneado del balanceado por tratamiento experimental
Nota. Cada uno de los balanceados fue horneado de acuerdo con la temperatura a soportar de
cada producto, a fin de no descomponer (y dañar) los principios activos (biológicos) de cada uno
(ver numerales 2.2.2.1 a 2.2.2.4 para ver las temperaturas por producto).
Figura 22. Producto final del balanceado con proteína de plasma bovino
Producto final del balanceado con proteína de plasma bovino
Nota. Todos los balanceados fueron correctamente almacenados según su producto biológico.
36
2.2.3 Origen y aclimatación de camarones
Los camarones utilizados en el bioensayo se obtuvieron del laboratorio de Cultivo de
Plancton ubicado en ESPOL. Se tomaron los parámetros iniciales de temperatura, pH, oxígeno
disuelto y salinidad. Después, se empezó la aclimatación de los animales, se hizo biometría
inicial de los camarones y se registraron los pesos con ayuda de una balanza digital. Los
camarones fueron pesados en grupos de 10 animales por muestra.
Figura 23. Pesaje de los camarones por pecera de tratamiento

Pesaje de los camarones por pecera de tratamiento
Nota. Se realizó desinfección de cada uno de los materiales utilizados para el pesaje y se procuró
pesar en un tiempo mínimo a fin de que los camarones se estresen lo más mínimo posible.
37
2.2.4 Fase de alimentación con tratamientos experimentales
La fase de alimentación con tratamientos experimentales tuvo una duración de 34 días. En el
transcurso de este tiempo, los camarones fueron alimentados 2 veces al día con una tasa de
alimentación del 10% de su biomasa, además diariamente se realizó sifoneo del alimento no
consumido y materia fecal presente en las peceras antes de la alimentación, adicional, se
midieron parámetros físicos de temperatura y oxígeno disuelto diariamente en cada una de las
peceras. Parámetros químicos como amonio, nitritos y nitratos fueron medidos semanalmente.
Figura 24. Alimentación de camarones por tratamiento experimental

Alimentación de camarones por tratamiento experimental
Nota. Se alimentó a los camarones con un porcentaje del 10% de su biomasa semanal
2.2.5 Registro de peso
Se registraron los pesos de los animales por tratamientos a la mitad de cada semana (cada
miércoles), se registraron los valores a fin de comprobar una mejoría en el crecimiento debido a
los diferentes tratamientos. Cabe recalcar que los camarones fueron pesados en “pull”, es decir,
10 animales por muestra.
38
2.2.6 Análisis de resultados de pruebas in vitro y de crecimiento
Se llevó a cabo un análisis de los resultados obtenidos mediante un estudio que evaluó el
crecimiento de 4 tratamientos experimentales frente a un grupo control. Para determinar si
existieron diferencias estadísticamente significativas entre las medias de los tratamientos, se
utilizó un análisis de varianza (ANOVA) a una vía, considerando las diferencias como
significativas cuando la probabilidad de error “P” fue menor o igual a 0.05 (P ≤ 0.05). Para el
análisis, se comprobó inicialmente si los datos cumplían con normalidad y homogeneidad de
varianzas. Para la variable “crecimiento” en el bioensayo, hicieron transformaciones con Log X,
para el cumplimiento del ANOVA. Esta prueba se empleó para identificar cualquier variación en
la supervivencia entre los tratamientos. Para los análisis in vitro, también se realizó una ANOVA
entre las concentraciones probadas frente a un control (bacteria + medio) a fin de observar la
dosis óptima de cada uno de los productos biológicos. Estos análisis estadísticos fueron
interpretados utilizando el software de programación RStudio.
39
Capítulo 3
40
3. Resultados y análisis
Dentro de este proyecto integrador se presentan 3 tipos de resultados, resultados
concernientes a las pruebas in vitro, a las pruebas in vivo o bioensayos y la elaboración y
constitución del alimento. A continuación, se presentan los resultados de las pruebas in vitro.
Dentro estas pruebas se encuentran los MIC y las pruebas de sensibilidad.
3.1 Pruebas in vitro
En el caso del MIC este fue realizado con la lisozima, el plasma y las enzimas.
3.1.1 Lisozima
Para la lisozima se probaron 3 diferentes concentraciones: 500, 1000 y 2000 ppm, las mismas
que fueron comparadas con un grupo de control constituido por medio y bacterias.
Figura 25.Concentración vs Absorbancia del producto experimental Lisozima en 4 h de incubación.

Concentración vs Absorbancia del producto experimental Lisozima en 4 h de incubación con los
controles y antibiótico.
41
Nota. El gráfico presenta el comportamiento inhibitorio que otorga el producto utilizado
(Lisozima) a distintas concentraciones, comparado a dos controles (Control + y Control -) y a un
antibiótico comercial.
El gráfico de la figura 27 presenta las diferentes concentraciones utilizadas en el MIC en
conjunto con el control positivo (bacteria + medio LB), el control negativo (medio LB puro) y el
control de antibiótico (florfenicol 50 ppm + bacteria).
En la gráfica anterior, se observa el comportamiento típico de crecimiento bacteriano en un
medio de cultivo, según se ha descrito en la literatura. Para este caso, se presentó una fase de
adaptación de 2 horas, luego de lo cual se observó una fase de crecimiento exponencial entre la
hora 2 y la hora 3 de cultivo.
Los resultados muestran que a las 2 horas de incubación todos los tratamientos actuaron de
maneral similar con respecto al antibiótico. Para comprobar la existencia de diferencias
significativas entre los tratamientos y el control se realizó un análisis de ANOVA. Los resultados
fueron los siguientes.
Tabla 1. Concentración vs Absorbancia del producto experimental Lisozima en 4 h de incubación a diferentes concentraciones y en ausencia de producto experimental.
Concentración vs Absorbancia (promedio ± desviación estándar) del producto experimental
Lisozima en 4 h de incubación a diferentes concentraciones y en ausencia de producto
experimental.
Concentración Absorbancia Absorbancia Absorbancia Absorbancia Absorbancia
1h 2h 3h 4h 5h
1000 ppm 0.0634 ± 0.0773 ± 0.0773 ± 0.3425 ± 0.693 ±
0.0082a 0.0165a 0.0165a 0.0195a 0.040a
42
2000 ppm 0.0699 ± 0.0854 ± 0.0854 ± 0.3342 ± 0.681 ±
0.0110 ab 0.0224a 0.0224a 0.0179a 0.024a
500 ppm 0.0812 ± 0.0967 ± 0.0967 ± 0.4324 ± 0.784 ±
0.0242 b 0.0250a 0.0250a 0.0426b 0.041b
CONTROL 0.0814 ± 0.1156 ± 0.1156 ± 0.4548 ± 0.789 ±
0.0090 b 0.0063b 0.0063b 0.0322b 0.042b
Nota. Para cada una de las concentraciones se utilizó 10 réplicas, letras diferentes sobre los
promedios indican diferencias significativas entre grupos. Letras idénticas señalan ausencia de
significación estadística.
Figura 26. Concentración vs Absorbancia del producto experimental Lisozima en 4 h de incubación a diferentes concentraciones y en ausencia de producto experimental.
Concentración vs Absorbancia (promedio ± desviación estándar) del producto experimental
Lisozima en 5 h de incubación a diferentes concentraciones y en ausencia de producto
43
experimental.
Nota. Letras (a, b) diferentes sobre los promedios indican diferencias significativas entre grupos.
Letras idénticas señalan ausencia de significación estadística.
En la primera hora de incubación (10:30 a.m.) se halló que no hay diferencias significativas
en ninguno de los tratamientos frente al control, ni diferencias entre tratamientos.
En la segunda hora de incubación (11:30 a.m.) tampoco se muestran diferencias
significativas entre las concentraciones 1000 ppm y 2000 ppm, sin embargo, sí las hay con el
tratamiento de control y con la concentración 500 ppm. Adicionalmente, no se presentan
diferencias significativas entre las otras concentraciones frente al control.
44
A las 12:30 a.m. no se revelaron diferencias significativas en la concentración 1000 ppm con
respecto a las otras concentraciones (2000 ppm, 500 ppm), pese a esto sí hay diferencias
significativas en las concentraciones 1000 ppm y 2000 ppm con respecto a la de control.
A las 14:30 no se presentaron diferencias significativas entre las concentraciones 1000 ppm y
2000 ppm, pero sí hay diferencias entre la concentración de 1000 ppm en relación con el control
y la concentración 500 ppm. Esto mismo se presenta para la concentración 2000 ppm, por otro
lado, tampoco hay diferencia significativa entre el control y la concentración 500 ppm.
Por último, a las 15:30 no hay diferencias significativas entre las concentraciones 1000 ppm
y 2000 ppm, pero sí hay diferencias entre la concentración de 1000 ppm en relación con el
control y la concentración 500 ppm. Esto mismo se presenta para la concentración 2000 ppm,
además, tampoco hay diferencias significativas entre el control y la concentración 500 ppm.
En esta prueba se buscó evaluar la eficacia de la lisozima en la inhibición de la bacteria V.
parahaemolitycus. Se utilizaron 3 diferentes concentraciones de lisozima: 500, 1000, 2000 ppm,
las mismas que fueron comparadas a un grupo de control (medio + bacteria). Las
concentraciones 1000 ppm y 2000 ppm fueron las que mostraron una menor absorbancia a lo
largo del tiempo inhibiendo el crecimiento de la bacteria en los intervalos muestreados.
45
3.1.2 Plasma bovino
Para el caso del plasma bovino también se probó 3 concentraciones que fueron de 10000
ppm, 3000 ppm y 6000 ppm juntamente con un grupo de control.
Figura 27. Concentración vs Absorbancia de la proteína de plasma bovino en 5 h de incubación

Concentración vs Absorbancia de la proteína de plasma bovino en 5 h de incubación.
Nota. La imagen presenta el desempeño de cada una de las concentraciones contra el crecimiento
del plasma bovino, las cuales fueron comparadas con sus respectivos controles y un antibiótico
comercial.
46
Figura 28. Comparación concentración vs Absorbancia de la proteína de plasma bovino en 5 h de incubación a diferentes concentraciones y con un grupo de control.
Comparación concentración vs. absorbancia de la proteína de plasma bovino en 5 h de
incubación, a diferentes concentraciones y con un grupo de control.
Nota. Letras (a, b, c, d) diferentes sobre los promedios indican diferencias significativas entre
grupos. Letras idénticas señalan ausencia de significación estadística.
El presente gráfico muestra el rendimiento alcanzado por las concentraciones fijadas para
el plasma a lo largo de un periodo de 6 horas de incubación. Pese a esto, se llevó a cabo una
diferencia entre la absorbancia de la primera hora y la sexta hora, con el propósito de identificar
la concentración más idónea dentro de esta prueba. Esta consideración fue ejecutada debido a la
presencia de turbidez en el producto probado, y se buscó asegurar que todas las concentraciones
se encuentren en condiciones homogéneas para efectuar cálculos estadísticos precisos. Como
47
resultado de estas modificaciones, se presenta a continuación el gráfico del desempeño de las
concentraciones dentro de las 6 horas de incubación.
Figura 29. Crecimiento bacteriano en 3 concentraciones de Plasma bovino en función de la absorbancia.

Crecimiento bacteriano en 3 concentraciones de Plasma bovino en función de la absorbancia.
Nota. Letras (a, b, c, d) diferentes sobre los promedios indican diferencias significativas entre
grupos. Letras idénticas señalan ausencia de significación estadística.
El gráfico de la figura 29 muestra que el control negativo presentó diferencias significativos
con respecto al control positivo y a las concentraciones de 3000 ppm, 6000 ppm y 10000 ppm,
además las concentraciones de 1,0000 y 6000 ppm presentaron diferencias significativas con los
controles y con la concentración de 3000 ppm, pero no presentaron diferencias significativas
entre ellas, por otro lado, la concentración de 3000 ppm presentó diferencias con respecto a las
concentraciones de 10000 ppm, 6000 ppm y los controles.
48
Asimismo, el gráfico revela que las concentraciones de 10000 ppm y 6000 ppm presentaron
menores diferencias entre la primera y sexta hora de incubación lo que revela que las mismas
inhibieron el crecimiento bacteriano dentro de estas horas de incubación, destacando dentro de
esta prueba.
3.1.3 Enzimas
Para las enzimas, se tomaron 3 concentraciones las cuales correspondieron al 50, 70 y 100%
de la concentración de las enzimas, estas se compararon con el control
Figura 30. Comparación de concentración vs Absorbancia de Enzimas en 4 h de incubación, a diferentes concentraciones y con un grupo de control.
Comparación de concentración vs Absorbancia de Enzimas en 4 h de incubación, a diferentes
concentraciones y con un grupo de control.
Nota. Letras diferentes sobre los promedios indican diferencias significativas entre grupos.
49
Los resultados mostraron que en la etapa inicial sin incubación (11:00 a.m.) el control
exhibió diferencias significativas con respecto a las otras concentraciones, por consiguiente, la
concentración del 70% no presentó diferencias significativas con la concentración del 50% y la
concentración 100%, además la concentración del 50% exhibió diferencias significativas con
respecto a la concentración del 100%.
A la cuarta hora de incubación (15:00 p.m.) el control presentó diferencias significativas
en referencia a los demás tratamientos, la concentración del 100% bajo su absorbancia en esta
hora de incubación y también presentó diferencias significativa con los demás tratamientos, para
el caso de la concentración de 50% y 70% en ambas no se visualizó diferencias significativas.
A la quinta hora de incubación (16:00 p.m.) el control presentó diferencias significativas
con las concentraciones del 50 y 70%, pero no con la concentración del 100% esto da a entender
que esta concentración ha servido como un medio para el crecimiento de esta.
A las 24 horas de incubación se observó que el control presenta diferencias significativas
con respecto a los otros tratamientos siendo esta menor a las absorbancias de las concentraciones
estudiadas.
En esta prueba se visualizó que las enzimas en la concentración del 100% a lo largo del
tiempo sirvieron como un medio para el crecimiento de la bacteria, a lo largo de las 4 primeras
horas, pese a esto se ve un ligero cambio en la quinta hora, pues se observó una mínima
inhibición en el crecimiento de la bacteria.
50
Figura 31. Crecimiento bacteriano en 3 concentraciones de Enzimas en función de la absorbancia.
Crecimiento bacteriano en 3 concentraciones de Enzimas en función de la absorbancia.
En la figura 31, se observa el crecimiento bacteriano usando 3 dosis diferentes de enzimas,
este grafico demuestra el desempeño que obtuvo cada una en el MIC, los datos revelan que la
concentración al 100% fue la efectiva para inhibir el crecimiento bacteriano por presentar
diferencias significativas con el control positivo.
3.1.4 Simbiótico
Para las pruebas de antagonismo se midieron los halos de cada una de las concentraciones,
esta prueba fue realizada con el Simbiótico y el suero de leche.
51
En el caso del simbiótico, a las 24 horas el crecimiento del halo fue proporcional a la
concentración, siendo la concentración de 800000 ppm la que obtuvo mejores resultados, con
halos cercanos a los 20 mm de diámetro, pese a esto el halo formado por el control fue aún más
notorio, siendo este mayor que 30 mm.
Figura 32. Efecto de la concentración de simbiótico en la longitud de halo (promedio ± desviación estándar).
Efecto de la concentración de simbiótico en la longitud de halo (promedio ± desviación
estándar).
Nota. Letras diferentes sobre los promedios indican diferencias significativas entre grupos. Letras
idénticas señalan ausencia de significación estadística.
3.1.5 Suero de leche
Para la prueba de sensibilidad con el suero de leche se probaron 3 concentraciones (10000
ppm, 20000 ppm, 30000 ppm) juntamente con el control, los resultados mostraron que la
concentración de 10000 ppm fue la menos efectiva contra la bacteria, presentando diferencias
52
significativas entre las otras concentraciones. Por otro lado, la concentración correspondiente a
20000 ppm presentó diferencias significativas con respecto al control y a la concentración de
10000 ppm, por consiguiente, la concentración de 30000 ppm y de 20000 ppm fueron las que más
se destacaron debido a la longitud de sus halos, pese a esto, las mismas no superó a los halos
realizados por el control; ya que los mismos presentaron diferencias significativas entre ellos.
Figura 33. Efecto de la concentración de simbiótico en la longitud de halo (promedio ± desviación estándar).
Efecto de la concentración de suero de leche en la longitud de halo (promedio ± desviación
estándar).
53
3.2 Bioensayo
Entre los resultados del bioensayo se presentan la medición de parámetros ambientales y
químicos.
3.2.1 Parámetros fisicoquímicos
3.2.1.1 Oxígeno disuelto
Figura 34. Cantidad de oxígeno disuelto (mg/L) en cada uno de los tratamientos experimentales.
Cantidad de oxígeno disuelto (mg/L) en cada uno de los tratamientos experimentales.
Bacteriófago
8,00
7,50
7,00
6,50
6,00
5,50
5,00
4,50
4,00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
Oxigeno Disuelto mg/L
TBR1 TBR2 TBR3
54
Plasma Bovino
8,50
8,00
7,50
7,00
6,50
6,00
5,50
5,00
4,50
4,00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
TPR1 TPR2 TPR3
Lisozima
8,50
8,00
7,50
7,00
6,50
6,00
5,50
5,00
4,50
4,00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
TLR1 TLR2 TLR3
55
Simbiótico
7,50
7,00
6,50
6,00
5,50
5,00
4,50
4,00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
TSR1 TSR2 TSR3
Control
8,00
7,50
7,00
6,50
6,00
5,50
5,00
4,50
4,00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
Control 1 Control 2 Control 3
Nota. Los gráficos muestran la cantidad de oxígeno medido en cada uno de los días de
experimentación, mediciones menores de 5 mg/L fueron corregidas al momento a fin de no
afectar a los tratamientos.
56
Los gráficos muestran las mediciones de oxígeno disuelto mg/L en los tratamientos
experimentales a lo largo de 34 días de experimentación. En este tiempo, las mediciones de
oxígeno se mantuvieron estables y óptimas siendo estas mayores a 5 mg/L en todos los
tratamientos, esto propició un ambiente adecuado para el crecimiento en cada uno de ellos.
3.2.1.2 Temperatura
Figura 35.Temperatura (oC) en cada uno de los tratamientos experimentales.

Temperatura (oC) en cada uno de los tratamientos experimentales.
Bacteriófago
39,0
Temperatura
34,0
29,0
24,0
19,0
14,0
9,0
4,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
TBR1 TBR2 TBR3
Plasma Bovino
39,0
34,0
29,0
24,0
19,0
14,0
9,0
4,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
TPR1 TPR2 TPR3
57
Lisozima
34,0
29,0
24,0
19,0
14,0
9,0
4,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
TLR1 TLR2 TLR3
Simbiótico
34,0
29,0
24,0
19,0
14,0
9,0
4,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
TSR1 TSR2 TSR3
Control
34,0
29,0
24,0
19,0
14,0
9,0
4,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
Control 1 Control 2 Control 3
Nota. Los gráficos muestran la temperatura en cada uno de los días de experimentación,
mediciones menores de 24 mg/L fueron corregidas al momento a fin de no afectar a los
58
tratamientos, se trató de mantener en todos los acuarios condiciones similares, con respecto a la
temperatura.
Los gráficos muestran las temperatura en los tratamientos experimentales a lo largo de 34
días de experimentación. Durante este lapso, los valores de temperatura se mantuvieron
adecuados para la experimentación variando de 25oC - 35oC en todos los tratamientos. Al igual
que en el caso anterior esto propició un ambiente adecuado para el crecimiento en cada uno de
los tratamientos.
3.2.1.3 pH
Figura 36. Medición de pH en cada uno de los tratamientos por semana experimentación.
Medición de pH en cada uno de los tratamientos por semana experimentación.
pH
pH 1 Semana pH 2 Semana pH 3 Semana pH 4 Semana pH 5 Semana
8,3
8,2
8,1
8
7,9
7,8
7,7
7,6
7,5
7,4
Bacteriófago Simbiótico Plasma Lisozima Control
Nota. El gráfico muestra la cantidad de pH medido en cada una de las semanas de
experimentación, mediciones de pH no idóneas para el cultivo fueron corregidos semanalmente,
a fin de evitar inconvenientes en el crecimiento de los camarones.
59
El presente gráfico muestra los niveles de pH para cinco tratamientos diferentes:
bacteriófago, simbiótico, plasma, lisozima y control, durante un periodo de cinco semanas. Los
tratamientos de bacteriófago y control mantuvieron un nivel de pH constante de 8 durante todo el
periodo. Por otro lado, los tratamientos simbiótico y lisozima experimentaron una disminución
en los niveles de pH a 7,7 en la tercera semana, pero se recuperaron a 8 en las semanas
siguientes.
El tratamiento con Plasma mostró un aumento en los niveles de pH a 8,2 en la cuarta semana,
pero volvió a 8 en la quinta semana. Aunque hubo pequeñas fluctuaciones en los niveles de pH
con los tratamientos simbiótico, lisozima y plasma, todos los tratamientos mantuvieron en
general niveles de pH bastante estables a lo largo del tiempo.
La estabilidad que presentó el bioensayo con respecto al pH (7.7- 8.2) a lo largo de las 5
semanas, indicó que los mismos estaban en un ambiente adecuado para el crecimiento dentro de
esta experimentación.
60
3.2.1.4 Amonio.
Figura 37. Medición de Amonio en cada uno de los tratamientos por semana experimentación.
Medición de Amonio en cada uno de los tratamientos por semana experimentación.
Amonio
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
pH 1 Semana pH 2 Semana pH 3 Semana pH 4 Semana pH 5 Semana
Nota. El gráfico muestra la cantidad de amonio medido en cada una de las semanas de
experimentación, mediciones de amonio no idóneas para el cultivo fueron corregidas
semanalmente ajustando los recambios, a fin de evitar inconvenientes en el crecimiento de los
camarones.
El gráfico indica los niveles de amonio en cinco tratamientos diferentes a lo lago de 5
semanas, estos tratamientos incluyen al bacteriófago, simbiótico, plasma, lisozima y control.
En el tratamiento bacteriófago, los niveles de amonio aumentaron significativamente de 0 a 3
mg/L. En el tratamiento simbiótico, los niveles de amonio aumentaron gradualmente de 0 a 1
mg/L. Los tratamientos plasma, lisozima y control mostraron un aumento similar de 0 a 1 mg/L.
61
Durante la experimentación los niveles de amonio en los tratamientos simbiótico, plasma,
lisozima y control parecen estar dentro de un rango seguro. Los niveles observados en el
tratamiento bacteriófago en las semanas 4 y 5 podrían ser perjudiciales para los camarones.
3.2.1.5 Nitrito
Figura 38. Medición de nitrito en cada uno de los tratamientos por semana experimentación.
Medición de nitrito en cada uno de los tratamientos por semana experimentación.
Nitrito
Nitrito 1 Semana Nitrito 2 Semana Nitrito 3 Semana
Nitrito 4 Semana Nitrito 5 Semana
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Nota. El gráfico muestra la cantidad de nitrito medido en cada una de las semanas de
experimentación, mediciones de nitrito no idóneas para el cultivo fueron corregidos
semanalmente, a fin de evitar inconvenientes en el crecimiento de los camarones.
El gráfico presenta las cantidades de nitrito (mg/L) en los cinco tratamientos a lo largo de las
5 semanas de experimentación; para el caso particular del bacteriófago, los niveles de nitrito se
mantuvieron en 0 durante las 3 primeras semanas, estas se vieron en aumento a las semanas 4 y 5
siendo este de 1 mg/L.
62
Para el simbiótico los niveles de nitrito aumentaron de 0 a 1 mg/L, el plasma, por otra parte,
presentó cantidades que iban de 0 a 2 mg/L en la cuarta semana de experimentación y disminuyó
a 1 mg/L en la quinta.
Para el caso de la lisozima y el control los niveles de nitrito se mantuvieron en 0 durante las 3
primeras semanas obteniendo un ligero aumento de 1 mg/L en las cuarta y quinta semana.
Durante todo el experimento los niveles de nitrito en los tratamientos fueron estables a
excepción del tratamiento con el plasma durante la cuarta semana, en la cual se presentaron
cantidades que pueden ser perjudiciales a los camarones.
3.2.1.6 Nitrato
Figura 39. Medición de nitrato en cada uno de los tratamientos por semana experimentación.
Medición de nitrato en cada uno de los tratamientos por semana experimentación.
Nitrato
Nitrato 1 Semana Nitrato 2 Semana Nitrato 3 Semana
Nitrato 4 Semana Nitrato 5 Semana
30
20
10
0
Nota. El gráfico muestra la cantidad de nitrato medido en cada una de las semanas de
experimentación, mediciones de nitrato no idóneas para el cultivo fueron corregidos
semanalmente, a fin de evitar inconvenientes en el crecimiento de los camarones.
63
El gráfico presenta las cantidades de nitrato (mg/L) en los cinco tratamientos a lo largo de las
5 semanas de experimentación. En el tratamiento con bacteriófago los niveles de nitrato fueron
menores en las primeras 3 semanas siendo este de 0 mg/L, pese a esto en la cuarta y quinta
semana se vieron drásticamente modificadas presentando cantidades de 20 mg/L y 10 mg/L,
respectivamente.
En el tratamiento con el simbiótico los niveles de nitrato aumentaron de 0 a 10 mg/L a lo
largo de toda la experimentación. En el tratamiento con el plasma los niveles de nitrato
aumentaron de 0 a 10 mg/L a partir de la tercera semana, pero disminuyeron a 5 mg/L en la
última semana de la experimentación. Para el control los niveles aumentaron de manera gradual
de 0 a 5 mg/L durante las cinco semanas de experimentación. Finalmente, en el tratamiento con
la lisozima los niveles se mantuvieron en constancia con 0 mg/L durante tres semanas, pero
aumentaron en la cuarta semana y en la quinta disminuyeron en cantidades de 20 mg/L y 5 mg/L,
respectivamente.
Según los resultados mostrados se asegura que los camarones tuvieron niveles de nitrato
óptimos para su correcto crecimiento, lo que asegura una buena supervivencia y bienestar en los
mismos.
64
3.2.2 Pruebas de crecimiento
Figura 40. Peso semanal de los tratamientos experimentales en los 34 días de experimentación.
Peso semanal de los tratamientos experimentales en los 34 días de experimentación.
Nota. El gráfico muestra el desempeño de los tratamientos en las semanas de experimentación, el
peso semanal mostrado es el peso total de cada pecera de tratamiento.
El gráfico anterior muestra los pesos semanales de cada uno de los tratamientos
experimentales en camarones, para una mayor visualización se procedió a segmentar este gráfico,
lo que nos permitió agilizar el análisis estadístico y asimismo la apreciación de los resultados en
el crecimiento.
65
Figura 41. Crecimiento semanal de los tratamientos experimentales en los 34 días de experimentación.
Crecimiento semanal de los tratamientos experimentales en los 34 días de experimentación.
66
Según los datos analizados, durante la primera semana no existió diferencia significativa
entre ninguno de los tratamientos, pese a esto en la segunda semana esto cambió y no hubo
diferencias significativas entre el control y los tratamientos con lisozima, bacteriófago y
simbiótico, pero sí con el plasma. Por otro lado, se observó que el tratamiento con simbiótico no
posee diferencias significativas con respecto al tratamiento con plasma, por lo cual los que han
tenido mejor resultado de crecimiento son el plasma bovino y el simbiótico.
En la tercera semana se observó que el tratamiento control no posee diferencias significativas
con respecto a los tratamientos con bacteriófago, lisozima y simbiótico, pero sí con el
tratamiento con plasma bovino. Pese a esto, los tratamientos con bacteriófago, lisozima y
simbiótico tampoco tienen muchas diferencias significativas con respecto al plasma bovino.
En la cuarta semana se visualizó que el tratamiento de control no presentó diferencias
significativas con respecto a los tratamientos con bacteriófago y lisozima, pero sí con el
tratamiento con plasma. Sin embargo, los tratamientos con bacteriófago, lisozima y simbiótico
no presentaron muchas diferencias significativas con respecto al plasma.
Finalmente, en la quinta semana, el tratamiento de control no registró diferencias
significativas con el simbiótico, lisozima y el bacteriófago, pero sí con el plasma bovino, y este
comportamiento cambió ligeramente en el bacteriófago puesto a que en esta semana no presentó
diferencias significativas con el plasma bovino.
67
Figura 42.
Crecimiento semanal de los tratamientos experimentales en los 34 días de experimentación.
En la figura 42, se observa que la ganancia de peso del tratamiento con proteína de plasma
bovino fue superior al control y al simbiótico y la lisozima, pero no al bacteriófago.
Los resultados sugirieron que el tratamiento con plasma bovino ha proporcionado mejores
crecimientos con respecto a los otros tratamientos desde la semana 2 hasta la semana 5.
68
3.2.3 Alimentación
Figura 43. Dosis de alimentación semanal para cada uno de los tratamientos experimentales en 5 semanas.
Dosis de alimentación semanal para cada uno de los tratamientos experimentales en 5 semanas.
Alimentación por semana de experimentación

2,500
2,000
1,500 Ración Diaria 1S

Ración Diaria 2S
1,000 Ración Diaria 3S
Ración Diaria 4S
Ración Diaria 5S
0,500
0,000
Nota. La alimentación en cada uno de los tratamientos fue creciente debido al crecimiento de los
camarones.
La alimentación en los 5 tratamientos fue suministrada de manera creciente a lo largo de las
semanas como se lo puede visualizar en el gráfico arriba presentado, siendo esta proporcional a
su crecimiento, dando la misma porción en dos horarios que representaba la mitad de su ración
diaria (10% Biomasa).
69
3.2.4 Pruebas físicas del alimento
Las pruebas físicas del alimento son esenciales para evaluar su calidad y eficacia. En este
estudio, se realizaron pruebas para evaluar la hidroestabilidad y la atractabilidad del alimento en
varios tratamientos, incluyendo Lisozima, Bacteriófago, Simbiótico y Plasma.
3.2.4.1 Atractabilidad
Figura 44. Tiempo de respuesta en camarones entre los tratamientos experimentales y el control.
Tiempo de respuesta en camarones entre los tratamientos experimentales y el control.
Tiempo de respuesta en los tratamientos y el control
Plasma 2
Control 8
0
Bacteriófago 0,5
Control 5
0
Simbiótico 6
Control 0,8
0
Lisozima 0,3
Control 6
0 2 4 6 8 10
Tiempo (min)
Nota. El gráfico muestra el tiempo de respuesta en minutos de los camarones al elegir un
tratamiento entre los dos probados, es preciso aclarar que todos los tratamientos fueron iniciados
en un mismo tiempo.
Los resultados del experimento muestran que los tratamientos con Plasma,
Bacteriófago, Simbiótico y Lisozima mejoran la atractividad del alimento para los camarones en
70
comparación con sus respectivos controles. Específicamente, el tiempo de respuesta para el
tratamiento con Plasma es de 2 minutos, significativamente menor que los 8 minutos observados
para su control. De manera similar, el tratamiento con Bacteriófago tiene un tiempo de respuesta
de 0,5 minutos, en comparación con los 5 minutos de su control. El tratamiento con Simbiótico
muestra un tiempo de respuesta de 6 minutos, frente a los 0.8 minutos de su control. Finalmente,
el tratamiento con Lisozima tiene un tiempo de respuesta de 0,3 minutos, notablemente menor
que los 6 minutos de su control.
71
Capítulo 4
72
4. Conclusiones y recomendaciones
4.1. Conclusiones
Este proyecto integrador ha logrado determinar las dosis óptimas de 3 productos
experimentales para inhibir el crecimiento de una cepa patógena de V. parahaemolyticus causante
de AHPND en camarones P. vannamei.
Los resultados obtenidos en los análisis in vitro revelaron concentraciones óptimas
específicas para cada uno de los 3 productos experimentales, proporcionando información
valiosa para el desarrollo y futuro de medidas preventivas o de control contra la enfermedad
AHPND. Así, se determinó la dosis óptima a usar con lisozima a 1000 - 2000 ppm, con la
proteína de plasma bovino a 3000 ppm, el simbiótico a 800000 ppm y, además, un cuarto y
quinto producto añadidos que fueron la proteína del suero de leche a 30000 ppm y las enzimas al
100% de concentración. La eficacia de los productos se validó posteriormente en un bioensayo
con camarones donde se observó un comportamiento diferencial en las semanas de evaluación.
Así mismo, la adaptación de un protocolo de molienda, mezclado y reconstitución de pellets
comerciales para camarones, incorporando estos productos experimentales, ha demostrado ser
una estrategia viable. Las pruebas físicas de calidad de pellet y la evaluación de la tasa de
crecimiento en camarones juveniles P. vannamei sometidos a estos tratamientos experimentales
han proporcionado evidencia de su eficacia.
Es de suma importancia destacar que, a pesar de las variaciones en los tratamientos, las
variables físicas y químicas se mantuvieron dentro de los rangos óptimos para el desarrollo del
bioensayo con camarones. Los resultados del bioensayo sugirieron que el tratamiento con
proteína de plasma bovino ha proporcionado mejores crecimientos con respecto a los otros
tratamientos desde la semana 2 hasta la semana 5. Estos resultados sugieren una alternativa
73
prometedora al uso de antibióticos, abriendo nuevas posibilidades para la industria cultural y
contribuyendo a la búsqueda de soluciones sostenibles.
Para finalizar, esta investigación no solo avanza en la comprensión de estrategias de control
para AHPND, sino también sienta las bases para futuras investigaciones, incluyendo la
optimización de procesos de producción y la exploración de aplicaciones prácticas la industria
acuícola. En última instancia, estos hallazgos tienen el potencial de impactar positivamente en la
salud y la sostenibilidad de la producción de camarones.
4.2. Recomendaciones
• Se sugiere realizar más lecturas durante los MIC para determinar el comportamiento del
producto y la bacteria en un periodo de tiempo más amplio.
• Se sugiere realizar más replicas para las pruebas de antagonismo
• Mantener los niveles de temperatura, oxígeno y salinidad estables, ya que en pruebas de
crecimiento estas variables afectan el metabolismo del crustáceo pudiendo ocasionar
mediciones de peso alteradas.
• Las peceras deben estar cubiertas con tapas de cualquier material que impida que los
camarones salten fuera de esta. Se recomienda utilizar tapas de acetato o enmalladas.
• En pruebas de crecimiento en peceras, se recomienda usar poca densidad de animales por
m3, ya que se da más espacio al camarón para crecer.
• En la elaboración del balanceado, tener en cuenta las temperaturas de secado ya que
temperaturas muy altas pueden inactivar el agente biológico de los tratamientos.
• Tener en cuenta el tamaño del animal para que el balanceado sea apto para su consumo.
74
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Escuela Superior Politécnica del Litoral

Facultad de Ingeniería Marítima y Ciencias del Mar

Determinación in vitro de dosis óptimas de 3 productos experimentales para inhibir

crecimiento en una cepa patógena de Vibrio parahaemolyticus causante de AHPND

Previo a la obtención del Título de:

Saray Elizabeth Consuegra Villao

Yumi Ariana Medina Lam

El presente proyecto se lo dedico a Dios,

quien me ha sostenido hasta el día de hoy,

quien con su infinito amor y misericordia me

ha permitido disfrutar de este logro, quien me

ha alentado cada día con su santa palabra,

motivándome a esforzarme y ser valiente

cada día, y a no desmayar en el proceso,

prometiéndome que él estará conmigo a

dondequiera que vaya.

A mi familia, a quienes amo y estoy

perpetuamente agradecida, quienes han sido

mi inspiración en cada logro de mis metas.

Saray Consuegra Villao

Con gran amor...

A Dios, por permitirme terminar con éxito mi

carrera, darme salud y fortaleza en todo

A mis padres, Christian y Yumi, por su amor,

sacrificio y por enseñarme a ser constante y

nunca rendirme frente a los obstáculos de la

A mis hermanos, abuelos y demás familia,

por el apoyo incondicional y por siempre

impulsarme a ser mejor.

A mi novio Ariel, por estar conmigo en todo

este proceso, motivándome, ayudándome y

celebrando mis victorias. Te amo

A mis amigos, futuros colegas y demás

Por último, en honor a la memoria de Daniel,

su amor, su legado y su espíritu viven en mi

corazón y me impulsan hacia delante.

Yumi Ariana Medina Lam

Agradezco a Dios quien es y será mi

fortaleza, a mi amada familia quienes en todo

momento estuvieron apoyándome, a todos los

docentes que contribuyeron en mi formación

universitaria, a nuestros tutores el Dr. Jorge

Cuéllar- Anjel y Dr. Jerry Landívar, por su

tiempo y guía en este proyecto integrador, a

mi coordinador de carrera MSc. Patricia

Urdiales, quien nos brindó amablemente su

apoyo y aliento en todo el proceso de nuestro

proyecto, de igual manera a MSc. Sonnia

Guartatanga por su ayuda y guía en la parte

experimental en el presente proyecto

Saray Consuegra Villao

A Dios, por brindarme fortaleza, sabiduría y

su inmenso amor en todo momento

A toda mi familia, por siempre apoyarme,

sostenerme e impulsarme a lograr mis metas

A mi compañera de tesis, Saray, por ser parte

de este proyecto, por su paciencia y su ayuda

A nuestros tutores, Dr. Jorge Cuéllar-Anjel y

Dr. Jerry Landívar por su orientación, apoyo