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    de 3

    Proteína A280

    UV/VIS Application Note


    Medición directa de la proteína
    La cuantificación de la proteína midiendo directamente su absorbancia a 280 nm es
    uno de los métodos rápidos y convenientes, ya que no se requieren reactivos y/o
    incubaciones adicionales. Las proteínas en solución dan una absorción ultravioleta
    característica a 280 nm debido a la presencia de los aminoácidos tirosina y triptófano
    [1]. Los enlaces de fenilalanina y disulfuro también contribuyen a la absorción a 280
    nm, aunque ligeramente. Parámetros tales como pH, fuerza iónica, etc. pueden
    cambiar el espectro de absorbancia y, por lo tanto, la muestra de proteína se disuelve
    en el tampón Tris-EDTA para mejorar la estabilidad.

    Para obtener una alta precisión de la concentración de proteínas, debe conocerse la


    secuencia exacta de aminoácidos de la proteína analizada y calcularse el coeficiente de
    absorción específica de la proteína antes de determinar la concentración de la solución [2,
    3]. Diferentes proteínas tienen coeficientes de extinción muy variables dependiendo de la
    composición de aminoácidos. Si una proteína no contiene ningún residuo de tirosina,
    triptófano y fenilalanina, no tendrá absorbancia a 280nm y por lo tanto no se puede medir
    con el método directo a 280 nm.

    Esta aplicación se centra en determinar la concentración de proteínas midiendo su


    absorbancia a 280 nm utilizando el espectrofotómetro UV/VIS de METTLER
    TOLEDO.

    Exploración espectral de aminoácidos


    3.5 aromáticos

    Tyr BSA
    2.5
    Absorbanc

    1.5 IgG Phe


    ia

    0.5

    0
    200 220 240 260 280 300 320
    Longitud de onda [nm]

    Fig 1. Exploración espectral de aminoácidos aromáticos


    Material y método
    Instrumentos y accesorios 4. 200 g/ml de proteína BSA
    • UV/VIS Excellence Spectrophotometer • Pesar 2,0 g de proteína BSA y transferir al
    UV/VIS Application Note

    (UV5Nano - 30254729) matraz aforado de 10 ml.


    • XPR 205 Balanza analítica (30355411) • Disolver y diluir hasta la marca con tampón TE.
    • Pipeta y punta Rainin XLS-1000 (27060058), XLS-
    5000 (17011790), XLS-10 µL (17014409) 5. Muestras con concentración conocida de BSA
    • Matraces volumétricos, 10 ml Preparar las soluciones de muestra enumeradas en el cuadro 1
    • Sonicator, Branson 3800 en matraces volumétricos de 10 ml. Diluir hasta la marca con
    tampón TE.
    Muestras y reactivos
    • Muestra de albúmina sérica bovina (BSA) Conc final. Pipeta
    BSA 200 mg/ml de BSA
    • Deionized water (DI water) Muestra de
    • Tris (hidroximetil) aminometano. Clorhidrato, identificación [mg/ml] [mL]
    Muestra 1 5 0.25
    (Tris-HCl), 99
    Muestra 2 100 5.00
    • Dihírato de etanol diaminetetraacetato Muestra 3 200 -
    disódico (EDTA-Na2), 99,9
    Tabla 1: Muestras de BSA con concentración conocida
    • Hidróxido de sodio (NaOH)
    • Ácido clorhídrico (HCl)

    Preparación de reactivos Medición


    1. 1.0 M Tris-HCl (Sol. A)
    • Pesar 1,576 g de Tris-HCl en un vaso de precipitados Procedimiento
    de 10 ml. Añadir 8 ml de agua DI y sonicate para • Pipetear 3 µL de muestra de proteína en la plataforma de
    disolver. microvolumen y medir su absorbancia a 280 nm.

    • Ajustar el pH de la solución a 8,0 utilizando NaOH. • TE Buffer (3 µL) se utiliza para la medición en blanco.

    Transferir la solución al matraz aforado de 10


    Parámetros de medición
    ml.
    Con plataforma de microvolumen (celda de medición)
    • Diluir la solución hasta la marca volumétrica
    con agua DI.
    Método BFW
    2. 0.5 M Disodium ethylenediaminetetraacetate Longitud de onda 280 nm
    dihydrate (Sol. B) Corrección de fondo 1 1-Punto
    • Pesar 18,16 g de EDTA-Na2 en un vaso de Referencia Longitud de
    onda 1 340 nm
    precipitados de 100 ml. Añadir 80 ml de agua DI y palets NaOH
    Tiempo de medición 5s
    hasta que el pH alcance 8.
    Pathlength Automático
    • Sonicate para que se disuelva. Ajuste el pH
    Concentración DilF*A(280,340)/
    8.0 con HCl.
    (Ruta*PercExtCoeff/10)
    • Transferir la solución a un matraz aforado de
    Unidad mg/L
    100 ml. Diluir la solución hasta la marca
    volumétrica con agua DI. Nota: Según la literatura, el coeficiente de extinción porcentual
    para la proteína BSA es (6,7 g/100 ml)
    3. TE buffer [4, 5]
    • Añadir 5 ml de Sol. A y 1 ml de Sol. B en un
    matraz aforado de 500 ml y diluir la solución hasta
    la marca volumétrica con agua DI.
    Resultados Referencia

    La concentración proteica de varias proteínas BSA sam- [1] Layne, E. Spectrophotometric y Turbidimetric
    ples se mide en seis réplicas y se tabula en los Métodos para Medir Proteínas. Métodos en
    Nota

    cuadro 2. Enzimología 3: 447-455. 1957

    1.0 [2] Gill S, von Hippel P. Cálculo de los coeficientes


    0.8 de extinción de proteínas a partir de los datos de
    Aplicación

    Absorbancia [A]

    0.6 secuencia de aminoácidos. Anal Biochem:

    0.4
    182:319-26. 1989

    0.2
    [3] Pace C, Vajdos F, Fee L, Grimsley G, Gray T.
    0.0 Cómo medir y predecir el coeficiente de absorción
    molar de una proteína. Sci. de la proteína; 4:2411-
    240 280 320 360 400
    Longitud de 23. 1995
    onda [nm]

    [4] https://sharebiology.com/te-buffer/#gs.4fuuwv

    [5] https://sharebiology.com/ preparation-of-


    edta-solution/#gs.4fxr88

    [6]http://ccc.chem.pitt.edu/wipf/Courses/1140_0
    5_ files/Extinction-coefficients.pdf
    UV/VIS

    Fig 2. Espectro de la proteína BSA

    Recuperac
    Mezquino SD RSD ión
    Muestra Conc. [mg/ml] [%] [%]
    Muestra 1 9.98 0.08 0.81 99.83
    Muestra 2 99.10 0.69 0.69 99.10
    Muestra 3 201.29 0.60 0.30 100.65

    Tabla 2: Concentración de la muestra BSA

    El porcentaje de recuperación de las muestras


    de BSA es del 99,83%, 99,10% y 100,65%
    respectivamente.

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