Universidad de Chile

Facultad de Ciencias
Departamento de Biología
Bioquímica C5210522-1

INFORME PRÁCTICO 3: CUANTIFICACIÓN DE

PROTEÍNAS

Laboratorio Bioquímica para PEMBQ

Integrantes: Juan Luis Haro

Gabriela Valdivieso

Fecha de realización: 10/04/2024

Fecha de entrega 19/04/2024

Introducción
La Ley de Lambert-Beer expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de longitud de
onda fija) y concentración de un cromóforo en solución. La absorbancia de una solución es
directamente proporcional a su concentración a mayor número de moléculas mayor interacción de la
luz con ellas; también depende de la distancia que recorre la luz por la solución a igual concentración,
cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrará y por último,
depende de ε, una constante de proporcionalidad denominada coeficiente de extinción que es
específica de cada cromóforo (Díaz, N. A., et al, 2010). Esta absorbancia puede ser medida por un
instrumento llamado espectrofotómetro, el cual es un instrumento que permite proyectar un haz de luz
a través de una muestra y medir la absorbancia o la transmitancia (la cantidad de luz que pasa a
través de la muestra, es decir, el recíproco matemático de la absorbancia). La cantidad de luz
absorbida o transmitida a una determinada longitud de onda es proporcional a la concentración del
material. Si el material no absorbe luz por sí mismo, se puede mezclar con otros reactivos para
obtener, mediante una reacción química específica, una solución que sí absorba luz (García, R. D.,
2018).
Existen diferentes métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan
en: a) la propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, b) para la formación de
derivados químicos, o c) la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes
(colorimetría). El fundamento de la colorimetría está basado en la medición de la absorción de
radiación de la zona visible por sustancias coloreadas que se encuentren en una muestra, y su
intensidad de coloración será directamente proporcional a sus concentraciones (Pérez-Sánchez, L., et
al, 2019). También los métodos de Biuret, Método de BCA, Lowry así como de Bradford. Este último
es utilizado como método preferente en la elaboración de éste práctico y se basa en la unión de un
colorante Coomassie a las proteínas. El colorante, en solución ácida, existe en dos formas una azul y
otra naranja. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con
un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre. Este método es sensible (1-15 µg), simple,
rápido, barato y pocas sustancias interfieren en su determinación (Reyes, E. F., & Cejudo., s.f).
Como proteína es utilizada la Bovine serum albumin (BSA), la cual es usada como estándar ya que
puede ser aislada en forma altamente pura. Además, la BSA es altamente estable y
comparativamente económica. La causa más significativa de utilizar BSA es su homología estructural
con la albúmina sérica humana (HSA) (Chakraborty, B., & Basu, S., 2009).

El objetivo general de este práctico es determinar la concentración de proteínas de BSA de una

muestra problema. Para llevar a cabo este objetivo se plantean los siguientes objetivos específicos:
● Interpretar los cambios físicos de una solución mediante métodos colorimétricos y su relación
con la concentración de proteínas.
● Verificar el cumplimiento de la ley de Lambert-Beer para el método de cuantificación utilizado.

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Materiales y métodos

Se requiere que el volumen total de cada tubo sea de 1 ml. Se requieren masas en 6 tubos en el
intervalo 1ug a 8μg. Cada tubo contiene un volumen uniforme de 0,2ml de reactivo de Bradford.
El volumen restante entre solución diluida y reactivo de Bradford se completa con agua. La proteína
está disuelta en agua.

La solución patrón está a 0,1 mg/ml. Planteamos manejar volúmenes en los tubos que correspondan
a 0,1ml para 1ug, 0,2ml para 2ug, consecutivamente. Utilizamos la ecuación de dilución.

1μ𝑔 = 0, 001 𝑚𝑔

𝐶1𝑉1 = 𝐶2𝑉2

𝐶1 = 0, 1𝑚𝑔/𝑚𝑙 = 100μ𝑔/𝑚𝑙
𝑉1 = 0, 1𝑚𝑙

𝐶2 = 10μ𝑔/𝑚𝑙
𝑉2 = ?

𝐶1𝑉1 100μ𝑔/𝑚𝑙·0,1𝑚𝑙
𝑉2 = 𝐶2
= 10μ𝑔/𝑚𝑙
= 1𝑚𝑙

Esto significa que para obtener la concentración deseada debemos diluir 0,1 ml de solución patrón en
0,9 ml de agua.

Para suplir el volumen necesario de dilución de cada tubo necesitamos 3ml de dilución total, por lo
que mezclamos 0,3 ml de solución patrón con 2,7ml de agua. Los volúmenes de reactivo para cada
tubo se muestran en la tabla I.

Para realizar este laboratorio se utilizaron los siguientes materiales:

● Solución patrón de BSA 0,1 mg/ml

● Muestra problema de proteína
● Reactivo de Bradford 5x
● Agua destilada
● Tubos de ensayo
● Espectrofotómetro
● Papel milimetrado
● Pipetas de vidrio 1ml
● Propipeta
● Gradilla
● Vaso precipitado

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Tabla I. Volúmenes y concentraciones usados en el práctico.

Tubo BSA (ml) Agua (ml) Reactivo de Bradford

(ml)

Blanco 0 0,8 0,2

Tubo 1 0,1 0,7 0,2

Tubo 2 0,3 0,5 0,2

Tubo 3 0,4 0,4 0,2

Tubo 4 0,5 0,3 0,2

Tubo 5 0,6 0,2 0,2

Tubo 6 0,8 0 0,2

Resultados brutos
Los datos obtenidos de la absorbancia de los tubos con BSA y Bradford en el espectrofotómetro se
muestran en la tabla II a continuación.

Tabla II. Datos obtenidos de µg de BSA y absorbancia a 595nm sin tratamiento alguno.

Tubo [BSA] (µg/ml) Absorbancia (UA)

1 1 0,762

2 3 0,899

3 4 0,925

4 5 0,990

5 6 1,038

6 8 1,110

Análisis de resultados

Para obtener la absorbancia de la proteína de BSA es necesario restar la absorbancia del blanco a la
absorbancia medida por el espectrofotómetro de cada tubo con la proteína. De esta manera se
obtiene solo la absorbancia de la proteína. Los resultados se muestran en la tabla III.
Tabla III. Datos de la concentración de proteína y su absorbancia. La Absorbancia medida (UA) es la dada por el
espectrofotómetro y la Absorbancia corregida(UA) es la absorbancia de la proteína después de restar el blanco.

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 [BSA] (µg/ml) Absorbancia medida (UA) Absorbancia corregida (UA)

Blanco 0 0,740 0

Tubo 1 1 0,762 0,022

Tubo 2 3 0,899 0,159

Tubo 3 4 0,925 0,185

Tubo 4 5 0,990 0,250

Tubo 5 6 1,038 0,298

Tubo 6 8 1,110 0,370

Tomando los datos de la tabla III de la cantidad de proteína y la absorbancia corregida, se grafica una
curva de calibración como se muestra en la figura 1. En el caso de estos datos tiene un R2 de 0,9885,
lo cual nos indica que los datos de absorbancia corregida están cercanos a la línea de regresión
ajustada.

Figura 1. Gráfico de absorbancia corregida en función de la cantidad de proteína (μg). Absorbancia corregida se refiere a la
absorbancia medida menos la absorbancia del tubo blanco, sin proteína.

Aunque el R2 de la figura 1 nos indica que los datos son bastante acertados, se pueden eliminar
algunos puntos que se salen de la proporcionalidad para hacerlo más preciso, tal es el caso de los
puntos 2, 4 y 7 que corresponden a los tubos (y su respectiva absorbancia) 1, 3 y 6 respectivamente.
El nuevo gráfico se ilustra en la figura 2 a continuación.

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Figura 2. Gráfico ajustado de absorbancia corregida en función de la cantidad de proteína (μg). Para esto se eliminaron 3
puntos.

Como se puede apreciar, el R2 de este gráfico ajustado es un poco más cercano a la unidad, con un
valor de 0,9987, lo cual nos indica que los datos se ajustan mejor a la línea de regresión.

Es necesario aquí indicar que en ambos casos se cumple la ley de Lambert-Beer, pues en ambos
casos la absorbancia con la cantidad de proteína siguen una tendencia proporcionalmente lineal, es
decir, a medida que aumenta la cantidad de proteína, aumenta la absorbancia.

Tomando el gráfico de la figura 2, tenemos que la pendiente corresponde a 0,0495x, este valor es
análogo al factor de calibración o coeficiente de extinción molar. Este dato fue entregado por excel,
sin embargo, en caso de no tener este valor entregado, es posible calcular el factor de calibración con
la ecuación de la recta.

Mediciones de la muestra problema

La muestra problema se diluyó en igual medida a la solución patrón. Se trabajó con 0,5 ml de la
solución diluida.

BSA (ml) Agua (ml) Reactivo de Bradford (ml)

0,5 0,3 0,2

La muestra problema dió 0,226 de resultado en absorbancia. Esto equivale a 5,3 μg en 1 ml de

solución según la ecuación de la recta presente en la Figura 2:

𝑦 = 0, 266 = 0, 0495𝑥 + 0, 0033

0,226−0,0033
𝑥= 0,0495
= 5, 3

Esto es 0,53mg en 100 ml de solución.

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Cuestionario

1) En términos de absorción de la luz ¿cómo se explica que un vidrio tenga color verde?
El color verde en un vidrio se explica debido a la absorción selectiva de ciertas longitudes de onda de
luz visible. Los vidrios de color verde suelen contener óxidos metálicos que actúan como agentes
colorantes, estos absorben selectivamente ciertas longitudes de onda de luz visible, dejando pasar
otras. En el caso del vidrio verde, la luz verde es reflejada mientras que todos los otros espectros son
absorbidos.

2) ¿Qué se entiende por coeficiente de extinción molar?

El coeficiente de extinción molar es también conocido como coeficiente de absorción molar o factor de
calibración de la absorbancia. Es una propiedad específica del compuesto y depende del solvente y
de las condiciones experimentales.

3) ¿Qué se entiende por absorbancia? Dé la fórmula que la define, indicando claramente el

significado de los términos.
La absorbancia es una medida de la cantidad de luz absorbida por una muestra en una longitud de
trayectoria específica a través de un medio. Es la resultante de la luz absorbida por el soluto más la
absorbida por el solvente. La ecuación que representa esto es:

𝐴 = ε𝑙𝑐
Donde: A: Absorbancia
ε: Coeficiente de extinción molar.
l: longitud de camino óptico a través de la muestra.
C: Concentración de la muestra.

4) Represente gráficamente a) la relación entre la transmitancia (ordenada) y la

concentración de una sustancia, y b) entre absorbancia (ordenada) y la concentración
de una sustancia.

a) b)

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 5) Se quiere determinar la concentración de una sustancia midiendo la absorbancia en una
longitud de onda en que también absorbe el solvente. ¿Cómo podría descartar la
absorción de éste?
Si se quisiera determinar la concentración de una sustancia midiendo la absorbancia en una longitud
de onda cuyo solvente también absorbe, lo más óptimo sería medir la absorbancia solo del solvente
para luego restarla de la absorbancia medida de la sustancia. Este método se denomina blanqueo y
de esta manera luego se puede calcular la concentración que corresponderá a la sustancia en
cuestión sin el solvente.

Discusión
Como se mencionó anteriormente, las mediciones realizadas siguen una proporcionalidad directa, lo
que nos verifica que se cumple la Ley de Lambert-Beer. El valor de R2 obtenido en ambos gráficos de
calibración fue de un valor bastante cercano a la unidad por lo que ambos están dentro de un marco
aceptable de confiabilidad de los datos. Este resultado puede ser debido al método utilizado, ya que
el método de Bradford es bastante sensible y se caracteriza por una respuesta lineal. Sin embargo, el
gráfico ajustado de la figura 2 confiere un valor aún más exacto dado a que se eliminaron puntos que
se alejan de la proporcionalidad existente entre la cantidad de proteína y la absorbancia. En el caso
del primer punto eliminado el cual corresponde al tubo 1, este tuvo que ser repetido pues
inmediatamente se supo que el valor se salía de lo normal, lo cual pudo influir en la linealidad de las
absorbancias medidas.

Conclusiones
Como conclusión destacar que tanto el objetivo principal como los específicos se cumplieron, pues se
determinó la concentración de proteínas de BSA de la muestra problema de manera exitosa y
además se interpretaron los cambios físicos de una solución mediante métodos colorimétricos y su
relación con la concentración de proteínas.
También mencionar que se verificó el cumplimiento de la ley de Lambert-Beer.
Además se determinó la concentración de la muestra problema.

Bibliografía

❖ Chakraborty, B., & Basu, S. (2009). Interaction of BSA with proflavin: A spectroscopic
approach. Journal of Luminescence, 129(1), 34-39.
❖ Díaz, N. A., Ruiz, J. A. B., Reyes, E. F., Cejudo, A. G., Novo, J. J., Peinado, J. P., & Fiñana, I.
T. (2010). Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de
biomoléculas. Universidad de Córdoba, 1-8.
❖ García, R. D. (2018). Instrumentos que revolucionaron la química: la historia del
espectrofotómetro.
❖ Pérez-Sánchez, L., Casanova Paso, A. G., & Morales Martín, A. I. (2019). Biomarcadores de
nefrotoxicidad capaces de identificar pacientes oncológicos en riesgo de desarrollar daño
renal.
❖ Reyes, E. F., & Cejudo. (s.f). Métodos para la cuantificación de proteínas.

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Anexo
1) Gráfico confeccionado en el laboratorio y firmado por la docente.