Informe 3
Informe 3
Informe 3
Facultad de Ciencias
Departamento de Biología
Bioquímica C5210522-1
Gabriela Valdivieso
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Materiales y métodos
Se requiere que el volumen total de cada tubo sea de 1 ml. Se requieren masas en 6 tubos en el
intervalo 1ug a 8μg. Cada tubo contiene un volumen uniforme de 0,2ml de reactivo de Bradford.
El volumen restante entre solución diluida y reactivo de Bradford se completa con agua. La proteína
está disuelta en agua.
La solución patrón está a 0,1 mg/ml. Planteamos manejar volúmenes en los tubos que correspondan
a 0,1ml para 1ug, 0,2ml para 2ug, consecutivamente. Utilizamos la ecuación de dilución.
1μ𝑔 = 0, 001 𝑚𝑔
𝐶1𝑉1 = 𝐶2𝑉2
𝐶1 = 0, 1𝑚𝑔/𝑚𝑙 = 100μ𝑔/𝑚𝑙
𝑉1 = 0, 1𝑚𝑙
𝐶2 = 10μ𝑔/𝑚𝑙
𝑉2 = ?
𝐶1𝑉1 100μ𝑔/𝑚𝑙·0,1𝑚𝑙
𝑉2 = 𝐶2
= 10μ𝑔/𝑚𝑙
= 1𝑚𝑙
Esto significa que para obtener la concentración deseada debemos diluir 0,1 ml de solución patrón en
0,9 ml de agua.
Para suplir el volumen necesario de dilución de cada tubo necesitamos 3ml de dilución total, por lo
que mezclamos 0,3 ml de solución patrón con 2,7ml de agua. Los volúmenes de reactivo para cada
tubo se muestran en la tabla I.
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Tabla I. Volúmenes y concentraciones usados en el práctico.
Resultados brutos
Los datos obtenidos de la absorbancia de los tubos con BSA y Bradford en el espectrofotómetro se
muestran en la tabla II a continuación.
Tabla II. Datos obtenidos de µg de BSA y absorbancia a 595nm sin tratamiento alguno.
1 1 0,762
2 3 0,899
3 4 0,925
4 5 0,990
5 6 1,038
6 8 1,110
Análisis de resultados
Para obtener la absorbancia de la proteína de BSA es necesario restar la absorbancia del blanco a la
absorbancia medida por el espectrofotómetro de cada tubo con la proteína. De esta manera se
obtiene solo la absorbancia de la proteína. Los resultados se muestran en la tabla III.
Tabla III. Datos de la concentración de proteína y su absorbancia. La Absorbancia medida (UA) es la dada por el
espectrofotómetro y la Absorbancia corregida(UA) es la absorbancia de la proteína después de restar el blanco.
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[BSA] (µg/ml) Absorbancia medida (UA) Absorbancia corregida (UA)
Blanco 0 0,740 0
Tomando los datos de la tabla III de la cantidad de proteína y la absorbancia corregida, se grafica una
curva de calibración como se muestra en la figura 1. En el caso de estos datos tiene un R2 de 0,9885,
lo cual nos indica que los datos de absorbancia corregida están cercanos a la línea de regresión
ajustada.
Figura 1. Gráfico de absorbancia corregida en función de la cantidad de proteína (μg). Absorbancia corregida se refiere a la
absorbancia medida menos la absorbancia del tubo blanco, sin proteína.
Aunque el R2 de la figura 1 nos indica que los datos son bastante acertados, se pueden eliminar
algunos puntos que se salen de la proporcionalidad para hacerlo más preciso, tal es el caso de los
puntos 2, 4 y 7 que corresponden a los tubos (y su respectiva absorbancia) 1, 3 y 6 respectivamente.
El nuevo gráfico se ilustra en la figura 2 a continuación.
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Figura 2. Gráfico ajustado de absorbancia corregida en función de la cantidad de proteína (μg). Para esto se eliminaron 3
puntos.
Como se puede apreciar, el R2 de este gráfico ajustado es un poco más cercano a la unidad, con un
valor de 0,9987, lo cual nos indica que los datos se ajustan mejor a la línea de regresión.
Es necesario aquí indicar que en ambos casos se cumple la ley de Lambert-Beer, pues en ambos
casos la absorbancia con la cantidad de proteína siguen una tendencia proporcionalmente lineal, es
decir, a medida que aumenta la cantidad de proteína, aumenta la absorbancia.
Tomando el gráfico de la figura 2, tenemos que la pendiente corresponde a 0,0495x, este valor es
análogo al factor de calibración o coeficiente de extinción molar. Este dato fue entregado por excel,
sin embargo, en caso de no tener este valor entregado, es posible calcular el factor de calibración con
la ecuación de la recta.
La muestra problema se diluyó en igual medida a la solución patrón. Se trabajó con 0,5 ml de la
solución diluida.
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Cuestionario
1) En términos de absorción de la luz ¿cómo se explica que un vidrio tenga color verde?
El color verde en un vidrio se explica debido a la absorción selectiva de ciertas longitudes de onda de
luz visible. Los vidrios de color verde suelen contener óxidos metálicos que actúan como agentes
colorantes, estos absorben selectivamente ciertas longitudes de onda de luz visible, dejando pasar
otras. En el caso del vidrio verde, la luz verde es reflejada mientras que todos los otros espectros son
absorbidos.
𝐴 = ε𝑙𝑐
Donde: A: Absorbancia
ε: Coeficiente de extinción molar.
l: longitud de camino óptico a través de la muestra.
C: Concentración de la muestra.
a) b)
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5) Se quiere determinar la concentración de una sustancia midiendo la absorbancia en una
longitud de onda en que también absorbe el solvente. ¿Cómo podría descartar la
absorción de éste?
Si se quisiera determinar la concentración de una sustancia midiendo la absorbancia en una longitud
de onda cuyo solvente también absorbe, lo más óptimo sería medir la absorbancia solo del solvente
para luego restarla de la absorbancia medida de la sustancia. Este método se denomina blanqueo y
de esta manera luego se puede calcular la concentración que corresponderá a la sustancia en
cuestión sin el solvente.
Discusión
Como se mencionó anteriormente, las mediciones realizadas siguen una proporcionalidad directa, lo
que nos verifica que se cumple la Ley de Lambert-Beer. El valor de R2 obtenido en ambos gráficos de
calibración fue de un valor bastante cercano a la unidad por lo que ambos están dentro de un marco
aceptable de confiabilidad de los datos. Este resultado puede ser debido al método utilizado, ya que
el método de Bradford es bastante sensible y se caracteriza por una respuesta lineal. Sin embargo, el
gráfico ajustado de la figura 2 confiere un valor aún más exacto dado a que se eliminaron puntos que
se alejan de la proporcionalidad existente entre la cantidad de proteína y la absorbancia. En el caso
del primer punto eliminado el cual corresponde al tubo 1, este tuvo que ser repetido pues
inmediatamente se supo que el valor se salía de lo normal, lo cual pudo influir en la linealidad de las
absorbancias medidas.
Conclusiones
Como conclusión destacar que tanto el objetivo principal como los específicos se cumplieron, pues se
determinó la concentración de proteínas de BSA de la muestra problema de manera exitosa y
además se interpretaron los cambios físicos de una solución mediante métodos colorimétricos y su
relación con la concentración de proteínas.
También mencionar que se verificó el cumplimiento de la ley de Lambert-Beer.
Además se determinó la concentración de la muestra problema.
Bibliografía
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approach. Journal of Luminescence, 129(1), 34-39.
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T. (2010). Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de
biomoléculas. Universidad de Córdoba, 1-8.
❖ García, R. D. (2018). Instrumentos que revolucionaron la química: la historia del
espectrofotómetro.
❖ Pérez-Sánchez, L., Casanova Paso, A. G., & Morales Martín, A. I. (2019). Biomarcadores de
nefrotoxicidad capaces de identificar pacientes oncológicos en riesgo de desarrollar daño
renal.
❖ Reyes, E. F., & Cejudo. (s.f). Métodos para la cuantificación de proteínas.
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Anexo
1) Gráfico confeccionado en el laboratorio y firmado por la docente.