BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA

FACULTAD DE INGENIERÍA AGROHIDRÁULICA

PROGRAMA DE INGENIERÍA AGROFORESTAL

EVALUACIÓN DE MORTALIDAD DE GUSANO COGOLLERO

(Spodoptera frugiperda L.) MEDIANTE EL USO DE Metarhizium spp. IN VITRO

TESIS PROFESIONAL

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE

LICENCIADA EN INGENIERÍA AGROFORESTAL

PRESENTA:

EUGENIA CABRERA HUERTA

DIRECTOR DE TESIS

DR. OMAR ROMERO ARENAS

Tetela de Ocampo, Puebla, México. Diciembre de 2013

 BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA

FACULTAD DE INGENIERÍA AGROHIDRÁULICA

PROGRAMA DE INGENIERÍA AGROFORESTAL

EVALUACIÓN DE MORTALIDAD DE GUSANO COGOLLERO

(Spodoptera frugiperda L.) MEDIANTE EL USO DE Metarhizium spp. IN VITRO

TESIS PROFESIONAL

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE

LICENCIADA EN INGENIERÍA AGROFORESTAL

PRESENTA:

EUGENIA CABRERA HUERTA

DIRECTOR DE TESIS

DR. OMAR ROMERO ARENAS

ASESORES

DR. JOSÉ FILOMENO CONRADO PARRAGUIRRE LEZAMA

M.C. ALFREDO BÁEZ SIMÓN

Tetela de Ocampo, Puebla, México. Diciembre de 2013

La presente tesis titulada: “EVALUACIÓN DE MORTALIDAD DE GUSANO
COGOLLERO (Spodoptera frugiperda L.) MEDIANTE EL USO DE Metarhizium spp. IN
VITRO”, realizada por Eugenia Cabrera Huerta, ha sido revisada y aprobada por el
siguiente consejo particular, para obtener el título de:

LICENCIADA EN INGENIERÍA AGROFORESTAL

Facultad de Ingeniería Agrohidráulica.

Consejo Particular Integrado por: Firma.

Director: Dr. Omar Romero Arenas ________________________

Asesor: Dr. José Filomeno Conrado Parraguirre Lezama _______________________

Asesor: M.C. Alfredo Báez Simón _______________________

Tetela de Ocampo, Puebla, México. Diciembre de 2013

El presente trabajo forma parte del Cuerpo Académico denominado “Recursos Naturales
y Sistemas Agroforestales” en la línea de investigación: Los Sistemas Agroforestales
para la Transformación Industrial y el Desarrollo Socioeconómico de Comunidades
Rurales. Con número de clave BUAP-CA-265.

La presente tesis, fue financiada por el proyecto “VIEP” con una vigencia a partir del
01/Enero/2012 al 31/Diciembre/2013.

 
 DEDICATORIA

A DIOS

Por darme la bendición y la oportunidad de concluir satisfactoriamente mis estudios de

licenciatura.

A MIS PADRES

Plutarco Cabrera y Teresa Huerta

Por motivarme a seguir adelante y brindarme su apoyo para mi superación profesional.

A MIS HERMANOS

Rocío, Grisel y Oscar

Quienes me han brindado su afecto y compañía durante todo este tiempo.

A MIS AMIGOS

Rodolfo, Javier, Abraham, Esther, Eliza, José Luis, Miriam, Flor, Juan Manuel, Liz, Gaby, Paula,
Jorge Luis, Ma. De Jesús, Jimena, Susy, Wendy, Trino y Andrés.

Gracias por compartir momentos de alegría y tristeza, por motivarme a seguir estudiando y
por brindarme su valiosa amistad.
 AGRADECIMIENTOS

A la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, por otorgarme la oportunidad de

realizar mis estudios dentro de sus instalaciones.

A todos los profesores de Ingeniería Agroforestal, por transmitirme su conocimiento,

tiempo y dedicación.

A todo el personal administrativo del Campus BUAP-Tetela de Ocampo, por la paciencia,

apoyo y facilidades otorgadas durante mis estudios.

A la Universidad Autónoma de Nuevo León, en especial a la Facultad de Ciencias

Forestales, por aceptarme y recibirme de manera generosa dentro de sus instalaciones;
además de compartir conocimientos y experiencias durante mi estancia.

Al Dr. José Concepción Rodríguez Maciel, Profesor Investigador Adjunto del Colegio de
Postgraduados, Campus Montecillo-Estado de México, por otorgarme el material necesario
para la realización de la presente tesis.

Con gran énfasis y respeto agradezco al Dr. Omar Romero Arenas, quien además de ser mi
maestro y tutor de tesis, ha sido mi amigo, me ha motivado a seguir superándome
académicamente; asimismo, por brindarme su tiempo y apoyo incondicional.

A la Vicerrectoría de Investigación y Estudios de Posgrado (VIEP), por el apoyo financiero

para la ejecución de este proyecto de investigación.
 ÍNDICE GENERAL

Contenido Pag.

LISTA DE CUADROS…………………………………………………………… I

LISTA DE FIGURAS…………………………………………………………… II

RESUMEN………………………………………………………………………. III

ABSTRACT…………………………………………………………………….. IV

I- INTRODUCCIÓN……………………………………………………………. 1

II-OBJETIVO GENERAL Y PARTICULAR………………………………….. 3

III-HIPÓTESIS………………………………………………………………….. 4

IV-REVISIÓN DE LITERATURA…………………………………………….. 5

4.1 G usano c ogollero ( Spodoptera frugiperda) J. E . S MITH; ( Lepidoptera:

5
Noctuidae)……………………………………………………………………….
4.2 Clasificación taxonómica…………………………………………………….. 5

4.3 Distribución geográfica…………………………………………………….. 6

4.4 Biología y hábitos…………………………………………………………… 6

4.5 Caracteres distintivos……………………………………………………….. 7

4.6 Ciclo biológico………………………………………………………………. 7

4.7 Control………………………………………………………………………. 9

4.8 Generalidades de los hongos entomopatógenos……………………………. 10

4.9 Metarhizium anisopliae…………………………………………………………….. 11

4.10 Clasificación taxonómica………………………………………………….. 11

4.10.1 Características macroscópicas y microscópicas…………………………. 12

4.11 Efecto entomopatógeno……………………………………………………. 12

4.12 Producción de enzimas…………………………………………………….. 14

4.12.1 Lipasas…………………………………………………………………… 15

4.12.2 Quitinasas………………………………………………………………… 15

4.13 Producción de toxinas……………………………………………………… 16

4.14 Factores que afectan el desarrollo de los hongos entomopatógenos……… 16

4.14.1 La temperatura…………………………………………………………… 16

4.14.2 Humedad relativa………………………………………………………… 17

4.14.3 Precipitación, radiación solar y suelo……………………………………. 17

4.14.4 Insecto huésped………………………………………………………….. 18

4.14.5 Nutrición…………………………………………………………………. 18

4.14.6 Edad………………………………………………………………………. 18

4.14.7 Densidad de población…………………………………………………… 18

4.14.8 Composición del medio de cultivo………………………………………. 19

V. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………….. 20

5.1 Localización………………………………………………………………….. 20

5.2 Recolecta de material biológico (insectos)…………………………………. 21

5.3 Aislamiento y purificación de Metarhizium spp……………………………. 21

5.4 Identificación de Metarhizium spp…………………………………………… 22

5.5 Identificación del insecto……………………………………………………. 23

5.6 Preparación de la dieta………………………………………………………. 23

5.7 Preparación de suspensiones…………………………………………………. 24

5.8 Conteo de conidios…………………………………………………………… 24

5.9 Inoculación………………………………………………………………….. 25

5.10 Diseño experimental……………………………………………………….. 26

VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN……………………………………………. 28

6.1 Aislamiento de Metarhizium spp…………………………………………….. 28

6.2 Identificación del hongo……………………………………………………… 28

6.3 Identificación taxonómica del insecto micosado por Metarhizium spp…….. 31

6.4 Concentración de conidios de Metarizhium spp…………………………….. 32

6.5 Col onización de Metarhizium spp., nativo s obre l arvas de g usano c ogollero
34
(Spodoptera frugiperda)…………………………………………………………..
6.6 Mortalidad de larvas………………………………………………………….. 35

6.7 Larvas que pasaron al estado de pupas………………………………………. 39

6.8 Emergencia de adultos……………………………………………………….. 39

6.9 Tiempo letal (TL50) entre cepa nativa y cepa comercial de Metarhizium spp.,
41
sobre larvas de gusano cogollero………………………………………………….

VII. CONCLUSIONES……………………………………………………………. 43

VIII. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………. 44

IX. ANEXOS………………………………………………………………………. 59
 ÍNDICE DE CUADROS

Contenido Página

Cuadro 1. Clasificación taxonómica de gusano cogollero (Spodoptera frugiperda

L.)…………………………………………………………………………………… 5

Cuadro 2. Clasificación taxonómica de Metarhizium anisopliae (Alexopoulos,

2010). ………………………………………………………………………………………………………… 12

Cuadro 3. Aislamiento de hongos entomopatógenos en insectos del orden

coleóptera en el municipio de Tetela de Ocampo, Puebla………………………….. 28

Cuadro 4. Identificación taxonómica de Phyllophaga spp………………………… 32

Cuadro 5. Prueba de rangos múltiples de concentraciones (Tukey)………………. 33

Cuadro 6. Prueba de rangos múltiples en mortalidad (Tukey)…………………….. 38

i
 ÍNDICE DE FIGURAS
Contenido Página

Figura 1. Ciclo biológico de gusano cogollero (Spodoptera frugiperda L)……………. 9

Figura 2. Ciclo patogénico de Metarhizium spp. Alves (1998)………………………… 13

Figura 3.Localización del municipio de Tetela de Ocampo, Puebla-México………….. 20

Figura 4. Purificación de la cepa nativa de Metarhizium spp………………………….. 22

Figura 5. Identificación de Metarhizium spp…………………………………………… 22

Figura 6. Preparación de la dieta artificial……………………………………………… 23

Figura 7. Preparación de suspensiones………………………………………………… 24

Figura 8. Conteo de conidios en cámara de Neubauer…………………………………. 25

Figura 9. Inoculación de larvas de gusano cogollero con Metarhizium spp…………… 26

Figura 10. Crecimiento de Metarhizium spp., nativa en medio de cultivo PDA………. 29

Figura 11. Identificación microscópica de cepa nativa de Metarhizium spp…………... 29

Figura 12. Phyllophaga spp., infectado por Metarhizium spp…………………………. 31

Figura 13. C oncentración d e co nidios/mL d e cep a n ativa y cep a comercial d e

33
Metarhizium………………………………………………………………………………
Figura 14. Colonización de Metarhizium spp., nativo, sobre larvas de gusano cogollero
35
(Spodoptera frugiperda)………………………………………………………………….
Figura 15. Mortalidad de larvas a diferentes concentraciones de con/mL de cepa nativa
36
y comercial de Metarhizium spp…………………………………………………………
Figura 16. P orcentaje d e l arvas m uertas a diferentes co ncentraciones d e co n/mL d e
36
Metarhizium nativo y comercial………………………………………………………….
Figura 17. Número de larvas que llegaron al estado de pupa…………………………... 39
Figura 18. Emergencia d e ad ultos en cad a u no d e l os t ratamientos a d iferentes
40
concentraciones…………………………………………………………………………..
Figura 19. P orcentaje d e emergencia d e ad ultos d e g usano co gollero a d iferentes
41
concentraciones entre cepa nativa y comercial de Metarhizium spp…………………….
Figura 20. Tiempo de mortalidad de larvas de 72-168 hrs. post-infección…………… 42

ii
 EVALUACIÓN DE MORTALIDAD DE GUSANO COGOLLERO
(Spodoptera frugiperda L.) MEDIANTE EL USO DE Metarhizium spp. IN VITRO

RESUMEN

Se realizó la evaluación de mortalidad de gusano cogollero (Spodoptera frugiperda L.) en

condiciones de laboratorio, mediante el empleo de seis concentraciones de conidios entre
cepa nativa y una cepa comercial de Metarhizium. La cepa nativa de Metarhizium spp. fue
aislada del adulto de gallina ciega (Phyllophaga spp.) en la comunidad de San Nicolás,
Tetela de Ocampo, Puebla. La identificación del género Metarhizium, previamente aislado,
se realizó mediante las características macro y microscópicas relevantes de este género.

Se realizaron suspensiones de conidios 10-10, en donde se obtuvieron concentraciones de

53x104, 9x104, y 5x104 conidios/mL de cepa nativa de Metarhizium spp., y 36x104, 7x104, y
4x104 conidios/mL de cepa comercial de Metarhizium. La concentración de 53x104
conidios/mL de la cepa nativa, reportó una mortalidad del 72.5% y la más baja se obtuvo
de la cepa de Metarhizium comercial bajo la concentración de 4x104 conidios/mL,
equivalente al 32.5%. El mayor índice de mortalidad para ambas cepas, ocurrió a las 72 hrs
post-infección, con 11 larvas en promedio de las tres concentraciones de Metarhizium
nativo y 6 larvas de la cepa comercial de Metarhizium. Estos resultados demostraron la
factibilidad del uso de cepas de Metarhizium spp., para el control biológico del gusano
cogollero (Spodoptera frugiperda L.) in vitro.

Palabras clave: cepas de Metarhizium spp., conidios, control biológico, gusano cogollero,
y mortalidad.

iii
 EVALUATION OF MORTALITY OF FALL ARMYWORM
(Spodoptera frugiperda L.) THROUGH THE USE OF Metarhizium spp. IN VITRO.

ABSTRACT

The evaluation was conducted of mortality of fall armyworm (Spodoptera frugiperda L.)
in laboratory conditions, through the use of six concentrations of conidia among native
strain and commercial strain of Metarhizium. The native strain of Metarhizium spp. was
isolated from the adult of white grubs (Phyllophaga spp.) in the community of San Nicolás,
Tetela de Ocampo, Puebla. The identification of the genus Metarhizium, previously
isolated, was carried out using the macro and microscopic features relevant to this genre.

Suspensions were made of conidia 10-10, where were obtained concentrations of 53x104,
9x104 and 5x104 conidia/mL of native strain of Metarhizium spp; and 36x104, 7x104 and
4x104 conidia/mL of commercial strain of Metarhizium. The concentration of 53x104
conidia/mL of the native strain, reported a mortality rate of 72.5% and the lowest was
obtained from the strain of Metarhizium commercial under the concentration of 4x104
conidia/mL, equivalent to 32.5%. The highest mortality rate for both strains, occurred at 72
hrs post-infection, with 11 larvae on the average of three concentrations of Metarhizium
native and 6 larvae of the commercial strain of Metarhizium. These results demonstrate the
feasibility of the use of native strains of Metarhizium spp. for biological control of the fall
armyworm (Spodoptera frugiperda L.) in vitro.

Key words: native strain of Metarhizium spp., conidia, biological control, fall armyworm,
and mortality.

iv
 I.- INTRODUCCIÓN

En la actualidad la producción de alimentos enfrenta el reto de mantener un alto nivel de

calidad, co nsiderando aspectos d e i nocuidad a limentaria y s istemas d e p roducción co n
retribución m ás j usta pa ra l os produc tores ( García y González, 2010). E n M éxico s on
frecuentes e importantes los daños que causan las plagas en los cultivos agrícolas, entre la
mas i mportantes s e encuentran: el g usano co gollero d el maíz, l a m osca d e l a fruta, e l
picudo de l algodonero y de l m anzano, l as a rañas roj as, l as m osquitas bl ancas, l as
chicharritas o los pulgones (Alatorre et al., 2000).

El gusano cogollero del maíz (Spodoptera frugiperda L.), puede oc asionar una reducción
en la producción, que va desde un 20% hasta la pérdida total del cultivo, ataca las primeras
etapas del desarrollo de la planta e incluso en épocas de floración (Del Rincón et al., 2006).
En México se encuentra en todas las regiones donde se cultiva maíz, aunque los daños son
más s everos en el t rópico y e l s ubtropico, s e c onsidera la p laga m ás v oráz y da ñina del
cultivo (Rodríguez y Marín, 2008). Este insecto hace raspaduras sobre las partes tiernas de
las hojas, el cual, posteriormente aparecen como pequeñas áreas traslúcidas y una vez que
la larva alcanza su desarrollo, empieza a comer follaje preferentemente en el cogollo; de ahí
su denominación (Soto, 2008).

En l os ú ltimos años el em pleo d e s ustancias t óxicas en M éxico s e h a multiplicado y el

empleo d e p laguicidas s e incrementa a nualmente en u n 1 0%, por l o que es ne cesario
modificar estas prácticas agrícolas, para reducir el riesgo en la salud d e los productores y
de los consumidores (Ávila, 2004). Sin embargo, su uso excesivo ha provocado resistencia
de las plagas, además su acumulación en el medio ambiente afecta la flora y fauna silvestre
benéfica (Jiménez, 1998). Con el fin de minimizar estas consecuencias desfavorables, se ha
propuesto disminuir el u so d e l os p laguicidas co nvencionales y d esarrollar n uevas
estrategias p ara u n M anejo I ntegrado d e P lagas ( MIP), p rincipalmente p or m edio d el
control b iológico; s iendo este un m étodo de control de pl agas m ás r acional y re spetuoso
con el medio ambiente (Badii y Abreu, 2 006). El uso de organismos benéficos como una
alternativa s ostenible d e control d e i nsectos, es r ecomendable d entro d e u n m anejo

1
integrado de plagas, ya que no tiene efectos nocivos para el medio ambiente, la salud del
hombre y los animales (Jiménez, 1998).

Particularmente, los h ongos h an s ido u na d e las m ejores a lternativas p ara el co ntrol d e

plagas en los últimos años; asimismo, presentan un amplio espectro de huéspedes (De Faria
y Wraight, 2007). Los hongos entomopatógenos son un grupo de microorganismos con más
de 700 especies (Goettel et al., 2005; Roy et al., 2006) de ntro de 90 g éneros que pueden
infectar insectos (Goettel et al., 2005). Las enfermedades causadas por hongos en insectos
comúnmente reducen significativamente las poblaciones (Alatorre, 2000), demostrando así,
que l os b ioinsecticidas p ueden s er u na alternativa v iable p ara r esolver l os p roblemas d e
plagas en l a ag ricultura ( Barajas et al., 2009). Entre los h ongos m ás u tilizados co mo
insecticidas b iológicos s e i ncluye a Beauveria bassiana (Balsamo) V uillemin y
Metarhizium anisopliae (Metchnikoff) S orokin (M onzón, 2001; Rodrí guez y Arredondo,
2007). M. anisopliae ataca más de 200 especies de insectos y ácaros de diversos géneros,
en los órdenes Orthoptera, Hemiptera, Lepidoptera, Dermaptera, Hymenoptera, Coleoptera,
entre otros (Polar et al., 2008).

La presente investigación tiene como propósito, identificar y caracterizar cepas nativas de

Metarhizium spp., en el m unicipio d e T etela d e O campo-Puebla, ad emás d e ev aluar s u
efecto patogénico en gusano cogollero in vitro.

2
 II. OBJETIVOS

2.1 Objetivo general

 Evaluar la mortalidad de gusano cogollero (Spodoptera frugiperda L.), mediante el

uso de conidios de Metarhizium spp., a diferentes concentraciones.

2.2 Objetivos específicos

 Aislar e i dentificar Metarhizium spp., en i nsectos d el o rden co leóptera en el

municipio de Tetela de Ocampo, Puebla.

 Determinar el mayor porcentaje d e m ortalidad de gusano c ogollero ( Spodoptera

frugiperda L.), a t ravés d e d iferentes co ncentraciones de c onidios entre una cepa
nativa y una cepa comercial de Metarhizium.

 Cuantificar la concentración optima de conidios de una cepa nativa de Metarhizium

spp., que provoque e n el menor tiempo, el mayor í ndice d e m ortalidad d e gusano
cogollero (Spodoptera frugiperda L.).

3
 III. HIPÓTESIS

 El p orcentaje d e m ortalidad d e g usano co gollero ( Spodoptera frugiperda L.) s erá

mayor en l a p resencia d e conidios de l a cepa n ativa d e Metarhizium spp., e n
comparación a la cepa comercial.

4
 IV. REVISIÓN DE LITERATURA

4.1 Gusano cogollero (Spodoptera frugiperda) J. E. SMITH; (Lepidoptera: Noctuidae)

El gusano co gollero d el maíz (GC) Spodoptera frugiperda J. E . SMITH; (Lepidóptera:

Noctuide), fue descrito por primera vez por J. E. Smith en el año de 1852. Esta plaga puede
ocasionar una reducción en la producción y/o pérdida total del cultivo, si la plaga ataca en
periodos cercanos a l a etapa de floración. En México se ha reportado la presencia de esta
plaga en l as d istintas r egiones d el p aís (López et al., 1999), donde s e ha n re portado
pérdidas de hasta un 60% (SAGARPA, 2006).

4.2 Clasificación taxonómica

La clasificación taxonómica del gusano cogollero de acuerdo a Ángulo (2000), se describe
en el Cuadro 1.

Cuadro 1. Clasificación taxonómica de gusano cogollero (Spodoptera frugiperda L.)

Reino Animal
Phylum Artrópoda
Subphylum Mandibulata
Clase Insecta
Subclase Endopterigota
División Pterigota
Orden Lepidoptera
Suborden Frenatae
Super familia Noctuidea
Familia Noctuidae
Subfamilia AmphIpyirinae
Tribu Prodeniu
Género Spodoptera
Especie S. frugiperda

5
4.3 Distribución geográfica

Esta plaga se encuentra ampliamente distribuida en todas las regiones agrícolas tropicales
y subtropicales del continente americano. En México se encuentra prácticamente en todas
las regiones donde se cultiva maíz, aunque los daños son más severos en el sureste del país.
Las l arvas s e l ocalizan en el cogollo d e l as p lantas, donde s e al imentan d e l as h ojas en
formación, las cuales, al desarrollarse quedan pe rforadas y ra sgadas; e n ataque prematuro
causa el retraso y muerte de plántulas (Rodríguez y Marín, 2008).

En el estado de Puebla se reporta que el gusano cogollero del maíz es uno de los principales
problemas entomológicos en la zona de Amatlán, perteneciente al municipio de Zoquiapan.
Investigaciones p asadas, r eportan q ue es ta p laga afecta un 28% de l as p lantas en l as
localidades (Aragón, 1987; López-Olguín y Aragón, 1987), oc asionando pérdidas de 319,
358 y 604 kg/ ha, equivalentes al 10.8, 12 .5 y 21.1% de la producción con niveles de daño
leve, moderado y se severo, respectivamente (Hernández, 1988).

4.4 Biología y hábitos

Esta p laga ataca u n amplio rango d e cu ltivos, en tre l os q ue d estaca: maí z, s orgo, chile y
cebolla; aunque tiene alrededor de 20 0 hos pedantes (B autista, 2006). Las h embras
ovipositan varias m asas d e h uevecillos, g eneralmente en el envés d e l as h ojas. Los
huevecillos s on e sféricos, de c olor v erdoso o pa rdo y l as m asas s on cu biertas co n l as
escamas de las palomillas. Las larvas al eclosionar, tienen hábitos gregarios y se alimentan
de un área foliar muy reducida; a los pocos dias se dispersan a l as plantas vecinas, en las
que se establecen en el cogollo, la temperatura predominante es de 30 °C . Tienen hábitos
canibalísticos, por lo que a partir del tercer instar larvario rara vez se observa más de una
larva p or co gollo. S e p resentan s eis i nstares larvarios, el u ltimo r epresenta u n m ayor
tamaño d e l ongitud, q ue p ueden al canzar h asta 3 5 m m entre los 1 4- 22 dí as
aproximadamente (Rodríguez y Marín, 2008).

6
4.5 Caracteres distintivos

De acuerdo a Bautista (2006), los caracteres más distintivos del gusano c ogollero son l os
siguientes:

a) En el m acho, el ár ea costal d e las a las an teriores s on d e co lor p álida; ad emás,

poseen una mancha elíptica blanquecina cerca del centro y, a u n lado de esta, una
franja diagonal clara dirigida del margen costal al centro del ala.

b) Presenta una pequeña mancha blanquecina en el margen apical.

c) La h embra p resenta u na mancha e líptica en e l m argen co stal d elimitado p or u na

línea clara.

d) Como larva, en el octavo segmento abdominal (vista dorsal), presenta cuatro puntos
negros e n form a de c uadrado que corresponden a l os pi náculos setígeros dorsales;
son prominentes y carecen de microespinas.

e) La cab eza p resenta ár eas ad frontales d e co lor b lanco-amarillo, en f orma d e “Y ”

invertida.

4.6 Ciclo biológico

Según Ángulo (2000), e l gusano cogollero (Spodoptera frugiperda L.) pasa por diferentes
etapas durante su vida (Figura 1). Estas etapas son:

1. Huevo o postura. Individualmente s on de form a g lobosa, c on e strías ra diales, d e

color r osado p álido q ue s e torna g ris a medida q ue s e ap roxima la eclosión. L as
hembras de positan l os hue vos c orrientemente d urante las p rimeras h oras d e la
noche, tanto en el haz co mo en el en vés d e las h ojas, estos s on p uestos en varios
grupos o m asas cu biertas p or s egregaciones d el ap arato b ucal y es camas d e s u
cuerpo que s irven c omo prot ección c ontra a lgunos e nemigos n aturales o f actores
ambientales adversos.

7
2. Larva o gusano. Las larvas al nacer se alimentan del coreon, más tarde se trasladan
a diferentes partes de las plantas, evitando así la competencia por el alimento y el
canibalismo. Su color varía según el alimento, pero en general son oscuras con tres
rayas p álidas es trechas y l ongitudinales; en e l d orso s e d istingue u na b anda
negruzca m ás an cha h acia el co stado y otra p arecida p ero amarillenta m ás ab ajo.
Las l arvas pa san por 6 ó 7 e stadíos o mudas, s iendo d e m ayor i mportancia p ara
tomar las medidas de control los dos primeros; el primero miden de 2-3 milímetros
y l a cab eza es n egra co mpletamente, el s egundo m ide d e 4 -10 m ilímetros y l a
cabeza es car melita cl aro; las l arvas p ueden a lcanzar h asta 3 5 m ilímetros e n su
último es tadío. A p artir d el t ercer es tadío s e i ntroducen en el co gollo, h aciendo
perforaciones que son apreciados cuando la hoja se abre o desenvuelve.

3. Pupa. Son de color caoba y miden de 14-17 milímetros de longitud, con su extremo
abdominal (cremaster) terminando en 2 es pinas o g anchos en f orma d e " U"
invertida. Esta fase se desarrolla en el suelo y el insecto está en reposo hasta los 8 o
10 días en que emerge el adulto o mariposa.

4. Adulto o mariposa. La m ariposa vuela co n f acilidad d urante l a noc he, s iendo

atraída por la luz; es de coloración gris oscura, las hembras tienen alas traseras de
color b lancuzco, m ientras q ue l os m achos t ienen arabescos o f iguras i rregulares
llamativas en las alas d elanteras, y l as t raseras s on b lancas. En reposo d oblan s us
alas sobre el cuerpo, formando un á ngulo agudo que permite la observación de una
prominencia ubicada en el tórax. Permanecen escondidas dentro de las hojarascas,
entre l as malezas o en ot ros s itios s ombreados dura nte el d ía, son act ivas al
atardecer y/o dura nte l a noc he, son capaces d e d esplazarse a v arios k ilómetros d e
distancia, especialmente cuando soplan vientos fuertes.

8
 Figura 1. Ciclo biológico de gusano cogollero (Spodoptera frugiperda L).

4.7 Control

Las practicas de control químico para este tipo de plaga, es utilizar insecticidas líquidos y
aplicarlo cuando el cultivo del maíz se encuentre en estado de plántula o jiloteo, también se
puede ut ilizar produc tos granulados (Rodríguez y Marín, 2008). S e ne cesita a plicar
insecticidas, co mo Cl orpirifos, Ca rbaril y Paratión m etílico, t odos es tos q uímicos d eben
aplicarse h acia el p unto d e cr ecimiento de l a p lanta cu ando la p resencia d e las l arvas n o
rebasen el tercer instar de desarrollo (Cortez et al., 2002).

También s e h a r ecurrido al u so d e en emigos n aturales co mo u na a lternativa al co ntrol

químico, el cu al, se d efine co mo la m anipulación d eliberada p or e l h ombre d e
entomopatógenos (ba cterias, hong os, ne matodos y virus) y e ntomófagos (de predadores y
parasitoides) para reducir la población de Spodoptera frugiperda a ni vel que no pr oduzca
daños económicamente importantes (Ruíz, 2001).

9
4.8 Generalidades de los hongos entomopatógenos

Existen a proximadamente 700 e species de hong os e ntomopatógenos y a lrededor de 100

géneros ( López y Hans, 2001). E ntre l os géneros m ás i mportantes e stán: Metarhizium,
Beauveria, Aschersonia, Entomophthora, Zoophthora, Erynia, Eryniopsis, Akanthomyces,
Fusarium, Hirsutella, Hymenostilbe, Paecelomyces y Verticillium (López y H ans, 2001).
La FAO (2003), resalta a los g éneros de m ayor u so co mercial, en tre l os q ue d estaca:
Metarhizium, Beauveria, Paecilomyces, Verticillium, Rhizopus y Fusarium.

Estos microorganismos infectan a los artrópodos, principalmente a los ordenes: Hemiptera,

Diptera, Col eoptera, Lepidoptera, H ymenoptera y Orthoptera (T anada y Kaya, 1993;
Humber, 1997), a través de la penetración de la cutícula y ejercen múltiples mecanismos de
acción, confiriéndoles una alta capacidad para evitar que el hospedero desarrolle resistencia
(Motta y M urcia, 2011). Producen u na g ran can tidad d e m etabolitos s ecundarios,
químicamente d iversos; algunos de e llos, s on m uy p otentes desde el punto de vista
biológico, cau san s everas r eacciones ad versas en o tros o rganismos, e liminan la
competencia d e l os n utrientes y f acilitan el es tablecimiento d el p atógeno ( Pucheta et al.,
2006). Asimismo, contribuyen a la integridad estructural del hospedero al inhibir el proceso
selectivo de sus en zimas y a i nterferir c on s u s istema re gulador, además, d e r ealizar
funciones completamente diferentes dentro de la célula antes de ser secretada y facilitar el
movimiento de los iones a través de las membranas (St Legar, 1997).

Los estados de ninfa y larva son más susceptibles a los ataques de hongos entomopatógenos
que los adultos, en otros ocurre lo contrario; los estados de hue vo y pupa frecuentemente
no s on i nfectados (T anada y Kaya, 199 3). Los hongos e ntomopatógenos tienen un gran
potencial para ser empleados como biocontroladores (Cañedo y Ames, 2004). Por ejemplo,
los g éneros Beauveria, Metarhizium y Paecilomyces, tienen u n am plio u so y ac eptación
por s u es pecificidad y ef ectividad co mo i nsecticidas biológicos (Ca ñedo y Ames, 2004;
Morales et al., 2009; García y González, 2010) y suelen comercializarse en preparados a
base de esporas (Giraldo, 2009).

10
4.9 Metarhizium anisopliae

Es un hongo imperfecto (Hyphomycete) que presenta reproducción asexual, perteneciente a

la división Deuteromycetes, fue uno de los primeros microorganismos que se usaron para el
control d e i nsectos pl aga. E ste hong o fue a islado por primera v ez por M etschnikoff e n
1879, del escarabajo gallo del trigo; dicho aislado fue el Anisoplia austriaca (Coleoptera:
Sacarabeidae) descrito por Sorokin (Lezama, 1995). Esta especie presenta un alto potencial
de u so en l a r egulación d e p lagas en t odos l os a groecosistemas d el m undo, t anto en
aplicaciones inundativas, como en estrategias de conservación (Faria et al., 2007; Meyling,
2007; J abbour, 2009). H a s ido re comendado en m uchos cu ltivos y s e ap lica en d iversas
regiones contra una gran diversidad de insectos fitófagos; de diferentes órdenes y familias,
así co mo ácaros (Shi, 2008). P resenta carácter c osmopolita y gran diversidad g enética
(Inglis, 2008 ), ad emás, de s er un a gente s eguro sin riesgos para e l hom bre y e l m edio
ambiente (Zimmermann, 2007; Torriello, 2009).

En estudios se ha demostrado que el uso de Metarhizium anisopliae infecta a más de 200

especies de insectos, dentro de los ordenes Orthoptera, Demaptera, Hemiptera, Lepidoptera,
Diptera, H ymenoptera y C oleoptera, en es te ú ltimo s e h a r eportado 1 34 es pecies de
hospederos, p rincipalmente en l as f amilias C urculionidae, El ateridae y Es carabaeidae
(Zimmermann, 1993). Los i nsectos m uertos p or es te h ongo s on cu biertos co mpletamente
por micelio, el cual, inicialmente es de color bl anco pe ro se t orna verde cuando el hongo
esporula (Monzón, 2001). Es una de las especies de hongos entomopatógenos con las que
más s e h a t rabajado en t odo e l m undo, en re lación c on s u produc ción m asiva y
comercialización como bioplaguicida (Kabaluk, 2005; Faria et al., 2007).

4.10 Clasificación taxonómica

La mayoría de los hongos entomopatógenos se clasifican dentro de la división Eumycota,

que s e car acterizan por no form ar plasmodio o ps eudoplasmodio y por no pre sentar una
fase asimilativa típicamente filamentosa. La subdivisión Deuteromycotina (Cuadro 2), se
caracteriza por no pre sentar un e stado s exual, por l o que s e c onocen como hong os
imperfectos y están integrados en t res cl ases: Hyphomycetes, B lastomycetes y

11
Coelomycetes. La m ás i mportante es H yphomycetes, p orque ab arca l a m ayoría d e l as
especies conocidas como patógenos de insectos (Ignoffo et al., 1996).

Cuadro 2. Clasificación taxonómica de Metarhizium anisopliae (Alexopoulos, 2010).

Reino Fungi
División Mycota
Subdivisión Eumycota
Clase Deuteromycetes
Subclase Hyphomycetes
Orden Hypocreales
Familia Clavicipitaceae
Género Metarhizium
Especie M. anisopliae

4.10.1 Características macroscópicas y microscópicas

Metarhizium anispliae presenta una colonia pegada al medio, completamente redonda, de

colores oliváceo, amarillento, verdoso, marrón oscuro, dependiendo del aislamiento, con un
revés incoloro a marrón, a veces verdoso citrino. Los conidióforos nacen del micelio y son
irregularmente r amificados co n d os a t res r amas en cad a s epto, m iden d e 4 a 14μ de
longitud x 1.5 a 2.5 de diámetro. Las fiálides son cilíndricas en forma de clava, adelgazados
en el áp ice, miden d e 6 a 1μ 3de longitud y de 2 a 4μ deámetro.
di L as co nidias s on
unicelulares, c ilíndricas y t runcadas, f ormadas en c adenas m uy l argas, h ialinas a v erde
oliváceo, miden de 3.5 a 9μ de longitud x 1.5 a 3.5μ de diámetro (Cañedo y Ames, 2004).

4.11 Efecto entomopatógeno

El ciclo patogénico de Metarhizium anisopliae se divide en seis etapas que son: adhesión de
esporas, penetración, invasión, colonización, muerte y emergencia de estructuras del hongo
sobre la epicutícula (Figura 2) (Ojeda et al., 2011).

12
 Figura 2. Ciclo patogénico de Metarhizium spp. Alves (1998).

a) Adhesión de los conidios. Los conidios se adhieren a l a superficie del insecto a las 24
hrs. después de la infección, iniciando el hongo el proceso patogénico (Arruda et al., 2005;
Kurtti y Keyhani, 2008).

b) Penetración. La principal vía de penetración se lleva a cabo a través del tegumento. Una
vez que l os c onidios s e a dhieren a l a c utícula de l a rtrópodo, g erminan y form an t ubos
germinativos q ue i nvaden l a cu tícula, f orman es tructuras d enominadas ap resorios y
penetran la superficie de la cutícula y en casos especiales, por el aparato bucal, orificio anal
y genitales (Bittencourt et al., 1999; Arruda et al., 2005); por m edio de la combinación de
procesos f ísicos y en zimáticos, Metarhizium anisopliae tiene l a cap acidad p ara s intetizar
enzimas hidrolíticas tales como proteasas, lipasas, amilasas y quitinasas, proceso que ocurre
a 48 h rs. post-infección. La p rimera b arrera p ara l a p enetración es l a ep icutícula para l a
acción d e l ipasas es pecíficas (enzimas produc idas por Metarhizium anisopliae)
relacionadas con la pre-penetración y crecimiento en la cutícula del hospedero (Silva et al.,
2009). A demás, posee la p roteína q uinasa A, i mportante p ara l a d iferenciación d e l as

13
estructuras a presoras, penetración y d egradación d e l a cutícula, adquisición de n utrientes,
regulación de pH, síntesis de lípidos, control del ciclo celular y del citoesqueleto (Fang et
al., 2009).

c) Invasión. A l as 96 hrs. po st-infección l as h ifas co lonizan el h uésped y em ergen d e l a

cutícula. U na v ez d entro d el i nsecto, e l h ongo s e d isemina v ía h emolinfa y produce
blastosporas y cuerpos filamentosos de hifas que invaden el sistema inmune del hospedero
y se multiplican rápidamente en los tejidos (Kaaya et al., 1993; Asaf et al., 2002; Kurtti y
Keyhani, 2008).

d) Colonización. La colonización del hongo en los órganos del artrópodo se produce en la

siguiente s ecuencia: cu erpos grasosos, sistema d igestivo, t ubos d e m alpigio, h ipodermis,
sistema n ervioso, m úsculos y t ráquea. Bittencourt et al., (1999) m encionan que l a
penetración de l hong o e n l os ór ganos ocurre a l qui nto dí a pos t-infección i nvadiendo
también los órganos reproductivo y digestivo.

e) Muerte. Esta etapa se caracteriza por la producción de micotoxinas, cambios patológicos

en el hemocele, acción histolítica y bloqueo mecánico del aparato digestivo, secundario al
crecimiento de las hifas (Rath et al., 1995).

f) Emergencia. Se produce después de la muerte del insecto y cuando las condiciones de

humedad r elativa s on ad ecuadas. La em ergencia d el m icelio s e r ealiza a t ravés d el
tegumento, crece en la superficie y esporula después entre las 48 a 60 hrs. de la muerte del
hospedero (Smith et al., 2000; Arruda et al., 2005).

4.12 Producción de enzimas

Los hongos entomopatógenos producen un gran número de enzimas las que son de utilidad
relevante p ara s u acción s obre el h ospedero, p ues l e p ermite co nvertir l os t ejidos d e l os
insectos en n utrientes p ara s u cr ecimiento. Las en zimas s on l as q ue d eterminan l a
virulencia, porque permiten al patógeno coexistir con los procesos metabólicos cambiantes
asociados a los estados de las enfermedades del hospedero (Pucheta et al., 2006).

14
Las cutículas son muy poco utilizadas por la mayoría de los hongos, pero es indispensable
su penetración para la completa invasión, por lo cual, han desarrollado un poderoso sistema
enzimático; dentro de l os que s e en cuentra u n am plio es pectro d e p roteasas m uy activas
para la penetración de la epicutícula hi drofóbica (Saksirirat y Hoppe, 1991 ). La v ariación
en l a v irulencia s e p uede r elacionar co n l a p roducción y act ividad en zimática d e l as
especies de este género, durante la penetración en la cutícula del hospedero (Borges et al.,
2010).

4.12.1 Lipasas

La producción de lipasa por un hongo entomopatógeno contribuye significativamente en la

penetración y provisión de nutrientes in vivo. Las lipasas actúan sobre los lípidos antes que
las q uitinasas. U na v ez q ue l a s uperficie l ipídica d e l a ep icutícula es d egradada p or l as
lipasas, el hongo produce grandes cantidades de proteasas (Pr1), para degradar el material
proteínico de la procutícula que se encuentra adherida como una cubierta de la quitina. Sólo
a través de la acción coordinada y combinada de las tres principales enzimas hidrolíticas,
(proteasa, q uitinasa y l ipasa) s e p uede llevar a cab o l a d esintegración completa d e la
cutícula del insecto hospedero (Hegedus y Khachatourians, 1995).

4.12.2 Quitinasas

Es el p rincipal co mponente es tructural en las p aredes c elulares de l os hong os y de

exoesqueletos de invertebrados (Warren, 1996). Están ampliamente distribuidas en plantas,
así co mo también en b acterias, h ongos, i nsectos y vertebrados ( Xiang et al., 20 05). La
principal f unción d e es tas en zimas es hidrolizar q uitina; en e l c aso d e l os h ongos es ta
enzima p articipa en l a m odificación d e l a m orfogénesis d e s u p ared c elular ( Sahai y
Manocha, 1993). Estas enzimas modulan el crecimiento y la autolisis de paredes celulares
de hongos que contienen quitina y también están involucradas en micoparasitismo (Lorito
et al., 1998), así como en actividades de hongos entomopatógenos y hongos nematófagos
hacia sus hospederos (T ikhonov et al., 2 002). Los hon gos e ntomopatógenos Metarhizium
anisopliae y Beauveria bassiana producen varias qui tinasas (St. Leger et al., 1986; Kang
et al., 1999), las cuales pueden tener una gran variedad de funciones. Algunas de ellas son

15
importantes en zimas q ue p articipan en l a d egradación d e l a cu tícula y act úan e n f orma
coordinada con proteasas para hidrolizar la cutícula del insecto hospedero (St. Leger et al.,
1986).

4.13 Producción de toxinas

Los hongos entomopatógenos poseen la capacidad de sintetizar toxinas que son utilizadas
en el ciclo de las relaciones patógeno-hospedero. El estudio de estas toxinas (dextruxinas,
demetildestruxina y protodextruxina) es de suma importancia ya que se pueden sintetizar
productos quí micos de ba ja t oxicidad y d e el evada acc ión insecticida, aca ricida y
nematicida (Hall, 1981 ; Wang et al., 2005). Las t oxinas s on i mportantes p ara
microorganismos parasíticos, ya que facilitan la infección por debilitamiento del hospedero.
Algunas especies de hongos entomopatógenos son capaces de producir ácidos orgánicos y
algunos de ellos han sido implicados en el proceso infectivo. Por ejemplo, se ha reportado
la produc ción de á cido oxá lico por B. bassiana, L. lecanii, P. fumosoroseus y
M. anisopliae, este ultimo produce toxinas llamadas dextruxinas que pueden matar insectos.
Las de struxinas s on l os c ompuestos m ejor c aracterizados, y a que s u m odo de a cción
también i nhibe la s íntesis d e A DN, ARN y d e p roteínas en l as células d e los insectos
(Pucheta-Díaz, 2006).

4.14 Factores que afectan el desarrollo de los hongos entomopatógenos

Entre l os f actores ab ióticos y b ióticos q ue af ectan l a es tabilidad y p ersistencia d e l os

hongos entomopatógenos, se encuentran los rayos ultravioleta, la temperatura, la humedad
relativa y los fungicidas (Hajek y St. Leger, 1994; Pucheta-Diaz, 2006). E l huésped es un
factor biótico importante que afecta la propagación, dispersión y persistencia, mismo que se
relaciona co n l os n utrimentos p resentes y l a et apa d e d esarrollo m ás s usceptible a l os
hongos entomopatógenos (Inglis et al., 2001).

4.14.1 La temperatura

La t emperatura es u no d e los p rincipales f actores q ue i nfluye en l a g erminación,

crecimiento vegetativo (Rath, 2000; Inglis et al., 2001), además en el proceso de infección,
así co mo en l a p ersistencia en ca mpo ( Ouedraogo et al., 1997). Se ha re portado que l a

16
temperatura óptima para el crecimiento in vitro de la mayoría de los hongos Hyphomycetes
oscila entre 20 y 30 °C (Goettel e Inglis, 1997; Inglis et al., 2001). Este factor ambiental es
relevante p ara l a ef icacia d e ag entes m icrobianos f úngicos p or i ncidir en s u cr ecimiento
vegetativo, ad emás, ser co nsiderada como u n p unto d e partida para la s elección de cepas
nativas con potencial para el control biológico (Luz y Fargues, 1997).

4.14.2 Humedad relativa

La h umedad r elativa es el s egundo f actor am biental m ás importante r elacionado co n l a

formación d e ep izootias en l as p oblaciones d e i nsectos y m uerte d e l os m ismos ( Fuxa y
Tanada, 1 987), así c omo de terminante e n s u de sarrollo y propa gación (Ra th, 2000).
Usualmente, l a g erminación d e la conidia d e l os h ongos en tomopatógenos oc urre e n un
rango d e h umedad r elativa en tre e l 9 0-100%, s in e mbargo, T anada y Kaya (1993),
mencionan que en este rango de humedad relativa, ayuda a l a germinación de la espora e
induce a l a es porulación. P or l o t anto, el p otencial ep izoótico d e l os h ongos d epende
también d e l a p roducción d e co nidios d el cad áver d el i nsecto ( Luz y Farges, 1 998). El
micelio normalmente permanece en el suelo en una atmósfera cercana al 99% de humedad
relativa (Zimmermann, 1986). Los hongos entomopatógenos que se utilizan en el control
de insectos plaga en la agricultura, también pueden ser afectados por a groquímicos, como
los fungicidas, insecticidas o herbicidas (Zimmermann, 1986). P or otro lado, las prácticas
culturales también influyen en la densidad de propágulos de los hongos entomopatógenos
en los agroecosistemas.

4.14.3 Precipitación, radiación solar y suelo

La lluvia juega un papel importante en la dispersión de los conidios (Inglis et al., 2001);
que le permite al hongo entomopatógeno dispersarse (Inyang et al., 2000). Por otra parte, la
radiación s olar es el f actor a mbiental m ás d estructivo q ue af ecta l a p ersistencia d e l os
hongos e ntomopatógenos, s iendo s u e spectro da ñino e ntre 290 y 315 nm ( Inglis et al.,
2001). La alta incidencia de este factor puede estimular o dañar el desarrollo de los hongos,
dependiendo de l a e specie (Moore et al., 1993). Se es tima q ue el p eriodo d e vida m edia
para l os conidios expuestos a l a ra diación s olar di recta, varia de un as 96 h rs (Ignoffo,

17
1992). La persistencia y eficacia de los hongos entomopatógenos es afectado por el tipo de
suelo (t extura, capacidad d e i ntercambio cationico, materia o rgánica y pH) ad emás d e l a
humedad y la presencia de microflora (Inglis et al., 2001).

4.14.4 Insecto huésped

La r elación q ue ex iste entre h uésped-hongo e ntomopatógeno e stá i nfluenciada por l os

factores fisiológicos y morfológicos, entre los más importantes son: densidad poblacional,
el co mportamiento, ed ad, n utrición, l esiones cau sadas p or ag entes m ecánicos, q uímicos,
depredadores y parasitoides (Inglis et al., 2001).

4.14.5 Nutrición

La nutrición es u n f actor i mportante q ue r egula l a s usceptibilidad d el insecto h uésped al

entomopatógeno (Urrutia et al., 2006). Una nutrición inadecuada a m enudo incrementa la
susceptibilidad del insecto, lo que predispone a l as infecciones microbianas (Sikorowski y
Lawrence, 1994). Por otra parte, una buena nutrición puede disminuir la susceptibilidad del
insecto hacia los hongos entomopatógenos (Ekesi et al., 2000).

4.14.6 Edad

La ed ad s e h a co nsiderado co mo u no d e l os f actores q ue d etermina l a mortalidad del

hospedero (Sikorowski y Lawrence, 1994), debido a que existe una edad de maduración de
la respuesta inmune. Los primeros ínstares de desarrollo de las larvas son más susceptibles
a las i nfecciones c ausadas por l os e ntomopatógenos, a l pos eer un s istema i nmunológico
poco desarrollado (Boucias y Pendland, 1984).

4.14.7 Densidad de población

Tiene importancia en l a epizootia d e la enfermedad. Cua ndo l a densidad de l a pobl ación

aumenta, hay una probabilidad mayor de que el insecto tenga contacto con el patógeno a
través d e i ndividuos i nfectados o d irectamente con el p atógeno ( Inglis et al., 2001). La

18
competencia p or r ecursos p uede s er u n f actor d e es trés en s i m ismo q ue f avorece l a
susceptibilidad a determinados patógenos (Sikorowski y Lawrence, 1994).

4.14.8 Composición del medio de cultivo

La composición del medio de cultivo, así como el «estrés hídrico» y el «estrés osmótico»
tienen u n ef ecto s obre l a g erminación, cr ecimiento, v irulencia y car acterísticas d e l a
superficie de los propágulos de Metarhizium anisopliae (Ypsilos y Magan, 2004; Rangel
et al., 2008).

En g eneral, e l d esarrollo d e l os pa tógenos fúng icos de ntro de l os hos pederos, p uede s er

afectado no s ólo por l as re acciones de i nmunidad d e l os hos pederos ( Feldhaar y G ross,
2008); sino también, indirectamente por la composición del alimento del hospedero (Hajek
y St. Leger, 1994).

19
 V. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1 Localización

La recolecta de insectos del orden coleóptera se realizó en las comunidades de La Cañada,

San Nicolás y Z oyatitla, p ertenecientes al m unicipio d e T etela d e O campo, P uebla
(Figura 3). El municipio de Tetela de Ocampo se localiza en la Sierra Norte del estado de
Puebla, de ntro d e l a z ona de cl imas templados, conforme s e a vanza de s ur a norte se
incrementa l a h umedad, i dentificándose cl imas q ue v arían d esde templado s ubhúmedo
hasta el semicálido, pasando por el templado húmedo primordialmente, la temperatura del
mes más frío se encuentra entre –3 y 18 °C; una precipitación media anual de 750 mm y la
del mes más seco es mayor de 40 milímetros, el tipo de vegetación predominante es bosque
de pino, mezclado con algunas especies de encino “bosque de pino-encino” (INEGI, 2010).

Figura 3. Localización del municipio de Tetela de Ocampo, Puebla-México.

El experimento d e l a p resente i nvestigación se r ealizó en el l aboratorio de la e scuela d e

Ingeniería A groforestal, d e la U nidad Regional T etela d e la B enemérita U niversidad
Autónoma de P uebla, ubi cada en A v. U niversidad S /N, Barrio Benito J uárez, T etela de
Ocampo, Puebla.

20
5.2 Recolecta de material biológico (insectos)

Durante los meses de mayo y junio de 2012, se realizó la recolección de material biológico,
“insectos del orde n c oleopera” en las co munidades an tes m encionadas, donde s e
establecieron parcelas, m ediante u n m uestreo d irigido. P ara f acilitar l a c aptura de l os
insectos, se u tilizó la t écnica d irecta, que i ncluyó la b úsqueda en h ojarasca (materia
orgánica) y directamente de insectos micosados y/o sospechosos.

5.3 Aislamiento y purificación de Metarhizium spp

Los insectos r ecolectados en c ampo q ue p resentaron s íntomas d e i nfección ( micosis) en

campo, s e t rasladaron a l l aboratorio d e Micología d e l a U nidad R egional Tetela-BUAP,
donde se observó la presencia de estructuras microscópicas (micelio). Para los individuos
sospechosos de la enfermedad, se realizaron lavados con agua estéril y desinfecciones con
NaHClO a 0,5% dura nte 1 m in. Seguidamente se realizaron lavados con agua estéril y se
colocaron en c ámaras h úmedas para e stimular l a e sporulación de l hong o, l o c ual se
incubaron a 28ºC por 7 -9 dí as. A pa rtir del d ecimo d ía, s e o bservó m icelio vigoroso co n
estructuras r eproductivas s obre l os i nsectos, p osteriormente s e r ealizaron transferencias
bajo co ndiciones as épticas, co n s iembras p or ag otamiento en p lacas de petri d e 9 cm d e
diámetro, u tilizando co mo medio d e cu ltivo agar pa pa de xtrosa (P DA), e n pre sencia d e
antibióticos (estreptomicina), s egún e l método de scrito por Rhod es y S mith (1992). Las
placas s e d epositaron en una incubadora (V WR ® ) dura nte 7 dí as a 28 ºC. Las co lonias
diferenciales s e t rasferirán a n uevas p lacas co n m edio P DA h asta l ograr s u p urificación
(Figura 4).

La cep a co mercial de Metarhizium, s e adquirió en la c iudad d e P uebla en l a empresa

“Agrobionsa de M éxico”, donde s e a dquirió e l producto Meta- BLAS. P osteriormente se
realizó una activación del micelio en placas de Petri de 9 cm de diámetro, utilizando como
medio de cultivo agar papa dextrosa (PDA) y se incubó a temperatura ambiente.

21
 a b

Figura 4. Purificación de la cepa nativa de Metarhizium spp.; a: vaciado de medio de

cultivo sólido (PDA); b: trasferencia de de conidios.

5.4 Identificación de Metarhizium spp

Una v ez t eniendo l a cep a p ura, s e p repararon m uestras d e m icelio co n es tructuras

reproductivas de l hong o, s e de positaron e n un port aobjetos y s e l e ad icionó una gota de
colorante de c ontraste (a zul de lactofenol) y s e re alizo un ba rrido c on una a guja de
disección para distribuir la muestra y lograr la mayor visibilidad posible. Las muestras se
visualizaron b ajo u n m icroscopio co mpuesto a d iferentes au mentos (40x y 100x)
identificando estructuras microscópicas (conidios, conidióforo, fiálides y esporas) tomando
como base las claves propuestas por Barnett y Hunter (1998) y Carrillo (2003) (Figura 5)
características del género Metarhizium y se tomaron fotografías con una cámara binocular
para microscopio a 40x para su posterior digitalización (Pedraza et al., 2011).

Figura 5. Identificación de Metarhizium spp.

22
5.5 Identificación del insecto

Para identificar el insecto en donde se aisló el hongo entomopatógeno (Metarhizium spp),

se realizó a través del uso de la guía rápida para la identificación de insectos de McGavin
(2000); en donde se observó la taxonomía del insecto y se comparó con las características
descritas en la guía.

5.6 Preparación de la dieta

Se p reparó d ieta artificial d e S OUTH LAND P RODUCTS INC (870 -265-3747) que
incluyó una s erie d e s ustancias s intéticas a b ase d e h arinas d e s oya y d e t rigo,
conservadores y complejos vitamínicos (Montes et al., 2001).

La d ieta artificial f ue elaborada en b ase a u na modificación r ealizada p or D ilcia et al.,

(1989). Para lo cual, se realizó 1, 420.00 m L de dieta en dos etapas. Primero se midió 710
mL de agua destilada estéril en una probeta, luego se colocó en un recipiente de aluminio y
se puso a hervir durante 5 minutos, inmediatamente se retiró del fuego y se colocó 150 grs
de d ieta SOUTH L AND y s e d isolvió co n u n agitador electrónico h asta h omogeneizar l a
mezcla. Posteriormente, se colocó a baño María y con una micropipeta se colocó 5 mL de
dieta sobre vasos trasparentes de plástico y se dejó solidificar (Figura 6).

Figura 6. Preparación de la dieta artificial

23
5.7 Preparación de suspensiones

Se tomaron preparaciones de medio de cultivo (PDA) con aislados monospóricos de cepas

de Metarhizium spp (una comercial y otra nativa), de 25 días de desarrollo, posteriormente
se ag rego 1 0 m L d e ag ua d estilada es téril (ADE) para s uspender y re mover esporas y
conidios. Después de 15 m inutos se realizó la recuperación y aforación de la mezcla a 1 0
mL en una probe ta g raduada, de e sta form a que dó preparada l a s uspensión m adre
(Figura 7); de l a cual, s e t omó u n 1 m L y se d epositó en t ubos de ensayo c on 9 m l d e
(ADE), quedando de esta manera preparada la dilución 10-1; se repitió el procedimiento
llevando 1 mL de esta dilución (10-1) a tubos con 9 mL de ADE, hasta obtener una dilución
de 10 -10 (Benítez, 2002) . Para el en sayo d e m ortalidad en l a p resente i nvestigación, s e
tomaron las diluciones 10-1, 10-5 y 10-10 para ambas cepas de Metarhizium spp.

Figura 7. Preparación de suspensiones

5.8 Conteo de conidios

A partir de las diluciones que se realizaron anteriormente, se determinó la concentración de

conidios, tomando una muestra de 60µ con una micropipeta, posteriormente se depositó en
la placa de la cámara de Neubauer y se observó al microscopio a 10x y 40x (Figura 8). El
proceso d e r ecuento d e co nidios (Benítez, 2002), se r ealizó t res v eces con l a s iguiente
fórmula:

Totales Esporas = No. de esporas 104

8
24
 Figura 8. Conteo de conidios en cámara de Neubauer

5.9 Inoculación

Las larvas de gusano cogollero (Spodoptera frugiperda) de tercer instar utilizados en la

presente investigación, provienen de un criadero del departamento de fitosanidad del
Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, Estado de México. La metodología para la
inoculación de los tratamientos consistió en colocar 20 larvas en inmersión en una caja petri
(Figura 9), posteriormente se retiró el exceso de inóculo sobre las larvas (Lucero et al.,
2004) y se colocó cada una de ellas en recipientes de plástico con tapa semitransparente de
25 mL de capacidad con tapa, la cual, posee una ventana circular en el centro facilitando el
intercambio gaseoso con 5 mL de dieta (Arévalo y Zenner, 2009) y se incubaron a 28 °C.

25
 Figura 9. Inoculación de larvas de gusano cogollero con Metarhizium spp.

5.10 Diseño experimental

El diseño para la presente investigación fue de bloques al azar, donde se compararon tres
concentraciones de conidios (10-1, 10-5 y 10-10) con dos cepas de Metarhizium spp. En

total se evaluaron 6 tratamientos, cada tratamiento tuvo 40 repeticiones; teniendo

así, un total de 240 larvas de tercer instar de gusano cogollero.

Las larvas se evaluaron cada 24 horas, a partir del tercer día de haber iniciado el
experimento. La mortalidad se determinó visualmente; las larvas vivas tendieron a moverse
cuando estuvieron expuestas a la luz, asimismo cuando se agitaron los vasos de plástico
transparente. La sospecha de muerte, se confirmó por la ausencia de movimiento de la larva
al ser tocada la superficie ventral del tórax con unas pinzas esterilizadas. Las larvas muertas
se seleccionaron en bandejas por separado y estuvieron en observación hasta cuando se
detectó la esporulación de Metarhizium spp. Durante el periodo de monitoreo, se registró el
número de larvas vivas y el de cadáveres con esporulación debido al efecto del hongo
entomopatógeno (Nájera et al., 2005).

26
La mortalidad expresada en porcentaje, se determinó mediante la siguiente fórmula:

% M = Lvx 100
Po

Donde:
%M = Porcentaje de mortalidad larval
Po = Población inicial
Lv= larvas muertas por el tratamiento

Los r esultados obtenidos se sometieron a un análisis de varianza (ANOVA) y pr ueba de

separación de medias por Tukey (p <0.05), utilizando el paquete estadístico SPSS versión
17 ( Statistical Packagefor S ocial S ciences) p ara d eterminar d iferencias en tre l os
tratamientos.

27
 VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1 Aislamiento de Metarhizium spp

Se r ecolectaron un t otal de 58 insectos del o rden co leóptera d e las co munidades d e S an

Nicolás, La Cañada y Zoyatitla, pertenecientes al municipio de Tetela de Ocampo Puebla.
Los insectos sospechosos de m icosis se colocaron en c ámaras húmedas, al t ermino de 7
dias no se observó infección por micosis. Sin embargo, se observó un i nsecto infectado en
campo, correspondiente a la comunidad de San Nicolás (Cuadro 3), donde a los diez días
en cámara húmeda, s e observo micelio vigoroso que posteriormente se aisló en medio de
cultivo sólido PDA.

Cuadro 3. Aislamiento de hongos entomopatógenos en insectos del orden coleóptera en el

municipio de Tetela de Ocampo, Puebla.

Insectos infectados por hongos entomopatógenos

Comunidad Sospechosos Esporulación en cámara
húmeda
La Cañada 24 0
San Nicolás 18 1
Zoyatitla 16 0

6.2 Identificación del hongo

El género Metarhizium durante su desarrollo pasa por dos etapas, la primera corresponde al
crecimiento de micelio, que se caracterizó por presentar micelio blanco de textura lanosa y
la etapa de esporulación; en la cual, aparecieron discos concéntricos delimitando las zonas
de e sporulación y m ostraron una c oloración v erde ol ivo (Barajas et al., 2009) . T iene la
capacidad de colonizar sustratos y producir una gran cantidad de enzimas.

Se identificó morfológicamente una cepa de Metarhizium spp., localizada en San Nicolás,

Tetela de Ocampo, Puebla; cuyas características macroscópicas en medio de cultivo Papa
Dextrosa A gar ( PDA) i ncubadas a 2 8°C, i ncluían co lonias co ncéntricas co n cr ecimiento
radial en un lapso de siete a diez días y una coloración verdosa (Figura 10).
28
 Figura 10. Crecimiento de Metarhizium spp., nativa en medio de cultivo PDA.

La cepa pura con características macroscópicas relevantes del género Metarhizium, se

identificaron taxonómicamente mediante la prueba de tinción, realizado por medio de una
coloración de azul de lactofenol, donde presentó hifas y micelio ramificado, conidióforo de
12µ de longitud, fiálides cilíndricas y adelgazadas en el ápice, con una longitud de 5µ de
longitud x 2.5µ de diámetro, conidias cilíndricas y truncadas en el ápice con 3.9µ de
longitud y 1.8µ de diámetro (Figura 11). Estas características microscópicas permiten una
identificación fácil y relativa del género Metarhizium.

a b

Figura 11. Identificación microscópica de cepa nativa de Metarhizium spp.; a: hifas y

micelio ramificado, b: características del conidióforo, fiálide y conidio. Resolución a.
x1300; b x1600.

29  
 
Estos datos son semejantes a los obtenidos por Elósegui et al., (2006), donde realizaron un
trabajo de aislamiento, identificación y caracterización morfométrica de aislados nativos de
hongos mitospóricos y reportaron que el aislado correspondiente a Metarhizium anisopliae
con clave Ma-30, presenta características macroculturales en medio PDA: colonias blancas
y algodonosas al inicio que se tornan amarillo verdoso y finalmente verde olivo oscuro y
costroso con zonas con micelio aéreo abundante blanquecino y el reverso amarillo intenso;
asimismo, presenta conidioforo con verticilos de 2-3 ramas cada uno, con tonos verde olivo
oscuro q ue aclara alápice, células co nidiógenas 6 ,0-10,0 (8,1μ) x 2,0-2,5 (2,1μ), c onidios
subhialinos a ligeramente v erdes, ci líndricos a l igeramente elipsoidales, 5,0-8,5 (6,6μ) x
2,0-3,0 (2,4μ).

Trabajos re alizados por Elósegui et al., (2006) obt uvieron un a islado de Metarhizium
anisopliae (Metschnikoff) S orokin aislado d e u na muestra d e s uelo d el insecto Galleria
mellonella y ot ro de Paecilomyces lilacinus (Thom.) de un t otal de 17 m uestras. P or s u
parte, Sun (2002) , logró 6,7% d e éxito para Metarhizium y 10% de é xito para Beauveria
spp., en Coptotermes formosanus a pa rtir de 90 m uestras de s uelo e i nsectos muertos
sospechosos de micosis. Este comportamiento se puede atribuir a la efectividad del método
de t rampeo con i nsectos s usceptibles, d onde s e re quiere de un a c antidad de pr opágulos
viables q ue g arantice l a i nfección, l os que de ben s er de l orde n de 1x104 unidades por
insecto co mo m ínimo s egún Bateman et al., (1996) También ex iste la p osibilidad d e q ue
los m icroorganismos c ompetidores c on su pr oducción d e m etabolitos activos af ecten l a
viabilidad de es tos propágulos fúng icos de seados ( Jenkins y G rzywacz, 2000). Sin
embargo, Jackson et al., (2000) pl antean que au nque es te m étodo d e a islamiento d irecto
conlleva mucho tiempo de muestreo en campo y experiencia, la realidad es que entre los
más ex itosos ag entes de co ntrol con m icroorganismos s e en cuentran aquellos ai slados
obtenidos directamente de los insectos hospederos, y no de las colecciones de cultivos o de
métodos indirectos a través de medios de cultivo selectivos (Moore y Caudwell, 1997).

30
6.3 Identificación taxonómica del insecto micosado por Metarhizium spp

El i nsecto d el cu al se ai sló Metarhizium spp., fue i dentificado como Phyllophaga spp;

teniendo co mo car acterísticas m orfológicas: 3 c m de largo, c olor ro jizo a p ardo oscuro,
frente c on a bundantes s edas m edianas o co rtas y er ectas, p ronoto b rillante co n p untos
irregularmente d istribuidos y co n s edas er ectas, l argas y es parcidas, é litros g labros y
brillantes, m aza an tenal 1 .5 v eces m ás l arga q ue el f unículo, p igidio b rillante co n s edas
cortas irregularmente distribuidas. Todas las uñas tarsales dentadas, el dentículo es grande y
esta bl anqueado por e scotaduras e strechas y profunda s, presentó pelos sobre e l c uerpo,
élitros duros y resistentes que protegen a las alas posteriores. Este insecto presentó colonias
en el exoesqueleto d el i nsecto, p rincipalmente en las al as an teriores q ue conforman e l
abdomen y cab eza d el es carabajo; as imismo, se o bservó m icelio en e l t orax, c on una
consistencia blanquecina que representa el estado de crecimiento micelial (Figura 12), el
cual, posteriormente se identificó como Metarhizium spp.

Área infectada

Figura 12. Phyllophaga spp. infectado por Metarhizium spp.

De acu erdo a las c laves t axónomicas y s iguiendo metodología por M cGavin (20 00), se
determinó la clasificación del insecto infectado por Metarhizium spp (Cuadro 4).

31
 Cuadro 4. Identificación taxonómica de Phyllophaga spp.

Reino Animal
Phylum Atrópoda
Clase Insecta
Orden Coleóptera
Familia Scarabaeidae
Género Phyllophaga
Especie spp.

En t rabajos r ealizados p or Hernández et al., (2011), re portan en el es tado d e M orelos, el

aislamiento e i dentificación de Metarhizium anisopliae sobre l arvas de Phyllophaga spp.,
con síntomas de infección de enfermedad lechosa y micelio abundante, resultados parecidos
a los encontrados en este trabajo de investigación.

6.4 Concentración de conidios de Metarizhium spp

Mediante el co nteo d e co nidios en cá mara N eubauer, se determinó la co ncentración d e

conidios de cada una de las concentraciones utilizadas. La mayor concentración de conidios
se obt uvo e n Metarhizium nativo 1/10 c on 53x10 4 con/mL y Metarhizium comercial 1/10
4
con 36x10 con/mL (Figura 13). Las co ncentraciones m ás b ajas s e o btuvieron co n
Metarhizium nativo 5/ 10, Metarhizium comercial 5/10, Metarhizium nativo 10/ 10 y
Metarhizium comercial 10/10; con 9x104, 7x104, 5x104 y 4 x104 con/mL r espectivamente.
No s e o bservó d iferencias s ignificativas d e co ncentraciones en tre Metarhizium comercial
10/10 y Metarhizium nativo 10 /10 y de es ta ú ltima concentración co n Metarhizium
comercial 5/10. Por su parte, las concentraciones de Metarhizium nativo 5/10, Metarhizium
comercial 1/ 10 y Metarhizium spp., nativo 1/ 10, mostraron d iferencia s ignificativa
(Cuadro 5).

32
Cuadro 5. Prueba de rangos múltiples de concentraciones (Tukey).

Subconjunto para alfa = 0.05

N
Variable e d c b a

Metarhizium Comercial 10/10 3 4,5033

Metarhizium Nativo 10/10 3 5,9567 5,9567

Metarhizium Comercial 5/10 3 7,3367

Metarhizium Nativo 5/10 3 9,7533

Metarhizium Comercial 1/10 3 36,9200

Metarhizium Nativo 1/10 3 53,1700

Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos.

*Datos ubicados en columnas iguales significan que no hay diferencia estadística entre la concentración de
conidios entre cepa nativa y cepa comercial de Metarhizium spp.

Figura 13. Concentración de conidios/mL de cepa nativa y cepa comercial de Metarhizium.

33  

 
6.5 Colonización de Metarhizium spp., nativo sobre larvas de gusano cogollero
(Spodoptera frugiperda)

La esporulación de Metarhizium spp, sobre larvas, se realizó de 5 a 6 dias después de su

muerte. I nicialmente ap arecieron colonias b lancas a lgodonosas, car acterísticas del es tado
de crecimiento del micelio (Figura 14). La emergencia del hongo se realizó por diferentes
vías, t ales co mo el ap arato b ucal y a bdomen. E n l a Figura 14a se obs erva que l a
emergencia d el h ongo s e r ealizó en la parte i nferior de l a cabeza, co lonizando el aparato
bucal e invadiendo el cuerpo de la larva mediante la producción de enzimas; por su parte en
la Figura 14b, se obs ervan dos c olonias de Metarhizium spp., e n di ferentes z onas, l a
primera está ubicada en la parte lateral del tórax y la segunda en el abdomen; así mismo en
la Figura 14c, se observa la esporulación del hongo en la parte inferior del abdomen y por
último en la Figura 14d, se observa l a e sporulación de hong o c on c oloración verdosa,
característico d e este g énero. Es tas i mágenes n os m uestran l a h abilidad q ue t iene
Metarhizium spp., para co lonizar a s u h ospedero m ediante l os m ecanismos d e a cción d e
este h ongo; el cual, invade el cu erpo d el ar trópodo h ospedero a t ravés d e l a cu tícula y
posteriormente se reproduce en él, favoreciendo así la transmisión horizontal del hongo y
además p uede t ener ef ecto s obre la r eproducción d el o rganismo q ue está s iendo at acado
(Quesada et al., 2004). De manera general, la muerte del insecto se debe a una combinación
de daños mecánicos producidos por el crecimiento del hongo, desnutrición y por l a acción
de los metabolitos secundarios o toxinas que el hongo produce (Chul et al., 1999).

La presencia de Metarhizium spp., se observó también sobre pupas (Figura 14f), ya que la
infección puede o currir si h ay en trada d e esporas a l as ce ldas, antes de que és tas s ean
operculadas, pero una vez que esto ha ocurrido, la pupas en desarrollo están en un ambiente
cerrado, de alta hum edad y al p arecer muy p ropicio p ara el de sarrollo de los hong os
entomopatógenos, o cacionando l a m uerte d el h ospedero e i mpidiendo l a e mergencia d el
adulto (Espinosa et al., 2011).

34
 aa b
b c

d e f

Figura 14. Colonización d e Metarhizium spp., nativo, s obre l arvas de g usano c ogollero
(Spodoptera frugiperda); a, b y c: co lonización d e Metarhizium spp., en es tado d e
crecimiento sobre el cuerpo de la larva; d: esporulación del hongo con crecimiento radial y
coloración v erdosa; e: co lonias d e Metarhizium spp., observadas en m icroscopio
(resolución 40X) y f: em ergencia y co lonización d e Metarhizium spp., sobre p upa de
gusano cogollero.

6.6 Mortalidad de larvas

Las concentraciones evaluadas durante las 72-168 hr s. post-infección, Metarhizium nativo

1/10 (53x104 con/mL) causó m ayor m ortalidad con 29 larvas, eq uivalentes a l 72.5% de l
total de la población correspondiente a este tratamiento; teniendo diferencias significativas
con l as demás co ncentraciones, posteriormente Metarhizium nativo 5/ 10 (9x104con/mL)
con un t otal de 22 l arvas (55%), i nmediatamente Metarhizium comercial 1 /10 (36x104
con/mL) con 21 l arvas ( 52.5%), luego Metarhizium nativo 10/ 10 (5x10 4 con/mL) c on 19
larvas (47.5%), Metarhizium comercial 5/ 10 (7x104con/mL) con 17 l arvas (42.5%) y
finalmente Metarhizium comercial 1 0/10 (4x104con/mL) con 13 l arvas (32.5%)
(Figura 15 y 16).
35
Figura 15. Mortalidad de larvas a diferentes concentraciones de con/mL de cepa nativa y
comercial de Metarhizium spp.

Tratamientos

Figura 16. Porcentaje de larvas muertas a diferentes concentraciones de con/mL de

Metarhizium nativo y comercial.

36
Estos datos son parecidos a los reportados por S oto (2008), donde reportó una mortalidad
del 68% de larvas ne onatas de g usano c ogollero ba jo un a c oncentración d e 1.2x105
conidias/mL adicionada con u na gota de t ween 8 0 y o bservadas a l as 7 2 h rs. de spués de
haber realizado el experimento en laboratorio. Por su parte García et al., (2011) reportaron
un alto rango de mortalidad de larvas de Epilachna varivestis y Spodoptera frugiperda del
93.2 al 100% a las 72 hrs. después de haber iniciado el experimento a una concentración de
1x109 esporas mL-1, utilizando dos aislamientos de Bb18 y Bb42 de Beauveria bassiana y
Ma91 de Metarhizium anisopliae en laboratorio.

Sin em bargo Pérez et al., (2001) m encionan que l as c epas de Metarhizium anisiopliae
causaron una m ortalidad s uperior al 50 % s obre A. insularis a l as 72 hrs . después de l a
aplicación. Así m ismo Nájera et al., (20 05) reportan q ue l a cepa n ativa d e Metarhizium
anisopliae originario del estado de Jalisco-México, provocó el 80% de mortalidad a los 30
días d e h aber i niciado el ex perimento s obre l arvas d e Phyllophaga spp., a u na
concentración de 2x10 8 con/g. Es te ú ltimo d ato está r elacionado co n e l r esultado d e
mortalidad obtenido mediante la utilización de la cepa nativa de Metarhizium 1/10 bajo la
concentración de 53x104 con/mL.

Los d atos o btenidos en es te ex perimento, i ndican qu e l a co ncentración de Metarhizium

comercial 10/ 10 y Metarhizium nativo 1 /10 mostraron d iferencias s ignificativas
(Cuadro 6) además, se observó que las concentraciones de Metarhizium nativo 5/10 (9x104
con/mL) y Metarhizium comercial 1/10 (36x104 con/mL), tienen el mismo efecto respecto a
la m ortalidad d e l arvas, ya q ue n o m uestran d iferencias s ignificativas. Lo m ismo s ucede
4
entre la c oncentración de Metarhizium nativo 10/ 10 (5x10 con/mL) y Metarhizium
comercial 5/10 (5x104 con/mL).

37
Cuadro 6. Prueba de rangos múltiples en mortalidad (Tukey).

Subconjunto para alfa = 0.05

Variables
d c b a
Metarhizium Comercial 10/10 13,00
Metarhizium Comercial 5/10 17,00
Metarhizium Nativo 10/10 19,00
Metarhizium Comercial 1/10 21,00
Metarhizium Nativo 5/10 22,00
Metarhizium Nativo 1/10 29,00
Se muestran las medias para los grupos en los subconjuntos homogéneos.
*Datos ubicados en columnas iguales significan que no hay diferencia estadística entre la mortalidad de larvas
bajo diferentes concentraciones de conidios entre cepa nativa y cepa comercial de Metarhizium.

Las concentraciones de la cepa de Metarhizium comercial, a excepción de la concentración

1/10 (36x104 con/mL), mostraron menor virulencia en comparación a la cepa nativa, ya que
la virulencia está determinada por factores que dependen de su información genética, lo que
influye en la producción de enzimas y toxinas para la infección. Por tal razón, una posible
causa de disminución de la patogenicidad del aislamiento podría deberse a la supresión de
genes d eterminantes en el d esarrollo d e las d iferentes etapas d el mecanismo d e infección
(Riba et al., 1985 ; Riba et al., 1986) . P or o tra p arte, l os p orcentajes b ajos d e m ortalidad
obtenidos en este ex perimento, es tán r elacionados a l a n o u tilización d e ac eite Tw een
durante l a p reparación d e l as s uspensiones, ya q ue V élez et al., (2001) señalan que e ste
aceite m ejora l a p enetración g racias a l as p ropiedades cu tinofílicas, p ermitiendo m ayor
adhesión d e las es poras a la cutícula del i nsecto. Esta mezcla emulsiva ( conidias, agua y
Tween) cubre mejor al insecto, debido que el aceite funciona como adherente, cumpliendo
una función sinergista, permitiendo la germinación del hongo en menor tiempo (Contreras
et al., 1997). A demás, también pudi eran e star i nfluenciados por e l m étodo de i nmersión
utilizado para la inoculación de las larvas, ya que esta metodología presenta una desventaja
frente a ot ros m étodos, ya que por efecto de lavado, se pudo afectar la adherencia de las
esporas y así, su virulencia (Rodríguez et al., 2002).

38
6.7 Larvas que pasaron al estado de pupas

De cada una de las dosis aplicadas, la concentración donde se obtuvo el mayor número de
de pupa s, fue Metarhizium comercial 10/ 10 (4x10 4 con/mL) c on 27 pupa s, s eguida d e l a
concentración de Metarhizium comercial 5/10 (7x104 con/mL) con 23 pupa s. Sin embargo,
cabe s eñalar q ue l a cepa n ativa de Metarhizium spp e n l a c oncentración 1/ 10 (53x10 4
con/mL) solo representó 11 pupa s teniendo d iferencias s ignificativas co n l os d emás
tratamientos (Figura 17).

Figura 17. Número de larvas que llegaron al estado de pupa.

6.8 Emergencia de adultos

La concentración donde se logro la menor emergencia de adultos de gusano cogollero, fue

Metarhizium nativo 1/10 con 6 a dultos, e quivalentes al 1 5% del t otal d e l a pobl ación de
este t ratamiento. P or s u p arte, las concentraciones donde hubo m ayor e mergencia de
adultos fue Metarhizium comercial 5/10 y Metarhizium comercial 10/10; con 17 ( 42.5%) y
18 (45%) larvas respectivamente (Figura 18 y 19). Estos d atos g uardan r elación a l os
39
reportados por Ángel-Sahagún et al., (2005) quienes evaluaron la sensibilidad de huevos,
pupas y a dultos de Haematobia irritans en t res aislados d e l os hong os e ntomopatógenos
Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae y Paecilomyces fumosoroserus utilizados a
una concentración (con/mL) de 1x106 para huevos, 1x108 para pupas y las dos para adultos,
hallando que todos los estadios son susceptibles a la acción de los hongos entomopatógenos
con una r educción en l a e closión d e 3 ,8 a 6,3% respecto a un 72% d e eclosión de l
tratamiento testigo, m ortalidad e ntre 50 y 71,3% e n pupa s y 90% e n a dultos. De m anera
general, s e m ostró q ue la co ncentración m ás a lta d e Metrahizium ssp. na tivo 1/ 10
(53x104con/mL), hubo un m ejor c ontrol en l a em ergencia d e ad ultos d e Spodoptera
frugiderda.

Figura 18. Emergencia d e adultos en cad a u no d e los t ratamientos a d iferentes

concentraciones.

40
 Figura 19. Porcentaje de emergencia de adultos de gusano cogollero a diferentes
concentraciones entre cepa nativa y comercial de Metarhizium spp.

6.9 Tiempo letal (TL50) entre cepa nativa y cepa comercial de Metarhizium spp., sobre
larvas de gusano cogollero

La m ortalidad d e l arvas d e g usano co gollero, mediante l a u tilización d e Metarhizium

nativo, ocurrió a las 72 hrs. donde se registró el mayor índice de mortalidad para cada uno
de l os t ratamientos (TL50). Respecto a l índice d e m ortalidad producida por l a cepa
comercial de Metarhizium spp., ocurrió entre 72-96 hrs. donde se registró el mayor índice
de mortalidad para cada uno de los tratamientos (TL50), Figura 20.

De m anera general, la mayor m ortalidad d e larvas p ara ambas cepas, ocurrió a l as 72 -96
hrs; es decir, a los 3-4 días post-infección. Estudios en laboratorio realizados por Lezama et
al., (1996) han demostrado que S. frugiperda es susceptible al hongo M. anisopliae en los
estados biológicos de huevo y larva, con porcentajes de mortalidad de 100% y valores de
TL50 de 2.5 A 2.9 dias en huevo y 1.3 a 3.1 dias en larva, bajo una concentración de 1x108
conidias por mL, semejantes a los obtenidos en esta investigación. Luna y Lecuona (2002),
mencionan q ue l as cepas n ativas d e Metarhizium anisopliae provocaron m ortalidad d e
tucuras (Rhammatocerus pictus) entre los 5.4 y 7.9 días, siendo el tiempo de sobrevivencia

41
media de 7 días frente a los 10.4 dias de B. bassiana; demostrando así su mayor agresividad
frente a B. bassiana. Así m ismo, Ibarra et al., (2005 ) mencionan q ue las c epas d e
Metarhizium anisopliae (M362 y M379) colectados en la r epública m exicana, mataron
significativamente m ás r ápido a los a dultos de l a c hicharrita d el m aíz (Dalbulus maidis),
con prom edios de 10.5 y 10.3 dí as a comparación d e l a cepa d e Beauveria bassiana con
12.0 hasta 14.8 días.

Figura 20. Tiempo de mortalidad de larvas de 72-168 hrs. post-infección.

Los re sultados obt enidos e n l os di ferentes t rabajos de i nvestigación y re portados por l os

autores an teriores, p ermiten d emostrar el p otencial d e Metarhizium para el control
biológico de insectos plaga de diferentes órdenes.

42
 VII. CONCLUSIONES

 Los insectos del género Phillophaga son susceptibles a la infección causada por el
hongo Metarhizium spp., en el municipio de Tetela de Ocampo-Puebla.

 La m ayor produc ción de c onidios s e pr esento e n l a c epa na tiva de Metarhizium

spp., c on 53x104 con/mL en m edio d e cu ltivo P DA, r epresentando as í mayor
producción de estructuras reproductivas en comparación a la cepa comercial.

 La concentración 10 -1 de cep a n ativa d e Metarhizium spp., presento m ayor

porcentaje de mortalidad 72.5 a las 72 hrs post-infección, en comparación al la cepa
comercial 10/10 con el 32.5% que fue el resultado más bajo obtenido en la presente
investigación.

43
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 IX. ANEXOS

Evidencia fotográfica

Colecta de insectos sobre cultivos Colecta de insectos sobre malezas

Colecta de insectos sobre malezas Phyllophaga spp. micosado

Identificación de Metarhizium spp. Conidios de Metarhizium spp.

59
Preparación de la dieta Preparación de la dieta

Vaciado de la dieta sobre vasos Solidificación de la dieta sobre vasos

Preparación de suspensiones Inoculación de Metarhizium spp. sobre

larvas de gusano cogollero

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Conteo de conidios en cámara Neubauer Incubación rústica de gusano cogollero

Micelio de Metarhizium spp. nativo Micelio aéreo de Metarhizium spp. nativo

Colonización de Metarhizium spp. nativo Pupas muertas donde no emergió el adulto

61