DOCUMENTO

Qumica Clnica 2003; 22 (5) 392-394

Deteccin e identificacin de la proteinuria de Bence Jones

Sociedad Espaola de Bioqumica Clnica y Patologa Molecular Comit Cientfico Comisin de Protenas1 Documento G . Fase 3 . Versin 5. Preparado por Jos Antonio Viedma Contreras

Indice 0 Introduccin 1 Objeto 2 Utilidad clnica de la determinacin de la proteinuria de Bence Jones 3 Procedimientos para la deteccin e identificacin de la proteinuria de Bence Jones 3.1 Fase preanaltica 3.2 Fase analtica 3.2.1 Inmunofijacin 3.2.2 Electroforesis de alta resolucin 3.2.3 Electroforesis capilar 3.2.4 Inmunoprecipitacin de cadenas ligeras de inmunoglobulinas en fase lquida 3.2.5 Estimacin cuantitativa de la proteinuria de Bence Jones 3.3 Fase postanaltica 4 Bibliografa

El empleo de tcnicas sensibles permite la deteccin de proteinuria de Bence Jones a bajas concentraciones en la gammapata monoclonal de significado incierto y en la expansin clonal de clulas B secundaria a neoplasias, enfermedades autoinmunes, e infecciones. La proteinuria de Bence Jones debe evaluarse siempre considerando la situacin clnica individual de cada paciente y la presencia de anemia, hipercalcemia, insuficiencia renal, o lesiones osteolticas (1,5-7).

1 OBJETO
El objeto del presente documento es recomendar procedimientos adecuados para detectar, identificar y estimar cuantitativamente la proteinuria de Bence Jones.

2 UTILIDAD CLNICA DE LA DETERMINACIN DE PROTEINURIA DE BENCE JONES

La proteinuria de Bence Jones debe investigarse en los siguientes casos (1-11): Diagnstico y seguimiento de las gammapatas monoclonales Sospecha clnica o de laboratorio de mieloma de cadenas ligeras (hipogammaglobulinemia en adultos detectada por la electroforesis del suero o por la cuantificacin inmunoqumica de inmunoglobulina G) Sospecha clnica de amiloidosis AL o enfermedad por depsito de cadenas ligeras

0 INTRODUCCIN
Las protenas de Bence Jones son cadenas ligeras libres monoclonales (kappa o lambda) de inmunoglobulinas o sus fragmentos, producidas en exceso y secretadas por clulas B derivadas de un clon que prolifera (1,2). Debido a su tamao molecular relativamente pequeo (22 kDa) las cadenas ligeras libres filtran a travs de los glomrulos y son reabsorbidas y catabolizadas por las clulas tubulares proximales. Cuando se supera la capacidad de reabsorcin tubular se excretan en la orina (proteinuria pre-renal). Las protenas de Bence Jones pueden estar presentes en la orina como molculas intactas, formas incompletas o fragmentos y diferentes polmeros de masa molecular variable. La excrecin urinaria de protenas de Bence Jones tiene un significado clnico importante, tanto diagnstico como pronstico, porque se asocia frecuentemente a neoplasias proliferativas de clulas B, especialmente mieloma mltiple, macroglobulinemia de Waldestrm, linfomas, amiloidosis AL o enfermedad por depsito de cadenas ligeras (2,3). La protena de Bence Jones puede ser demostrada en la orina en ms del 80% de los pacientes con mieloma mltiple, y constituye en el 20% de los casos el nico componente monoclonal. La concentracin de la protena de Bence Jones excretada depende principalmente de la masa tumoral y de la funcin renal (3,4).

3 PROCEDIMIENTOS PARA LA DETECCIN E IDENTIFICACIN DE LA PROTEINURIA DE BENCE JONES

3.1 Fase pre-analtica Las protenas de Bence Jones son susceptibles de degradacin por proteasas bacterianas. El espcimen recomendado para la deteccin de la proteinuria de Bence Jones es una muestra de orina reciente, habitualmente la segunda orina de la maana. Puede conservarse la muestra al menos una semana de 2 a 8 C, aadiendo azida sdica (0,1 g/L) para prevenir crecimiento bacteriano. La orina centrifugada debe ser concentrada convenientemente antes de su anlisis (12). En el caso de disponer de mtodos con elevada sensibilidad y buena resolucin, no es necesario concentrarla (13-17). 3.2 Fase analtica El mtodo seleccionado debe permitir la verificacin de las dos caractersticas de las protenas de Bence Jones: cadenas ligeras libres y monoclonalidad.

Composicin de la Comisin de Protenas de la SEQC: E. Bergn Jimnez, L. Borque de Larrea, M. Corts Rius, MA. Diguez Junquera, M. Garca Montes, I. Llompart Alabern, C. Martnez-Br, D. Prez Surribas, P. Rosique Samper, J.A. Viedma Contreras.

392 Qumica Clnica 2003; 22 (5)

Deteccin e identificacin de la proteinuria de Bence Jones

3.2.1 Inmunofijacin

La inmunofijacin es el mtodo de eleccin para la deteccin e identificacin de las protenas de Bence Jones. Se recomienda el empleo de mtodos de inmunofijacin con elevada sensibilidad y buena resolucin que permitan la deteccin e identificacin de la proteinuria de Bence Jones en concentraciones superiores a 10 mg/L (12-15). Los antisueros empleados en la inmunofijacin deben tener una elevada afinidad y avidez frente a las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas y frente a las cadenas ligeras totales (libres y ligadas). Los antisueros frente a cadenas ligeras libres (determinantes ocultos) resultan tiles para identificar proteinas de Bence Jones que migran de forma coincidente con inmunoglobulinas intactas. Cuando exista un fondo importante de cadenas policlonales o si en la electroforesis de alta resolucin aparecen bandas no identificadas en la inmunofijacin es conveniente utililizar al menos dos diluciones de la orina previamente concentrada (12,18). Un problema asociado con el empleo de mtodos sensibles de inmunofijacin y la mejora de la tecnologa de la electroforesis es la visualizacin en la orina del patrn en escalera de cadenas ligeras libres policlonales. El aspecto morfolgico habitual es de 3 a 8 bandas kappa igualmente espaciadas, cuya intensidad es mxima en la cara catdica del centro del patrn y disminuye andica y catdicamente. Aproximadamente el 25% de los casos se acompaan de 3 a 5 bandas lambda ms dbiles que las kappa. El patrn en escalera refleja diferencias en la carga (sustituciones de aminocidos por mutaciones en el ADN) y el tamao molecular de las cadenas ligeras (modificaciones post-translacionales), originando mltiples bandas en la inmunofijacin. El patrn policlonal en escalera puede observarse en la proteinuria tubular de diversa etiologa, y puede inducirse en individuos sanos mediante la infusin endovenosa de arginina que bloquea la reabsorcin tubular. El patrn en escalera no tiene un significado clnico relevante pero puede dificultar la correcta interpretacin de la proteinuria de Bence Jones (19,20).
3.2.2 Electroforesis de alta resolucin

3.2.4 Inmunoprecipitacin de cadenas ligeras de inmunoglobulinas en fase lquida

Aunque los mtodos inmunoqumicos en fase lquida no permiten identificar la monoclonalidad de las cadenas ligeras libres, se ha propuesto el cociente kappa/lambda en orina sin concentrar como un mtodo de cribado para la deteccin de protenas de Bence Jones (21-23).
3.2.5 Estimacin cuantitativa de la proteinuria de Bence Jones

La electroforesis de alta resolucin en gel de agarosa empleando colorantes sensibles y orina concentrada permite definir el tipo de proteinuria y la deteccin de componentes monoclonales en la orina en concentraciones superiores a 100 mg/L (1-6,12).
3.2.3 Electroforesis capilar

No existe en la actualidad un mtodo definitivo para la cuantificacin de la proteinuria de Bence Jones (24,25). Los procedimientos inmunoqumicos se desaconsejan por las siguientes razones: La naturaleza de las protenas de Bence Jones (monoclonalidad) con diferentes estados de polimerizacin y en ocasiones fragmentos, diferente grado de reactividad de los antisueros frente a las diferentes protenas de Bence Jones, y a la coexistencia de cadenas ligeras libres policlonales y protenas de Bence Jones. Algunos antisueros con reactividad frente a las cadenas ligeras libres no reconocen los determinantes antignicos de algunas protenas de Bence Jones y pueden mostrar reactividad cruzada con las cadenas ligeras ligadas a las inmunoglobulinas. La coexistencia de cadenas ligeras libres policlonales y proteinuria de Bence Jones. El potencial problema de exceso de antgeno. Los procedimientos electroforticos basados en la evaluacin densitomtrica del componente monoclonal (5,24,25) son criticables porque: Los mtodos usados actualmente para la cuantificacin de la excrecin urinaria de protena no presentan una sensibilidad y linealidad igual para todas las protenas presentes en la muestra, en particular protenas de bajo peso molecular y protenas de Bence Jones. Las diferentes protenas presentan diferente afinidad por los colorantes empleados en la electroforesis, y no se ha demostrado que coloraciones iguales para distintas protenas correspondan a igual concentracin de protena. En ocasiones no es posible delimitar el componente monoclonal en trazados que presentan un fondo intenso o mltiples bandas, y cuando comigran molculas de inmunoglobulina intactas y protenas de Bence Jones. 3.3 Fase postanaltica El informe de la investigacin de la proteinuria de Bence Jones debe incluir la descripcin del tipo de proteinuria y la evaluacin del patrn morfolgico de las cadenas ligeras obtenido por inmunofijacin. Aunque no existe un mtodo ideal para la estimacin cuantitativa de la proteinuria de Bence Jones, el procedimiento densitomtrico es el ms adecuado. Se recomienda emplear un mtodo con sensibilidad similar para las diferentes protenas presentes en la orina o calibrar el densitmetro frente a diferentes concentraciones de albmina (13, 26).

La electroforesis capilar constituye un procedimiento potencial para el estudio de la proteinuria de Bence Jones: la separacin de las protenas depende esencialmente de la resultante neta del flujo electroendosmtico hacia el ctodo y de la movilidad electrofortica de las protenas hacia el nodo (tampn alcalino) cuando se aplica una diferencia de potencial de varios kV a lo largo de un capilar. La migracin se produce hacia el ctodo donde un detector monitoriza el paso de las protenas midiendo la absorbancia en la regin ultravioleta (214 nm). Las protenas individuales pueden ser identificadas mediante inmunosubstraccin. El principal inconveniente para la aplicacin de la electroforesis capilar en el estudio de las protenas urinarias lo constituye la presencia habitual en la orina de numerosas substancias que absorben radiacin en la regin ultravioleta.

4 BIBLIOGRAFA
1. Merlini G, Aguzzi F, Wicher J. Monoclonal gammapathies. JIFCC 1997; 9: 171-6. 2. Aguzzi F, Wicher JT, Johnson AM. Bence Jones protein. En Ritchie RF, Navolotskaia O Eds, 1st Edition Serum proteins in Clinical Medicine, Scarborough, Maine. Foundation for Blood Research & Beckman Instruments Inc, 1996; 1: 11.04.

Qumica Clnica 2003; 22 (5) 393

DOCUMENTO

Qumica Clnica 2003; 22 (5) 392-394

3. Beetham R. Detection of Bence Jones protein in practice. Ann Clin Biochem 2000; 37: 563-70. 4. Marshall T, Williams KM. Electrophoretic analysis of Bence Jones proteinuria. Electrophoresis 1999; 20: 1307-24. 5. Keren DF, Alexanian R, Goeken JA, Gorevic PD, Kyle RA, Tomar RH. Guidelines for clinical and laboratory evaluation of patients with monoclonal gammopathies. Arch Pathol Lab Med 1999; 123: 106-7. 6. Kyle RA. Sequence of testing for monoclonal gammopathies. Serum and urine asssays. Arch Pathol Lab Med 1999;123: 114-8. 7. Levinson SS, Keren DF. Free light chains of immunoglobulins: Clinical Laboratory analysis. Clin Chem 1994; 40: 1869-78. 8. Pezzoli A, Pascali E. The clinical significance of pure Bence Jones proteinuria at low concentration. Am J Clin Pathol 1989; 91: 473-5. 9. Pascali E, Pezzoli A. The clinical spectrum of pure Bence Jones proteinuria. A study of 66 patients. Cancer 1988; 62: 2408-15. 10. Gertz MA, Lacy MQ, Dispenzieri A. Amyloidosis: Recognition, confirmation, prognosis, and therapy. Mayo Clin Proc 1999; 74: 490-4. 11. Buxbaum JN, Chuba JV, Hellman GC, Solomon A, Gallo GR. Monoclonal immunoglobulin deposition disease: Light chain and light and heavy chain deposition diseases and their relation to light chain amyloidosis. Clinical features, immunopathology, and molecular analysis. Ann Inter Med 1990; 112: 455-64. 12. Pascali E. Bence Jones proteins identified by immunofixation electrophoresis of concentrated urine. Clin Chem 1994: 40: 945-6. 13. Matsuda K, Hiratsuka N, Koyama T, Kurihara Y, Hotta O, Itoh Y, et al. Sensitive method for detection and semiquantification of Bence Jones protein by cellulose acetate membrane electrophoresis using colloidal silver staining. Clin Chem 2001; 47: 763-766. 14. Sheat JM, Lorier MA. A simple silver-staining technique for detecting Bence Jones proteins in unconcentrated urine. Clin Chem 1987; 33: 561-3. 15. Aguzzi F, Gasparro C, Bergami R, Merlini G. High sensitivity electrophoretic method for the detection of Bence Jones protein and for the study of proteinuria in unconcentrated urines. Ann Clin Biochem 1993; 30: 287-92. 16. Heys AD, Norden AGW, Fulcher LM, Flynn FV. Bence-Jones protein detection: A rapid immunoblotting technique for routine use on unconcentrated urine. Ann Clin Biochem 1986; 23: 571-6.

17. Norden AGW, Fulcher LM, Flynn FV. Immunoglobulin light chain immunoblots of urine proteins from patients with tubular and BenceJones proteinuria. Clin Chim Acta 1987; 166: 307-15. 18. Hess PP, Mastropaolo W, Thompson GD, Levinson SS. Interference of polyclonal free light chains with identification of Bence Jones proteins. Clin Chem 1993; 39: 1734-8. 19. Harrison HH. The ladder light chain or pseudooligoclonal pattern in urinary immunofixation electrophoresis (IFE) studies: a distinctive immunofixation pattern and an explanatory hypothesis relating it to free polyclonal light chains. Clin Chem 1991; 37: 1559-64. 20. MacNamara EM, Aguzzi F, Petrini C, Higginson J, Gasparro C, Bergami MR, et al. Restricted electrophoretic heterogeneity of immunoglobulin light chains in urine: A cause for confusion with Bence Jones protein. Clin Chem 1991; 37: 1570-4. 21. Levinson SS. An algorithmic approach using k/l ratios to improve the diagnostic accuracy of urine protein electrophoresis and to reduce the volume required for immunoelectrophoresis. Clin Chim Acta 1997; 262: 121-30. 22. Boege F. Measuring Bence Jones proteins with antibodies against bound immunoglobulin light-chains: how reliable are the results?. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1993; 31: 403-5. 23. Bergn E, Bergn M. Uso del cociente cadenas kappa/cadenas lambda en orina para el estudio de la protena de Bence Jones. Qum Cln 1999; 18: 266-70 24. Tillyer CR. The estimation of free light chains of immunoglobulins in biological fluids. Int J Clin Lab Res 1992; 22: 152-158. 25. Graziani M, Merlini G, Petrini C. Guidelines for the analysis of Bence Jones protein. Clin Chem Lab Med 2003; 41(3): 338-346. 26. Salomo M, Gimsing P, Nielsen LB. Simple method for quantification of Bence Jones proteins. Clin Chem 2002; 48: 2202-7.
Correspondencia: SEQC Comisin de Protenas c/ Padilla, 323 Despacho 68 08025 Barcelona

394 Qumica Clnica 2003; 22 (5)