Práctica 4 Enzimas
Práctica 4 Enzimas
Práctica 4 Enzimas
Enzimas
Enzimas
La mayoría son
Proteínas
Biocatalizadores Que
intervienen
Incrementan la Reacciones
velocidad químicas
De los
Aceleran la velocidad
de las reacciones
Mediante la
Disminución de la
energía de activación
de la reacción
Actividad enzimática
es
Directamente
proporcional Determinación Cantidad sustrato consumido
Por medio de (producto formado)/unidad
A su concentración de tiempo
Velocidad de la
reacción que Se debe expresar en
cataliza Unidades Internacionales
(UI) de actividad enzimática
Se encuentra en
Fuentes mas
riñón, hígado, bazo
y pulmón importantes hígado,
Catalizan reacciones
Valores normales huesos e intestino
de transaminación
En crecimiento los
TGO y TGP difieren en ambos
sexos valores son altos por
Aumentan en
Aumenta en actividad
enfermedades
hepatobiliopatias , osteoblástica ,
hepáticas , hepatitis
procesos como en el
víricas y tóxicas
obstructivos o embarazo (III
neoplásicos trimestre)
Enzimas Séricas Pancreáticas
Amilasa Lipasa sérica
En individuos sanos la
actividad total de la CK en En el infarto la
suero se compone de CK-MM alteración que se
En el infarto es la importancia manifiesta es el
la actividad de la CK-MB. aumento de LDH1,
Ayudan a reconocer antes de los de LDH
precozmente reinfartos total.
El aumento de la CK también
se da en esfuerzo físico,
heridas musculares, daño
hipoxico
Enzimas
Factores que modifican
la actividad enzimática
Tiempo de
pH del medio reacción
Concentración Efecto de
de la enzima inhibidores y
activadores
Acción
hidrolítica Pepsina
La pepsina, es una
endopeptidasa, hidroliza
enlaces peptídicos situados Sobre
al lado amino de Phe, Tyr,
Trp, Asp, Glu y Leu. No actúa Proteínas
si el residuo anterior es Pro.
Ya que rompen
Enlaces
peptídicos
Relación de experimentos :
Determinación de la Actividad de la lactato deshidrogenasa
Factores que afectan la actividad enzimática
Determinación de la
actividad de la lactato
deshidrogenasa
Experimento Determinación de Lactato Deshidrogenasa
Fundamento
Procedimiento
Procedimiento
Mezclar e insertar la cubeta en el fotómetro.
Poner el cronómetro en marcha.
Pasados 30 segundos, anotar la absorbancia inicial y efectuar nuevas lecturas cada
minuto durante 3 minutos.
Calcular el incremento de absorbancia por minuto promedio (∆A/min).
30 1 min 1 min 1 min
seg
Abs
Abs 1 Abs 2 Abs 3
Inicial
Promedio
Leer las
absorbancias
a 340 nm
Cálculos
Experimento Determinación de Lactato Deshidrogenasa
Resultados
Valores de Absorbancia
Muestra 1
Absorbancia 0.358
inicial
Abs 1 0.345 0.013
Abs 2 0.320 0.025
Abs 3 0.302 0.018
https://www.youtube.com/watch?v=aXgqmb_o_pI
Efecto del pH sobre la
actividad enzimática
Enzimas
Carboxilo poseen
Mayor velocidad de
reacción enzimática
Por lo tanto
Mayor actividad
enzimática
Efecto del pH sobre la velocidad
Experimento 1
Procedimiento
de una reacción enzimática
a) Preparar 5 tubos de prueba de acuerdo al siguiente cuadro.
1 2 3 4 5
Solución de ovoalbúmina 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL
HCl 1.0 N 2.0 mL 0.5 mL 0.0 mL 0.0 mL 0.0 mL
Na2CO3 10% 0.0 mL 0.0 mL 0.0 mL 0.5 mL 2.0 mL
Agua destilada 0.0 mL 1.5 mL 2.0 mL 1.5 mL 0.0 mL
1 2 3 4 5
Efecto del pH sobre la velocidad
Experimento 1
Procedimiento
de una reacción enzimática
b) En 5 tubos pequeños, medir 0.3 mL
de una solución de pepsina al 1%. d) Agregar rápidamente a cada uno
de los 5 primeros tubos, los 0.3 mL
de la solución de pepsina que se
1 2 3 4 5 encuentra en los segundos tubos.
10 minutos
EXPERIMENTO 1
1 2 3 4 5
Solución de ovoalbúmina 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL
HCl 1.0 N 2.0 mL 0.5 mL 0.0 mL 0.0 mL 0.0 mL
Na2CO3 10% 0.0 mL 0.0 mL 0.0 mL 0.5 mL 2.0 mL
Agua destilada 0.0 mL 1.5 mL 2.0 mL 1.5 mL 0.0 mL
Tubo 1
1 2 3 4 5
1 minuto
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
pH calculado 0.54 7
5 minutos
pH práctico 1.5
1 minuto 0 0 0 0 0
1 2 3 4 5 Aclaramiento 5 minutos 0 2 0 0 0
10 minutos 0 5 0 0 0
10 minutos
El pH óptimo de la pepsina es: ……………………………………..
Efecto del pH sobre la velocidad
Experimento 1 de una reacción enzimática
Resultados
Construya en Microsoft Excel una grafica 6
con los resultados obtenidos colocando
en el eje X el pH y en el eje Y la actividad 5
Actividad Enzimática
enzimática (aclaramiento).
4
0
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00
pH
Efecto de la temperatura
sobre la actividad enzimática
Reacciones Reacciones
químicas enzimáticas
1 2 3 4
Efecto de la temperatura sobre la
Experimento 3
Procedimiento
velocidad de una reacción enzimática
d) Agregar rápidamente a cada uno de los 4 primeros
b) En 4 tubos pequeños, medir 0.3 mL de tubos, las soluciones de pepsina de los 4 segundos tubos.
pepsina al 1%
2
1
4
2
1 2 3 4 3 4
37 oC
100 o C
0 oC 20 oC 37 oC 92 oC 0 oC 20 oC 37 oC 92 oC
Efecto de la temperatura sobre la
Experimento 2
Resultados
velocidad de una reacción enzimática
a) Expresar el aclaramiento (la actividad enzimática) de cada uno
de los tubos, con 0 – 5 cruces al final de 1, 5 y 10 minutos.
1 2 3 4
1 minuto
1 2 3 4
1 2 3 4 1 minuto 0 0 1 1
Aclaramiento 5 minutos 0 0 3 1
5 minutos
10 minutos 0 1 5 1
1 2 3 4
10 minutos
Efecto de la temperatura sobre la
Experimento 2
velocidad de una reacción enzimática
Resultados
Construya en Microsoft Excel una grafica 6
con los resultados obtenidos colocando
en el eje X la temperatura y en el eje Y la 5
Actividad Enzimática
actividad enzimática (aclaramiento).
4
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Temperatura (oC)
Influencia de la concentración de la
enzima sobre la velocidad de reacción
Aumento [E]
Velocidad inicial
Aumenta
(nmol/min)
proporcionalmente
Velocidad
enzimática
Concentración de enzima
(µg/mL)
Efecto del concentración de la enzima sobre
Experimento 3
Procedimiento
la velocidad de una reacción enzimática
a) Preparar 4 tubos de prueba de acuerdo al siguiente cuadro.
1 2 3 4
Solución de ovoalbúmina 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL
HCl 1.0 N 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL
Agua destilada 1.5 mL 3.5 mL 4.2 mL 4.2 mL
1 2 3 4
1 2 3 4
Pepsina 1 %
preincubada 3.0 mL 1.0 mL 0.3 mL 0.0 mL
Pepsina 1%
hervida 0.0 mL 0.0 mL 0.0 mL 0.3 mL
Efecto del concentración de la enzima sobre
Experimento 3
Procedimiento
la velocidad de una reacción enzimática
b) Preincubar lo siguiente en 4 tubos pequeños
10 minutos
Efecto del concentración de la enzima sobre
Experimento 3
la velocidad de una reacción enzimática
Cálculos
Calcule la concentración de la pepsina en cada uno de los tubos en miligramos por tubo.
Solución pepsina 1%
X = 0.03 g = 30 mg
Efecto del concentración de la enzima sobre
Experimento 3
Resultados
la velocidad de una reacción enzimática
a) Expresar el aclaramiento (la actividad enzimática) de cada uno
de los tubos, con 0 – 5 cruces al final de 1, 5 y 10 minutos.
1 2 3 4
1 minuto
1 2 3 4
1 2 3 4 1 minuto 3 2 0 0
Aclaramiento 5 minutos 5 4 1 0
5 minutos
10 minutos 5 5 3 0
1 2 3 4
10 minutos
Efecto del concentración de la enzima sobre
Experimento 3
la velocidad de una reacción enzimática
Resultados
Construya en Microsoft Excel una grafica
con los resultados obtenidos colocando 6
en el eje X el [E] y en el eje Y la actividad
Actividad Enzimática
enzimática (aclaramiento). 5
0
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00
[E]
Bibliografía
• Bisswanger, H. (2017). Enzyme kinetics: principles and methods. John Wiley & Sons.
• Huntington, J. A., & Stein, P. E. (2001). Structure and properties of ovalbumin. Journal of
Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 756(1-2), 189-198.
• Suwareh, O., Nau, F., & Causeur, D. (2019). Identification of the physicochemical
characteristics of peptides that influence their hydrolysis by pepsin. In Workshop Infogest
statistical treatment of peptidomic data.
• Zotter, A., Bäuerle, F., Dey, D., Kiss, V., & Schreiber, G. (2017). Quantifying enzyme
activity in living cells. Journal of Biological Chemistry, 292(38), 15838-15848.