LES PROTÉINES

1
 Plan
 Définition
 Caractéristiques des protéines
 Structure tridimensionnelle des protéines
◦ Structure primaire
◦ Structure secondaire
 Hélice α
 Feuillet plissé β
 Coude β
◦ Structure tertiaire
◦ Structure quaternaire
 Les différents types de liaisons ou forces impliquées dans la
structuration des protéines
 Définition
 Les protéines sont une classe de molécules biologiques
« de première importance » (du grec proteios).
 Ce sont des macromolécules de type polymère
composée d’une ou plusieurs chaînes d'acides aminés
(chaines polypeptidiques). .
 Les protéines (ou les protides) sont des éléments
essentiels car elles ont des rôles très variés au sein
d’une cellule et au sein d’un organisme:
◦ un rôle structurel (l'actine),
◦ un rôle catalytique (les enzymes),
◦ un rôle de régulation de l'expression des gènes (les
facteurs de transcription), etc. 3
 Caractéristiques des protéines
 Chaque protéine a une structure qui est
déterminée génétiquement , possède une taille
prédéfinie (modifiée parfois après traduction).
 Dans une cellule, chaque protéine joue un rôle
particulier.
 Les protéines sont synthétisées et dégradées en
permanence dans les cellules.
 Caractéristiques des protéines
 Une protéine est
◦ Monomérique = une seule chaîne peptidique
◦ Multimérique = plusieurs chaînes peptidiques.
 Homomultimèrique = plusieurs chaînes peptidiques
identiques
 Hétéromultimèrique = plusieurs chaînes peptidiques
différentes.
◦ Une haloprotéine quand elle ne fournit que des acides
aminés, après hydrolyse.
◦ Une hétéroprotéine quand elle fournit des acides aminés
et d’autres molécules différentes, après hydrolyse.
 La partie protéique: apoprotéine
 La partie non protéique: groupement prosthétiques
 Caractéristiques des protéines
 Les protéines peuvent être classées selon leur forme
globale.
◦ Les protéines globulaires: myoglobine
◦ Les protéines fibreuses : fonctions structurales ou
protectrices (kératine, collagène …)

 Les protéines peuvent être covalement liées à d’autres

molécules:
◦ à un lipide; on parle de lipoprotéine,
◦ à un glucide; on parle de glycoprotéine
◦ si c’est à un métal; on parle de métalloprotéine
6
Structure tridimensionnelle des protéines
 Les protéines diffèrent les unes des autres
parce qu’elles ont un nombre distinct et une
séquence distincte de résidus d’acides
aminés.
 Une séquence donnée d’acides aminés
s’enroule en une structure
tridimensionnelle unique et complexe
désigné sous le terme de conformation;
 Cette conformation est réalisé grâce à
l’établissement de liaisons faibles.
7
 Conformation tridimensionnelle des
protéines
 Cette conformation est classée par ordre de
complexité croissante en structure primaire,
secondaire, tertiaire et quaternaire.
 La structure tridimensionnelle des protéines
renseigne sur leur rôle dans la cellule (relation
structure-activité).

8
 Conformation tridimensionnelle des
protéines
 La structure primaire est la structure chimique
(covalente): quels acides aminés et dans quel ordre.
 La structure secondaire correspond aux structures
spatiales régulières (hélices a, feuillets b etc…).
 La structure tertiaire concerne l’arrangement dans
l’espace de ces structures secondaires, c’est à dire
la position dans l’espace de chaque atome.
 La structure quaternaire est une association de
structures tertiaires : certaines protéines existent
sous forme de complexes comportant alors
plusieurs sous-unités (exemple: l’hémoglobine).
Structure tridimensionnelle des protéines
Structure primaire
 Décrit la séquence ou l’ordre d’enchaînement des acides
aminés qui constituent la protéine.

 Cette séquence est fixée apres traduction de l’information

contenue dans le gène codant.
 Les AA sont numérotés en allant du N-terminal vers le C-
terminal.
 La structure primaire s’écrit en utilisant le code à 1 lettre
ou le code à 3 lettres.
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
M V H L T P E E K S A V T A L
…
 Met Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu
…
N-term C-term 11
Structure primaire
 Structure secondaire :
 1er stade de l’organisation dans l’espace d’une chaîne
peptidique.

 Une chaine d’AA possède au niveau des liaisons

peptidique de nombreux groupements –CO- et –
NH- ceux-ci peuvent établir en eux dans l’espace des
liaisons hydrogène et former une structure
secondaire.


 Les structures secondaires (stables) les plus

fréquentes sont l’hélice α, le feuillet plissé β et les
coudes β.

13
 L’hélice a

 La chaîne principale s’enroule en spirale, vers la

droite.
 Structure stabilisée par des liaisons hydrogènes
(intramoléculaires) entre les résidus n et n+4.
 L'hélice α s'élève de 0,54nm à chaque tour.
 Elle compte 3,6 résidus par tour. .
 Les plans des liaisons peptidiques sont parallèles à
l’axe de l’hélice.
 Les chaînes latérales R et liaisons C-H pointent vers
l’extérieur.
L’hélice a
L’hélice a
 L’hélice a
La kératine de nos cheveux est une protéine
en hélice a qui forme une fibre allongée.

Hélice a
 Feuillet plissé β
 La chaine peptidique se trouve sous forme en zigzag.
 La chaîne principale est étirée et deux segments de la
protéine se placent côte à côte, unis par des liaisons
hydrogènes entre les groupements C=O et NH.
 Si les segments sont orientés dans le même sens, on
parle de feuillets parallèles.
 Si les segments sont orientés dans le sens contraire, on
parle de feuillets antiparalléles.
 Les chaînes latérales, R, se dressent au sommet des
arêtes.

18
Feuillet plissé β
Feuillet plissé β

20
 Feuillet plissé β
La fibroïne est une protéine sécrétée par le
ver à soie qui donnera le fil de soie. Cette
protéine est constituée essentiellement de
feuillets plissés b.

feuillets plissés b
 Le coude b
R

4
R
3
Pont Hydrogène

2
R
1

• Le coude ou tour β est un coude serré impliquant 4 résidus et qui

permet à la chaîne de changer de direction.
• La chaîne principale de la protéine fait un tour en U; retrouvé
souvent à la jonction de deux segments de la chaîne formant un
feuillet β antiparallèle.
• Ces coudes contiennent en général une glycine ou une proline.
 Structure tertiaire

 La structure tertiaire consiste en une organisation

des structures secondaires entre elles.
 Cela implique l’apparition de liaisons hydrogène,
ioniques, de forces hydrophobes et parfois de ponts
disulfure.
 La structure tertiaire correspond à la structure
tridimensionnelle de la protéine.
 Une structure tertiaire n’est pas une structure
figée : elle peut se modifier (se tordre, se déformer)
sous l’effet de la fixation d’une molécule (ligand) ou
sous l’effet de la variation d’un paramètre physico-
chimique (pH, température).
Structure tertiaire
 Une protéine soluble (qui sera au contact de l’eau)
va se replier de façon à ce que les résidus les plus
polaires soient au contact du solvant.
 Les résidus apolaires, eux, seront au cœur de la
protéine de façon à ne pas interagir avec l’eau.
 Une protéine hydrophobe (qui sera insérée dans
des lipides) va se replier de façon à ce que les
résidus les plus hydrophobes soient au contact des
lipides qui l’entourent.
 Les résidus polaires, eux, seront au cœur de la
protéine de façon à ne pas interagir avec ces
lipides.
24
Liaisons
hydrophobes
 Exemple de structure tertiaire

Myoglobine Carboxypeptidase
 Structure quaternaire:
 C’est l’association de plusieurs chaînes peptidiques
pour donner un complexe stable et actif.
 Plusieurs sous-unités tridimensionnelles (structures
tertiaires) s’assemblent pour former des unités
fonctionnelles beaucoup plus grandes (enzymes,
ribosomes et des fibres protéiques).
 Les chaînes qui constituent ce complexe sont des
protomères ou sous-unités, chacune ayant une
structure tertiaire définie.
 L’association des différentes chaînes se fait via des
liaisons faibles et parfois aussi via des ponts
disulfures.
27
 Structure quaternaire:
Les protéines: structure 3D

 Exemple:
L’hémoglobine
 Un transporteur
d’oxygène,
 Possède une structure
quaternaire,
 Formée de quatre sous-
unités (2 et 2).
 Les différents types de liaisons ou forces
impliquées dans la structure des protéines

 Structure primaire: liaisons peptidiques

(covalentes), les ponts disulfure
 Structures II, III et IVaires : liaisons faibles
éventuellement covalentes
◦ Les liaisons hydrogène,
◦ Les liaisons ioniques,
◦ Les forces hydrophobes
◦ Les ponts disulfure
29
 Les liaisons hydrogène
 Une liaison hydrogène se forme lorsqu'un atome
d'hydrogène déjà lié par covalence à un autre atome
électronégatif subit l'attraction d'un autre atome
électronégatif.
 Dans les cellules, les atomes électronégatifs qui
participent à des liaisons hydrogène sont le plus
souvent l'oxygène et l'azote.
• Les liaisons hydrogène sont environ
vingt fois plus faibles que les liaisons
covalentes.
• Les liaisons faibles permettent de
brefs contacts entre les molécules; les
molécules s'associent, réagissent
l'une à l'autre, puis se séparent.
Les liaisons hydrogène
 Liaison ionique
 Un atome cède un ou plusieurs électrons pour
former un ion chargé positivement (cation). Un autre
atome capte ces électrons pour former un ion chargé
négativement (anion).
 Il y a donc transfert d'électrons entre les atomes.
(oxydation : l'atome perd des électrons et réduction :
l'atome gagne des électrons).
• Les cations et les anions
s'attirent l'un l'autre dans
une liaison ionique (En
raison de leurs charges
opposées) .
• Par exemple, le chlorure de
 Forces hydrophobes

 Comme les
molécules non
polaires ne
peuvent pas réagir
avec l'eau.

 Elles tendent à
créer entre elles
des liaisons de type
interactions
hydrophobes
Les ponts disulfures
Les différents types de liaisons ou forces
impliquées dans la structuration des
protéines

35
 Plan
 Quelques différences entre les différentes formes des
protéines.
 Exemples de protéines fibreuses
◦ Collagène
◦ Kératine
 Techniques d’étude des structures des protéines
 Propriétés physico-chimiques des protéines
◦ Masses molaires
◦ Caractère amphotère
◦ Solubilité
 En fonction de la force ionique
 En fonction du pH
◦ Stabilité thermique des protéines
◦ Autres propriétés
Quelques différences entre les
différentes formes des protéines
EXEMPLES DE
PROTÉINES FIBREUSES
Collagène

 Protéine extracellulaire
insolubles très résistantes.
 3 types: I (90%), II, III.
 Retrouvé partout dans
l’organisme dans l’os, le
cartilage, les tendons, les
ligaments, les vaisseaux,
etc.
 Structure en triple hélice α
 1/3 des résidus d’AA=
glycine (Gly-X-Y).
 Présence d’hydroxyproline
et d’ hydroxylysine.
 Contient des sucres
(glucose, galactose).
La kératine
 Protéine insoluble dans l’eau;
retrouvée dans la peau.
 Cheveux : constituée de 14 % de
cystéine (ponts disulfures) =
rigidité.
 2 types:
 La kératine α: formée d’hélice α =
mammifères (cheveux et ongles).
 La kératine β: formée de feuillet β
plissés antiparallèles =oiseaux
(plumes)
 Lors de la coiffure (permanente),
il y a cassure des ponts disulfure
et réassemblement.
 Techniques d’étude des structures
des protéines
 Les méthodes les plus importantes pour la
détermination des 4 types de structures des protéines
sont:
Structure Méthode
Primaire Séquençage
Secondaire Dichroisme circulaire, RMN,
Diffraction
Tertiaire RMN, Diffraction des Rayons X
Quaternaire Résonnance Magnétique Nucléaire,
Diffraction
PROPRIÉTÉS PHYSICO-
CHIMIQUES DES
PROTÉINES
 Masses molaires

 La masse moléculaire s’échelonne de 10KDa à plusieurs millions.

 La masse moléculaire d’une protéine est souvent utilisée comme
élément caractéristique servant à la définition ou à la nommer:
◦ ex : P47 c’est une protéine de 47KDa

Protéine Masse moléculaire (dalton)

Cytochrome c 12300
Myoglobine 17200
Anhydrase carbonique 30000
Ovabulmine 42700
Albumine 66250
Ovotransferrine 76-78000
43
 Caractère amphotère des
protéines
 Caractère amphotère
(comme AA), avec un degré
de complexité plus élevé en
raison du plus grand nombre
de charge mis en jeu.

Histidine: pouvoir tampon à pH neutre avec pHi = 44

 La solubilité
 La solubilité d’un composé est la quantité maximale du
composé qui peut se dissoudre dans un litre de solvant
considéré.
 La solubilité des protéines dépend de certains paramètres :
 - Influence de la concentration en électrolytes de la solution.
 - Influence du PH.
 - Influence des solvants organiques: les alcools méthyliques,
l’acétone précipitent les protéines.

45
 Evolution de la solubilité en
fonction de la force ionique

Importance de la détermination de la force ionique optimum

Evolution de la solubilité en fonction du
pH

La solubilité est minimum au pH isoélectrique (valeur de pH

pour laquelle la somme des charges positives et négatives
est égale à 0).
La solubilité augmente avec la force ionique
 Stabilité thermique des protéines

 Froid ou chaleur provoquent la dénaturation des

protéines.
 Dénaturation: modification de la structure
tridimensionnelle sans modification de la structure
primaire.
 Perte d’activité biologique, modification des propriétés
physico-chimiques.
 Autres propriétés des protéines

 Visible: les holoprotéines sont incolores

 Absorption de la lumière en UV:
◦ Absorption à 200 nm (liaison peptidique)
◦ AA aromatiques (absorption à 280 nm)
 Coloration par fixation des colorants:
◦ Les protéines fixent des colorants (Rouge Ponceau, noir
d’amide, Bleu de coomasie…)
 Coloration par réaction: permet le dosage des protéines
◦ Réaction du biuret.
◦ Lowry.
49
 Détermination de la structure primaire des
protéines
 I- Stratégie générale
 II- Techniques de séparation et de purification
 III- Fragmentation
◦ 1- Détermination de la composition en AA (analyse)
◦ 2- Coupures chimiques : CNBr, NBS
◦ 3- Coupures enzymatiques
 IV- Séquençage
◦ 1- Détermination du C-terminal
◦ 2- Détermination du N-terminal
◦ 3- Dégradation d’Edman
 V- Établissement de l’ordre dans lequel les AA sont liés.
 Stratégie générale
Purification Fragmentation Séquençage
- obtention de - Edman
- protéines - C-terminal
- peptides peptides
- analyse A.A. - N-terminal

reconstitution reconstitution

• La détermination de la séquence complète en AA d’une

protéine et l’ordre de ces AA passe par les étapes
suivantes:
• Extraire, séparer et purifier la protéine.
• Rompre les ponts disulfures (sous unités), fragmenter la
protéine, et hydrolyser la protéine (analyse = composition en Aa).
• Séquençage de la protéine et identification des Aa aux extrémités Ct
et Nt.
 Les techniques de purification
• Les diverses techniques pour séparer les
polypeptides se base sur sa taille, sa solubilité dans
un solvant particulier, sa charge ou son aptitude à se
lier à un support.
Paramètre Technique
Densité Ultracentrifugation
Solubilité Précipitation au sulfate d'ammonium
Taille Filtration sur gel
Charge Chromatographie d'échange d'ions,
électrophorése, isofocalisation.
Affinité Chromatographie d'affinité
Ultracentrifugatio
n

Procédé de séparation
des composés d'un
mélange en fonction
de leur différence de
densité en les
soumettant à une force
centrifuge.
L'appareil utilisé est
une machine tournante
à grande vitesse
 Chromatographie d’exclusion
Ou chromatographie gel
filtration: la séparation
est basée sur la taille
des protéines.

• Le gel est composé de billes trouées avec des trous de

différents diamètres; les petites molécules pénètrent dans
les trous et sortent tardivement et les grandes sortent les
premiéres.
Chromatographie d’affinité

 Nécessite la
reconnaissance de la
protéine par un ligand
porté par la phase
solide
 Méthode plus efficace
que la
chromatographie par
échange d’ions ou la
chromatographie par
gel filtration.
 Condition: il faut avoir
un ligand pour la
protéine recherchée.
Electrophorèse en gel de polyacrylamide (PAGE) avec
SDS

 Le Sodium dodécylsulfate
(SDS), dénature les
protéines.
 La séparation dans le
PAGE avec SDS est
fonction de la masse
molaire car toutes les
molécules sont chargées
de la même façon.
Focalisation isoélectrique
Détermination de la composition en
acides aminés

 Définition: c’est l’identification des acides aminés

constitutifs d’une protéine ou d’un peptide

 Cette étape comporte :

 La rupture de la séquence peptidique par hydrolyse
des liaisons peptidiques.
◦ Hydrolyse chimique des liaisons peptidiques
◦ Hydrolyse enzymatique
 L’analyse qualitative et quantitative des acides
aminés du mélange obtenu après hydrolyse.
 Hydrolyse chimique des
liaisons peptidiques
 Hydrolyse totale acide
◦ Par HCl à 6 Mol/L, à chaud (110°C), pendant 24 h
environ.
◦ Inconvénients : détruit le Tryptophane et transforme
la Glutamine en Glutamate et l'Asparagine en
Aspartate.
◦ Méthode la plus utilisée, mais, nécessite d’autres
méthodes pour compléter les résultats de l’analyse.
 Hydrolyse totale alcaline
◦ Par NaOH à 4 Mol/L à chaud (110°C) pendant 4 à 8
heures environ.
◦ Inconvénients: détruit la Sérine, l’Arginine, la
Thréonine et la Cystéine,
◦ Utilisation limitée à la détermination de la teneur en
Tryptophane.
 Hydrolyse enzymatique

 Protéolyse totale.
 Pronase= mélange de protéases extrait de
Streptomyces griseus.
 Intérêt: Détermination de la teneur en
Asparagine, en Glutamine et en Tryptophane
d’un peptide, acides aminés (détruits par les
méthodes chimiques plus sévères).
 Inconvénient : risque de contamination par
l’autodégradation des enzymes protéolytiques.
 Analyse qualitative et quantitative des acides
aminés du mélange obtenu après hydrolyse

 Comporte une séparation des acides aminés par

chromatographie sur résines échangeuses d’ions,
suivie du dosage de chaque acide aminé par la
réaction colorée à la ninhydrine.

 Ceci donne la composition qualitative et

quantitative du peptide (Identification des acides
aminés et de leur nombre).
Rupture des ponts disulfures

 Permet la
séparation des
chaînes
polypeptidiques si
elles sont liées par
ponts disulfure
 Empêche le
conformation
native qui pourrait
résister l'action des
agents
protéolytiques
 Coupure intra-chaine chimique

Solution Lieu de coupure

Bromure de cyanogène (BrCN) C-terminal des
méthionines
N-bromosuccinimide (NBS) Après Tyr et Trp
Hydroxylamine (NH2OH) Liaisons Asparagine-
Glycine
 Coupure enzymatique intrachaine
Endopeptidases

Enzyme Lieu de coupure

Pepsine Avant le N des AA aromatique: Phe, Trp,
Tyr
Asp N protéase Avant le N de Asp, cystéine, parfois Glu
Trypsine Après le C des AA basiques: Lys-Arg
Chymotrypsine Après le C des A.A. aromatiques: Phe,
Tyr, Trp
Endoprotéase V8 Après le C de Glu, parfois de Asp
Coupure enzymatique des extrémité C et N-
Ter
Exopeptidases
Extrémité spécificité
attaquée
Carboxypeptidase A C-ter Arg, Lys, Pro
Carboxypeptidase B C-ter Arg, Lys
Carboxypeptidase C C-ter Tous
Carboxypeptidase Y C-ter Tous sauf la gly
Leucine amino peptidase N-ter Pro
Aminopeptidase N-ter Tous
 Détermination du C-terminal par
méthode chimique
 Hydrazinolyse :
H2N-NH2
 L’hydrazine à
100°C attaque
toutes les liaisons
peptidiques et
donne des dérivés
hydrazide d’acide
sauf pour l’acide
aminé C-terminal
qui reste normal.
 Détermination du N-terminal par
méthode chimique

 Méthode de Sanger (FDNB)

 Méthode de dansylation
 Méthode récurrente d'Edman
Méthode récurrente d'Edman =
analyse séquentielle.
 Cela permet le
séquençage de
peptides constitués de
40 à 60 résidus d’AA.
 La détection des PTH-
AA se fait par HPLC
 Méthode récurrente d'Edman = analyse séquentielle.
0,1 1er cycle 0,1 4ème cycle
PTH-Ala PTH-Ala
Absorbance

Absorbance
0 0
0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25
Temps de rétention (min) Temps de rétention (min)

0,1 2ème cycle 0,1 5ème cycle

PTH-Ile
Absorbance

Absorbance
PTH-Phe

N-term
0
0 5
A-I-G-A-F-V…
10 15 20 25
0
0 5 10 15 20 25
Temps de rétention (min) Temps de rétention (min)

0,1 3ème cycle 0,1 6ème cycle

PTH-Gly

Absorbance
Absorbance

PTH-Val

0 0
0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25
Temps de rétention (min) Temps de rétention (min)

L’intensité du pic diminue à chaque cycle (rendement) et on voit apparaître des petits
pics parasites (résidus de cycles précédents, acides aminés oxydés…).
 Détermination de la séquence en AA
 C’est l’établissement de l’ordre dans lequel les AA sont
liés.
 Les fragments protéolytiques sont séparés par l'HPLC
et séquencer ainsi l’un après l’autre par la méthode
d'Edman après identification des extrémités C et N
terminales.
 La séquence du polypeptide original est obtenue en
comparant les séquences en AA d'une série de
fragments peptidiques avec celles d'une deuxième série
dont les sites d'hydrolyse recouvrent ceux de la
première série:
 Exemple
 Peptides de 14 AA.
 En N terminal= Tyrosine Y
 En C terminal = Lysine K
 Après hydrolyse acide complète, les AA suivants ont été
retrouvés:
 D;A ; G; I ; R; K;Y; Q ; M; F;

 En utilise le CNBr qui hydrolyse spécifiquement après Met

(M – X) et analyse séquentielle d’Edman: on obtient
 D - I - K - Q - M; K; K - F - A - M;Y - R - G - M

 En utilise la trypsine qui hydrolyse les liaisons peptidiques

après des résidus chargés positivement (K, R) et analyse
séquentielle d’Edman.
◦ Q - M – K; G - M - D - I – K; F - A - M – K;Y - R
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

______________
H3N- - - - - - - - - - - - - - -COO

Le CNBr hydrolyse spécifiquement après Met (M – X)

D-I-K-Q-M
K
K-F-A- M
Y-R-G-M
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

______________
H3N- - - - - - - - - - - - - - -COO

K-F-A-M

D-I-K-Q-M

Y-R-G-M
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

______________
H3N- - - - - - - - - - - - - - -COO

La trypsine hydrolyse les liaisons peptidiques

après des résidus chargés positivement (K, R)
Q-M-K
G-M-D-I-K
F-A-M-K
Y-R
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

______________
H3N- - - - - - - - - - - - - - -COO

F-A-M-K

Q-M-K

G-M-D-I-K

Y-R
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

______________
H3N- - - - - - - - - - - - - - -COO

K
F-A-M-K
K-F-A-M
Q-M-K
D-I-K-Q-M
G-M-D-I-K
Y-R-G-M
Y-R

Séquence peptidique:
Y-R-G–M-D-I-K-Q-M-K-F-A-M-K
Tableau général des structures des acides aminés
Tableau général des structures des acides
aminés