Électrospray

par Bertrand MONÉGIER

Rhône Poulenc Rorer
Centre de recherche de Vitry-Alfortville
Responsable du laboratoire de spectrométrie de masse

1. Principe........................................................................................................ PE 3 350 - 2
1.1 Description de l’interface ............................................................................. — 2
1.2 Mécanismes d’ionisation ............................................................................. — 3
1.3 Particularités de l’électrospray .................................................................... — 3
2. Interprétation des spectres.................................................................... — 5
2.1 Espèces multichargées ................................................................................ — 5
2.1.1 Calcul de la masse moléculaire.......................................................... — 5
2.1.2 Précision de la mesure........................................................................ — 5
2.1.3 Spectres SM/SM d’ions multichargés ............................................... — 6
2.2 Espèces monochargées ............................................................................... — 6
3. Applications ............................................................................................... — 6
3.1 Étude des biomolécules............................................................................... — 6
3.2 Couplage avec les différentes techniques chromatographiques ............. — 7
3.2.1 Chromatographie liquide.................................................................... — 7
3.2.2 Électrophorèse capillaire .................................................................... — 9
3.3 Application à la chimie combinatoire ......................................................... — 9
4. Conclusion .................................................................................................. — 10
Pour en savoir plus ........................................................................................... Doc. PE 3 350

L a détermination des masses moléculaires supérieures à 2 000 ou 3 000 dal-

tons (Da) exige l’utilisation d’aimants à haut champ ou de spectromètres
équipés d’analyseurs à temps de vol. Le premier type d’appareillage, fort coû-
teux, fait appel à l’ionisation par LSIMS (Liquid Secondary lon Mass Spectro-
metry) et reste limité à des masses inférieures à 10 000 Da ; dans le deuxième
cas, l’ionisation par les produits de fission du 252Cf (PDMS - Plasma Desorption
Mass Spectrometry) ne permet guère d’aller au-delà de 25 à 30 kDa, avec une
précision souvent insuffisante pour vérifier sans ambiguïté la conformité des
produits analysés.
Deux techniques récentes, le MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption
Ionisation - Time Of Flight) et l’électrospray, ont constitué une véritable révolu-
tion pour l’analyse des composés de haute masse moléculaire, tout particulière-
ment les peptides et les biomolécules (protéines, fragments d’ADN et d’ARN).
L’originalité de l’électrospray réside dans sa capacité à obtenir des molécules
portant plusieurs dizaines de charges. La spectrométrie de masse mesure tou-
jours le rapport de la masse d’un ion, divisé par le nombre de charges qu’il porte
(m/z). Par conséquent, une protéine de 50 000 Da portant 50 charges dues à des
protons est détectée à une masse apparente de 1 001 [(50 000 + 50)/50]. Autre-
ment dit, la zone d’observation des différentes espèces ioniques est ramenée
dans une gamme de rapports m/z tout à fait compatible avec l’utilisation d’ana-
lyseurs quadrupolaires.

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Une autre caractéristique de l’électrospray vient du fait que le processus

d’ionisation se produit en phase liquide et à la pression atmosphérique. Il est
d’autre part tout à fait adapté à l’étude des composés polaires ou thermosensi-
bles (l’ionisation se produit en effet à température ambiante). Son couplage avec
les techniques chromatographiques en phase liquide était donc logique, sup-
plantant même, tant sa réalisation est aisée, les techniques du thermospray et de
l’interface à courroie mobile, délicates à mettre en œuvre et dont les applications
restent, en comparaison, par trop ponctuelles.
Le nombre de publications dans ce domaine est devenu considérable, que ce
soit pour l’analyse de métabolites, la caractérisation d’impuretés diverses,
l’identification précoce de produits d’origine naturelle, ou encore pour l’étude
de milieux biologiques complexes.

1. Principe rant dans le processus de désolvatation puisqu’il permet de sécher

les solvants résiduels de façon que seuls les ions en phase gazeuse
puissent traverser l’orifice pour pénétrer dans l’enceinte de l’appa-
reil.
1.1 Description de l’interface Il existe un certain nombre de variantes, selon les constructeurs.
Certains utilisent un capillaire de transfert chauffé entre l’orifice et
l’analyseur, de façon à optimiser la désolvatation. D’autres propo-
Ce mode d’ionisation s’effectue à la pression atmosphérique et à sent, pour des débits supérieurs à quelques dizaines de microlitres
température ambiante. L’échantillon en solution est introduit (au par minute, d’ajouter un courant d’azote chaud, traversant le nébuli-
moyen d’un pousse-seringue ou d’une pompe chromatographique) sat extérieur et dirigé vers l’orifice, afin d’améliorer à la fois la sensi-
dans l’appareil par l’intermédiaire d’un capillaire dont l’extrémité bilité et le rapport signal sur bruit.
traverse une aiguille métallique portée à un potentiel de plusieurs Le vide dans l’analyseur doit être maintenu en permanence entre
kilovolts (typiquement 3 à 5 kV). Il en résulte la formation de goutte- 10–3 et 10–4 Pa. Afin de maintenir cette pression, les appareils munis
lettes mono- ou polychargées, qui conduisent, par désolvatation, à de pompes turbomoléculaires ou de pompes à diffusion nécessitent
des ions en phase gazeuse (figure 1). un étage de pompage supplémentaire entre l’orifice et l’analyseur.
Au contraire, les spectromètres équipés d’un système de pompage
cryogénique peuvent s’en affranchir.

Capillaire contenant Contre-électrode

l'échantillon en solution
1.2 Mécanismes d’ionisation
Gouttelettes N2
chargées
Orifice La formation d’ions directement à partir de la surface d’un liquide,
Ions Analyseur sous l’action d’un champ électrique intense, a été mise en évidence
par Dole en 1968 [1]. Ce phénomène, appelé nébulisation électros-
N2 3 à 5 kV tatique, permet de former des gouttelettes ayant une charge nette
N2 élevée. Plusieurs modèles ont été proposés pour expliquer les diffé-
-3 -4 rents mécanismes qui conduisent à la formation d’ions en phase
Pression atmosphérique 10 à 10 Pa
gazeuse à partir de gouttelettes liquides chargées [2].
■ Au fur et à mesure de l’évaporation du solvant, la taille des gout-
Figure 1 – Interface électrospray
telettes diminue jusqu’à ce que la limite de Rayleigh soit atteinte, de
façon que les répulsions électrostatiques entre charges de même
signe à leur surface soient telles qu’il y a explosion coulombienne
On utilise parfois le terme IonSpray quand la nébulisation est [3].
assistée pneumatiquement par un courant d’azote coaxial au débit,
■ Le modèle d’Irbane et Thomson [4], pour lequel il a été démontré
qui permet essentiellement de pouvoir utiliser une gamme de débits
qu’il n’explique que la formation d’ions monochargés [5] suggère
nettement plus importante (5 à 200 ou 300 mL/min), voire parfois
qu’il y a désorption de molécules chargées lorsque la valeur du
même jusqu’à 1 mL/min, contre quelques mL/min seulement sans
champ électrique présent dans les gouttelettes multichargées
gaz nébulisateur). Dans la suite de cet article, nous nommerons
atteint la valeur de 109 V/m.
indifféremment ces deux techniques électrospray, le principe d’ioni-
sation étant rigoureusement identique dans les deux cas. ■ Le modèle de Fenn [6] est un compromis tenant compte des deux
À quelques millimètres de l’aiguille est placée une contre-élec- premiers mécanismes ; la formation d’ions en phase gazeuse à par-
trode qui permet de diriger le faisceau ionique vers l’interface, cons- tir de gouttelettes liquides chargées passe par plusieurs étapes
tituée généralement d’un orifice conique dont le diamètre est de (figure 2) :
l’ordre d’une centaine de micromètres. Un flux d’azote, dirigé le plus — une succession d’explosions coulombiennes provoquent une
souvent à contre-courant du trajet des ions, joue un rôle prépondé- diminution de la taille des gouttelettes ;

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— en deçà de la limite de Rayleigh, la valeur du champ électrique particulièrement vrai lorsque l’on a affaire à des ions monochargés
est telle qu’il y a éjection de nanogouttelettes ou de molécules char- et (ou) de rapport m/z inférieur à 1 000-1 500 uma.
gées parfois encore partiellement solvatées.
■ Pour une différence de potentiel de quelques volts, les ions n’ont
pas une énergie suffisante pour que soient totalement éliminés
d’éventuels adduits avec le solvant.
+
+ ■ Pour une différence de potentiel de 30 V, l’énergie est suffisante
-- -- pour que ces adduits disparaissent au profit d’ions moléculaires
+ +
+ + -- + + -- +
+
protonés [M + H]+ ou sous forme [M + Na]+.
+ -- + --
+ -- + +
+ --
+
■ Pour une différence de potentiel encore plus élevée (de l’ordre de
+ + + 120 V), l’énergie est telle que des fragments dus à des collisions
+
avec l’azote qui circule au niveau de l’interface deviennent prépon-
dérants. Les spectres, sans toutefois être aussi sélectifs, sont com-
Gouttelettes contenant Réduction de la taille Désorption d'ions parables à ceux obtenus par spectrométrie de masse en tandem
une espèce chargée des gouttelettes par de la surface du
(SM/SM). Il est possible de fragmenter ultérieurement ces ions dans
majoritaire évaporation du solvant liquide sous l'effet
une cellule de collision et de caractériser ainsi des ions petits-fils
et explosions du champ électrique
coulombiennes
(SM/SM/SM).
■ Au-delà de 120 V, les fragments sont toujours présents, mais la
Figure 2 – Mécanismes d’ionisation en électrospray sensibilité diminue rapidement.

1.3 Particularités de l’électrospray

2. Interprétation des spectres
L’obtention par électrospray d’espèces moléculaires portant plu-
sieurs dizaines de charges ramène les rapports m/z de molécules
pouvant atteindre 100 000 Da à des valeurs comprises entre 1 000 et 2.1 Espèces multichargées
3 000 unités de masse atomique (uma), compatibles avec l’utilisa-
tion d’analyseurs quadrupolaires. En mode positif, les ions sont du
type (M + nH)n+, où M est la masse moléculaire, n le nombre de 2.1.1 Calcul de la masse moléculaire
charge porté par l’ion considéré, et H la masse du proton. Ils ont
donc une masse apparente de mn = (M + nH)/n. Les spectres de molécules multichargées se présentent comme
Des cations du type (M + aH + bX)(a + b )+ peuvent également être une distribution statistique autour d’une valeur qui représente l’état
observés (où X est la masse du cation, et a et b sont respectivement de charge moyen du composé. Pour un composé pur, chacun des
le nombre de protons et de cations portant des charges positives). pics du spectre représente la même molécule possédant des états
En mode négatif, ce sont le plus souvent des ions du type (M – nH)n– de charge différents, deux ions adjacents se différenciant toujours
qui sont détectés. par une seule charge [9]. Il est ainsi très facile de calculer le nombre
Nota : dans tout ce qui suit, M, H, X, (Na, K) représentent aussi bien l’ion considéré que
de charges d’un pic, puis d’en déduire celui de tous les autres, pour
sa masse. enfin calculer la moyenne statistique de la masse moléculaire à par-
L’ionisation dépend de paramètres physico-chimiques [7] [8] tels tir de chacun des états multichargés (figure 3). Notons que tous les
que le pKa, le pH, la nature du solvant, le nombre de sites protona- appareils sont équipés d’algorithmes qui effectuent ces calculs auto-
bles et leur accessibilité, de même que de la différence d’affinité pro- matiquement.
tonique entre le soluté et la phase éluante. C’est la raison pour
laquelle il convient d’éviter d’utiliser seuls des solvants organiques
apolaires (dichlorométhane, cyclohexane, etc.). Il est d’autre part 2.1.2 Précision de la mesure
recommandé, en ions positifs, de travailler en milieu acide (en ajou-
tant le plus souvent 0,1 % d’acide acétique ou trifluoroacétique) ou Les limites dans la précision de la mesure tiennent à deux para-
encore en présence d’acétate d’ammonium (de 2 à 50 mM), de façon mètres essentiels : les limites de résolution spectrale et de précision
à favoriser dans ce cas des adduits du type [M + NH4]+. Les phases imposées par les techniques de mesures physiques ainsi que la
éluantes doivent être relativement volatiles : les solvants les plus composition isotopique du composé à analyser.
fréquemment utilisés sont des mélanges eau/acétonitrile ou eau/ Un ion monochargé comporte en effet plusieurs pics séparés
méthanol. Enfin, quand la phase mobile contient trop de sels ou d’une unité de masse correspondant à la répartition statistique des
d’électrolytes, tels que des perchlorates ou des tampons phospha- différents isotopes qui le constituent. On parle de profil isotopique
tes, le rendement d’ionisation des solutés diminue à leur profit et le pic contenant les isotopes les plus abondants est appelé pic
(sélectivité d’ionisation), entraînant des pollutions importantes ; ils monoisotopique. La complexité du profil isotopique s’accroît avec la
peuvent même se déposer et s’accumuler au niveau de l’orifice masse moléculaire. Au-delà de 10 000 Da, le pic monoisotopique
jusqu’à le boucher. devient inexistant, et la perte de signal engendrée par le gain en
Signalons enfin que la réponse du signal est sensible à la concen- résolution nécessaire à la séparation des différents isotopes est éga-
tration du soluté ; contrairement à toute logique, la dilution de lement trop importante.
l’échantillon peut entraîner une bien meilleure réponse, tandis que Cela devient encore plus délicat lorsque l’on a affaire à des ions
des concentrations plus importantes peuvent se caractériser par multichargés : l’écart entre deux isotopes diminue quand le nombre
l’absence totale de signal. En règle générale, la concentration idéale de charges portées par la molécule augmente (il peut même être
est de l’ordre de quelques dizaines de picomoles par microlitre. directement corrélé au nombre de charges), nécessitant des résolu-
L’allure des spectres dépend d’un paramètre essentiel : la diffé- tions encore plus importantes pour les séparer. C’est la raison pour
rence de potentiel entre la tension au niveau de l’orifice et le pre- laquelle la mesure de la masse moyenne obtenue à plus faible réso-
mier potentiel appliqué dans l’enceinte de l’appareil ; c’est tout lution s’avère plus facile, et souvent plus efficace, particulièrement
pour des composés de masse moléculaire supérieure à 3 000 Da. En

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Ions positifs Ions négatifs

3. Applications
M+ni X M-n X
mi = mi = n i
ni i

1 - Détermination du nombre de charges

3.1 Étude des biomolécules
portées par un ion, deux pics adjacents
étant toujours séparés par une charge
(n1 = n2+1)

Intensité relative (%)

Historiquement, l’électrospray doit sans doute ses premiers suc-
cès à la possibilité de mesurer la masse moléculaire de peptides et
n1 m1 - X m +X de protéines intactes jusqu’à environ 100 000 Da [11]. Auparavant,
n2 = n2 = 1
m1 m2 - m1 m2 - m1 caractériser de tels composés nécessitait de procéder au préalable à
100
une hydrolyse enzymatique, de séparer et d’isoler les différents pep-
2 - Extrapolation à tous les autres états tides de coupure, et enfin de combiner microséquençage et détermi-
n2 multichargés et moyenne statistique de
75 m2 la masse moléculaire calculée à partir
nation de leur masse moléculaire par LSIMS.
de chacun d'eux La précision des mesures, liée à la sensibilité de la technique, en
fait maintenant un outil incontournable pour l’étude de conformité
50 M = ni (mi - X) M = ni (mi + X) des peptides et des protéines [12], de même, en ions négatifs, pour
les oligonucléotides. Dans le cas des protéines, endogènes ou
recombinantes, les biochimistes sont souvent confrontés à des pro-
25
blèmes de conformité et de modification post-traductionnelles qui
ne sont pas toujours détectables par dégradation d’Edman (séquen-
çage d’acides aminés) ou par analyse d’acides aminés. Quand les
0
800 1 000 1 200 1 400 1 600 m/z séquences d’acides aminés sont connues, la seule détermination de
la masse moléculaire, combinée aux techniques plus classiques de
M masse moléculaire chimie des protéines, permet notamment, parfois même au sein de
n nombre de charges mélanges :
X masse de l'élément responsable de la charge (généralement X=1, — d’identifier l’extrémité C-terminale de polypeptides dont
les charges étant le plus souvent dues à des protons) l’extrémité N-terminale a été déterminée par séquençage ;
— de montrer des inhomogénéités C- et N-terminales [13] ;
Figure 3 – Interprétation des spectres d’ions multichargés — de caractériser certaines modifications post-traductionnelles
[14] : l’écart entre la masse expérimentale et la masse calculée
d’après sa séquence permet d’identifier ou de réduire le nombre
règle générale, la moyenne de la masse moléculaire calculée à partir d’hypothèses sur la nature chimique des modifications (phospho-
de tous les états multichargés donne une précision excellente, très rylations, glycosylations, liaisons avec des lipides ou des acides
souvent supérieure à 0,01 %. nucléiques) ;
— de confirmer la bonne maturation des ponts disulfures ou de
Notons que pouvoir travailler à haute résolution, avec des analy- caractériser la formation de dimères covalents. Signalons à ce pro-
seurs magnétiques ou, mieux encore, grâce à la spectrométrie de pos que si le nombre maximal de charges observées pour des pep-
masse à résonance cyclotronique [10], peut se révéler utile dans cer- tides ne contenant pas de pont disulfure est en général proche du
tains cas pour déterminer, à partir de son profil isotopique, le nom- nombre de résidus basiques (arginine, lysine, histidine, NH2 termi-
bre de charges d’un ion (et donc la masse moléculaire du composé), nal), la présence de ponts disulfures dans la molécule limite l’accès
lorsqu’il est seul présent dans le spectre. aux sites protonables ; la charge globale de la molécule est, dans ce
cas, inférieure à celle de la même molécule dénaturée. D’autre part,
l’attribution de la position des ponts disulfures est possible en com-
2.1.3 Spectres SM/SM d’ions multichargés binant les résultats obtenus par séquençage et par spectrométrie de
masse après hydrolyse enzymatique [15] (figure 4a) ;
La double spectrométrie de masse (SM/SM) permet de fragmen- — de mettre en évidence différents états d’oxydation : l’oxyda-
ter, par collision avec un gaz neutre, un ion préalablement sélec- tion de certains résidus sensibles (tryptophane, méthionine) peut
tionné, et d’obtenir ainsi des informations quant à sa structure. Si le être responsable de la perte d’activité biologique de certains pepti-
nombre global de charges reste constant, dans le cas d’espèces des. Le nombre d’atomes d’oxygène excédentaires d’un peptide
multichargées, elles se répartissent inégalement sur les différents peut être déduit de la confrontation des masses moléculaires expé-
fragments issus de coupures de liaisons interatomiques : les ions rimentales et théoriques ;
fils ont donc généralement un nombre de charges inférieur à celui — enfin, dans le cas où l’extrémité N-terminale est bloquée, seule
de l’ion parent et peuvent ainsi être détectés à une masse apparente la spectrométrie de masse permet de caractériser rapidement le pro-
supérieure à celui-ci (parfois même au point d’être en dehors de la duit.
gamme de masse de l’analyseur utilisé). Au-delà de trois charges,
Toutefois, plus la masse moléculaire est importante, plus il
l’interprétation des spectres SM/SM devient extrêmement
devient difficile d’analyser des mélanges de composés de masses
complexe : ils présentent des fragments ayant un nombre de char-
proches (2 à 10 Da pour des masses moléculaires supérieures à 20
ges variables qu’il est difficile a priori de déterminer.
ou 30 kDa) ou de caractériser les différents types d’adduits souvent
rencontrés (Na, K...). Il n’est pas rare que les états multichargés
d’une protéine soient en fait une superposition d’espèces protonées
2.2 Espèces monochargées et cationiques : dans ce cas, la masse expérimentale est légèrement
excédentaire par rapport à la masse théorique (figure 4b). Au-delà
de 50 à 60 kDa, la pureté devient un paramètre essentiel pour mesu-
Lorsque l’on a des espèces monochargées, l’interprétation des rer avec précision la masse de protéines intègres par électrospray.
spectres est tout à fait similaire à celle des spectres FAB (Fast Atom
Bombardment) ou LSIMS (Liquid Secondary lon Mass
Spectrometry) : on rencontre des espèces [M + H]+, [M + Na]+ ou
[M + K]+, [M + solvant + H]+, [2M + H]+, etc.

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10+
(M+10H)
masse théorique = 10792,8 1888,87
masse mesurée = 10790,6

D = 2, d'où l'existence probable d'un pont disulfure

entre les deux cystéines de la séquence

11+
(M+11H)
901,99 9+
(M+9H)
1199,95

8+
(M+8H)
1349,83

a spectre électrospray de l'angiogénine

Forme dimère
M=21580,6
7+
(M+7H)
983,40 19+ 17+ 1542,44
(M+19H) (M+17H)
1030,52 1278,27 1427,00 1474,69

1000 1200 1400 1600

m/z

43+
(M+43H)
1546,5
masse théorique = 66438
masse mesurée = 66460
D = 22 uma
Position
54+
théorique
(M+54H)
1231,5 51+
(M+51H)
1303,8
48+
(M+48H)
1384,9
1545 1550 1555 1560 1565 1570 1575
47+
(M+47H)
Agrandissement
1414,9
57+
(M+57H) 45+
b spectre électrospray de l'albumine (M+45H)
humaine recombinante 1166,9
1477,2

44+
(M+44H)
1512,9

900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
m/z

Figure 4 – Spectres électrospray de deux protéines

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3.2 Couplage avec les différentes D’autre part, déterminer en ligne la masse moléculaire des consti-
tuants d’un mélange permet d’élaborer rapidement des hypothèses
techniques chromatographiques quant à leur structure, en faisant appel si nécessaire aux techniques
SM/SM. En outre, certains produits sont difficiles à isoler ou, encore,
se dégradent en cours de purification. Cela est tout particulièrement
3.2.1 Chromatographie liquide vrai dans des mélanges aussi complexes que les milieux biologi-
ques.
Le couplage chromatographie liquide/spectrométrie de masse
(CL/SM) est particulièrement utile pour l’analyse de composés polai-
res, peu volatils ou thermiquement instables.

Tableau 1 – Valeurs optimales de débit et quantités d’échantillon requises selon le type de colonne utilisé
Chromatographie liquide Interface Spectromètre de masse

Diamètre de la colonne Quantité totale

Débit Division du débit Débit
(mm) de produit injecté
4,6 1 mL/min 1/25 à 1/5 40-200 mL/min 0,5 à 1 nanomole
2,1 200 mL/min avec ou sans 40-200 mL/min
1 50 mL/min sans 50 mL/min ¯
Capillaire 5 mL/min sans 5 mL/min subpicomole

La difficulté majeure dans sa mise en œuvre concerne l’obtention ■ Les applications sont extrêmement nombreuses : études méta-
d’ions en phase gazeuse à partir des solutés en phase liquide, ce qui boliques, qualitatives [21] et quantitatives [22], caractérisation de
nécessite des interfaces très spécifiques permettant le passage de la produits d’origine naturelle, cartographies peptidiques [23], étude
phase liquide à des débits élevés vers l’enceinte du spectromètre de modifications posttraductionnelles, caractérisation de formes
sans en affecter la pression. Aussi l’électrospray, technique pour glycosylées de protéines naturelles ou recombinantes [24] [25], etc.
laquelle le processus d’ionisation se produit à la fois en phase
liquide, à la pression atmosphérique et à température ambiante, est- Exemple : La figure 5 montre le chromatogramme obtenu par CL/
il le mieux adapté à sa réalisation [16] [17] [18]. Il s’agit même pro- SM d’un hydrolysat d’albumine humaine recombinante (d’une masse
bablement à l’heure actuelle de la plus universelle des techniques moléculaire de 66 438, composée de 585 acides aminés, ayant 17
dans ce domaine, au point qu’elle est par ailleurs en train de sup- ponts disulfures et une cystéine libre), qui a permis à la fois de couvrir
planter le thermospray. plus de 90 % de sa séquence primaire et de montrer la bonne
conformité des ponts disulfures [23].
■ Plusieurs conditions sont à réunir :
● compatibilité de solvant : nous l’avons vu, il faut que la phase
éluante soit relativement volatile et exempte de sels ou de tampons
(notons toutefois que des travaux récents ont montré qu’il est possi-

Intensité relative (%)

ble d’éliminer la majeure partie des phosphates de la phase éluante, 100
au moyen d’une membrane située entre la colonne et l’interface
électrospray [19]). La phase inverse, qui utilise généralement des
mélanges eau/acétonitrile est de loin la plus utilisée ;
75
● compatibilité de débit : généralement les débits doivent être
compris entre quelques microlitres et quelques centaines de micro-
litres par minute. L’utilisation de microcolonnes est donc particuliè-
rement aisée [20]. Au-delà de 200-300 mL/min, la sensibilité diminue 50
généralement, même si les spécifications de la plupart des appareils
signalent maintenant la possibilité d’atteindre des débits de 1 mL/
min, qui sont les plus fréquemment utilisés dans des conditions 25
analytiques classiques. Il est alors recommandé d’installer en sortie
de colonne un diviseur de débit, réalisé simplement à l’aide d’un té
connecté à deux capillaires de même diamètre et de longueurs
différentes : le rapport des pertes de charge, c’est-à-dire des lon- 0
1 251 501 751 1 001 1 251 1 501 1 751 2 001 2 251 2 501 m / z
gueurs, est inversement proportionnel au rapport des débits. Même 0,0 13,3 26,5 39,8 53,1 66,7 80,1 93,5 106,9 120,4 134,0 Temps
si, dans ce cas, les quantités de produit nécessaires sont plus impor- (min)
tantes (de l’ordre de la nanomole, comme le montre le tableau 1), la
plus grande partie des composés peut être récupérée au moyen Figure 5 – Chromatogramme obtenu par CL / SM -électrospray
d’un collecteur de fractions (pour donner un exemple, un débit au d’un hydrolysat d’albumine humaine recombinante
niveau du nébulisat de 40 mL/min permet de récupérer les 24/25e de
la phase éluante).
Il est dans tous les cas recommandé d’avoir en série ou en paral- 3.2.2 Électrophorèse capillaire
lèle (selon les débits) un autre système de détection (détecteur ultra-
violet, fluorimètre, radiodétecteur, etc.) afin d’être encore plus spéci- En ce qui concerne le couplage avec l’électrophorèse capillaire, il
fique. est souvent nécessaire d’ajouter un solvant afin de maintenir, au
niveau de l’interface, des débits de l’ordre de quelques microlitres

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par minute. Les limitations de cette technique tiennent notamment

aux faibles quantités d’échantillon introduites et à l’obligation d’uti-

Intensité relative (%)

liser des tampons volatils. Si cette technique de couplage est facile
à mettre en œuvre dans le cas des peptides, des protéines, des oli-
gonucléotides [26] et des composés ioniques [27], l’analyse de com- 750
posés non chargés, qui nécessite l’adjonction de micelles pour
779
assurer une migration électrophorétique, est nettement plus problé- 722
matique.
822

694
3.3 Application à la chimie combinatoire

La chimie combinatoire connaît un essor important dans le

domaine pharmaceutique.
Dans le principe, il s’agit de synthétiser puis de tester l’activité
biologique de mélanges contenant plusieurs centaines, voire plu-
sieurs milliers de produits [28] de façon à cibler le plus rapidement
possible de nouvelles sources thérapeutiques.
Appliquée tout d’abord à la synthèse peptidique (banques de pep- 600 650 700 750 800850 900 950
tides), elle s’étend maintenant à d’autres types de synthèse. Il est Masse moléculaire
facile de calculer la population théorique des différents constituants a spectre théorique
du mélange en fonction de leur masse moléculaire (spectre théori-
que). La comparaison du graphique obtenu avec le spectre électros- Intensité relative (%)
pray du mélange se révèle extrêmement utile pour en vérifier la 750
conformité (figure 6). 100

722
4. Conclusion 75 779

822
La technique électrospray connaît un succès au moins compara-
ble à celui du FAB au début des années 80, tant par le champ d’appli- 694
50
cations qui s’est considérablement élargi depuis son apparition que
par les limites de détection qu’elle permet d’atteindre.
Sa gamme de masse est très étendue puisqu’il est possible de
déterminer la masse moléculaire de biomolécules jusqu’à
100 000 Da et plus avec une précision encore supérieure à ce jour à 25
celle obtenue avec des analyseurs à temps de vol (MALDI). La
mesure de la masse moléculaire d’un ADN de 108 Da, avec un appa-
reil à résonance cyclotronique, a même été rapportée [29].
La sensibilité est approximativement 100 fois supérieure au FAB 0
ou au LSIMS : quelques dizaines de picomoles suffisent en général 600 650 700 750 800
850 900 950
pour déterminer la masse moléculaire d’un peptide (notons néan- Masse moléculaire
moins que les limites de détection restent supérieures au MALDI, b spectre obtenu en électrospray
qui atteignent quelques femtomoles).
Particulièrement adaptée aux composés polaires et thermosensi- Figure 6 – Vérification de la conformité d’un mélange synthétique de
bles, elle a permis, en outre de réaliser un souhait qui tenait particu- 6 800 hexapeptides
lièrement à cœur à tous les spécialistes depuis longtemps :
interfacer, pratiquement en routine, la spectrométrie de masse avec
la chromatographie liquide ou, encore, avec l’électrophorèse capil-
laire.
Développée à ses débuts sur des spectromètres équipés d’analy-
seurs quadrupolaires, elle existe maintenant sur tous les types de
spectromètres, magnétiques, cyclotrons et trappes ioniques.

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Électrospray R

E
par Bertrand MONÉGIER N
Rhône Poulenc Rorer
Centre de recherche de Vitry-Alfortville
Responsable de laboratoire de spectrométrie de masse
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