Radioanalyse: Applications: Dosage Biologique

Radioanalyse
Applications : dosage biologique

par François BOURREL
Docteur en pharmacie
Diplômé de l’Institut national des sciences et techniques nucléaires
du Commissariat à l’énergie atomique (INSTN-CEA)
Attaché des Hôpitaux de Toulouse
et Philippe COURRIÈRE
Professeur de biophysique, UFR de pharmacie, Toulouse
Biologiste des centres de luttes contre le cancer
1. Présentation générale............................................................................. P 3 361 – 2

1.1 Intérêt du marquage d’une substance ....................................................... — 2
1.2 Dilution isotopique ...................................................................................... — 2
2. Système d’antigène-anticorps.............................................................. — 3
2.1 Propriétés du système antigène-anticorps................................................ — 3
2.2 Détermination de la constante d’affinité par la méthode de Scatchard ...... — 5
3. Dosages radio-immunologiques .......................................................... — 6
3.1 Dosages par compétition (RIA)................................................................... — 6
3.2 Courbe d’étalonnage et traitement mathématique des données............ — 8
3.3 Réalisation pratique : application au dosage de la thyroxine libre ......... — 9
3.4 Dosages immunoradiométriques (IRMA) ................................................. — 10
3.5 Évaluation de l’efficacité analytique d’un dosage radio-immunologique ... — 11
4. Détection du signal radioactif ............................................................. — 23
4.1 Scintillation solide ....................................................................................... — 23
4.2 Scintillation liquide...................................................................................... — 25
Pour en savoir plus........................................................................................... Doc. P 3 363
es radio-isotopes ont révolutionné la biologie médicale. La radio-immunolo-

L gie reste la mesure de référence de l’infiniment petit en biologie. Des efforts
constants ont été réalisés pour améliorer la simplicité, la détectabilité et la rapi-
dité (par une automatisation croissante) de la méthode.
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© Techniques de l’Ingénieur, traité Analyse et Caractérisation P 3 361 − 1
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1. Présentation générale — soit la substance radiomarquée S* est identique à celle à doser S ;

— soit c’est un réactif spécifique R* ≈ S qui est marqué.
Soit à doser une substance S (une hormone H, par exemple), dans

un échantillon d’un milieu biologique donné (sérum) ; le choix de la 1.2 Dilution isotopique
meilleure méthode de dosage à mettre en œuvre devra répondre à
quatre impératifs : 1.2.1 Principe de la dilution isotopique (DI)
— sa limite de détection ou détectabilité doit être la plus basse
possible ; en effet, la concentration de S dans le milieu étant géné- Soit m*0 une quantité connue de substance pure S* radiomar-
ralement très faible, de l’ordre de la picomole (10–12 mole), la quée, d’activité r0 (connue) et d’activité spécifique A0 (figure 1) que
méthode choisie doit avoir une limite de détection suffisante, tout l’on ajoute à l’échantillon à doser :
en restant fiable (par exemple, valeurs normales des hormones thy-
roïdiennes : [FT4] 10 à 25 pmol.L–1 ; [FT3] 4 à 8 pmol.L–1) ; r0
A 0 = --------- (2)
— elle doit être spécifique ; un milieu biologique est toujours m*0
extrêmement complexe et la technique mise en œuvre doit doser de
façon spécifique la substance S seule et non tout autre composé On a réalisé une dilution isotopique (DI) ; l’activité est conservée,
présent dans le sérum (par exemple, problème des réactions croi- mais l’activité spécifique du mélange diminue :
sées en immunoanalyse lors du dosage de la TSH (thyroïd stimula- r0
ting hormone), FSH (follicle stimulating hormone), LH (luteinizing A = ------------------------ < A 0 (3)
m*0 + m x
hormone), HCG (hormone gonochorionique humaine). Ces hormo-
nes possèdent des chaînes structurales communes. L’indice d’Abra- D’après (2) et (3) :
ham [P 1 455] permet de caractériser les réactions croisées lors du A
dosage d’un analyte) ; m x = m*0  ------0- – 1 (4)
A 
— elle doit être reproductible ; sur un plan moins fondamental, la
méthode choisie doit pouvoir être utilisée en routine, sur un nombre Connaissant m*0 et A0, la relation (4) permet de déterminer mx, si
important d’échantillons, sans nuire à sa qualité ; l’on sait mesurer de façon fiable A ; pour ce faire il est possible de
— sur un plan moins fondamental, elle doit, bien sûr, être la plus procéder de deux façons.
simple et la moins chère possible (automatisation).
1.2.2 Dosage par dilution isotopique

1.1 Intérêt du marquage d’une substance
Soit dans une prise d’essai de volume V, connu, d’un milieu bio- 1.2.2.1 Dosage avec extraction directe
logique (sérum), une masse très faible mx d’une substance S à Après DI, on extrait du milieu réactionnel une quantité m*
e de
doser. substance pure (figure 2) ; dans ces conditions :
Dans les techniques analytiques classiques, on commence tou- e < r*
— l’activité de l’échantillon diminue r * 0 ;
jours par extraire quantitativement de l’échantillon, une masse — l’activité spécifique est conservée.
connue me de substance pure ; compte tenu du rendement d’extrac-
tion k, déterminé simultanément (ou dans les mêmes conditions)
grâce à un étalon interne :
m x = km e (1)
S* Dilution S* + S
Ces techniques analytiques classiques n’ont pas une limite de m* 0 isotopique mx + m*0
détection suffisamment basse pour détecter de très faibles quanti- r0 r0
tés ; de plus, l’étape de l’extraction quantitative est longue et déli- A0 A < A0
cate.
Le problème peut être posé différemment lorsqu’il est possible
d’identifier S pour suivre directement ses variations dans le milieu
réactionnel (ou tout réactif R réagissant spécifiquement avec S), Figure 1 – Principe de la dilution isotopique
supposons qu’il soit possible de « marquer » S, sans modifier ses
propriétés chimiques (et immunologiques) :
S ≡ S*
S* va émettre un signal facilement détectable permettant de l’iden- S* S* + S
Dilution
tifier. m* 0 isotopique mx + m*0
r0 r0
Les principaux traceurs utilisés en biologie clinique sont de deux
A0 A < A0
types :
— les traceurs radioactifs, faisant appel à un radionucléide 3H,
14C, 125I et 131I ;
— les traceurs non radioactifs comme :
Extraction non
• un enzyme, révélé ultérieurement par une substance chromo- quantitative
gène,
• une substance luminogène, émettant directement ou indirec-
tement un signal lumineux,
• un nucléide non radioactif, se distinguant cependant par un me*
re < r 0
spin nucléaire demi-entier (marqueur de spin) (par exemple : le
A
gadolidium).
Seuls les radionucléides vont nous intéresser. Deux cas seront
alors à distinguer : Figure 2 – Dosage par dilution isotopique avec extraction directe
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Soit :
r e /r 0
re
A = --------- (5)
m* e
D’après (3) et (5) :
r0 re
- = ---------
----------------------- (6)
m*0 + m x m* e
r0 (r e / r 0 ) x
m x = m* - – m*0
e ---- (7)
re
Pour déterminer m x , m*0 et m* e sont connues ; l’extraction n’a

pas besoin d’être quantitative, l’expression (7) ne nécessitant pas
de remonter à la prise d’essai ; r 0 et r e sont mesurables grâce à un
compteur γ ou β , selon le radionucléide utilisé comme traceur. mx m (mx ou maj )
On a réalisé une mesure absolue de m x .
Figure 3 – Courbe d’étalonnage d’un dosage par compétition
1.2.2.2 Dosage avec extraction indirecte
Après DI, on remplace l’étape d’extraction directe précédente par Par interpolation sur la courbe d’étalonnage (figure 3), on déter-
une extraction indirecte grâce à un réactif R, susceptible de réagir mine la valeur correspondante m x : on a réalisé une mesure relative
de façon analogue avec la substance S à doser et S* marquée, direc- de m x , directement dans le milieu réactionnel.
tement dans le milieu réactionnel :
— soit selon une réaction totale (stœchiométrique) ; mais ce cas
ne se présente jamais en biologie clinique ; À ce type de méthode, se rattache le cas particulier où S est
— soit selon une réaction d’équilibre, obéissant à la loi d’action une substance antigénique (ou un haptène) et R l’anticorps spé-
de masse : cifique anti-S ; la très haute spécificité de la réaction antigène-
anticorps (surtout avec utilisation d’anticorps monoclonaux) est
R + S* + S ! R-S + S + S* ainsi associée à une excellente détection du signal radioactif γ
ou β , émis par le traceur ; ce sont les conditions d’un radio-
immunodosage.
Àt=0: M 0 + m*0 + m 0
À t équilibre : ( M 0 – m*
e ) ( m* e)
0 + m – m* m*
e
La quantité m représente :
— soit la quantité m x à déterminer ;
2. Système
— soit une quantité m aj de cette même substance, correspon- d’antigène-anticorps
dant à des standards de concentration connue.
En fonction de la loi d’action de masse :
En 1960, R. Yalow et S. Berson proposent un dosage de l’insuline
m* plasmatique par une méthode [21] faisant appel à une réaction anti-
e
K = -----------------------------------------------------------------------
- gène-anticorps associée à l’emploi d’insuline marquée à l’iode 131.
( M 0 – m* ) (
e m + m*0 – m* e) Ils inventent une méthode de dosage qui devait, en quelques années,
connaître de multiples débouchés : la radio-immunoanalyse.
m*
e est solution de l’équation du second degré :
Son développement bénéficia également de circonstances favo-
2 rables, notamment : les travaux de L. Miles et C. Hales sur le mar-
K ( m*
e ) – [ K ( M 0 + m + m*
0 ) + 1 ]m*
e + Km 0 ( m + m*
0) = 0 quage des anticorps [22][23], l’utilisation dans le dosage d’une
molécule non plus d’un mais de deux anticorps capables de réagir
e = f ( M 0 , m*
m* 0 , m) sur des sites différents de la molécule. Les résultats obtenus dès
1968 par ces auteurs permirent de passer aux techniques par excès
Les quantités M 0 et m*0 étant maintenues constantes : d’anticorps et d’améliorer encore la limite de détection jusqu’à des
valeurs de 10–16 et 10–17 moles pour le dosage de la GH (hormone
re de croissance) par exemple.
----- = F ( m ) (8)
r0
r e et r 0 se mesurent (le rapport r e / r 0 mesure le rendement

d’extraction), mais la fonction F est complexe ; on préfère donc 2.1 Propriétés du système
effectuer un étalonnage de la réaction. antigène-anticorps
M 0 et m*0 étant maintenues constantes, on réalise différents
équilibres, pour plusieurs valeurs connues de m ( m aj ) , dans des
Le système antigène-anticorps obéit aux mêmes principes de
conditions rigoureusement identiques.
l’interaction ligand-récepteur et est à la base de tous les immuno-
À chaque fois, à l’équilibre, on mesure le rendement d’extraction dosages. Il est caractérisé par la capacité de liaison réversible et met
r e / r 0 et on trace le graphe correspondant à (8) ou courbe d’étalon- en jeu des liaisons non covalentes qui impliquent des interactions
nage ; dans les mêmes conditions, on détermine ce rendement de types hydrophobes, forces de Van der Waals, interstatiques et
d’extraction pour l’échantillon inconnu (figure 3). hydrogènes.
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Cette réaction, qui obéit à la loi d’action de masse, est réversible

et on obtient un équilibre lorsque la quantité de complexe Ag-Ac
formé par unité de temps est égale à la quantité de ce même
complexe dissocié par unité de temps : B/F
K a [Ac]
Ag + Ac ! Ag-Ac
On peut écrire : –K a
d [ Ag-Ac ]
-------------------------- = k 1 [ Ag ] [ Ac ] – k 2 [ Ag-Ac ] (9)
dt
avec [Ag] concentration molaire en antigène,
[Ac] T B
[Ac] concentration molaire en anticorps,
[Ag-Ac] concentration du complexe Ag-Ac,
k1 constante de vitesse de la réaction d’association
Figure 4 – Représentation de Scatchard pour un seul site
(mol–1.L.s–1),
k2 constante de vitesse de la réaction de dissociation
(s–1).
À l’équilibre, il se forme autant de complexes [Ag-Ac] qu’il s’en
dissocie, par conséquent : B /F
d [ Ag-Ac ]
-------------------------- = k 1 [ Ag ] [ Ac ] – k 2 [ Ag-Ac ] = 0
dt –K a 1
D’où :
k 1 [ Ag ] [ Ac ] = k 2 [ Ag-Ac ]
k1 [ Ag-Ac ] –K a 2
----- = ------------------------- = K a
k2 [ Ag ] [ Ac ]
avec Ka constante d’affinité à l’équilibre (mol–1.L),

1 [Ac] 1T [Ac] 1T +[Ac] 2 T B
K d = ------ constante de dissociation à l’équilibre (mol.L–1).
Ka
Par convention, l’affinité est exprimée par la mesure de la
Figure 5 – Représentation de Scatchard d’un anticorps polyclonal à
constante de dissociation Kd, l’affinité sera d’autant plus grande,
deux sites d’affinité différentes
que Kd sera faible (de l’ordre de 10–12 mol.L–1), ce qui indique que
l’anticorps peut capter un ligand faiblement concentré.
Une étude sur les réactions d’association d’antigènes de structure
très voisine avec un anticorps ayant une affinité déterminée a Cette expression démontre l’existence d’une relation linéaire
démontré que leurs constantes de vitesse d’association k1 étaient entre le rapport B/F et la concentration en complexe B. On peut
très voisines (10–7 à 10–8 mol–1.L.s–1) à la différence des constantes représenter cette relation sur un graphe : c’est la représentation de
de vitesses de dissociation k2 qui elles varient avec une grande Scatchard (figure 4).
amplitude (10–4 à 102 s–1). Ces grandes amplitudes sont donc res- Les relations (11) et (12) et la représentation de Scatchard mon-
ponsables des variations de la constante d’affinité Ka. La spécificité trent que si l’on peut séparer le complexe [Ag-Ac] « B » de l’antigène
de la réaction antigène-anticorps semble être mieux représentée par libre [Ag] « F » sans perturber l’équilibre de la réaction, on peut
k2 que par Ka. À constante d’affinité Ka égale, le choix d’un anti- déterminer graphiquement les valeurs de Ka et de [Ac]T.
corps, pour le développement d’un radio-immunodosage sera gran-
dement conditionné par la valeur de la constante de vitesse de Les relations précédentes ont été établies sur la base qu’une
dissociation k2. Une réaction Ag-Ac doit être rapide, certes, mais molécule d’antigène réagissait avec une molécule d’anticorps. En
également stable pour limiter la dissociation lors des phases de réalité, les antigènes présentent souvent plusieurs épitopes, et de
séparation de la fraction libre et liée (constante k2 faible). plus des immunoglobulines de type G possèdent deux sites identi-
ques de liaison. Les équations restent valables si l’affinité Ka pour
Si on appelle F (free), la concentration en antigène libre [Ag] et B chaque site est identique et s’il n’existe pas de coopérativité (modi-
(bound), la concentration en complexe [Ag-Ac], on obtient : fication de l’affinité du site voisin). Il suffit alors de modifier l’équa-
tion (12) par le nombre de sites n de liaison sur l’anticorps :
B
K a = ---------------- (10)
F [ Ac ]
B
---- = K a ( n [ Ac ] T – B )
F
[ Ac ] T = [ Ac ] + [ Ag-Ac ]
(11)
[ Ac ] = [ Ac ] T – [ Ag-Ac ] = [ Ac ] T – B Dans le cas où l’anticorps est hétérogène (exemple : Ac poly-
clonal), la représentation de Scatchard n’est plus une droite. La pré-
avec [ Ac ] T concentration d’anticorps présent dans la réaction. sence de deux sites ayant des affinités différentes sera caractérisée
par une cassure de la droite, la pente de chaque droite sera équiva-
Les relations (10) et (11) permettent d’écrire :
lente à l’affinité de chaque site, l’extrapolation sur l’axe des abscis-
ses permet de déterminer la concentration de chaque site de
B
---- = K a ( [ Ac ] T – B ) = K a [ Ac ] T – K a B (12) fixation (figure 5).
F
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2.2 Détermination de la constante Ces données brutes doivent être conduites d’une manière prati-
que pour laisser apparaître les valeurs de B/F et B telles qu’elles sont
d’affinité par la méthode reportées dans le tableau 2.
de Scatchard
La concentration de l’antigène apportée par le traceur est :
La valeur de Ka peut être calculée à partir de la courbe d’étalon-
nage de la trousse représentée selon la méthode de Scatchard. T
[ Ag ] t = -------------------------
Celle-ci envisage la variation de B/F en fonction de la concentration R ⋅ AS ⋅ V
molaire B en antigène lié :
B avec T activité totale du traceur introduit dans la réaction
---- = K a [ Ac ] T – K a B (ipm),
F
On réalise une réaction de compétition entre le traceur et l’anti- R rendement du compteur (R = 0,8) pour l’iode 125,
gène stable en présence de concentrations croissantes, connues, de
ce dernier ; pour chaque concentration, après séparation des AS activité spécifique du traceur (Bq/pmol),
complexes, on mesure l’activité du complexe traceur-anticorps
(tableau 1). (0) V volume réactionnel (L).
La concentration en antigène libre est donnée par :

Tableau 1 – Données brutes obtenues
lors de l’établissement de la courbe d’étalonnage
d’une trousse de dosage de la tri-iodothyronine libre F = [ Ag ] T – B
Activité mesurée d’où :

Tubes sur la forme liée B
(ipm) ( [ Ag ] T ( B* – LNS ) )
B = ---------------------------------------------------
Total............................................. T T
Liaison non spécifique : LNS ..... LNS
Étalon zéro E0 ............................. B*0 B B
---- = -------------------------
Étalon 1 E1 ................................... B*1 F [ Ag ] T – B
Étalon 2 E2 ................................... B*2
Étalon 3 E3 ................................... B*3 avec LNS liaison non spécifique, permet de connaître le
pourcentage de liaison non spécifique, c’est-à-dire la
Étalon 4 E4 ................................... B*4 radioactivité retrouvée dans le précipité en l’absence
ipm : impulsions par minute d’anticorps (exprimée en ipm : impulsions par minute).
(0)
Tableau 2 – Calcul préliminaire à réaliser pour tracer la représentation de Scatchard
(a)
Concentrations Concentration (b) (c = a.b)
B* [d = c/(a – c)]
des étalons de l’antigène présent B – LNS B
dans la réaction [Ag]T (ipm) ----------------- B/F
(pmol/L) T (pmol/L)
(pmol/L)
E0 [Ag]t B*0 B*0 – LNS B0 B0

-------------------------- -------------------------------
-
T ( [ Ag ] t – B 0 )
E1 E1 + [Ag]t B*1 B*1 – LNS B1 B1

-------------------------- --------------------------------------------
T ( E 1 + [ Ag ] t – B 1 )
E2 E2 + [Ag]t B*2 B*2 – LNS B2 B2

-------------------------- --------------------------------------------
T ( E 2 + [ Ag ] t – B 2 )
E3 E3 + [Ag]t B*3 B*3 – LNS B3 B3

-------------------------- --------------------------------------------
T ( E 3 + [ Ag ] t – B 3 )
E4 E4 + [Ag]t B*4 B*4 – LNS B4 B4

-------------------------- --------------------------------------------
T ( E 4 + [ Ag ] t – B 4 )
E aj concentration de l’antigène apportée par les étalons ou les échantillons

[Ag]t concentration de l’antigène apportée par le traceur (pmol.L–1)
[Ag]T concentration de l’antigène présent dans la réaction = E aj + [Ag]t
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En traçant la représentation de Scatchard, il est possible de déter-

miner par extrapolation sur l’axe des abscisses, la concentration Molécule marquée libre
molaire totale en antisérum [Ac]T (mol.L–1) et la constante d’affinité
Ka (mol–1.L) de l’interaction Ag-Ac. S* (Ag*) F*
+
S(Ag) +R(Ac) R –S (Ag-Ac)
3. Dosages Molécule «froide»
radio-immunologiques R-S*(Ag*-Ac) B*
Molécule marquée liée
D’après leur principe, pour réaliser un bon dosage RIA (compéti- K* = K

tion) ou IRMA (sandwich), les réactifs et les différentes étapes de la T* = B*+F*
réaction doivent remplir certaines conditions : S = Sx ou Saj
— la substance, Ac* ou Ag*, doit être marquée par un radio-
nucléide approprié (iode, tritium) ;
— l’anticorps Ac utilisé doit assurer un maximum de spécificité à
Figure 6 – Principe d’un dosage par compétition
la réaction, notamment en utilisant des anticorps monoclonaux ;
— les fractions libres et liées doivent être totalement séparées, de
façon à ne mesurer que l’activité de l’une ou de l’autre ;
— la validité analytique du dosage doit être contrôlée. La mesure de l’activité de l’une ou l’autre des fractions libre F* ou
liée B* à l’équilibre exige de les séparer parfaitement ; la méthode
de séparation choisie devra répondre à trois critères :
— elle ne doit pas interférer avec la réaction du dosage, c’est-à-
3.1 Dosages par compétition (RIA) dire avec la liaison Ac-Ag, car cela pourrait nuire à la sensibilité du
dosage ;
Ce principe a été mis au point par R. Yalow et S. Berson en 1960 — elle doit être simple et rapide pour être utilisée en routine ;
pour le dosage de l’insuline : — la présence du milieu réactionnel (plasma ou sérum) ne doit
pas affecter la séparation, ce qui pourrait introduire des difficultés
— la substance à doser S est un antigène ou un haptène Ag ;
pour la standardisation ; pour y remédier, il est possible d’introduire
— le réactif R est l’anticorps spécifique Ac ;
une quantité constante de sérum albumine dans chaque tube.
— la substance une fois marquée (Ag*) par un radionucléide doit
conserver son immunoréactivité ; Ag et Ag* doivent être immuno- On distingue généralement quatre grands types de techniques :
chimiquement identiques ; — les méthodes dites de partition physique ;
— Ag* doit posséder une haute activité spécifique (AS) ; en effet, — les méthodes d’adsorption de la fraction libre F* ;
la concentration en substrat marqué [Ag*] doit être inférieure à la
— la précipitation sélective du complexe Ac-Ag* ;
plus faible concentration en substrat non marqué à doser, de façon
à avoir un déplacement appréciable de l’équilibre de compétition ; — la formation du complexe Ac-Ag* sur un support solide (phase
comme généralement cette concentration est très faible (de l’ordre hétérogène).
de la fmol.mL–1) pour pouvoir détecter Ag*, son AS devra être la
plus élevée possible ; de ce fait, la précision et la sensibilité du
dosage seront augmentées car, pour une même quantité de subs- 3.1.1 Méthodes de partition physique
trat, le signal mesuré (ipm : impulsions par minute) sera plus grand.
Ce dosage s’effectue directement dans le milieu réactionnel, sans ■ Électrophorèse
extraction préalable.
Ce type de dosage est basé sur une réaction de compétition entre Sous l’action d’un champ électrique, la migration du complexe
la substance à doser (Ag) dans l’échantillon inconnu ou la solution Ac-Ag* est différente de celle de la fraction libre F* ; suivant la
étalon, et la substance identique (Ag*), marquée par un radio- nature du support on distingue :
nucléide, vis-à-vis de leur anticorps spécifique commun Ac. — la chromato-électrophorèse sur papier ;
À l’équilibre, nous avons les réactions données dans la figure 6. — l’électrophorèse sur gel de cellulose ;
Pour des quantités de Ac et Ag* données constantes, ces équili- — l’électrophorèse sur gel d’amidon ou de polyacrylamide.
bres montrent que la proportion de Ag* liée : Ce sont des techniques lentes, dépassées et chères.
B* = Ac-Ag*
■ Filtration sur gel ou chromatographie d’exclusion moléculaire
sera d’autant plus faible que la quantité de Ag présente dans le
milieu (échantillon à doser ou étalons) est plus importante ; en Le complexe B*, beaucoup plus volumineux, peut être séparé de
d’autres termes, les proportions de B* (ou de F*) sont fonction de la la fraction libre F*, par passage sur Séphadex® ou Biogel®, par chro-
quantité de Ag présente dans la prise d’essai : matographie d’exclusion moléculaire ; le milieu d’incubation est
déposé en tête d’une colonne dont la porosité est choisie de telle
B* = f ( [ Ag ] ) ou F* = g ( [ Ag ] ) façon que la partie F* est retenue dans les particules de gel tandis
que la partie B* « exclue » de ces billes peut être facilement éluée.
Comme les relations f et g sont inconnus, il faut procéder à un éta-
lonnage de la réaction ; c’est donc une méthode relative.
3.1.2 Adsorption de la fraction libre F*
Cette méthode nécessite une séparation totale des fractions libre
F* et liée B*, de façon à ne mesurer que la radioactivité (ipm) corres-
pondant à l’une ou l’autre de ces fractions : la qualité du dosage, en Méthode très utilisée en RIA par suite de sa simplicité, de sa rapi-
particulier sa justesse, en dépend. dité et de sa capacité.
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B* + F* B* F*
B* + F* B* F*
Ac1 Ac2
anti Ac1
Milieu Adsorbant
d'incubation
Figure 7 – Séparation de la fraction libre et liée par adsorption Figure 8 – Immunoprécipitation du complexe Ac-Ag grâce
de la fraction libre sur des particules de charbon Dextran à un second anticorps
Le phénomène d’adsorption dépend de nombreux paramètres,

surface de l’adsorbant, taille et polarité de Ag*, température, force
ionique, pH..., une optimisation est nécessaire.
Les principales substances adsorbantes sont : B* F*
— le charbon végétal activé au Dextran ;
— le silicate, le talc ou le kaolin ;
— la cellulose ;
— la résine échangeuse d’ions (Amberlite® ou Dowex®).
+
Exemple : avec le charbon Dextran (DCC : Dextran coated char-
coal) (figure 7), l’antigène libre F* vient se fixer sur les particules de Ag* Ag
charbon et précipitent ; après un certain temps d’incubation, on centri- Compétition
fuge 30 min à 2 500 g, de façon à séparer le précipité F* du surnageant
B*. Pour éviter l’adsorption de constituants non spécifiques, en parti- Ac Séparation
culier B*, les particules sont revêtues de Dextran dont la porosité per-
met seulement à F* de s’y fixer en « excluant » B*.
Figure 9 – Compétition en phase hétérogène
Ces techniques conviennent aux petites molécules, comme les
stéroïdes ou les hormones thyroïdiennes, mais sont peu spécifiques.
Ces deux techniques de précipitation peuvent conduire à des

3.1.3 Précipitation sélective du complexe B artefacts de concentration en fonction de la présence d’auto-
anticorps de la substance à doser 3.5.8.
3.1.3.1 Précipitation fractionnée ou chimique
Les anticorps qui sont des immunoglobulines (IgG) peuvent pré-
cipiter en présence de réactifs comme l’acide trichloroacétique 3.1.4 Fixation de l’anticorps sur un substrat solide
(TCA) ou le polyéthylène glycol (PEG) et se séparer ainsi de la frac-
tion libre F* qui reste en solution ; on l’isole par centrifugation.
L’anticorps de la réaction (Ac) est fixé sur un support solide :
Ces méthodes sont peu spécifiques, mais présentent l’avantage, phase hétérogène (figure 9).
en particulier avec le PEG, de pouvoir être automatisées (milieu
homogène). Après une première incubation, les complexes Ac-Ag et Ac-Ag*
L’on peut également réaliser la précipitation spécifique du (B*) restent fixés sur le support solide, F* reste dans le surnageant ;
complexe (Ag*-Ac) à l’aide d’anticorps. pour l’éliminer, il suffit de retourner le tube.
Les principaux supports utilisés sont :
3.1.3.2 Immunoprécipitation — des disques de polystyrène ;
L’anticorps spécifique de la réaction Ac1 joue, dans un second — les parois du tube réactionnel (tube revêtu d’anticorps) ;
temps, le rôle d’antigène vis-à-vis d’un second anticorps Ac2 anti- — des particules insolubles en polysaccharide ;
Ac1 ; le complexe formé précipite et est recueilli après centri-
— des microparticules insolubles ;
fugation ; Ac1 peut être, par exemple une γ globuline de lapin et Ac2
un sérum de chèvre anti-γ globuline de lapin (figure 8). — des ailettes placées au fond du tube.
C’est une des méthodes les plus utilisées actuellement en routine, C’est une technique solide, rapide et applicable aussi bien en RIA
mais elle présente deux inconvénients : elle est longue, deux incu- qu’en IRMA ; un effet de matrice, dû au fait que le support utilisé
bations étant nécessaires, et nécessite la présence de deux épitopes peut lier des composés non spécifiques, se manifeste parfois et doit
sur Ac1. être surveillé.
RADIOANALYSE _______________________________________________________________________________________________________________________
3.2 Courbe d’étalonnage et traitement

B*/T
mathématique des données
Le lecteur pourra se reporter à la références [23]. B*

0 /T
En pratique, Ac (M0) et Ag* ( m*0 ) gardant des valeurs constantes,
une série d’équilibres successifs est réalisée avec des quantités B1
croissantes connues de Ag (étalons) ; pour chacun d’eux, on B2
mesure, après séparation complète, les valeurs de B* (ou de F*) cor-
respondantes et l’on trace le graphe :
B* ( ipm ) = f ( [ Ag ] aj )
Bx
Il suffit alors, en opérant dans des conditions rigoureusement Bi
identiques, de déterminer B*x (ou F*x ) pour l(es) échantillon(s)
inconnu(s) et d’en déduire par interpolation graphique la (ou les)
valeurs(s) de [Ag]x.
Sur la courbe d’étalonnage, la valeur de B*0 correspondant à [Ag] aj
[Ag] x
[ Ag ] aj = 0 représente la fraction maximale de Ag* susceptible de
se lier à Ac en l’absence de Ag, c’est la capacité maximale de liaison
du système Ac-Ag. Figure 10 – Courbe d’étalonnage d’un dosage par compétition,
variation de B*/T en fonction de [Ag]aj
Pour des raisons de commodité, on trace plutôt le graphe :
B
------ ( % ) = f ( [ Ag ] aj )
B0
Ainsi toutes les courbes d’étalonnage partent de 100 %. B /B0 (%)
Signification de 50 % B/B0.
Le 50 % B/B0 est le point de la courbe habituellement associé
au maximum de précision, endroit où la pente est maximale.
Plus grand est le changement du pourcentage de liaison par
unité de concentration, plus grandes sont la sensibilité et la pré-
cision. Ce paramètre 50 % de liaison a été largement employé en
contrôle de qualité et optimisation des dosages radio-immuno-
logiques.
Il existe de multiples façons de tracer la courbe réponse-concen-

tration, selon le paramètre utilisé pour représenter la réponse Concentration
(figure 10) :
Figure 11 – Interpolation linéaire d’une courbe étalonnage
B* F*
------- ( % ) = f ( [ Ag ] aj ) , ------- = g ( [ Ag ] aj ) , etc.
T T
■ Méthodes les plus utilisées actuellement

Signification de B*0 /T. ● Interpolation linéaire : elle consiste à considérer qu’entre deux
Cette valeur est déterminée en divisant les impulsions du points consécutifs du graphe les variations réponse-concentration
standard zéro par le nombre d’impulsions totales. Cela repré- sont linéaires (figure 11).
sente la capacité de liaison maximale d’un anticorps dans le sys- Cette méthode a l’avantage d’être simple, de convenir à la majo-
tème en vigueur et est fonction de la concentration d’anticorps. rité des dosages (même IRMA), mais peut entraîner des erreurs sys-
D’avis commun, on estime que 50 % de liaison de la quantité tématiques si le graphe expérimental est très incurvé ou s’il
d’antigène marqué disponible est optimal. présente des points aberrants.
● Fonction spline [24][25] : elle consiste, entre deux points expé-
Ce mode de représentation est le plus fréquemment utilisé, il peut rimentaux consécutifs, à représenter la courbe par un polynôme du
être employé pour contrôler l’immunoréactivité et la stabilité du tra- troisième degré de la forme :
ceur, la stabilité de l’anticorps et la performance d’analyse dans un
programme de contrôle de qualité. 3 2
y = ax + bx + ex + d
Tracer un graphe non linéaire dont on ne connaît pas l’équation à
partir même d’un grand nombre de points mais en quantité discrète,
n’est pas toujours mathématiquement correct et peut entraîner des avec y la réponse,
variations individuelles. Pour cette raison, le tracé manuel de la x la concentration.
courbe d’étalonnage et l’interpolation graphique sont actuellement Ces différents polynômes ne sont pas indépendants et doivent
abandonnés au profit du traitement mathématique des données. répondre à un certain nombre de conditions aux limites (continuité
Grâce à l’informatique, il est possible, à partir des données expé- en particulier). La fonction spline interpolée passe obligatoirement
rimentales, d’établir l’équation de la courbe d’étalonnage (ou d’une par les points expérimentaux, tandis que la fonction spline lissée
portion donnée de cette courbe) et de calculer la concentration « smooth spline » traite la courbe dans son ensemble. Cette
inconnue dans la prise d’essai à partir de cette équation. méthode est applicable aussi bien en RIA qu’en IRMA.
_______________________________________________________________________________________________________________________ RADIOANALYSE
Les étapes de dilution du sérum au-delà de certaines limites peu-

vent modifier l’équilibre de la fraction libre [26], il a été calculé
logit (B /B 0 )
qu’une dilution d’un facteur 100 entraîne une baisse de T4L de 2 %.
3.3.3 Méthodologie
Le dosage de la thyroxine libre, hormone thyroïdienne active,

nécessite un isolement de la fraction libre de l’hormone de sa frac-
tion liée aux protéines vectrices. La technique de référence de sépa-
logit a = In[a /(1–a)]
ration de la fraction libre, de la fraction liée utilisable en routine fait
appel à la chromatographie d’exclusion. Nous proposons de
détailler la méthodologie du dosage de la thyroxine libre avec « la
trousse FT4 Sclavo Lab Technogenetics ».
3.3.3.1 Séparation chromatographique

Les sérums ou standards sont placés dans des petites colonnes
chromatographiques contenant une quantité connue et constante
lg [Ag] aj de Sephadex LH-20 et un tampon qui normalise le pH du sérum. Les
échantillons passent à travers le Sephadex à température ambiante.
Il a été prouvé que, dans certaines conditions d’expérimentations et
Figure 12 – Linéarisation de la courbe d’étalonnage en coordonnées à l’intérieur de certaines limites, la dilution d’un sérum n’apporte
logit-log pas de modification de la concentration en hormone libre et que la
quantité d’hormone adsorbée sur le gel est directement proportion-
● Méthode logit-log : elle permet une bonne linéarisation du nelle aux taux d’hormones libres du sérum. En pratique, après
graphe B* ⁄ B*0 = f ( [ Ag ] aj ) (figure 12) ; on porte: l’adsorption chromatographique, les fractions protéiques sont éli-
minées par le lavage de la colonne avec une solution tampon. Les
— en abscisse, lg [Ag] ;
hormones adsorbées sont récupérées par une solution protéique
— en ordonnée, logit B* ⁄ B*0 (%).
tamponnée.
Sachant que :
3.3.3.2 Dosage radio-immunologique
B * ⁄ B *0 ( % )
logit B * ⁄ B *0 ( % ) = ln ---------------------------------
1 – ( B * ⁄ B *0 )
- L’éluat des colonnes Sephadex LH-20 est collecté directement
dans les colonnes Liso-phase, bouchées à leur extrémité inférieure
Si elle donne d’excellents résultats en RIA, cette méthode est inu- et contenant un immunosorbant (gel de Sépharose auquel le
tilisable en IRMA, dans ce cas B* ⁄ B*0 > 1 . second anticorps est lié par covalence). Le traceur approprié et
l’antisérum spécifique sont ajoutés aux éluats, le mélange réaction-
nel est tenu séparé du gel, par un disque en polyéthylène poreux.
Dans cette étape, la colonne est utilisée comme un tube à essai où
3.3 Réalisation pratique : application se fait la réaction radio-immunologique classique en phase liquide.
au dosage de la thyroxine libre La séparation de l’hormone liée à l’anticorps de l’hormone non liée
s’effectue en ôtant le bouchon bas, ce qui permet au milieu réaction-
nel de passer à travers le gel Sépharose : le complexe antigène-anti-
3.3.1 Rappel physiologique corps formé se lie à l’immunosorbant par chromatographie
des hormones thyroïdiennes libres d’affinité, tandis que l’hormone non liée est éluée par le lavage de la
colonne avec un tampon et éliminée.
Les hormones thyroïdiennes, 3,3’,5 tri-iodothyronine (T3) et 3,3’, La radioactivité des colonnes est alors comptée et la courbe stan-
5,5’ tétra-iodothyronine ou thyroxine (T4) circulent pour leur plus dard construite. Enfin, la concentration des échantillons T4 libre est
grande part transportées par des protéines plasmatiques : 99,97 % déterminée par la lecture sur la courbe standard.
de la T4 et 99,70 % de la T3 sont liées à la Thyroxine Binding Globu- Les protocoles de séparation par chromatographie et de dosage
line (TBG) pour la majeure partie, à la pré-albumine et à l’albumine de la thyroxine libre sont donnés dans les tableaux 3 et 4.
dans une moindre proportion. Les hormones libres T4L (0,03 % de
Les tubes NSB (non specific bound) permettent de déterminer le
la T4) et T3L (0,3 % de la T3) sont en équilibre constant avec les
pourcentage de liaison non spécifique, c’est-à-dire la quantité de Ag*
fractions liées. Les hormones libres constituent les entités biolo-
qui pourrait se fixer sur des anticorps autres que l’anticorps de la
giquement actives car immédiatement disponibles pour pénétrer
réaction et qui pourraient être présents dans le milieu réactionnel ;
dans la cellule.
pour un bon dosage, le NSB ne doit pas excéder 3 à 4 %. La valeur
NSB est un indicateur précis de la validité de l’étape de séparation.
3.3.2 Problématique du dosage des hormones libres Les tubes T, où l’on ne sépare pas B* et F*, permettent de connaî-
(celles non liées aux protéines porteuses) tre la radioactivité totale introduite dans les tubes :
T* = B* + F*
Le dosage des hormones libres se fait impérativement avec une
méthode par compétition en raison de la petite taille des molécules Les tubes standard 0 ne contenant pas de substance froide, per-
(§ 3.3.3). mettent de déterminer la capacité totale de liaison du système B*0 ,
Il faut doser une concentration 5 000 fois plus faible que celle de c’est-à-dire la quantité de Ag* qui se fixe sur Ac en l’absence de Ag.
l’hormone totale. Il faut donc un anticorps très affin. Les tubes standards 1 à 5 permettent de déterminer la courbe
Mais pour ne pas trop changer l’équilibre naturel entre l’hormone d’étalonnage.
liée et l’hormone libre, il ne faut pas introduire trop d’anticorps dans Les tubes échantillons contiennent les échantillons inconnus à
le test. Il faut donc un nombre constant et limité de sites anticorps. doser.
RADIOANALYSE _______________________________________________________________________________________________________________________
(0)
Tableau 3 – Protocole de séparation par chromatographie d’exclusion de la thyroxine libre

Colonnes LH-20
Étapes Réactifs
NSB Standards 0-5 Échantillons
Normalisation Standard 500 µL 500 µL
des standards
ou des sérums Sérum 500 µL
Agiter ou réaspirer une ou deux fois la solution par une pipette automatique
pour homogénéiser.
Adsorption de l’hormone Enlever les bouchons bas et laisser le contenu s’écouler entièrement
dans un réceptacle.
Incuber au moins 15 min à température ambiante.
Élimination des fractions Tampon LH-20 (dilué) 2 mL 2 mL 2 mL

non absorbées Laisser couler entièrement la solution.
Solution protéique 200 µL 200 µL 200 µL
Laisser couler entièrement la solution et incuber au moins 15 min à température
Désorption de l’hormone ambiante.
Pendant ce temps, préparer le nombre nécessaire de colonnes Liso-phase
(éliminer la solution tampon qui s’y trouve par simple décantation).
Placer des colonnes LH-20 au-dessus des colonnes Liso-phase correspondantes.
Tampon LH-20 (dilué) 500 µL 500 µL 500 µL
Récupération Recueillir les éluats directement dans les colonnes Liso-phase.
de l’hormone Retirer les colonnes LH-20 et procéder au dosage avec les colonnes Liso-phase
uniquement.
(0)
Tableau 4 – Protocole de dosage de la thyroxine libre

Tubes Colonnes Liso-phase
Réactifs
Activité totale (T) NSB Standards 0-5 Échantillons
Éluats des colonnes LH-20.......... 500 µL 500 µL 500 µL
Traceur ......................................... 100 µL 100 µL 100 µL 100 µL
Antisérum .................................... 100 µL 100 µL
Eau distillée.................................. 1 mL 100 µL
Des tubes de contrôles (ou des pools de sérums), contenant des 3.4.2 Mesure de la distribution F « free »
quantités connues de Ag, différentes de celles de la courbe étalon, et B « bound »
et, traités comme des échantillons, permettent de valider l’exacti-
tude du dosage.
3.4.2.1 Méthode de Miles et Hales
3.4 Dosages immunoradiométriques Cette technique (figure 13) est dite en phase homogène :
(IRMA) — la substance antigénique à doser (S = Ag) est mise en présence
d’un excès d’anticorps spécifique marqué (R* = Ac*) ;
Dans la technique IRMA, c’est l’anticorps Ac* qui est marqué et il — à l’équilibre, pour séparer l’excès de R* qui n’a pas réagi, on
n’y a pas de compétition. Le développement de ces techniques vient utilise le même antigène Ag fixé sur une phase solide ou immuno-
de l’utilisation d’anticorps monoclonaux. adsorbant (ImAd) qui va le fixer ;
— à l’équilibre, après centrifugation, on mesure l’activité du sur-
3.4.1 Principe nageant, B*.
Cette méthode nécessite un étalonnage (méthode relative) ;
La substance antigénique à doser, S (Ag), réagit avec l’anticorps l’excès de réactif R* et la quantité d’immunoadsorbant étant main-
spécifique marqué en excès, R* (Ac*), selon la réaction : tenus constants, on réalise une série d’équilibres avec des quantités
croissantes connues de la substance à doser (S = Saj) ; en théorie,
S + R* ! R* – S
l’activité du surnageant après séparation B*, en fonction de [Saj]
F* B* permet de tracer la courbe d’étalonnage ; par interpolation sur ce
graphe, on détermine la concentration [S]x de l’échantillon inconnu
Le réactif R*, qui peut être fixé sur un support solide, doit être (figure 14).
ajouté en excès, après séparation des fractions libres F* et liées B*
la radioactivité de R* – S est fonction de la quantité de S présente Dans la pratique, comme en RIA, c’est le traitement mathémati-
dans le milieu réactionnel B* = f ( S ) ; S = S x ou Sétalon. que adéquat des données qui permet cette détermination.
_______________________________________________________________________________________________________________________ RADIOANALYSE
— une deuxième incubation, en présence d’un anticorps marqué,

dit de reconnaissance (R* = Ac*) en excès est réalisée où ce dernier
* * se fixe sur un autre site antigénique de S resté libre ;
— après plusieurs lavages successifs, pour éliminer l’excès de R* ;
* l’activité B* correspondante est fonction de la quantité de S (étalon ou
*
inconnue) présente dans le milieu d’incubation.
* +
Comme pour la technique précédente, un étalonnage et un traite-
* ment mathématique des données sont nécessaires.
*
* *
Ac* Ag Immuno - F * = Ac* B * = Ac*-Ag 3.4.3 Exemple :

adsorbant
dosage IRMA de la thyrotropine (TSH)
Figure 13 – Séparation des fractions libres et liées à l’aide

d’un immunoadsorbant (principe de Miles et Hales)
3.4.3.1 Principe du dosage
La TSH joue un rôle essentiel dans le maintien des taux normaux

circulants des hormones thyroïdiennes T4 et T3. Nous proposons de
détailler la méthodologie du dosage de la TSH avec la « trousse
B* Dynotest TSH 1 du laboratoire Brahms ».
(ipm) Il s’agit d’un dosage immunoradiométrique de type sandwich
pour la détermination quantitative de l’hormone thyréotrope TSH
dans le sérum humain. Il utilise deux anticorps monoclonaux possé-
dant des sites différents de liaison avec l’antigène. Les deux anti-
corps sont utilisés en excès, l’un est radiomarqué à l’iode 125
Bx* (traceur), l’autre est immobilisé à la surface d’un tube (tube revêtu
d’anticorps).
Pendant l’incubation, les deux anticorps réagissent avec les molé-
cules de TSH de l’échantillon pour former un complexe de type
sandwich lié au tube (fraction liée B). Ensuite, l’excès de traceur qui
n’a pas réagi (fraction libre F) est dilué, puis totalement éliminé.
Après une étape de lavage, la radioactivité des tubes est mesurée.
[S ]x [S ] La radioactivité mesurée est directement proportionnelle à la
ipm impulsion/min concentration en TSH des échantillons respectifs. À partir de stan-
dards de concentration connue en TSH, une courbe d’étalonnage
est réalisée en considérant les concentrations et les valeurs de
Figure 14 – Courbe d’étalonnage et détermination de la radioactivité correspondantes.
concentration d’un échantillon dans le cas d’un dosage IRMA
3.4.3.2 Méthodologie
Le protocole de dosage de la thyrotropine est donné dans le

tableau 5.
Afin de déterminer la capacité de liaison du système IRMA, on cal-
* *
cule sur le dernier point de gamme d’étalonnage (ici point n° 5) le
rapport :
ELSA
ELSA
ELSA
+ * *
ipm 5
B 5 ⁄ T ( % ) = ---------------- × 100
* ipm T
* La valeur de B5/T doit se situer entre 25 et 40 %.

Ac Ac – Ag Ac – Ag – Ac*= B*
Ac* Afin de déterminer la liaison non spécifique (LNS), on calcule le
Éliminer rapport :
ipm 0
Figure 15 – Principe de la séparation en phase hétérogène ELSA
B 0 ⁄ T ( % ) = ---------------- × 100
ipm T
(Element Linked Solid Assay)
La LNS est normalement comprise entre 0,025 et 0,05 %.
3.4.2.2 Méthode ELSA (Element Linked Solid Assay)

Encore appelée méthode sandwich ou en phase hétérogène. La
substance à doser devant obligatoirement posséder deux détermi- 3.5 Évaluation de l’efficacité analytique
nants antigéniques (épitopes), la méthode ne convient qu’au d’un dosage radio-immunologique
dosage des grosses molécules protéiques (figure 15) :
— l’anticorps non marqué (Ac = R), dit de capture, est fixé sur une
phase solide (ELSA), une première incubation est réalisée avec la Le rôle du clinicien est de diagnostiquer, avec la marge d’erreur la
substance antigénique à doser (Ag = S) ; la quantité de S restée libre plus faible possible ou la probabilité la plus élevée, la présence (M+)
est éliminée par lavage ; ou l’absence (M–) d’une pathologie donnée.
RADIOANALYSE _______________________________________________________________________________________________________________________
(0)
Tableau 5 – Protocole de dosage de la thyrotropine

Points
1 Numéroter les tubes T 0 de gamme Patient
de 1 à 5
le standard 0 (µL) 100
2 Distribuer les standards (µL) 100
les échantillons (µL) 100
3 Distribuer traceur (µL) 200 200 200 200
4 Incuber 1 h à 170-250 tr/min à température

ambiante (17 à 27 °C)
5 Distribuer la solution de lavage (mL) 2 2 2
Aspirer ou décanter Aspirer ou décanter complètement

6 le surnageant et répéter l’étape de lavage
Lavage 2 fois avec 2 mL de solution de lavage.
7 Mesurer la radioactivité Temps de comptage conseillé : 1 min
Pour ce faire, il dispose :

— de l’examen clinique du patient, indispensable et primordial, et On peut définir la sensibilité fonctionnelle selon deux modes
de son interrogatoire ; la notion de prévalence (ou de non-préva- de calcul :
lence) est associée à cette phase ; — soit comme la plus petite concentration pour laquelle le
— d’examens complémentaires, imagerie et biologie, qui lui per- coefficient de variation intersérie est égal à 20 % ;
mettront de confirmer ou, éventuellement, d’infirmer son diagnostic. — soit à partir des courbes ROC (Received Operating Curve)
qui prennent en compte l’évaluation clinique du dosage biologi-
Exemple : exploration morphologique de la thyroïde par scinti- que [27].
graphie et/ou échographie ; exploration fonctionnelle, grâce au
dosage de la TSH et de la LT4.
Le rôle du biologiste est donc d’aider le clinicien à poser son dia- 3.5.1.2 Détermination
gnostic, en lui rendant des résultats les plus fiables possibles.
L’interprétation de ces résultats ne doit en aucun cas être dissociée
3.5.1.2.1 Limite de détection
du contexte clinique.
Pour remplir son contrat, le biologiste doit lui-même être sûr de La limite de détection Ly représente la plus petite concentration
ses réactifs, qu’il doit donc évaluer le plus rigoureusement possible ; mesurée, avec le plus de fiabilité, par la technique testée.
cette évaluation s’effectue à deux niveaux différents :
— sur le plan technique, de façon à caractériser l’efficacité analy-
tique du test utilisé, indépendamment de tout contexte clinique ; il La limite de détection ne doit pas être confondue avec la sen-
doit être sûr de ses instruments de mesure et de ses réactifs ; sibilité analytique σ , notion plus générale, qui s’exprime par le
— sur le plan clinique, de façon à vérifier l’efficacité diagnostique de rapport de la variation de l’effet, ici le signal, à la variation cor-
ce même test ; en particulier, il doit définir, sur une population témoin, respondante de la cause, ici la concentration :
les normes qui lui assureront le meilleur pouvoir discriminant.
∆ ( signal )
Exemple : pour une technique de dosage de la TSH donnée, le bio- σ = ------------------------------------------------
logiste doit définir un seuil au-dessous duquel la probabilité d’être ∆ ( concentration )
hyperthyroïdien doit être la plus élevée possible.
Dans un premier temps, nous nous intéresserons aux principaux La technique est d’autant plus sensible qu’une faible variation de
critères d’efficacité analytique utilisés, nous verrons ensuite les cri- la concentration produit une plus grande variation du signal détecté.
tères d’efficacité diagnostique à prendre en compte. C’est donc une notion indépendante de la concentration, qui s’appli-
que sur toute la gamme des concentrations.
Dans les valeurs basses, il est en effet difficile de savoir si le signal
3.5.1 Détectabilité, sensibilité fonctionnelle observé (rayonnement radioactif) provient du blanc (zéro) ou d’une
faible quantité de substance à doser.
3.5.1.1 Définition En raisonnant sur le signal détecté (y), si l’on effectue plusieurs
Ces deux critères expriment la capacité d’une méthode de dosage déterminations du blanc (supposé incontestable) et d’un échantillon
à distinguer les signaux issus par la mesure de deux échantillons de bas, en supposant que les distributions sont normales, deux cas
concentrations très voisines. La sensibilité s’applique sur une gamme peuvent se présenter :
de concentration au-delà du standard zéro, alors que la détectabilité — soit, par suite du recouvrement trop important des deux distri-
concerne les valeurs de concentration faible, voire nulles. butions (figure 16a), il est impossible de conclure si le signal
détecté provient du blanc ou de l’échantillon : la substance serait
donc indétectable ;
On définit la limite de détection comme étant la plus petite — soit, les deux distributions ne se recouvrant pas (ou peu), on
concentration dont la mesure donne un signal statistiquement admet que les signaux correspondant respectivement au blanc et à
différent de celui du standard zéro avec un intervalle de l’échantillon sont significativement différents pour que ce dernier
confiance de 95 %. soit détectable (figure 16b).
_______________________________________________________________________________________________________________________ RADIOANALYSE
t ( α, ν ) variable de Student pour un risque α

(risque de conclure à tort à la présence de
Fréquence
Fréquence
Blanc Échantillon Blanc Échantillon

la substance dans le liquide biologique)
et ν degrés de liberté (correspondant à
l’estimation de S c0 ),
SB Sy SB Sy
nB , ny nombre de répétitions lors du dosage du
blanc et des échantillons respectivement,
dans des conditions de routine
d’utilisation de la méthode. Si la gamme
yB y Signal (y) yB y Signal (y) d’étalonnage et les échantillons sont
dosés en duplicate, n B = n y = 2 , en
a recouvrement des distributions b pas de recouvrement
triplicate, n B = n y = 3 .
des distributions
Les termes S B , t ( α, ν ) , n B et n y dépendent étroitement des

Figure 16 – Distribution des fréquences conditions opératoires, c’est-à-dire de la technique et du protocole
statistique (recueil des données, traitement ...) choisi.
La limite de détection se détermine sur la répétabilité intra-essai
Une première approximation consiste à prendre comme limite de [28] du standard 0.
détection :
Pour passer de la limite de détection en signal (Ly) à son expres-
sion en concentration (Lc ) on utilise la courbe d’étalonnage (figure
17) ; pour une meilleure interpolation graphique, il est recommandé
Ly yB ± 3 SB de dilater la partie de la courbe correspondant aux valeurs basses :
Car dans cette hypothèse, 99,8 % du signal correspondant au
blanc étant compris dans ces limites, le risque de conclure que le SB
L c = k -------
signal, s’il est supérieur à Ly, provient de l’échantillon est inférieur à p
1 % statistiquement. Les deux éventualités précédentes se tradui-
sent par deux hypothèses : avec p la pente de la courbe dans cette zone.
— hypothèse nulle, H0 :
Exemple : pour un risque de 1 %, t ( α , ν ) = 2,325 ; en travaillant
en double, pour le blanc et pour l’échantillon, n B = n y = 2 :
yB ≈ y ⇒ yB – y ≈ 0
SB
La différence est nulle (ou insuffisante) la substance S est indétecta- L c = 2,3 ------ = 2,3S c0
ble ; p
— hypothèse alternative, H1 :
3.5.1.2.2 Sensibilité fonctionnelle
yB ≠ y ⇒ yB – y ≠ 0
■ Sensibilité fonctionnelle à partir du profil de précision interessai
La différence entre les moyennes est suffisamment différente pour Ce mode de calcul est celui préconisé par l’American Thyroid
que la substance S soit détectable. Association, il a été initialement proposé pour le calcul de la sensi-
bilité fonctionnelle de la thyrotropine (TSH) et des hormones thyroï-
Il existe donc une certaine probabilité de rejeter H0, alors que diennes libres [29]. Ce calcul tient compte de la variabilité physio-
l’hypothèse est vraie, risque α, c’est-à-dire que la substance S est logique de la substance à doser et des incertitudes analytiques, un
présente dans l’échantillon, et une probabilité de ne pas la rejeter, coefficient de variation interessai de 20 % est admis pour le calcul
risque β, c’est-à-dire qu’il n’y a pas de substance S dans l’échan- de la sensibilité fonctionnelle.
tillon, alors qu’en réalité il y en a.
En fonction du seul risque α (c’est-à-dire, rejet de l’hypothèse
nulle), on démontre que la limite de détection, exprimée en signal
fourni par l’appareil de mesure, est de la forme :
Signal
SB
L y = k --------------------- = k S c 0
dy ⁄ dc
1 1
avec k = t ( α , ν ) ------ + ------
nB ny
avec SB écart-type des signaux (ipm) fournis en Ly

répétant (habituellement 20 fois) le
dosage d’un échantillon dépourvu de la
substance à doser,
dy ⁄ dc pente de la courbe d’étalonnage entre les Lc Concentration
deux premiers points d’étalonnage (stan-
dard 0 et standard 1) = pente à l’origine,
S c0 = S B dy ⁄ dc écart-type, exprimé en concentration, Figure 17 – Limite de détection et pente initiale de la courbe de
pour des mesures de concentration nulle, calibration
RADIOANALYSE _______________________________________________________________________________________________________________________
(0)
Tableau 6 – Exemple de présentation des données

CV (%)
permettant le calcul du coefficient de variation
Étalons
20
E0 E 1 E 2 E3 E4 E 5 E 6
Reproductibilité interessai interlot ........
10 Moyenne..................................................
ET (écart-type) ........................................
CV %.........................................................
Sensibilité fonctionnelle Concentration C
Si l’on distribue le nombre de patients malades ou non en fonc-

Figure 18 – Profil de précision tion des résultats du test, on obtient la répartition de la figure 19.
Le seuil de discrimination (seuil de sensibilité fonctionnelle [SSF]
Le profil de précision (figure 18) s’établit à partir de la reproducti- ou cut-off) est un compromis entre la sensibilité et la spécificité
bilité interessai interlot des points de gamme (E0 à Eaj) de la courbe (tableau 8).
de calibration. Il est possible sur un même graphe de représenter la variation de
la sensibilité et de la spécificité en fonction du seuil de sensibilité
Pour chaque concentration des points de gamme, on calcule la
fonctionnelle (figure 20).
moyenne et leur dispersion (écart-type : ET), ensuite on réalise le
calcul du coefficient de variation : Les critères d’un test idéal seraient une sensibilité de 100 % et une
spécificité de 100 % qui permettraient au clinicien, sur la simple lec-
écart-type ture des résultats, de poser un diagnostic avec une certitude de
CV ( % ) = ---------------------------- × 100
moyenne 100 %. Ce test n’existe pas. Le biologiste doit s’efforcer d’utiliser
celui qui s’en rapproche le plus. Il devra apprécier, sur une ou plu-
Le tableau 6 présente la structure obtenue pour six points de sieurs populations témoins, le pouvoir discriminant de ce test à
gamme. affirmer ou non la présence d’une pathologie chez un sujet inconnu
On trace le profil de précision représentant l’évolution du coeffi- (n’appartenant pas à la population témoin). Or, ces critères de spéci-
cient de variation en fonction de la concentration. Le report d’un CV ficité et de sensibilité varient en sens inverse. Si on modifie le seuil
de 20 % sur la courbe permet, par extrapolation, de déterminer la de façon à augmenter la sensibilité, on diminuera la spécificité et
sensibilité fonctionnelle. inversement.
Choisir le seuil de discrimination à l’interception des deux cour-
■ Sensibilité fonctionnelle à partir des courbes ROC (Received bes consiste à donner à la spécificité et à la sensibilité la même
Operating Curve) importance.
À l’inverse du précédent, ce mode de calcul, plus européen, prend Le tracé des courbes ROC (figure 21) va permettre entre autres
en compte des paramètres cliniques, qui sont la spécificité et la sen- d’adapter le seuil de décision en fonction des contextes clinique et
sibilité (tableau 7), pour le calcul de la sensibilité fonctionnelle [30]. thérapeutique. (0)
Tableau 7 – Paramètres permettant de déterminer la spécificité et la sensibilité
Indices Définitions Valeur théorique Interprétation
Proportion des vrais positifs VP 1 Prob (T+/M+)

PVP = ---------------------- = Se
VP + FN
Proportion des vrais négatifs VN 1 Prob (T–/M–)

PVN = ---------------------- = Sp
VN + FP
Proportion des faux positifs FP 0 Prob (T+/M–)

PFP = ---------------------- = 1 – Sp
FP + VN
Proportion des faux négatifs FN 0 Prob (T–/M+)

PFN = ---------------------- = 1 – Se
VP + FN
M+ sujet malade FN faux négatifs

M– sujet sain FP faux positifs
T+ test positif VN vrais négatif
T– test négatif VP vrais positifs
Se sensibilité Sp spécificité
_______________________________________________________________________________________________________________________ RADIOANALYSE
(0)
Tableau 8 – Définitions de la spécificité et de la sensibilité
Spécificité Sensibilité
C’est l’aptitude à ne pas reconnaître des non-malades, c’est-à-dire : C’est l’aptitude à repérer les patients atteints d’une pathologie
— des sujets sains ; tumorale ; c’est le pourcentage de malades pour lesquels le taux
— des sujets atteints d’une pathologie bénigne ; de marqueurs est supérieur à un seuil.
— des sujets en rémission complète ;
— des sujets dont la localisation cancéreuse ne correspond pas à
celle étudiée.
population des vrais négatifs population des vrais positifs
Spécificité = ------------------------------------------------------------------------------------------ Spécificité = ----------------------------------------------------------------------------------------
population des vrais négatifs + population des vrais positifs +
population des faux positifs population des faux négatifs
Spécificité = proportion de vrais négatifs. Sensibilité = proportion de vrais positifs
1
Nombre de patients
Seuil
M– M+
Sensibilité
AUC
Area under the curve
VN VP
Aire sous la courbe
Résultats du test 0 1 – Spécificité 1

FN FP
Dans cet exemple et pour un seuil de discrimination donné [carré
bleu], la sensibilité et la spécificité du test sont maximales, 90 et
Figure 19 – Répartition des populations M+ et M– en fonction
86 % respectivement.
du seuil de discrimination choisi
Figure 21 – Courbe ROC

Seuil de sensibilité fonctionnelle
constitue un critère de qualité dans l’évaluation clinique d’une

trousse de dosage.
Pour atteindre une sensibilité et une spécificité de 100 %, le carré
bleu (figure 21) doit migrer en haut et à gauche. Cette migration
Spécificité s’accompagne d’un accroissement de l’AUC.
Seuil de discrimination
optimal La sensibilité fonctionnelle correspond au seuil de discrimina-
tion pour lequel la sensibilité et la spécificité sont maximales.
Sensibilité
Les applications principales sont :
— la fixation d’un seuil de discrimination, pour une méthode donnée ;
— la comparaison des performances diagnostiques pour deux
Échelle de grandeur méthodes différentes.
Figure 20 – Évolution de la sensibilité et de la spécificité en fonction Pour comparer deux trousses de dosages A et B, on détermine
du seuil de discrimination pour chacune d’elles et sur les deux même populations, l’ensemble
des couples (PVP (proportion de vrais positifs) = sensibilité, PFP
(proportion de faux positifs) = 1 – spécificité), pour différentes
La méthode ROC consiste pour l’établissement de la sensibilité valeurs du seuil S ; on obtient deux courbes ROC différentes. Pour
fonctionnelle : connaître la plus performante graphiquement pour une même
— à faire le bilan clinique d’une population de patients pour l’éta- valeur (PFP)A, calculée pour le test A, on détermine sur les deux
blissement des paramètres cliniques : sensibilité, spécificité ; courbes les valeurs correspondantes (PVP)A et (PVP)B.
— à doser dans cette population la substance avec la trousse à Dans le cas de la figure 22, pour une même valeur de la spécificité :
étudier dont on veut établir la sensibilité fonctionnelle ;
— à reporter pour un seuil de discrimination donné la valeur cal- (PVP)A > (PVP)B ,
culée de la sensibilité et la valeur de (1-spécificité) sur les axes d’un
graphique en X, Y ; donc :
— à calculer l’AUC (Area Under Curve) de cette courbe ; sensibilité A > sensibilité B
— l’AUC sera d’autant plus importante que la spécificité et la sen-
sibilité du test seront proches de l’unité, par conséquent l’AUC le test A est donc plus performant que le B.
RADIOANALYSE _______________________________________________________________________________________________________________________
L’erreur systématique sur un dosage, se répétant toujours dans le

PVP = prob (T+/M+) même sens pour chaque mesure, va donc se répercuter sur leur
moyenne x , d’où son expression en fonction de la valeur vraie et de
la moyenne (caractérisant la distribution). En immunoanalyse, une
(0,1) (1,1) des principales causes d’erreur systématique est liée au comporte-
(A ) ment différent des solutions étalons et des échantillons biologiques
PVPA (B ) à doser, ainsi qu’à la dénaturation des anticorps utilisés pour le
dosage, dont la capacité de liaison peut être réduite.
PVPB Le sens de l’erreur aléatoire (ou accidentelle) est imprévisible et
est généralement différent d’une mesure x i à l’autre x j ; de là son
expression en fonction de la moyenne, qui représente la distribu-
tion, et de la valeur considérée.
Différents critères vont permettre de déterminer l’origine des
erreurs de mesure, et de quantifier l’efficacité analytique du test ; il
s’agit de la spécificité, de l’exactitude, de la précision, de la limite de
détection.
(1,0)
(0,0)
PFPA
PFP = prob (T+/M –)
3.5.3 Spécificité
Figure 22 – Comparaison de deux techniques de dosage A et B
à l’aide des courbes ROC
3.5.3.1 Définition
Px
La spécificité d’un dosage est son aptitude à mesurer seule-
ment l’analyte désiré, même en présence de quantités importan-
tes de substances de structure voisine.
e
L’inverse de la spécificité de la reconnaissance épitopique est la
réaction croisée ou réactivité croisée, qui fait reconnaître deux
molécules différentes par un même anticorps.
ei
3.5.3.2 Mise en évidence de réaction croisée
ei - e Selon le principe de dosage, il existe deux façons d’évaluer la spé-

cificité.
cv c ci c
3.5.3.2.1 Détermination des pourcentages de réaction
cv valeur «vraie» de concentration croisée
ci valeur obtenue lors de la i e mesure
Cette méthode ne s’applique qu’aux dosages par compétition car
c moyenne des valeurs expérimentales
ei erreur totale commise dans la i e mesure
elle repose sur l’évaluation de la concentration de la molécule inter-
e partie non aléatoire de l'erreur totale ou erreur systématique férente qui induit un déplacement de 50 % du traceur. Elle consiste
ei - e erreur aléatoire (fortuite, accidentelle) sur la mesure de xi ou ci à réaliser des courbes de calibration avec des quantités croissantes
de la substance susceptible d’interférer. En résumé, on remplace la
gamme d’étalonnage originale par des quantités croissantes de la
substance interférente.
Figure 23 – Densités de probabilité, P ( x ), des concentrations
obtenues au cours d’un dosage. Composantes systématique et Exemple : à l’aide des courbes de la figure 24, on détermine les
aléatoire de l’erreur totale pourcentages de réaction croisée de la désoxycorticostérone et du cor-
tisol dans un immunodosage de progestérone :
3.5.2 Erreurs de mesure — désoxycorticostérone :
(4,4/70)/100 = 6,3 %
Toute mesure d’un paramètre biologique est entachée d’une
— cortisol :
erreur qu’il est obligatoire d’estimer pour apprécier les qualités ana-
lytiques de la méthode considérée. (4,4/20 000)/100 = 0,022 %
Par définition, l’indice d’Abraham I (ou RC50) est égal au rapport des
Par définition, l’erreur sur la mesure d’un paramètre biologi- masses (ou des concentrations) de substance nécessaires pour abais-
que donné, par une technique donnée, représente la différence ser de moitié la fraction totale B/T.
entre la valeur trouvée et la valeur vraie.
Dans cet exemple, plus l’indice d’Abraham est faible, plus les ris-
ques de croisement le sont.
Si l’on suppose, d’une part, qu’il est possible de connaître la
valeur vraie, ce qui est rarement le cas, d’autre part, que la distribu- Pour une capacité maximale y0 donnée (qui dépend de l’affinité
tion des résultats d’un grand nombre de mesures suit une loi nor- de Ag* et de Ac), I sera d’autant plus grand, donc les risques de
male, caractérisée par une moyenne c et un écart-type s (ou un réactions croisées aussi, que KA/KC sera faible, c’est-à-dire que les
CV (%) : coefficient de variation = ( s ⁄ c ) × 100), on obtient les densi- affinités de la substance à doser et du réactif croisant seront voisi-
tés de probabilité P ( x ) des concentrations de la figure 23. nes.
_______________________________________________________________________________________________________________________ RADIOANALYSE
3.5.4 Exactitude
B /T
3.5.4.1 Définition
Une technique de dosage est d’autant plus exacte qu’elle

donne un résultat le plus proche de la valeur vraie.
0,5
En général, on compare la valeur vraie à la moyenne d’une série

Cortisol de mesures d’un même échantillon : l’écart, dont l’inexactitude, est
imputable aux erreurs systématiques. Quand on dispose d’une
Désoxycorticostérone méthode de référence pour déterminer la valeur vraie, ou la plus
vraisemblable, la comparaison entre cette valeur et les résultats
Progestérone obtenus par la méthode évaluée permet de déterminer l’exactitude.
C (µg/L)
Quand on ne dispose pas de telles méthodes soit on se fixe une
4,4 70 20 000 (échelle log)
valeur cible, à partir d’une moyenne, soit on se contente de vérifier
que la méthode est capable d’estimer au mieux la valeur du paramè-
tre biologique mesuré par des tests de dilution et de surcharge.
Figure 24 – Mesure de la spécificité, détermination du pourcentage
de réaction croisée induit par la désoxycorticostérone ou le cortisol
3.5.4.2 Méthodes d’évaluation
lors d’un dosage RIA de la progestérone
Une évaluation objective de l’exactitude de la réponse d’une
méthode de dosage dans un milieu biologique quel qu’il soit néces-
site :
(Ag*)A (Ag)A (Ag)C
— de vérifier la linéarité de la réponse tout au long du domaine
+ (Ac)
de concentration de la gamme d’étalonnage ;
— de s’assurer que le milieu biologique concerné, par rapport au
KC KA* KA milieu des calibrateurs, n’influence pas la liaison de l’analyte à
l’anticorps ou aux anticorps en réalisant :
• un test de dilution (ou de parallélisme) pour détecter une
AgC - Ac AgA* - Ac AgA - Ac
éventuelle erreur absolue constante,
• un test de surcharge par des ajouts dosés pour détecter une
éventuelle erreur relative constante.
Figure 25 – Impact de la substance interférente, (Ag)C sur la loi
d’action de masse Cette vérification de la justesse d’une technique est indispensable
avant toute mesure à visée diagnostique et elle constitue une étape
importante et obligatoire de l’évaluation analytique d’une trousse
Calcul de l’erreur absolue sur la concentration. de tout immunodosage.
Pour apprécier l’erreur commise sur le résultat du dosage, par Pour apprécier cette erreur systématique, il est nécessaire de dis-
suite de la présence dans le milieu réactionnel de réactif(s) croi- poser de la valeur « vraie », ce qui est un problème non résolu pour
sant(s), considérons les équilibres simultanés (figure 25) : les composés concernés par les immunodosages en raison de
TC = BC + FC l’absence de méthode de dosage de référence, à l’exception des
hormones stéroïdiennes qui peuvent être dosées par la chromato-
BC graphie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse.
K C = --------------
-
F C N F″ 3.5.4.2.1 Test de dilution
N = B* ″ Il permet d’apprécier que l’estimation, par la méthode considérée,
A + BA + BC + NF
de la concentration de la substance à doser est proportionnelle à la
y = B A ⁄ T*
A valeur vraie (inconnue).
avec N = [ AC ] (concentration initiale en anticorps), Soit cv, la valeur vraie de la concentration ; on réalise une série de
dilution de cette substance, soit αi le degré de dilution (αi = 1, 2, 3,..., i)
N F″ concentration en A C libre à l’équilibre (tableau 9). (0)
soit :
N 1 KC TC Tableau 9 – Test de dilution : série de dilutions
- ----------------------------------
A – ------
T A′ = ---- – ------------------------- – T* -
y KA ( 1 – y ) KA K
1 – y  1 – ------C-
de la substance à doser
 KA 
Dilution cv c1 = cv ⁄ 2 c2 = cv ⁄ 3 ci = cv ⁄ i
L’erreur absolue sur la mesure a pour expression :
Valeur sur la Tv T1 T2 Ti
KC TC courbe étalon
∆T A = T A′ – T A = ------- -----------------------------------
KA K
1 – y 1 – ------C-

 K A Si la méthode est exacte, quelle que soit la dilution, la valeur esti-
mée doit être égale à la valeur exacte :
3.5.3.2.2 Détermination de la plus petite concentration de c
substance interférente fournissant un signal non T i = c i = ----v-
αi
nul
C’est la seule évaluation possible pour une méthode immunora- Le graphe T i = f ( 1 ⁄ α i ) doit être une droite de pente c v , passant
diométrique « IRMA ». par l’origine.
RADIOANALYSE _______________________________________________________________________________________________________________________
Si la méthode introduit une erreur constante en valeur relative 3.5.4.2.2 Test de récupération
(erreur relative systématique) ε : Il permet de vérifier que la substance analysée est dosée en tota-
Ti – ci lité dans le milieu réactionnel biologique (sérum).
ε = --------------
- = cte Soit c v , la valeur vraie de la concentration, à doser dans le sérum
ci
d’un patient ; on ajoute des quantités connues, croissantes de la
alors : substance à doser (tableau 11).
cv
T i = c i ( 1 + ε ) = ----- ( 1 + ε ) (0)
αi
Tableau 11 – Test de récupération : ajout de quantités
Le graphe T i = f ( 1 ⁄ α i ) est encore une droite passant par l’ori- connues, croissantes de la substance à doser
gine, de pente c v ⁄ ( 1 + ε ) , ne permettant pas de déterminer ε puis-
que c v est inconnue. Ajouts cv c v + δc c v + 2δc … c v + iδc
Si la méthode introduit une erreur absolue systématique ε’
Valeur sur la Tv …
c courbe étalon T1 T2 Ti
T i = c i + ε ′ = ----v- + ε ′
αi
Si le dosage est exact :
Le graphe T i = f ( 1 ⁄ α i ) est une droite de pente c v , dont l’ordon-
née à l’origine est ε’, qui peut donc être déterminée. Si l’écart entre cv = Tv , c1 = T1 ,
la valeur mesurée et la valeur vraie est constant tout au long de la
gamme de concentration étudiée, on parlera d’une erreur absolue c i = T i = c v + iδc = T v + iδc
systématique, qui sera révélée par un test de dilution lorsque
l’ordonnée à l’origine est significativement différente de zéro. Le graphe c i = f ( T v + iδc ) , pour i variable, est une droite passant
Exemple : épreuve de dilution d’une trousse de dosage IRMA de la par l’origine et de pente 1.
thyrotropine humaine (TSH). Chaque échantillon ainsi préparé est ana- S’il existe une erreur systématique absolue ε’ :
lysé deux fois (tableau 10 et figure 26).
Cette relation se traduit par une droite passant par l’origine et d’une T v = c v + ε ′ , …, T i = c i + ε ′ = c v + iδc + ε ′
pente égale à la concentration initiale. Dans le cas d’une erreur systé-
matique, l’ordonnée à l’origine est statistiquement différente de zéro T i = T v + iδc
et se traduit par une relation non linéaire. Les outils statistiques per-
mettant de comparer la valeur de l’ordonnée à l’origine à zéro ou la Le graphe T i = f ( T v + iδc ), pour i variable, est encore une droite
linéarité de la relation sont reportés dans un ouvrage Immunostat [31]. passant par l’origine et de pente 1, ne permettant de détecter ε’.
S’il existe une erreur systématique relative :
Tv – cv Ti – ci
ε = -----------------
- = --------------
-
50 cv ci
Valeurs observées mUI/L
40 y = 47,495x + 0,0338 T i = c i ( 1 + ε ) = ( c v + iδc ) ( 1 + ε )

30 = c v ( 1 + ε ) + iδc ( 1 + ε ) = T v + iδc ( 1 + ε )
20 Le graphe T i = f ( T v + iδc ) est une droite de pente (1 + ε), ne pas-

sant pas par l’origine, mais par le point de coordonnées ( T v , T v ) ; la
10 pente permet de déterminer ε.
0 Si l’écart entre ces valeurs, non constant, est proportionnel à la
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 concentration étudiée, on parlera d’une erreur systématique rela-
Dilution tive, qui sera révélée par un test de surcharge lorsque la pente de la
mUI mille unité internationale droite est significativement différente de l’unité.
Figure 26 – Épreuve de dilution : dosage TSH Exemple : un test de surcharge a été réalisé en ajoutant un volume
équivalent de standards St (0 ; 0,16 ; 0,31 ; 1,25 ; 5 ; 20 ; 80) fournis dans
(0)
la trousse à un sérum de concentration faible en thyrotropine (TSH).
Tableau 10 – Épreuve de dilution d’une trousse de dosage Chaque échantillon ainsi préparé sera analysé deux fois (tableau 12 et
IRMA de la thyrotropine humaine figure 27).
La courbe représentative des concentrations attendues en fonction
Valeur des concentrations observées est une droite de pente égale à 1, pas-
Contribution Valeur enregistrée Récupération sant par l’origine en l’absence d’erreur systématique ou en présence
Dilution du pool A prévisible (VE) / (VP) d’une erreur systématique absolue. Par conséquent, cette épreuve ne
(mUI/L) (VP) moy détecte pas une erreur systématique constante en valeur absolue. Les
(VE)
± ET outils statistiques permettant de comparer la valeur de l’ordonnée à
(%)
l’origine à zéro et la pente à 1 de la relation sont reportés dans
– 47,58 – – 0,380 – l’ouvrage Immunostat [31].
1/2 – 23,79 23,46 0,610 98,6
1/4 – 11,89 12,47 0,137 104,8
Test de dilution : mise en évidence d’une erreur absolue sys-
1/8 – 5,94 5,76 0,063 96,9 tématique.
1/16 – 2,97 2,92 0,002 98,3 Test de surcharge : mise en évidence d’une erreur relative
ET écart-type systématique.
_______________________________________________________________________________________________________________________ RADIOANALYSE
(0)
Tableau 12 – Test de surcharge : ajout d’un volume équivalent de standards

Volume 100 µL Contribution du pool Valeur enregistrée Récupération
Concentration (VE) / (VP)
Valeur prévisible (VP)
ajoutée moy
(VE)
(mU/L) (mU/L) ± ET (%)
– 4,89 – – 0,037 –
St (0) – 2,44 2,35 0,062 96,3
St (0,16) – 2,52 2,55 0,098 101,2
St (0,31) – 2,60 2,57 0,019 98,8
St (1,25) – 3,07 3,03 0,081 98,7
St (5) – 4,94 5,07 0,048 102,6
St (20) – 12,44 12,98 0,024 104,3
St (80) – 42,44 41,23 0,039 97,1
ET écart-type
50
Valeurs attendues mUI/L
3
+ 3s
40 y = 0,9711x + 0,1954
Concentrations trouvées
2
+ 2s
30
1
20 c
10 1
0 – 2s
0 10 20 30 40 50 2
Valeurs observées mUI/L – 3s
3
Figure 27 – Épreuve de surcharge : dosage TSH Numéro de série
a présentation du diagramme
L’épreuve de dilution et de surcharge ne peut pas être utilisée

pour vérifier l’exactitude d’une trousse destinée au dosage de
l’hormonémie libre en une étape. L’équilibre de la forme libre et
liée aux protéines dépend de la loi d’action de masse ; la surcharge 2
ou la dilution du sérum conduirait à une fixation ou à un déplace- 2s
ment de l’hormone de ces protéines porteuses, respectivement, si
bien que la proportion de forme libre et liée resterait inchangée,
rendant ainsi le test de surcharge ou de dilution inutile. s 4
L’épreuve de dilution ou de surcharge peut être réalisée sur
1 3
des trousses en deux étapes effectuant, avant le dosage, une Valeur
phase de séparation de la forme libre et liée (immunoextraction cible
ou chromatographique « voir méthode Technogénétics Sclavo » 5
§ 3.3.3). –s
3.5.4.2.3 Contrôle d’exactitude

– 2s
■ Courbe de Levey-Jennings
L’inexactitude d’un dosage est imputable, la plupart du temps,
aux erreurs systématiques et occasionnellement à une erreur acci-
b exemple
dentelle ; pour contrôler l’exactitude d’un dosage, on peut opérer de
la façon suivante.
Il faut disposer d’un ou plusieurs sérums de contrôle dont les Figure 28 – Diagramme de Levey-Jennings
concentrations sont connues, ciblées, ou bien déterminée à partir de
la moyenne d’une série de dosages antérieurs de ces contrôles, par
la même technique ; dans le cas d’un contrôle interlaboratoire, on Généralement un contrôle correspond à une valeur basse, le
prend la moyenne des résultats obtenus, pour une même technique, deuxième à une valeur moyenne, le troisième à une valeur élevée
par les différents laboratoires participant au contrôle. (figure 28a).
RADIOANALYSE _______________________________________________________________________________________________________________________
Après avoir traité ces contrôles comme les autres échantillons

(sérums) de la série, on compare les résultats obtenus c i avec la
moyenne, en calculant la différence c i – c . On place ensuite sur le Sérum I
diagramme de Levey-Jennings les points correspondant à ( c i – c ) ⁄ s
en grandeur et en signe (figure 28b) : D
— dans la zone 1, ( c i – c ) ⁄ s : le dosage peut être considéré 3s
C
comme correct ;
2s
— dans la zone 2, ( c i – c ) ⁄ s : le dosage doit être surveillé ;
R
— dans la zone 3, ( c i – c ) ⁄ s : le dosage est inexact et la série cor-
respondante doit être refaite. B
B
Si les valeurs obtenues se situent : XI
A
— dans la zone 1, zone idéale, les différentes valeurs se répartis-
sant autour de la valeur cible ;
— dans la zone 2, mauvais résultat placé hors limites acceptables, – 2s
ils ne sont pas représentatifs de l’ensemble des résultats ; ils corres-
C
pondent probablement à une erreur fortuite, dont l’origine est difficile – 3s
à cerner, mauvaise conservation du sérum, vaisselle contaminée,
mauvais réglage de l’appareil de mesure ;
— dans la zone 3, il s’agit d’une erreur d’exactitude (inexactitude),
quantifiable par la différence entre la moyenne de ces valeurs et la
– 3s – 2s 2s 3s Sérum II
valeur cible ; l’origine est peut être le choix de l’étalon, une erreur de X II
fenêtre spectrale ou de température ;
— dans la zone 4, il s’agit d’une dérive, non quantifiable ; elle peut Figure 29 – Diagramme de Youden
être due au vieillissement qui dénature les réactifs ;
— dans la zone 5, il y a dispersion, donc imprécision des résul-
tats, quantifiable globalement à partir du coefficient de variation 3.5.5 Précision
(CV %) ; elle est due à l’instabilité des réactifs, à la variation de tem-
pérature ou à la contamination entre échantillons.
Elle est définie comme la qualité de l’accord, dans une zone
Dans la pratique, avec trois contrôles, on admet généralement : définie de concentration, entre des mesures répétées, effectuées
— trois contrôles sur trois dans la zone 1, le dosage est à sur- dans des conditions déterminées.
veiller ;
— deux sur trois dans la zone 2, il est à contrôler ;
On l’exprime habituellement par l’écart-type (S) ou le coefficient
— un sur trois dans la zone 3, il est à contrôler. de variation (CV %) (écart-type divisé par la moyenne) de la distribu-
Pour déceler une dérive plus ou moins lente de la technique (ou tion des valeurs expérimentales de concentration obtenues lors de
éventuellement des appareils de mesure), on peut aussi calculer un la répétition des mesures sur le même échantillon.
cusum (cumulative sum) : Dans la pratique, pour déterminer la précision d’une technique de
dosage, on réalise sur un même échantillon et dans les mêmes
ci – c conditions opératoires plusieurs mesures ; après avoir vérifié que la
CS = ∑ -------------
si
- distribution des résultats est normale (courbe de Gauss), on déter-
i mine la moyenne C et l’écart-type S (ou le CV %) : la mesure sera
d’autant plus précise que l’écart-type (ou le CV %) est plus faible.
En valeur algébrique ; s’il n’y a aucune dérive, CS = 0 ; ce qui tra- La précision dépend :
duit une fluctuation régulière des ci autour de la moyenne. — de l’erreur aléatoire (représentée par l’écart-type) faite sur la
Des valeurs de CS positives ou négatives indiquent une dérive de mesure du signal ;
la méthode ; par exemple, si CS > 2, la technique doit être impérati- — de la pente de la courbe de calibration ;
vement contrôlée. — de la concentration à mesurer ;
— des conditions de répétitions des mesures.
■ Diagramme de Youden D’après la définition de la précision, ce contrôle doit être effectué
Deux sérums de contrôle, I et II, pour lesquels les moyennes de à plusieurs niveaux de concentrations : faible, moyen et élevé. La
plusieurs mesures, X I et X II constituent les valeurs cibles, peuvent précision sera d’autant meilleure que les erreurs aléatoires sont fai-
être introduits dans chaque série de dosage ; ces valeurs ainsi que bles (imprécision). Cela revient donc à évaluer la précision à partir :
celles des écart-types, SI et SII, sont portées sur deux axes de coor- — soit de la répétabilité ;
données rectangulaires (figure 29). — soit de la reproductibilité intralaboratoire ;
Le point A, de coordonnées X I et X II correspond à un dosage — soit de la reproductibilité interlaboratoire.
idéal (exact). Les valeurs trouvées pour ces deux sérums dans les Soient deux techniques de dosages (A) et (B) d’une même subs-
différentes séries sont aussi portées sur ces axes : si les valeurs tance :
trouvées correspondent aux points A, ou B, à l’intérieur d’un cercle — si C A = C B l’exactitude est la même :
de centre A et de rayon 2s (si SI et SII) ou d’un rectangle de côté SI
et SII , si S I ≠ S II , le dosage peut être considéré comme correct. SA < SB ,
Au point C, sur la première bissectrice des deux axes, le dosage
A est plus précise que B ;
est entaché d’une erreur systématique ; le segment AC représente la
— si S A = S B la précision est la même :
valeur de cette composante de l’erreur.
Au point D, hors de la première bissectrice et de la zone ± 2s, le CA ≠ CB ,
dosage est entaché d’une erreur accidentelle que la valeur DR per-
met de quantifier. les exactitudes sont différentes.
_______________________________________________________________________________________________________________________ RADIOANALYSE
— d’être un outil qui permet au fabricant d’optimiser les paramè-

Fréquence
tres de concentrations des réactifs, temps d’incubation, titre de

l’antisérum, lavages....
(A )
3.5.5.1 Comparaison RIA/IRMA
Dans leur principe même, les performances analytiques de ces
deux techniques sont différentes (tableau 14).
(0)
(B ) Tableau 14 – Avantages et inconvénients des techniques

SA RIA et IRMA
Technique Avantages Inconvénients
SB
• La constante d’affinité
de l’Ac pour l’antigène
doit être élevée pour
CA = C B C • Peut s’appliquer à tous obtenir une limite de
les antigènes qui possè- détection faible.
a A et B même exactitude : A plus précis que B
RIA dent un seul épitope. • Le nombre de sites
• Procédé de marquage anticorps doit être
par l’iode 125 simple constant pour avoir
sur les résidus tyrosyls. une bonne précision.
• Manque de spécificité
Fréquence
en raison d’un seul

anticorps.
• Utilisent deux sites de
reconnaissance.
• Accroissement de la
(A ) (B ) spécificité.
• Marquage de l’Ac : pas
de risque de modifi-
cation de l’antigénicité
de l’Ag comme dans le
SA SB cas des techniques RIA.
• Meilleure limite de • Nécessité de deux sites
détection que épitopiques : difficulté
les méthodes RIA : il est de doser des petites
IRMA molécules.
plus facile de mesurer
C une augmentation de • Effet « crochet »
CA CB (§ 3.5.8).
signal qu’une perte de
signal initialement très
b A et B même précision : A et B exactitudes différentes élevé.
• Meilleure activité
Figure 30 – Comparaison de l’exactitude et de la précision de deux spécifique : meilleure
trousses A et B précision des mesures .
 Sd = --------------
ipm
-
 ipm 
(0)
Tableau 13 – Les différentes expressions de la précision

Expressions de la précision Répétition des mesures 3.5.5.1.1 Conséquences du marquage
Elle est effectuée ■ Conséquences sur la précision
Répétabilité dans la même série de dosages. Dans les techniques RIA, c’est la molécule à doser (antigène ou
Elle est effectuée haptène), qui est marquée par le radionucléide (125I généralement),
Reproductibilité intraessai avec le même lot de réactifs. alors qu’en IRMA c’est l’anticorps ; ce dernier étant une immunoglo-
buline (IgG) peut supporter une plus grande activité spécifique et
Reproductibilité interessai Elle est effectuée avec des lots permet donc d’augmenter la précision de détection du signal.
de réactifs différents.
■ Conséquences sur l’immunoréactivité
C’est pourquoi on est amené à affiner cette notion et à proposer D’un point de vue immunologique, la présence du radionucléide
différentes expressions pour la précision (tableau 13 et figure 30). sur l’Ac ne risque pas de modifier son immunoréactivité vis-à-vis de
l’Ag ; en RIA, le marquage de petites molécules, comme les stéroï-
Les calculs précédents ont l’inconvénient de donner une précision des par exemple, peut entraîner des effets stériques sur cette immu-
ponctuelle sur une concentration donnée. noréactivité (surtout quand le traceur est 125I) ; or, les conditions
Un procédé pour apprécier la précision, très commode et répandu d’une bonne compétition sont que les affinités de Ag et Ag* vis-à-
en immunoanalyse, consiste à établir le profil de précision représen- vis de Ac soient identiques.
tant l’évolution du coefficient de variation en fonction de la concen-
tration. 3.5.6 Spécificité
Cette représentation a l’avantage : Elle est à priori meilleure en IRMA qu’en RIA ; dans les techniques
— de suivre la qualité de la trousse fournie par le fabricant ; RIA, un seul épitope est nécessaire sur la substance à doser, alors
— de permettre d’évaluer la précision dans la gamme de calibra- qu’en IRMA, l’Ag doit posséder au moins deux épitopes, l’un pour
tion et donc d’adapter le choix d’une trousse au but à atteindre (sen- l’Ac de capture, l’autre pour l’Ac de reconnaissance. Dans le premier
sibilité fonctionnelle) ; cas, la présence dans le milieu réactionnel (sérum) de fragments ou
RADIOANALYSE _______________________________________________________________________________________________________________________
de métabolites possédant un épitope pouvant être reconnu par l’Ac (Ac2), mais par d’autres sites (épitopes) que ceux les reliant à l’anti-
du dosage, par suite d’homologie séquentielle, va augmenter la gène à doser ; il va donc se former un complexe Ac1-Ac-Ac2, qui aug-
fixation non spécifique, diminuer le signal (ipm) détecté et donc mente le signal détecté et entraîne une erreur de dosage par excès.
entraîner des erreurs par excès. Au contraire, dans le cas des techni- Dans les techniques RIA, il peut aussi se produire des interféren-
ques IRMA, la nécessité de posséder un second épitope pour l’Ag à ces conduisant à des sous- ou surestimations de l’analyte en fonc-
doser diminue les risques de confusion (TSH, FSH, LH, HCG). tion du mode de séparation mis en place (figure 33 et tableau 15).
Mais cette obligation rend les techniques IRMA inaptes à doser
les petites molécules « haptènes ». ■ Effet crochet
L’effet crochet « hook effect ou effet cloche » apparaît dans les
méthodes « sandwich » lorsqu’un excès massif d’antigène (10 à
3.5.7 Limite de détection 10 000 fois le dernier point de gamme) dépasse les capacités de
liaison de l’anticorps fixé au support solide. Dans ces conditions,
Les techniques IRMA ont une limite de détection à priori plus l’anticorps de capture Ac1 n’est plus en excès par rapport à Ag à doser
basse que les techniques RIA. En effet, en IRMA, le signal détecté ne (figure 34a), ce dernier se fixe uniquement sur l’anticorps de recon-
peut provenir que de la formation du complexe Ac*-Ag (ou Ac1-Ag- naissance Ac2 (figure 34b), l’empêchant de former le « sandwich »
Ac*2 ) ; on mesure une augmentation du signal par rapport à un avec le complexe Ac1-Ag, le signal détecté, qui correspond à Ac1-Ag-
signal initial (bruit de fond) nul ou très faible. Ac2 diminue, entraînant une erreur par défaut : une sous-estimation
(figure 34).
En RIA, le signal provient des Ag* liés à Ac et non déplacés par les
Ag à doser ; on mesure donc une diminution d’un signal initial très Une addition séquentielle des réactifs, séparée par une étape de
élevé (Ag*-Ac avant compétition) ; une faible augmentation des Ag lavage soigneux permet d’éliminer ce phénomène. On obtient alors,
à doser ne peut provoquer qu’une faible diminution du bruit de pour les valeurs élevées d’antigène, un plateau correspondant à la
fond. saturation des sites de l’anticorps liant.
Il est recommandé de procéder en deux étapes, séparées par un
lavage soigné.
3.5.8 Risques d’interférences en IRMA et RIA Il est aussi possible de diluer le sérum du patient quand un précé-
dent dosage a indiqué une valeur élevée en Ag ou bien si le test de
Dans les techniques IRMA, il peut aussi se produire des interfé- recouvrement est inférieur à 100 %.
rences :
— soit avec d’autres substances du milieu ;
— soit avec des autoanticorps [32].
Dans le sérum du patient, il peut y avoir certaines molécules pos-
sédant l’un des épitopes de l’antigène à doser et qui peut réagir :
— soit avec l’anticorps de capture (figure 31a) ; Molécules
— soit avec l’anticorps de reconnaissance (figure 31b). Molécules interférentes
Dans les deux cas, après lavage, le signal détecté diminue, entraî- interférentes
ELSA
ELSA
nant une erreur par défaut.
De même, il peut y avoir dans le sérum des autoanticorps (auto
Ac) dirigés contre l’antigène à doser et qui vont bloquer :
— soit l’épitope correspondant à l’anticorps de détection (figure
32a) ;
— soit celui qui correspond à l’anticorps de capture (figure 32b). a réaction avec l'anticorps b réaction avec l'anticorps
de capture de reconnaissance
Dans les deux cas, le signal détecté diminue, entraînant une
erreur de dosage par défaut.
Après une immunoscintigraphie par exemple, le sérum du patient
peut contenir des anticorps antisouris (Acs) (figure 32c), se liant à la Figure 31 – Différents mécanismes d’interférence dans la méthode
fois à l’anticorps de capture (Ac1) et à l’anticorps de reconnaissance IRMA
Ac1 Ac2
ELSA
ELSA
ELSA
Auto-Ac Anticorps
antisouris (Acs)
a anticorps de détection b anticorps de capture c exemple

Figure 32 – Mécanismes d’interférence avec
des autoanticorps lors d’un dosage IRMA
_______________________________________________________________________________________________________________________ RADIOANALYSE
Ag + Ag* + +
Ac Auto-Ac-anti Ag
[1] [2] [3] [4]

Ag + Ag* + Ag + Ag*
Système de séparation spécifique : Système de séparation

immunoprécipitation par non spécifique : PEG
Ac de lapin anti-murin
Ag Comptage Ag
Comptage de
de [1] + [2]
Ag* Ag* [1] + [2] + [3] + [4]
Ag
Pendant la séparation Perte de
ipm
[3] + [4]
Ag*
Surestimation de Ag ipm Sous-estimation de Ag

Figure 33 – Mécanismes d’interférence des
autoanticorps lors d’un dosage RIA
(0)
Tableau 15 – Résumé des risques d’interférence
en IRMA et RIA
RIA IRMA
Système de séparation spécifique : Système de séparation non spécifique : PEG® Système « sandwich »
immunoprécipitation
Surestimation de la Tg Sous-estimation de la Tg Sous-estimation de la Tg
Tg : thyroglobuline
4. Détection du signal
radioactif
La détection doit être adaptée au type de rayonnement émis par
le traceur, on distingue :
— les rayonnements électromagnétiques (γ, X) : iode 125, cobalt 57 ;
ELSA
— les rayonnements particulaires β– mou (du tritium, carbone 14)

ELSA
et β– dur (phosphore 32, soufre 35).

Pour détecter et quantifier les rayonnements électromagnétiques
(γ, X) ou particulaire β– d’énergie élevée, on utilise une sonde consti-
(b) tuée d’un scintillateur solide et d’une cellule photosensible, l’ensem-
(a)
ble constitue le photomultiplicateur. Dans le cas d’un rayonnement
particulaire de très faible énergie (exemple : tritium, carbone 14), le
scintillateur est liquide pour qu’il soit au contact avec la source
Signal radioactive.
Zone d'étalonnage
4.1 Scintillation solide
4.1.1 Principe
Ag Certaines substances minérales ou organiques ont la propriété de
transformer une partie de l’énergie qui leur est cédée par une parti-
cule (rayonnement β) ou un photon (rayonnement X ou γ) qui les tra-
verse, en énergie lumineuse (phénomène de luminescence) sous
forme d’un photon (scintillation) dont le spectre est localisé dans
l’ultraviolet ou le visible. En effet, l’énergie cédée par la particule ou
Figure 34 – Mécanisme de l’effet crochet le photon dans le scintillateur soit par effet photoélectrique, soit par
RADIOANALYSE _______________________________________________________________________________________________________________________
effet Compton, soit par création de paires excite les atomes du cris-
tal qui reviennent à leur état fondamental en émettant des photons
Hauteur d'impulsion
de scintillation.
a2
Les scintillateurs utilisés ne sont pas aptes à détecter avec la
même efficacité tel ou tel type de particule ou de photon (tableaux
16 et 17).
E2
E1
Parmi les scintillateurs organiques, on peut citer l’anthracène et le
naphtalène.
a3
E3
a1
4.1.2 Propriétés d’un bon scintillateur
Un bon scintillateur doit : (1) (2) (3)

Énergie du photon
— être transparent aux photons visibles ou ultraviolets ;
— posséder un numéro atomique Z élevé pour accroître la proba- Figure 35 – Impulsions
bilité d’interaction par effet photoélectrique (la totalité de l’énergie
est déposée dans le détecteur) ;
— avoir un coefficient d’atténuation linéaire élevé qui, couplé à 4.1.3 Photomultiplicateur
une photo-fraction élevée (probabilité que la première interaction
dans le cristal soit un effet photoélectrique), permet une bonne effi- C’est un tube à vide comportant plusieurs électrodes. La photo-
cacité et influe sur le volume de matériau nécessaire ; cathode, analogue à une cellule photoélectrique, émet des électrons
lorsqu’elle est frappée par les photons issus du scintillateur (effet
— avoir un rendement de scintillation élevé (nombre de photons photoélectrique). Le nombre d’électrons émis est proportionnel au
lumineux émis par photon ou particule incidente) ; nombre de photons lumineux constituant la scintillation. Cette
— avoir une durée d’émission qui doit être la plus courte possible impulsion électrique est amplifiée par les différentes dynodes (por-
(l’émission d’un grand nombre de photons lumineux par unité de tées à des différences de potentiels croissants) pouvant ainsi pro-
temps) : la forme de cette émission est celle d’une exponentielle duire un gain de 108 à 109.
décroissante et sa constante de temps est généralement comprise Par conséquent, l’amplitude de l’impulsion sera proportionnelle à
entre 10–6 et 10–9 s. (0) l’énergie du photon ou de la particule déposée dans le scintillateur
(figure 35).
Tableau 16 – Scintillateurs utilisés selon la nature L’ensemble scintillateur-photomultiplicateur est appelé sonde à
du rayonnement scintillation (figure 36).
Grâce au couplage de cette sonde avec des sélecteurs d’ampli-
Scintillateurs Scintillateurs tude qui permettent de comptabiliser les impulsions ayant même
Détection
solides minéraux solides organiques grandeur, on trace un profil de courbe représentant le nombre
Rayonnements d’impulsions par unité de temps en fonction de l’énergie (amplitude
électromagnétiques : +++ + de l’impulsion). Cette courbe constitue le spectre énergétique du
gamma, X radioélément, le pic le plus intense correspond au pic photoélectri-
Rayonnements que et est caractéristique du radioélément.
particulaires : + +++ Par conséquent, l’on peut avec un tel appareillage identifier un
bêta, alpha, protons radioélément à partir de l’énergie de son pic photoélectrique. (0)
Tableau 17 – Récapitulatif des scintillateurs minéraux utilisés pour la détection des rayonnements gamma
Masse volumique Atténuation linéaire Photofraction Constante
Rendement lumineux
Scintillateur de décroissance
(relatif)
(g/cm3) (cm–1) (%) (ns)
NaI 3,7 0,34 18 230 100

BGO (1) 7,1 0,95 42 300 22
CsF 4,6 0,43 20 2,5 6
BaF2 4,9 0,45 19 0,8 à 630 5 à 21
GSO (1) 6,7 0,70 26 60 20
LSO (1) 7,4 0,86 33 40 75
YSO (1) 4,5 0,39 70 118
(1) BGO : germanate de bismuth
GSO : oxyorthosilicate de germanium
LSO : oxyorthosilicate de lutétium
YSO : oxyorthosilicate d’yttrium
_______________________________________________________________________________________________________________________ RADIOANALYSE
ipm 1
Radiation
2
3
Réflecteur de Scintillateur
lumière cristal de NaI
4
Photocathode
V1
Dynodes E
V2
V3 Influence du quenching sur le spectre pour des

échantillons de plus en plus quenchés de 1 vers 4
V4 Figure 37 – Variation du nombre d’impulsions électriques en

fonction de l’énergie du rayonnement
V5
4.2.2 Quenching
V6
Ce terme désigne un phénomène d’affaiblissement de la scintilla-
V7
tion provoqué par l’introduction de diverses substances (eau, sol-
vants organiques, protéines, etc.) dans le milieu de mesure. Cet
Anode V8
affaiblissement s’accompagne d’un déplacement du spectre éner-
(collecteur)
gétique vers les faibles amplitudes et une diminution de l’aire sous
la courbe spectrale (figure 37).
Lorsque l’échantillon radioactif est introduit dans le liquide scin-
C tillant des composés divers : eau, substances organiques, colorants
R
peuvent être apportés.
Signal Suivant l’étape au niveau de laquelle interagit le composé, on
+ définit deux types de quenching :
Très haute tension — le quenching chimique, il est dû aux composés qui agissent
sur les transferts d’énergie entre solvant et S1 et S2, ils captent de
l’énergie et la restituent non pas sous forme de fluorescence, mais
Figure 36 – Cellule photomultiplicatrice sous forme de chaleur (conversion interne) ;
— le quenching couleur, il est produit par des colorants qui
absorbent dans la région du bleu-violet et qui constituent une sorte
4.2 Scintillation liquide de filtre absorbant pour les photons, entre leur point d’émission et
le bord intérieur des fioles.
Lorsque l’on doit comparer entre elles des activités d’échantillons
4.2.1 Principe quenchés, deux cas peuvent se présenter :
— le taux de quenching est identique dans tous les échantillons.
C’est parce que les β– ont un très faible parcours dans la matière L’efficacité de comptage est la même pour tous les échantillons. Il
que leur détection se fait après avoir introduit la source radioactive est alors possible de comparer les activités relatives (ipm) des
à l’intérieur même du détecteur ; celui-ci se présente sous forme échantillons entre eux ;
d’un liquide qui possède des propriétés de fluorescence. Ces liqui- — le taux de quenching est variable d’un échantillon à l’autre.
des sont essentiellement des composés organiques aromatiques de Pour chaque échantillon l’efficacité est différente. Après avoir
la famille du benzène. mesuré les ipm (impulsions/min), il faut alors, pour chaque échan-
La longueur d’onde de leur fluorescence est située dans l’ultra- tillon, déterminer son efficacité de comptage (E) et calculer son acti-
violet à 270 mn. On sait que les photons de 270 nm ne peuvent pas vité réelle (dpm (désintégration/min)) :
traverser le verre ou la matière plastique dont sont constituées les ipm
fioles dans lesquelles sont placés l’échantillon radioactif et le scin- dpm = -----------
E
tillateur.
Cela oblige à utiliser un solvant (xylène, etc.) dans lequel sont dis- Ces opérations constituent ce que l’on appelle des corrections de
sous d’autres composés fluorescents, que l’on appelle solutés. Leur quenching.
rôle est de déplacer la bande de fluorescence du solvant (270 nm)
jusque dans la partie visible du spectre, à environ 450 mn.
4.2.3 Méthodes de correction de quenching
L’échantillon liquide, dont il faut mesurer la radioactivité, est dis-
sous dans un solvant organique (toluène, dioxane, xylène, cumène
4.2.3.1 Correction de quenching par standard interne
ou pseudocumène) contenant les agents de scintillation [PPO (2,5 –
diphényloxazole) et diméthyl-POPOP (1,4 – bis – 2 – (– 4 – méthyl – 5 Après mesure de l’activité A (ipm) d’un échantillon, il est ajouté
– phényloxazolyl) – benzène) par exemple]. Il faut attendre plusieurs dans celui-ci une quantité connue N (dpm) du même radionucléide
heures avant d’effectuer la mesure, car une scintillation apparaît sous la même forme physico-chimique. L’ajout de N (dpm) constitue
spontanément en l’absence de toute radioactivité. un standard interne. L’échantillon est mesuré à nouveau, son
RADIOANALYSE _______________________________________________________________________________________________________________________
activité est alors A’ (ipm). On a A’ (ipm) > A (ipm), la différence A’ 4.2.3.2 Correction de quenching
(ipm) – A (ipm) est due à la quantité N (dpm) ajoutée dans l’échan- par standardisation externe
tillon. L’efficacité de comptage E du standard interne est :
La méthode de correction est basée sur la mesure d’activité d’une
A′ ( ipm ) – A ( ipm ) source émettrice gamma qui est placée à l’extérieur de la fiole, d’où
E = -------------------------------------------------
N ( dpm ) le terme de standardisation externe.
L’efficacité de comptage de l’échantillon est la même que celle du La nature de la source externe dépend des compteurs, cela peut
standard interne, d’où l’activité réelle de l’échantillon : être du 137Cs, du 133Ba ou du 210Ra, l’activité est comprise entre 185
et 740 kBq. Compte tenu de l’énergie des rayonnements γ et de la
A ( ipm ) composition chimique du liquide scintillant (principalement C et H)
A échantillon ( dpm ) = -------------------- l’interaction des gamma se fait par effet Compton et le spectre en
E
énergie des électrons Compton produit est voisin de celui des bêta
■ Analyse du spectre de l’échantillon négatifs du 14C.
Plus le quenching est important, plus grand sera le déplacement Les spectres d’amplitude des impulsions de la source gamma
vers les faibles amplitudes, l’efficacité de comptage diminuant pro- subiront les mêmes modifications que ceux des radio-isotopes
portionnellement. Ainsi, la position du spectre le long de l’échelle contenus dans la fiole. Il y aura :
des abscisses renseigne sur l’importance du quenching, donc sur la — déplacement du spectre vers les faibles amplitudes ;
valeur de l’efficacité. Si l’on peut établir une relation du type : — diminution de la surface sous la courbe (baisse de comptage).
efficacité = f (position du spectre) L’évaluation du déplacement du spectre se fait par analyse du
spectre f.
on dispose alors d’un moyen pour déterminer l’efficacité de comp-
tage de l’échantillon, puis de son activité réelle (dpm). Après avoir déterminé le « paramètre source externe » qui est
fonction du quenching, il faut relier celui-ci à l’efficacité de comp-
L’analyse du spectre de l’échantillon fournit un paramètre numé- tage du radio-isotope à mesurer.
rique fonction de la forme et de la position du spectre (f de spectre)
variable selon le constructeur du détecteur. La relation s’établit au moyen d’une série de 8 à 10 échantillons
standards quenchés, dont il est déterminé les efficacités E et les
Des déterminations faites sur des étalons à quenching variable valeurs de standardisation externe. À partir de ces valeurs, la courbe
permettent d’obtenir une série de valeurs et donc d’établir une de correction de quenching est établie et mise en mémoire dans le
courbe de correction de quenching (figure 38) qui relie l’efficacité E compteur sous forme de polynôme du troisième degré ou de spline.
au paramètre f du spectre.
Pour les échantillons inconnus, leur efficacité est calculée à partir
L’efficacité de comptage E d’un échantillon inconnu est détermi- de leur paramètre de quenching et la fonction mathématique. Ce
née en reportant sur la courbe de correction de quenching la valeur calcul ne doit impérativement être fait que si le paramètre de quen-
f. La radioactivité réelle (dpm) est calculée en divisant l’activité rela- ching est compris entre les deux limites extrêmes de la courbe,
tive (ipm) par l’efficacité E. c’est-à-dire entre le premier et le dernier standard quenché.
Cette méthode de correction de quenching est simple à met-

tre en œuvre, elle est presque entièrement automatisable, mais 4.2.4 Problèmes de solubilité des échantillons
elle est imprécise dans le cas des mesures d’échantillons de fai- radioactifs dans le scintillateur
ble activité.
Les échantillons radioactifs à mesurer peuvent se présenter sous

des formes très diverses.
■ Composés hydrophobes
Efficacité
1 Ces composés sont solubilisés dans un solvant organique si pos-
sible aromatique, sinon dans tout autre solvant qui ne produit pas
de quenching.
■ Composés hydrosolubles et solutions aqueuses
Trois moyens permettent l’introduction de ces échantillons dans
0,9
les liquides scintillants :
— les mélanges ternaires : pour 0,2 mL d’échantillon ajouter
2,5 mL d’éthanol absolu, puis 10 à 12 mL de mélange scintillant du
type xylène-PPO-dMPOPOP. Ce mélange est le moins onéreux, mais
on ne peut y introduire au maximum que 3 % de solution aqueuse ;
— les mélanges à base d’émulsifiant : il s’agit de mélange de
0,8 scintillateur et d’un surfactant ionique ou non ; dans ces mélanges,
0,2 70 120 f (spectre) il peut être introduit jusqu’à 50 % de solution aqueuse ;
— le mélange scintillant à base de dioxane-naphtène : ces mélan-
ges étaient utilisés autrefois comme accepteur d’eau (30 %), mais
leur toxicité vis-à-vis des personnes qui les manipulent fait qu’ils
Figure 38 – Courbe de correction de quenching, qui relie l’efficacité doivent être maintenant remplacés dans la plupart des cas par les
de comptage au paramètre de position du spectre mélanges émulsifiants.

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Applications : dosage biologique

1. Présentation générale............................................................................. P 3 361 – 2

es radio-isotopes ont révolutionné la biologie médicale. La radio-immunolo-

1. Présentation générale — soit la substance radiomarquée S* est identique à celle à doser S ;

Soit à doser une substance S (une hormone H, par exemple), dans

1.2.2 Dosage par dilution isotopique

D’après (3) et (5) :

Pour déterminer m x , m*0 et m* e sont connues ; l’extraction n’a

r e et r 0 se mesurent (le rapport r e / r 0 mesure le rendement

Cette réaction, qui obéit à la loi d’action de masse, est réversible

avec Ka constante d’affinité à l’équilibre (mol–1.L),

La concentration en antigène libre est donnée par :

Activité mesurée d’où :

Tableau 2 – Calcul préliminaire à réaliser pour tracer la représentation de Scatchard

E0 [Ag]t B*0 B*0 – LNS B0 B0

E1 E1 + [Ag]t B*1 B*1 – LNS B1 B1

E2 E2 + [Ag]t B*2 B*2 – LNS B2 B2

E3 E3 + [Ag]t B*3 B*3 – LNS B3 B3

E4 E4 + [Ag]t B*4 B*4 – LNS B4 B4

E aj concentration de l’antigène apportée par les étalons ou les échantillons

En traçant la représentation de Scatchard, il est possible de déter-

3. Dosages Molécule «froide»

Molécule marquée liée

D’après leur principe, pour réaliser un bon dosage RIA (compéti- K* = K

Le phénomène d’adsorption dépend de nombreux paramètres,

Ces deux techniques de précipitation peuvent conduire à des

3.2 Courbe d’étalonnage et traitement

Le lecteur pourra se reporter à la références [23]. B*

Ainsi toutes les courbes d’étalonnage partent de 100 %. B /B0 (%)

Il existe de multiples façons de tracer la courbe réponse-concen-

■ Méthodes les plus utilisées actuellement

Les étapes de dilution du sérum au-delà de certaines limites peu-

Le dosage de la thyroxine libre, hormone thyroïdienne active,

3.3.3.1 Séparation chromatographique

Tableau 3 – Protocole de séparation par chromatographie d’exclusion de la thyroxine libre

Élimination des fractions Tampon LH-20 (dilué) 2 mL 2 mL 2 mL

Tableau 4 – Protocole de dosage de la thyroxine libre

— une deuxième incubation, en présence d’un anticorps marqué,

Ac* Ag Immuno - F * = Ac* B * = Ac*-Ag 3.4.3 Exemple :

Figure 13 – Séparation des fractions libres et liées à l’aide

La TSH joue un rôle essentiel dans le maintien des taux normaux

Le protocole de dosage de la thyrotropine est donné dans le

* La valeur de B5/T doit se situer entre 25 et 40 %.

3.4.2.2 Méthode ELSA (Element Linked Solid Assay)

Tableau 5 – Protocole de dosage de la thyrotropine

4 Incuber 1 h à 170-250 tr/min à température

Aspirer ou décanter Aspirer ou décanter complètement

Pour ce faire, il dispose :

t ( α, ν ) variable de Student pour un risque α

Blanc Échantillon Blanc Échantillon

Les termes S B , t ( α, ν ) , n B et n y dépendent étroitement des

avec SB écart-type des signaux (ipm) fournis en Ly

Tableau 6 – Exemple de présentation des données

Reproductibilité interessai interlot ........

Sensibilité fonctionnelle Concentration C

Si l’on distribue le nombre de patients malades ou non en fonc-

Tableau 7 – Paramètres permettant de déterminer la spécificité et la sensibilité

Indices Définitions Valeur théorique Interprétation

Pour déterminer m x , m0 et m e sont connues ; l’extraction n’a

E0 [Ag]t B0 B0 – LNS B0 B0

E1 E1 + [Ag]t B1 B1 – LNS B1 B1

E2 E2 + [Ag]t B2 B2 – LNS B2 B2

E3 E3 + [Ag]t B3 B3 – LNS B3 B3

E4 E4 + [Ag]t B4 B4 – LNS B4 B4