Botechnologies Végétales 1

Master 2 UAMO Biotech veg
Les biotechnologies végétales
Introduction
Les Biotechnologies végétales sont des technologies qui recouvrent toutes les
interventions en laboratoire sur les organes, les tissus, les cellules ou l’ADN des végétaux,
soit pour mieux maîtriser ou accélérer leur production, soit pour améliorer leurs
caractéristiques, au service de la recherche, de l’agriculture ou de productions industrielles.
Elles permettent notamment :
- la reproduction à l’identique par multiplication végétative à partir de fragments de tissus,
- l’accélération des générations grâce à la culture d’embryons immatures,
- le sauvetage d’embryons interspécifiques produits lors de croisements entre espèces
distantes,
- la modification du nombre et de l’organisation des chromosomes (ploïdie),
- la recombinaison entre génomes d’espèces différentes par croisement ou fusion de
protoplastes (cellules auxquelles on a retiréleurs parois)
- l’augmentation de la variabilité génétique en intervenant sur les organites du cytoplasme des
cellules (mitochondries et chloroplastes),
- la modification de l’information génétique au niveau de l’ADN par mutagénèse ou
transgénèse,
- la sélection génétique assistée par marqueurs grâce aux progrès de la génomique.
Les biotechnologies permettent d’augmenter la diversitégénétique naturelle.
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1. Les biotechnologies pour accélérer ou maîtriser la production de plantes

1.1 La reproduction àl'identique par multiplication végétative
La reproduction à l'identique par multiplication végétative permet de reproduire

immédiatement un génotype sélectionné. Chez les espèces oùcette technique est possible, elle
simplifie beaucoup les méthodes de sélection et augmente leur efficacitéainsi que la rapidité
de réponse du sélectionneur à la demande de l’utilisateur (agriculteur, consommateur,
industriel). La maîtrise de la micropropagation, par régénération d’une plante à partir de
fragments de tissus, a permis d'augmenter le rendement de la multiplication végétative.
De plus, elle permet de produire des plants de grande qualitésanitaire (par élimination
des virus souvent présents chez les plantes traditionnellement multipliées par voie végétative).
La Micropropagation est largement utilisée chez certaines espèces (exemple le fraisier).
- Naturelle
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Certains végétaux se multiplient naturellement sans passer par la reproduction sexuée.

Un nouvel individu se forme à partir d'un organe de la plante "mère" :
- La multiplication par stolons. Dans le cas du fraisier, il y a formation de tiges aériennes

rampantes. De place en place, se forment des bourgeons et des racines qui sont le point de
départ de nouveaux pieds.
- La multiplication par tubercules. Pour la pomme de terre, des tiges souterraines

renflées par les réserves permettent d'obtenir une nouvelle plante par développement de
bourgeons (les yeux, donnant des germes).
- La multiplication par rhizomes. Ce sont des tiges souterraines pouvant s'enraciner et donner
une nouvelle plante
- La multiplication par bulbilles, chez l'ail. Les bulbes secondaires, formés sur le côté du
bulbe, sont capables de s'en détacher, puis de s'enraciner pour se développer en une nouvelle
plante.
On appelle clones tous les individus nés d'un même organisme et possédant le même
patrimoine héréditaire. Un tubercule, un stolon, un rhizome, un bulbille sont donc àl'origine
d'un clone.
- In vitro
C'est une méthode pour cultiver des plantes ou des cellules sur des milieux nutritifs
artificiels. A l'origine, la méthode était destinée àrégénérer certaines plantes infectées par des
virus. Maintenant, elle est également utilisée pour multiplier des plantes en grand nombre.
Chez la pomme de terre, par exemple, on peut repiquer des fragments de germe comportant
un nœud muni d'une petite feuille et d'un bourgeon. La plante issue de la bouture peut être
fragmentée àson tour et conduit àd'autres boutures. Un seul bourgeon permet de produire en
moins d'un an 2 millions de plantes, toutes identiques àla plante mère.
1.2 L’accélération des générations
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Pour accélérer les générations, la culture d'embryons immatures est un moyen, utilisé
dans l'amélioration de certaines plantes, comme chez le tournesol et le maïs, pour raccourcir
la durée d’une génération. Ainsi chez ces espèces, trois générations par an deviennent
possibles. Cela permet donc de raccourcir la durée de la création d’une variété.
La technique de culture d'embryons immatures permet d'éviter la phase de maturation

de la graine. En effet, par cette technique, les embryons sont prélevés quelques jours après la
fécondation et non à maturité de la graine et cela permet ainsi de réaliser
plusieurs générations par an. Selon les espèces, les embryons sont prélevés plus ou moins tôt
après la fécondation. En effet, un très jeune embryon risque d'avoir une croissance perturbée
et plus lente, contrairement
à un embryon plus développé qui est par ailleurs plus facile à prélever. Les embryons sont
ensuite mis en culture pour régénérer une plante entière.
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La culture in vitro d'embryons permet de réduire fortement la dormance des graines

fraîchement récoltées, et ainsi d'assurer un développement homogène des embryons.
Cette technique permet donc un gain de temps, par réduction de la durée entre deux
générations. On peut cultiver plusieurs générations par an et accélérer les procédures
classiques de sélection : la fixation et la conversion de lignées, car plusieurs cycles
d'autofécondations ou de rétrocroisements successifs peuvent être réalisés chaque année.
Cette technique est très utilisée chez le tournesol et dans une moindre mesure chez le maïs.
a- Application au tournesol
La technique de culture d'embryons immatures est très pratiquée chez le tournesol où
les phénomènes de dormance des graines sont particulièrement forts. Elle est particulièrement
facile à mettre en œuvre, et permet d'obtenir 4 à 5 générations successives par an, au lieu
d'une seule en culture normale, car le cycle végétatif est ramenéà80 jours. Elle est utilisée
pour réaliser la fixation de lignées, la reconversion de lignées mâles fertiles en mâles stériles,
ou l'introduction de gènes de résistance.
Les jeunes graines sont prélevées 8 à15 jours après la fécondation, selon le génotype. Elles
sont désinfectées et disséquées.
Les embryons ainsi isolés sont mis en culture en boîte de pétri. Au bout de 3 à5 jours, on
observe la formation de cotylédons chlorophylliens. Ils sont alors transférés en milieu
d'enracinement, jusqu'à l'apparition d'un système racinaire assez développé. Les plantules
ainsi obtenues sont alors mises en acclimatation puis repiquées sur terreau.
Une technique simplifiée de sauvetage d'embryons de tournesol a également étémise au point.

Toutes les étapes de l'extraction des graines du capitule jusqu'au repiquage sur terreau sont
réalisées en conditions non stériles.
Dans ce cas, les embryons immatures sont placés directement sur papier filtre imbibéd'une
solution nutritive, jusqu'au développement des cotylédons.
1.3 Le sauvetage d’embryon interspécifique
Les croisements entre espèces distantes (voir ci-dessous) sont souvent stériles, bien
qu’il puisse y avoir formation d’un embryon, car celui-ci avorte très tôt ; dans ce cas, la
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culture in vitro d’embryons, récupérés peu de temps après la fécondation, permet d’éviter leur
avortement.
Lors de croisements interspécifiques, des barrières naturelles empêchent le

développement complet de l'embryon. Pour remédier à cette situation, on pratique après
fécondation un prélèvement précoce des embryons pour les mettre en culture sur un milieu
artificiel nutritif. Cette technique de culture in vitro est appelée sauvetage d'embryons
interspécifiques.
a tomate cultivée, Lycopersicon esculentum, du fait de son autogamie, possède une

variabilité génétique faible. En revanche, les tomates sauvages possèdent de
nombreux gènes de résistance aux maladies notamment l'espèce Lycoparium peruvianum. Les
barrières d'incompatibilité avec les espèces sauvages génétiquement les plus éloignées de la
tomate cultivée ne peuvent être contournées que grâce au sauvetage d'embryons.
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L'embryon est prélevé avant la phase de maturation de la graine.

Il est ensuite transplanté et cultivé sur un milieu artificiel riche en sucre, permettant la
régénération d'une plante nouvelle.
L'hybride obtenu est souvent croisépar le parent de l'espèce cultivée (rétrocroisement) et sa

descendance est sélectionnée, pour fixer des caractères nouveaux et intéressants, tout en
éliminant les caractères indésirables issus de l'espèce sauvage.
- Autres exemples d'application

- La courgette est une espèce fortement attaquée par l'oïdium, les virus de la mosaïque
du concombre et de la mosaïque de la pastèque.
Les variétés cultivées, Cucurbita pepo, sont insuffisamment résistantes à ces parasites. Des
croisements avec des espèces sauvages américaines résistantes, Cucurbita okeechobeensis et
Cucurbita ecuadorensis, ont étéréalisés grâce au sauvetage des embryons immatures, rendant
ainsi possible l'amélioration de la résistance aux maladies des variétés cultivées.
- La laitue, Lactuca sativa, est une espèce sensible au brémia. Le croisement avec deux
espèces sauvages, Lactuca virosa et Lactuca saligna, possédant des gènesde résistance
intéressants est difficile à réaliser. Le sauvetage d'embryons interspécifiques a permis
d'augmenter considérablement la réussite de ces croisements.
- La technique du sauvetage d'embryons

L'avortement d'embryons issus de croisements interspécifiques est attribué à un
développement retardé de l'albumen, par incompatibilité entre les tissus embryonnaires et
maternels.
La récupération de l'embryon doit être effectuée avant son avortement, entre 4 et 16 jours
après la fécondation, selon les espèces. Il est souvent nécessaire de réaliser ce prélèvement
sous une loupe binoculaire. C'est pourquoi on cherche àretarder cette opération pour disposer
de matériel végétal plus facilement manipulable.
Les graines immatures sont désinfectées en surface et après dissection, les embryons sont
transférés sur un milieu de culture solide approprié. Après deux semaines, les embryons ont
généralement atteint le stade cotylédonaire.
Le transfert sur un milieu riche en hormones de croissance permet la production de plantes.
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2. Les biotechnologies pour modifier les caractéristiques des plantes

2.1 La modification des niveaux de ploïdie*
2.1.1 Le doublement du nombre chromosomique
Un grand nombre d’espèces végétales sont polyploïdes, c’est-à- dire qu’elles

possèdent un nombre de chromosomes qui est un multiple supérieur à deux du nombre
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haploïde de base. C’est le cas par exemple de la pomme de terre, du poireau, de la luzerne, de
la canne àsucre. La découverte de la colchicine en 1936 a ouvert la voie au doublement du
nombre chromosomique d’espèces diploïdes. A la mitose, cette substance empêche en effet la
séparation des chromosomes obtenus par duplication des chromosomes de la cellule mère. Il
en résulte un doublement du nombre chromosomique.
Cette technique est entrée dans la pratique courante de l'amélioration de certaines

graminées fourragères (ray-grass) ou légumineuses fourragères (trèfle violet), de la betterave
(avec la création d'hybrides triploïdes), Elle apporte des caractères nouveaux : grande taille
des organes, amélioration de la digestibilitédes fourrages, pérennité....
La maîtrise du doublement chromosomique permet de restaurer la fertilité d’hybrides

interspécifiques qui sont souvent stériles.
Après hybridation interspécifique, elle permet donc la création d'espèces nouvelles (comme le
Triticale) ou la résynthèse d'espèces allopolyploïdes (c’est-à-dire formées par la juxtaposition
de deux génomes, comme le colza), et qui constitue encore une source de nouvelle variabilité
génétique.
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2.1.2 L'haplodiploïdisation
A partir de la dédifférenciation d’une cellule reproductrice (microspores ou ovules)

elle consiste à induire le développement d’un embryon (haploïde), dont le nombre
chromosomique sera doublé. Elle permet donc le passage direct de l'état hétérozygote* àl'état
homozygote*. Réalisée à partir de microspores, on parle d’androgénèse et à partir d’ovules,
on parle de gynogénèse. Elle peut aussi être obtenue in vivo par croisement interspécifiques
(par exemple les fleurs de blé pollinisées par du pollen de maïs donnent des embryons
haploïdes), ou par des génotypes inducteurs qui entraînent le développement d’embryons
haploïdes (cas du maïs). Il suffit alors de doubler le nombre chromosomique des embryons
haploïdes (soit in vitro, soit in vivo).
C’est une technique qui entraîne un gain de temps dans l'obtention des lignées pures
(100 % homozygotes). Cette technique, quand on peut l’utiliser, bouleverse complètement
l'organisation de la sélection de nouvelles variétés.
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Le processus d'haplodiploïdisation comprend l'obtention de plantes haploïdes à partir

des organes porteurs des cellules reproductrices, appelés gamétophyte mâle ou femelle, et le
retour vers la phase diploïde.
- Production de plantes mères
Le sélectionneur effectue un croisement entre deux lignées parentales présentant des

caractéristiques intéressantes et complémentaires. Ce croisement produira la génération F1.
Ce sont les plantes mères pour l'obtention de la phase haploïde. A ce stade, toutes les plantes
sont identiques. En revanche, sur ces plantes, la méiose à l'origine de la formation des
gamètes permet la ségrégation des caractères, selon
les lois de Mendel et les recombinaisons entre les chromosomes parentaux. Les
individus F2 seront alors tous différents les uns des autres, c'est la disjonction des caractères.
Pour faciliter le travail de sélection, l'haplodiploïdisation va permettre d'obtenir des
plantes homozygotes.
- Obtention de la phase haploïde
Il s'agit de récupérer les cellules ayant subi la méiose avant la fécondation. C'est làque
commence le travail de laboratoire.
L'obtention des plantes haploïdes peut se faire par culture in vitro de cellules destinées à
fournir les cellules reproductrices ou gamètes.
S'il s'agit de gamètes mâles, on parle d'androgenèse. S'il s'agit de gamètes femelles, c'est
la gynogenèse.
Une autre méthode d'obtention d'haploïdes est l'induction d'haploïdes in situ. On peut obtenir
des haploïdes après croisements entre espèces ou entre genres. Il y a fécondation, mais
les chromosomes incompatibles du parent pollinisateur sont rejetés naturellement.
On peut également provoquer une fécondation anormale àl'aide de pollen dénaturé. Dans ces
trois cas, on observe le développement d'un embryon haploïde. Une phase de sauvetage
d'embryons in vitro est ensuite généralement nécessaire. Mis en culture sur des milieux
particuliers, l'embryon haploïde va se développer, les tissus vont se différencier pour donner
des plantes haploïdes.
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- Retour à l'état fertile diploïde

Pour utiliser en sélection une plante régénérée par l'une de ces voies,
il faut disposer de plantes fertiles et donc diploïdes.
L'état haploïde étant instable, l'individu régénéré est parfois diploïde, on parle de
doublement spontané du stock chromosomique. Pour le blé, on peut compter 20 à
25 % d'haploïdes doublés spontanément,
60 à 65 % chez l'orge. Sinon, on provoque artificiellement un doublement
des chromosomes, le plus couramment par l'action d'un agent chimique, la colchicine.
Les plantes obtenues sont des diploïdes homozygotes : elles possèdent deux copies
identiques de chacun de leurs chromosomes
et donc portent des paires de gènes ou allèles identiques, d'oùleur grand intérêt.
- Sélection des lignées
Le matériel ainsi fixé est livré au sélectionneur. Le sélectionneur va alors trier les
plantes en fonction des critères agronomiques et technologiques recherchés.
La multiplication de ces plantes se fera par autofécondation : tous les descendants seront des
copies identiques de leurs parents.
- Traitement àla colchicine
La colchicine bloque la mitose après la duplication des chromosomes et les cellules

deviennent diploïdes.
Le traitement àla colchicine peut se réaliser au stade plantule par trempage des racines ou
injection dans les méristèmes.
Les taux de doublement sont alors très variables.
Actuellement, se développent des traitements in vitro au stade embryonnaire.
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- Déterminisme du niveau de ploï

die
Une vérification de la ploïdie des plantes régénérées peut être effectuée précocement
par cytométrie de flux. Une substance fluorescente se liant àl'ADN permet la coloration des
cellules.
La mesure de la densitéde cette coloration permet de déterminer le niveau de ploïdie. Sinon,
la constatation de la fertilitéde la plante garantit qu'elle est effectivement diploïde.
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2.2 Les échanges d’organites cytoplasmiques

La maîtrise de la fusion de protoplastes permet des échanges de mitochondries et de
chloroplastes entre cellules, voire des recombinaisons entre génomes mitochondriaux : c'est
une source de nouvelle variabilitégénétique. Un exemple est donnépar la mise au point de la
stérilitémâle Ogura chez le colza.
La stérilitémâle obtenue àpartir de celle du radis était déficiente en chlorophylle, or

elle était nécessaire pour produire des variétés hybrides ; il fallait donc corriger ce défaut. La
stérilitémâle étant contrôlée par les mitochondries et la déficience chlorophyllienne par les
chloroplastes, il a été possible par fusion de protoplastes de la lignée mâle stérile avec des
protoplastes d’une lignée fertile, d’obtenir une lignée mâle stérile (avec les mitochondries
entraînant la stérilitémâle) et non déficiente au niveau chlorophyllien (avec les chloroplastes
de la lignée fertile). De tels échanges de mitochondries entre cellules de plantes se produisent
parfois au niveau des contacts entre greffon et porte-greffe.
La présence de la paroi pectocellulosique des cellules est une des barrières aux
échanges d'information génétique. On peut séparer les cellules d'un tissu végétal grâce à
l'action d'enzymes généralement extraites de champignons, qui dégradent la cellulose et les
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matières pectiques de la paroi. Des agents stabilisants sont ajoutés au milieu pour empêcher
l'éclatement de la cellule. On obtient ainsi des cellules « déshabillées », qui deviennent
sphériques : les protoplastes. Ces derniers peuvent être obtenus àpartir de n'importe quel tissu
végétal, mais ce sont généralement les parenchymes des jeunes feuilles qui sont utilisés pour
leur préparation.
A partir de ces protoplastes, il est possible d'obtenir de nouvelles plantes. Si les conditions de
milieu sont favorables, la paroi végétale se reconstitue. Les organites cellulaires se
réarrangent et les cellules entrent en division. Elles donnent ainsi naissance à des
microcolonies, puis des cals, amas de cellules indifférenciées. Transférés sur un milieu de
régénération, les cals se développent en embryons somatiques qui donneront des plantules.
S'il est apparemment possible d'obtenir des protoplastes chez toutes les espècesvégétales, leur
culture puis la régénération d'une plante entière à partir des protoplastes posent encore de
nombreuses difficultés et constituent une limite de cette technique. Il semble notamment que
les monocotylédones soient plus récalcitrantes vis-à-vis de la culture des protoplastes que les
dicotylédones.
Applications
- L'hybridation somatique. La propriété la plus importante des protoplastes est leur
capacitéàfusionner entre eux lorsqu'ils sont placés dans un milieu approprié. Cette technique
permet de surmonter les barrières liées à la reproduction sexuée et de créer de nouvelles
combinaisons entre noyau et cytoplasme.
- La transformation génétique. Du fait de l'absence de la paroi pectocellulosique,
l'introduction directe de l'ADN dans les cellules est facilitée.
Les agents stabilisants
Ordinairement, l'appel d'eau provoqué par le potentiel osmotique de la vacuole de la
cellule est contrebalancé par la paroi végétale.
La suppression de la paroi doit donc être compensée par l'adjonction dans le milieu d'agents
plasmolysants, qui abaissent le potentiel osmotique, tels que des sucres ou des sels minéraux
en concentrations déterminées.
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L'hybridation somatique
Au cours de la reproduction sexuée, les informations génétiques contenues dans le

cytoplasme sont transmises par la mère. En revanche, la fusion de protoplastesconduit à
une hybridation des noyaux, mais aussi àcelle des cytoplasmes. Ceci est très intéressant pour
le transfert et l'amélioration de caractères àhéréditécytoplasmique, comme la stérilitémâle.
On parle d'hybridation somatique (car issue de cellules non reproductrices de la plante, Soma
= corps).
Les protoplastes sont des cellules chargées négativement et la fusion spontanée n'est que très
rarement observée. La fusion est obtenue sous l'action de divers agents chimiques ou d'un
choc électrique.
La dernière étape consiste àinduire la division des cellules. Elle aboutit àla formation de cals.
Ensuite, la différenciation des tissus est provoquée pour reformer une plante entière.
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Les travaux de sélection commencent sur la descendance de l'hybride somatique.
Applications pratiques
- La première démonstration de fusion entre des protoplastes différents remonte aux
travaux de Melchers et al., en 1978. Il recherchait des tomates cultivables àbasse température
et réalisa, à cette fin, des hybrides entre la tomate et la pomme de terre par fusion de
protoplastes : la pomate. Cette nouvelle espèce est malheureusement un exemple théorique,
car elle est stérile.
- La pomme de terre cultivée, Solanum tuberosum, est une espèce chez laquelle l'introduction
de caractères par fusion de protoplastes est facilement réalisable. Ainsi, on a pu introduire
des gènes de résistance au virus de l'enroulement, aux virus Y et X, au mildiou et à la
pourriture bactérienne due à Erwinia, à partir des espèces sauvages d'Amérique du Sud,
notamment Solanum brevidens.
- De nouvelles lignées mâles stériles de colza résistantes à l'atrazine ont pu également être
obtenues par cette technique.
Les techniques de fusion de protoplaste

- La fusion par des méthodes chimiques. On peut neutraliser la charge électrique
des protoplastes par des cations Ca2+ et un pH élevé. Ensuite, on utilise le polyéthylène
glycol (PEG) qui provoque une forte agrégation des cellules et déstabilise la membrane
plasmique.
Après retour aux conditions initiales, les protoplastes fusionnent.
- La fusion par des méthodes électriques. Cette technique, l'électrofusion, plus récente, utilise
des champs électriques intenses et de courte durée, qui en déstabilisant les membranes
entraînent la fusion des protoplastes.
Ce système semble être plus efficace.
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Les hybrides somatiques retenus
lors de la fusion entre protoplastes, tous les échanges sont possibles entre les deux. On
peut ainsi obtenir des degrés de fusion très variables.
Fusion des noyaux et des cytoplasmes

Lorsque la fusion des noyaux a lieu, il peut y avoir une recombinaison plus ou moins
importante entre les chromosomes des deux parents. Ce phénomène peut être utilisé pour
transférer des gènes nucléaires.
On cherchera notamment àobtenir des hybrides somatiques asymétriques, où seuls quelques

fragments d'ADN du parent donneur seront introduits dans l'espèce receveuse. En effet, les
cas de fusion importante de génomes entre espèces conduisent à des plantes souvent stériles
comme la pomate. Pour favoriser ce transfert partiel, l'ADN du parent donneur est déstabilisé
par irradiation ménagée des protoplastes (rayons x ou Y) avant la fusion.
Fusion unique des cytoplasmes : les cybrides

Très souvent, la fusion des noyaux n'a pas lieu et au cours des divisions successives, il
ne subsistera que l'un des noyaux parentaux. Celui-ci sera associéàun cytoplasme composite
ou recombiné. Il contient les organites cytoplasmiques de l'un ou l'autre parent.
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On constate souvent une recombinaison des mitochondries.

En revanche, les chloroplastes de l'un des deux parents sont souvent éliminés. Il y a alors
modification des relations nucléo-cytoplasmiques.
L'obtention de ces cybrides peut être également provoquée.

On utilise dans ce cas des doses létales d'irradiation pour les cellules du parent donneur, afin
d'inactiver complètement le noyau. Seuls seront transférés ses mitochondries et ses
chloroplastes. Le parent receveur peut en plus être traitéàl'iodo-acétate, entraînant le blocage
de ses organites. Ainsi, les cybrides issus de la fusion seront constitués du noyau du parent
receveur et des organites du parent donneur.
Les caractères sous la dépendance de l'ADN mitochondrial ou chloroplastique ne sont pas à
négliger. Ainsi, la stérilité mâle cytoplasmique est un caractère résultant de l'interaction
noyau-mitochondrie. On peut citer également la résistance aux herbicides qui est codée par
l'ADN chloroplastique.
Une application de la fusion de protoplastes
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Le colza Brassica napus est issu d'un croisement naturel entre la navette B. campestris
et le chou B. oleracea. L'espèce Brassica napus présente un fort hétérosis. Ainsi, il est apparu
nécessaire de modifier la biologie florale, afin de mieux contrôler la reproduction sexuée, en
vue de l'obtention de l'hybride. Des travaux ont étéengagés sur la mise au point d'un système
de stérilité mâlecytoplasmique. Chez une variété de radis japonaise, il a été découvert par
Ogura en 1968 une stérilitémâle spontanée, contrôlée par le cytoplasme. Les chercheurs ont
alors supposé qu'une plante qui aurait le noyau, les chloroplastesdu colza, et
les mitochondries du radis serait un colza mâle stérile. Pour obtenir ce colza, des techniques
de fusion de protoplastes ont été mises en œuvre. Ceci s'est déroulé en deux étapes :
- Introduction dans le colza de la stérilitémâle du radis par voie sexuée. La stérilitémâle du

radis, introduite au départ dans le chou, a été transférée ensuite dans le colza par une série
de rétrocroisements. On dispose ainsi de colzas mâles stériles, àcytoplasme de radis Ogura.
Toutefois, les plantes obtenues présentaient des défauts de verdissement et une absence de
nectaires nécessaires àune pollinisation réalisée presque exclusivement par les abeilles du fait
de l'absence de chloroplastes dans le colza obtenu.
- Fusion de protoplastes entre ces hybrides et des colzas normaux. Elle a étéréalisée en vue de
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sélectionner des régénérants à chloroplastes de colza, mais ayant des mitochondries

recombinées, responsables de la stérilitémâle cytoplasmique.
2.3 La modification de l’information génétique nucléaire

2.3.1 La mutagénèse
Au sens large, la mutagénèse artificielle correspond à l’induction de nouveaux

caractères par des modifications aléatoires au niveau du génome : translocation ou inversion
de segments chromosomiques, micro-délétions, changement dans la séquence des bases (A, T,
G et C) au niveau de la molécule d’ADN. Au sens restreint elle est limitée à ces derniers types
de modifications. Les micro-délétions d’ADN peuvent être obtenues par traitement au
rayonnement gamma (Cobalt 60) et les substitutions de bases peuvent être obtenues par des
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agents chimiques, dits mutagènes, comme le MSE (méthyle sulfonate d’éthyle), appliqués au
niveau des graines ou des cellules en culture (par exemple en présence d’un herbicide pour
sélectionner la résistance àcet herbicide).
Ce type de mutagénèse est de même nature que celle à la base de la variation à

l’intérieur des espèces et qui résulte d’événements se produisant spontanément soit au niveau
des chromosomes, soit au niveau de la chaîne d’ADN , sous l’action de facteurs extérieurs,
mutagènes, comme les UV, le rayonnement cosmique et de nombreuses molécules produites
par les plantes ou les champignons.
On estime par exemple qu’entre un grain de blé semé et celui qu’il donnera à la
génération suivante, une quinzaine de mutations se produisent spontanément dans son
génome.
2.3.2 La transgénèse
D’une façon générale, la transgénèse consiste à introduire un gène supplémentaire

dans le génome d’un organisme vivant (bactérie, animal, plante, etc.). Ce gène est identifié
grâce aux outils de la génomique et cloné, ce qui permet ensuite de le modifier à volonté
avant de le transférer dans le génome de la plante receveuse.
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Le transfert d’un gène d’une espèce à une autre est un phénomène qui s’est produit
spontanément au cours de l’évolution des organismes et dont les génomes gardent trace. Le
transfert lui-même peut se faire selon deux procédés :
* soit indirectement, par l’intermédiaire d’une bactérie, Agrobacterium tumefaciens.

Cette bactérie, agent de la galle du collet chez les plantes, a la propriété remarquable de
transférer naturellement à la plante une séquence de son ADN (dit ADN-T) pour lui faire
produire des substances dont elle a besoin pour son développement. Le principe est alors de
remplacer cet ADN-T par le gène àtransférer : la bactérie insère alors ce gène dans le génome
de la plante. Ce transfert se fait àpartir de fragments de tissus de la plante co cultivés in vitro
avec la bactérie.
* soit directement, par projection à très grande vitesse (sur des cellules, des fragments de
tissus, des méristèmes ou des embryons immatures, cultivés in vitro) de micro-billes de métal
porteuses du gène à transférer. C’est la technique de Biolistique, surtout utilisée chez les
monocotylédones céréales en particulier).
Dans les deux cas il faut pouvoir repérer, parmi les plantes régénérées àpartir du matériel
végétal traité, les plantes transformées (porteuses du transgène). Pour cela on introduit
simultanément un gène marqueur, dit marqueur de sélection. C’est parmi les plantes porteuses
de ce marqueur que se trouvent avec une forte probabilitéles plantes porteuses du transgène.
Les marqueurs les plus classiquement utilisés sont les résistances à un antibiotique ou àun
herbicide. Après action de ces substances lors de la culture in vitro, seules les cellules
transformées se multiplient. On ne récupère donc que des plantes transformées.
Dans les méthodes actuelles de transformation, le marqueur et le transgène n’étant pas liés,
l’élimination du marqueur se fait par tri en descendance.
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Le génie génétique désigne l'ensemble des techniques permettant d'introduire et de faire

exprimer dans un organisme vivant un ou des gènes provenant de n'importe quel autre
organisme. Les organismes ainsi obtenus sont dits Organismes Génétiquement Modifiés
(OGM). On distingue les techniques de biologie moléculaire qui permettent de préparer les
séquences d'ADN qui seront introduites, on parle de construction génétique, et les techniques
de transgénèsequi permettent de transférer le gène.
Plusieurs découvertes scientifiques ont permis d'aboutir à l'obtention de la première plante

transgénique en 1983. La compréhension des mécanismes responsables de la galle du collet,
maladie connue depuis l'antiquité, a permis la mise en évidence d'un transfert génétique
naturel. Elle est à l'origine des techniques de transformation génétique utilisées aujourd'hui.
La transgénèse permet d'apporter des solutions àdes problèmes très variés. Ils touchent aussi
bien l'agronomie, l'amélioration des qualités alimentaires, la santé, l'industrie ou
l'environnement. Ce chapitre montre la diversité des espècesconcernées et donne un aperçu
des améliorations possibles.
Les deux principales caractéristiques du génie génétique en comparaison de la sélection
25
classique basée sur la reproduction sexuée sont :
- Une source de gènes étendue. On peut franchir la barrière des espèces, des genres et des
règnes. Ainsi, il est possible d'introduire des caractères qu'il ne serait pas possible d'introduire
par sélection classique.
- Le transfert d'un gène précis. Elle permet de transférer le seul gène désiré et non de
transférer plusieurs gènes comme lors de la reproduction sexuée.
La transgénèse : différentes stratégies
26
Introduire un nouveau caractère
C'est un cas où le transfert de gènes s'accompagne d'un transfert de caractère. Une

copie du gène d'intérêt est introduite dans la plante. Son expression, par l'intermédiaire
d'un ARN messager, entraîne la production d'une protéine, responsable du nouveau caractère.
Les exemples dans ce domaine sont nombreux : introduction d'un gène de résistance à des
insectes, à des pathogènes, à des herbicides, modification de la composition des graines,
production de molécules d'intérêt industriel ou pharmaceutique.
Inactiver un caractère
Dans ce cas, il n'y a plus à proprement parler de transfert de gènes, on agit sur
l'expression d'un gène déjà présent dans la plante.
La stratégie antisens est la voie la plus couramment utilisée.
Elle consiste à bloquer l'expression d'un gène cible. Une copie « inversée » de ce gène est
introduite, d'où le nom de la technique. Les ARN messagers (ARNm) produits par la copie
originelle du gène et par celle introduite sont complémentaires. Ils s'hybrident donc et forment
une molécule d'ARN double brin. Cette molécule aberrante est dégradée. Ainsi l'expression
du gène est bloquée et le caractère ne s'exprime plus. Cette technique a permis d'obtenir
des espèces végétales à teneur en lignine réduite, des tomates et des melons à maturation
retardée, ou des pommes de terre contenant moins d'amidon.
Deux autres techniques permettent également d'inactiver un caractère. L'une repose sur
l'introduction dans la plante d'un gène codant pour un ribozyme. Ce sont des molécules
d'ARN enzymatiques. Ces molécules d'ARN synthétisées possèdent une séquence
complémentaire de l'ARN messager du gène cible à inactiver, le ribozyme s'hybride à cet
ARN messager et coupe spécifiquement l'ARN. Dans ce cas également, le caractère ne
s'exprime pas.
L'autre technique, la co-suppression (ou gene-silencing), consiste à surexprimer le gène. Il

s'agit cette fois d'introduire plusieurs copies du gène présent dans la plante. Des mécanismes
naturels de régulation se mettent en jeu dans la cellule, et dégradent les ARN messagers
produits en grande quantité. Cette technique est très sensible à son environnement. En
fonction des conditions du milieu, la régulation ne sera pas la même.
27
Les étapes de la transgénèse
Etape 1 : Identifier, isoler, intégrer et multiplier un gène d'intérêt
La première étape est l'identification d'un caractère que l'on veut introduire dans la
plante, comme par exemple des caractères de qualité nutritionnelle, la résistance à certains
insectes, à certaines maladies, à des herbicides, etc. Le gèned'intérêt peut provenir de tout
organisme vivant, plante, animal ou bactérie puisque le code génétique est universel. Il doit
ensuite être isolé de l'organisme donneur. Il est intégré dans une construction
génétique associant souvent un gène marqueur. Ce gène marqueur permet de sélectionner les
cellules qui ont intégréle gène d'intérêt. La construction est ensuite multipliée (clonée) afin de
disposer d'une quantitésuffisante d'ADN pour son introduction dans les cellules végétales que
l'on veut transformer.
28
Etape 2 : Transférer le gène
Il y a plusieurs méthodes pour introduire un gène dans une cellule :
- La transformation biologique
Cette technique utilise une bactérie du sol, Agrobacterium, qui a la propriété de

réaliser naturellement la transformation génétique d'une plante, afin de la parasiter. Ainsi,
une construction génétique introduite dans la bactérie (rendue avirulente au préalable) sera
transférée dans la plante et intégrée à son génome. C'est la technique la plus couramment
utilisée.
- Le transfert direct
Cette technique fait intervenir :

• soit une projection d'ADN dans les cellules de la plante par l'utilisation d'un canon à
particules qui projette dans les cellules des microparticules enrobées d'ADN (biolistique),
• soit l'introduction d'ADN dans des protoplastes, par action d'un agent chimique ou d'un
champ électrique (électroporation).
Les cellules issues de différents types de tissus végétaux peuvent être soumises à la
transformation. Selon les espèces, ce seront des disques foliaires, des sections de tige, des
cotylédons, des embryons, des microspores ou des protoplastes. Par exemple, chez le tabac et
la tomate, on utilise des disques foliaires ; chez la pomme de terre, la transformation
génétique peut se faire sur des protoplastes.
Etape 3 : Régénérer et évaluer les plantes transformées
Après sélection des cellules transformées, il faut régénérer les nouvelles plantes
transgéniques. Les cellules transformées se développent d'abord en cals, larges amas de
cellules indifférenciées. Après quelques semaines, on observe le développement de pousses.
Elles sont alors placées dans un nouveau milieu de culture permettant le développement des
racines. Quand les racines sont suffisamment développées, les plantules sont repiquées en pot
et acclimatées en serre.
29
La régénération in vitro des cellules transformées est une étape difficile à maîtriser. Aussi,
le génotype, le type de tissus et les conditions de culture sont choisis en fonction de leur
aptitude à la régénération.
Les plantes régénérées sont ensuite analysées pour confirmer l'insertion de la construction
génétique dans leur génome. Des analyses moléculaires sont conduites dans ce sens. Des
études sur l'expression du gène ont lieu à plusieurs stades, ce qui permet de caractériser le
niveau d'expression et le comportement de la plante exprimant le nouveau caractère.
Etape 4 : Incorporer dans une variétécommerciale
Les plantes transformées obtenues sont soumises à des croisements contrôlés pour
étudier les modalités de transmission du nouveau caractère à la descendance.
La transformation et la régénération étant des opérations délicates, le génotypede la plante

choisie est celui facilitant ces étapes. C'est pourquoi les plantes retenues sont ensuite soumises
à une succession de rétrocroisements afin d'introduire le gène dans le matériel élite et
d'obtenir de nouvelles variétéscommerciales exprimant ce caractère.
30
La réalisation d'une construction génétique
Identifier et isoler le gène d'intérêt
La construction d'un transgène débute par le repérage d'un caractère intéressant et

l'identification de la protéine responsable de ce caractère, puis du gène codant pour cette
protéine.
Par exemple, chez une bactérie, Bacillus thuringiensis, utilisée en pulvérisation pour lutter
contre certains papillons ravageurs des cultures de maïs, on a découvert le gène qui permet la
production chez la bactérie d'une protéine qui se transforme en toxine dans le tube digestif de
lapyrale. C'est ce gène d'intérêt qui a ensuite étéisoléàl'aide d'enzymes de restriction.
Intégrer le gène d'intérêt dans une construction génétique
Le gène d'intérêt seul ne peut pas s'exprimer dans la cellule végétale.
31
- Les séquences régulatrices
Il est nécessaire de lui ajouter des signaux de régulation. La présence

d'un promoteur devant la séquence codante du gène d'intérêt est indispensable. C'est une
séquence située en amont du gène, responsable de la transcription de l'ADN.
Une séquence terminateur est également indispensable. Située en aval, elle signale la fin de la
séquence codante.
D'autres séquences peuvent être ajoutées. Elles permettent de cibler le lieu d'accumulation du
produit du gène dans la plante, et de réguler la force de son expression.
- Les gènes marqueurs
Les gènes marqueurs permettent de repérer et de sélectionner, au cours des étapes

suivantes de la transformation génétique, les cellules ayant intégré le gène d'intérêt. Il peut
s'agir de gènes marqueurs de résistance àdes antibiotiques ou àdes herbicides. Les cellules
transgéniques sont alors sélectionnées par l'expression de leur résistance dans un milieu
contenant l'antibiotique ou l'herbicide.
Tous ces fragments de gènes d'origines différentes, gènes d'intérêt, gènes marqueurs et
signaux, sont assemblés in vitro. On obtient ainsi la construction génétique qui est multipliée
puis utilisée pour l'étape de transformation.
La multiplication de la construction génétique : le clonage
32
Pour insérer un gène dans une cellule végétale il est nécessaire d’avoir de nombreuses
copies de celui-ci. Le clonage permet d'obtenir une grande quantité de copie d’un gène
souhaité.
Les plasmides sont des molécules d'ADN circulaires présentes chez les bactéries, en plus de
leur unique chromosome. Ils sont utilisés pour héberger la construction génétique, car il est
relativement facile de travailler sur cette petite molécule d'ADN circulaire, qui possède de
nombreux sites de restriction. C'est alors un plasmide recombiné.
Le plasmide est ensuite réintégré dans des bactéries hôte, il s'agit le plus souvent de la
bactérie Escherichia coli. Par culture de cette bactérie, on obtient alors une multiplication
rapide du plasmide. On parle de clonage du gène ou de la construction génétique, car on
dispose ainsi de nombreuses copies du gène.
L’utilisation d’agrobacterium
33
a bactérie du sol, Agrobacterium tumefaciens, provoque chez les plantes infectées une
tumeur, la galle du collet.
Une autre espèce, Agrobacterium rhizogenes, parasite également les plantes selon les mêmes
mécanismes qu'A. tumefaciens.
Elle provoque alors le développement anarchique du système racinaire appelé chevelu

racinaire.
Transfert naturel de l'ADN-T par Agrobacterium tumefaciens
On a pu démontrer que le parasitisme d'Agrobacterium repose sur le transfert d'une

partie de son plasmide dans les chromosomes de la plante. Cette partie qui est transmise
au génome de la plante est appelée ADN-T.
Il s'agit d'une partie constante de l'ADN du plasmide de la bactérie, appelé ADN-T, pour
ADN Transféré. L'ADN-T est délimité par des bordures, bordure gauche et bordure droite,
constituées par des séquences de 25 nucléotides. C'est la région comprise entre ces frontières
qui est transférée.
Elle contient les gènes qui confèrent à la plante des propriétés tumorales, c'est-à-dire qu'ils
entraînent la prolifération continue et incontrôlée des cellules végétales par production
d'hormones de croissance.
Des gènes entraînant la synthèse d'opines sont également présents sur l'ADN-T. Les opines
sont des protéines spécifiques des bactéries qui ne sont pas habituellement présentes dans les
tissus sains. Relâchées dans le milieu, les opines favorisent la multiplication des souches
pathogènes et détournent une partie de l'activité photosynthétique de la plante au profit des
bactéries.
Sur le plasmide, en dehors de l'ADN-T, on trouve une région de virulence. Cette dernière
n'entraîne pas directement la formation de la maladie, mais est indispensable au transfert et à
l'intégration de l'ADN-T.
34
Transfert naturel de la construction génétique par Agrobacterium tumefaciens
C'est ce transfert naturel ou biologique de gènes, à l'aide d'Agrobacterium, qui est

utilisé pour transformer les végétaux. A. tumefaciens est la bactérie la plus employée. Le
principe est de modifier son plasmide Ti afin qu'il n'y ait pas de formation de la galle du collet,
mais qu'il y ait quand même transfert et intégration des gènes désirés dans le génome des
plantes.
On construit des plasmides Ti désarmés. C'est-à-dire que les gènes, situés sur l'ADN-T,
responsables du pouvoir pathogène de la bactérie, sont délétés. Il est toutefois nécessaire, pour
la réalisation du transfert de gènes, de garder intactes les deux bordures gauche et droite de
l'ADN-T, ainsi que les fonctions de virulence. Entre les deux bordures de l'ADN-T est insérée
la construction génétique. Elle est ensuite introduite dans le végétal.
Les systèmes binaires de transfert
Des constructions ont été réalisées pour diminuer la taille des plasmides et pour
simplifier les méthodes d'insertion de gènes dans l'ADN-T. Ainsi, l'information génétique,
nécessaire au transfert et àl'intégration dans le matériel végétal de la construction génétique, a
été répartie en deux plasmides. L'un est le plasmide d'Agrobacterium sans son ADN-T et
possédant encore les gènes de virulence. Il induira à distance le transfert de l'ADN-T
recombinéde l'autre plasmide, on parle d'action en trans. L'autre plasmide est un vecteur de
petite taille qui porte l'ADN-T recombiné, donc la construction génétique. Ce vecteur, appelé
vecteur binaire, possède la capacité de se répliquer dans Agrobacterium mais aussi dans E.
coli.
C'est donc àla fois un vecteur de transfert et un vecteur de clonage. Cette technique est de
plus en plus utilisée.
35
La transformation biologique
Coculture et transformation génétique
La transformation génétique est réalisée en mélangeant une culture d'une souche

d'Agrobacterium transformée, mise en suspension en milieu liquide, avec des explants de la
plante, on parle de coculture. C'est au cours de cette étape que la construction
génétique introduite dans la bactérie est transférée dans le génomede la plante.
Sélection des cellules transformées
La coculture est lavée pour éliminer les agrobactéries. Il faut ensuite sélectionner les
cellules qui sont effectivement transformées.
Pour cela, on apporte dans la culture des explants un agent sélectif approprié : herbicide,
antibiotique ... Seules les cellules végétales transformées, c'est-à-dire celles possédant et
exprimant le gène marqueur de sélection, soit de résistance àun herbicide, soit de résistance à
un antibiotique, pourront se développer.
36
Applications
Cette technique de transformation par Agrobacterium a été appliquée avec succès à

différentes espèces végétales dont le colza, la tomate, le coton, la pomme de terre, le soja, la
courgette, le tabac, le maïs, le riz… La transformation biologique est également possible chez
de nombreuses autres espèces.
L’aptitude à la transformation
Pour effectuer des transformations biologiques en routine, il est nécessaire d'avoir une
méthode de transformation très efficace. Trois facteurs interviennent àce niveau : la virulence
de la souche bactérienne, la susceptibilité des cellules vis-à-vis de la bactérie, et le choix
du marqueur de sélection. La durée de la coculture doit également être déterminée, un délai
trop long peut affecter la survie des tissus et l'aptitude àla régénération.
Le prétraitement de l’explant
L'objectif du prétraitement est de provoquer des blessures àla surface de l'explant par
projection de microparticules nues. Ceci favorise et localise la transformation
par Agrobacterium au niveau de ces fines blessures. Cette technique est notamment utilisée
pour la transformation de méristèmes.
37
Le transfert direct
Des méthodes dites de transfert direct utilisent des moyens physiques ou chimiques
pour permettre la pénétration d'ADN, généralement sous forme de plasmides dans une cellule
végétale. Les plus utilisées sont la biolistique et le transfert sur protoplastes.
La biolistique
Le principe consiste àprojeter sur des tissus des microparticules de tungstène ou d'or
de 1 à3 µm (1 µm = 10-6m) de diamètre enrobées d'ADN, àl'aide d'un canon àparticules. La
force de propulsion est obtenue soit par explosion d'une poudre dans une balle, soit par
détente d'un gaz sous pression (l'hélium le plus souvent). Certaines des microparticules vont
pénétrer dans les cellules, transportant avec elles l'ADN. Cet ADN doit ensuite atteindre
le noyau et s'y intégrer.
38
C'est une méthode facile d'emploi qui a permis d'obtenir de nombreuses plantes
transgéniques, notamment chez les monocotylédones, comme le maïs, le blé, le riz. C'est ainsi
qu'a été obtenu le premier maïs résistant à la pyrale. En revanche, cette méthode a
l'inconvénient de produire des plantes partiellement transformées, appelées chimères et
parfois d'engendrer l'insertion de nombreuses copies du gène d'intérêt.
Le transfert sur protoplastes
Les protoplastes sont un matériel privilégiépour le transfert direct de gènes. Débarrassées de

leur paroi pectocellulosique, ces cellules ne présentent plus d'obstacle à l'intégration de
l'ADN. Sur un mélange contenant les cellules végétales et l'ADN en solution, on modifie les
conditions physico-chimiques du milieu pour provoquer une perméabilisation temporaire et
réversible de la membrane plasmique.
Les molécules d'ADN pénètrent dans les protoplastes, elles doivent atteindre ensuite
le noyau et s'intégrer dans un chromosome de la cellule végétale.
Deux techniques principales permettent d'introduire l'ADN dans les protoplastes :
- L'action du PolyÉthylène Glycol (PEG)
Le PEG est un polymère qui déstabilise de façon réversible les membranes plasmiques,
permettant ainsi le transfert de l'ADN au travers de la membrane.
Cette méthode a permis l'obtention de maïs résistant à une matière active herbicide, le
glufosinate. Elle est également utilisée sur la betterave.
- L'électroporation
Cette méthode consiste à soumettre un mélange ADN-protoplastes à un choc

électrique pendant une fraction de seconde. La membrane plasmique se trouve ainsi
perméabilisée, ce qui permet l'intégration de l'ADN dans les cellules.
Ces deux méthodes sont relativement faciles àmettre en œuvre, mais supposent toutefois la
possibilité de régénérer des plantes à partir de protoplastes, ce qui limite leur emploi chez
39
les espèces récalcitrantes à la régénération.
Les techniques de transfert direct nécessitent également une étape de sélection des cellules
transformées.
ADN "nu"
Il n'y a pas d'obligation àce que les gènes que l'on désire introduire soient portés par
des plasmides, technique la plus facile et la plus rapide.
Les techniques de transfert d'ADN "nu", en cours de mise au point, permettent de réduire au
maximum la longueur de l'ADN transféré.
40
Les domaines d'application de la transgénèse
Les applications de la transgénèse peuvent être regroupées dans quatre grands

domaines :
- améliorations agronomiques,
- qualités alimentaires,
- production de molécules àintérêt industriel,
- production de molécules destinées àla santéhumaine.
41
L'agronomie
De nombreux travaux de transgénèse concernent l'introduction
de gènes de résistance aux herbicides ou aux insectes, et dans une moindre mesure, àcertains
virus et maladies. Associées à un usage raisonné d'herbicides et de pesticides, ces plantes
transgéniques vont améliorer l'efficacité de l'agriculture, tout en respectant encore mieux
l'environnement.
La résistance àdes insectes
La bactérie Bacillus thuringiensis constitue un véritable réservoir de gènes de

résistance aux insectes. En effet, les différentes souches de cette bactérie du sol recèlent
plusieurs protéines insecticides ayant différents modes d'action, et affectant uniquement
certains insectes. Chacune de ces protéines est codée par un seul gène, c'est donc un caractère
facilement transférable par génie génétique. Plusieurs équipes ont obtenu des tabacs, des
pommes de terre, des cotons, des tomates, des maïs résistants à des insectes grâce à cette
source de gènes.
Dans le cas du maïs, la résistance à la pyrale est conférée par le gène Cry A, appelé
communément Bt. Ce gène permet dans les cellules du maïs, la production d'une protéine qui
se transforme en toxine dans le tube digestif de la pyrale. Chez les autres animaux et chez
l'homme, cette protéine est simplement digérée sans aucun effet toxique.
La résistance àdes maladies
Les virus, les champignons et les bactéries sont responsables de pertes importantes en
production végétale. Or, il n'existe aucune méthode de traitement des maladies dues à des
virus chez les plantes cultivées. Par transgénèse, il est possible d'obtenir des plantes
résistantes aux virus. Ces plantes transgéniques synthétisent des protéines qui bloquent la
multiplication et le développement des virus. Ainsi, il a étépossible d'obtenir des courgettes et
des melons résistant au virus de la mosaïque du concombre.
42
L'obtention de plantes résistant aux champignons et aux bactéries est en cours de

développement.
La résistance àdes herbicides

Le glufosinate (Basta ou Liberty) et le glyphosate (Roundup) sont des herbicides
totaux qui détruisent aussi bien les mauvaises herbes que les plantes cultivées. Les gènes de
résistance àl'herbicide introduits dans une plante empêchent la matière active d'agir sur celle-
ci, transformant l'herbicide total en herbicide sélectif sur cette plante. Ainsi l'herbicide détruit
toutes les mauvaises herbes présentes tout en respectant totalement la plante cultivée.
De plus, ces désherbants totaux ont la propriété de ne pas être rémanents. De nombreuses
plantes transgéniques ont étédéveloppées pour obtenir une tolérance àces herbicides. Il s'agit
de variétés de betterave, colza, coton, maïs, pomme de terre et de soja
L'alimentation
Il s'agit de modifier la composition d'une plante afin de lui apporter des avantages
nutritionnels et gustatifs ou de lui conférer de nouvelles caractéristiques qui permettent de
diversifier les débouchés.
Les qualités nutritionnelles
En alimentation animale, les recherches vont dans le sens d'un développement de plantes
permettant un meilleur rendement nutritionnel et évitant l'apport de compléments nutritifs.
Ainsi, il est possible d'obtenir des plantes de maïs, colza, soja à teneurs élevées en acides
aminés, notamment en méthionine et lysine, et des maïs enrichis en huile. Concernant
l'alimentation humaine, des travaux sont menés pour diminuer les propriétés allergènes du riz
et du soja. Pour obtenir ce résultat, on cherche à introduire dans la plante un transgène qui
inhibe la synthèse de la protéine allergisante.
La maturation des fruits
Ce sont les résultats les plus avancés concernant la qualitéalimentaire. Sur le melon,
sur la tomate, on a pu obtenir des variétés transgéniques àmaturation retardée. Ces fruits
peuvent être récoltés àun stade de maturation plus avancé, donc être plus savoureux. D'autre
43
part, il en résulte une meilleure conservation et une aptitude au transport améliorée, réduisant
les pertes.
Le melon est le premier fruit génétiquement modifiéobtenu par un laboratoire de recherche

français. Un gène capable de bloquer la synthèse de l'éthylène a étéintroduit, ce qui ralentit la
maturation. Le détachement du fruit est retardéet le melon maintenu sur pied continue
d'accumuler des sucres.
La transformation agro-alimentaire
Dans ce domaine, les champs d'application potentiels sont très variés : il peut s'agir de
la production des protéines impliquées dans des procédés agro-alimentaires, ou de la
modification des caractéristiques des végétaux pour optimiser leur utilisation.
Ainsi, des travaux ont permis de modifier la teneur en amidon chez la pomme de terre, afin
d'augmenter la teneur en matière sèche, et de disposer ainsi de pommes de terre mieux
adaptées à la fabrication de fécule, de purée ou de chips.
Des gènes ont également ététransférés chez le colza pour modifier la teneur en acides gras ou
pour obtenir des huiles contenant des nouveaux acides gras recherchés en alimentation
humaine.
L'industrie
Les biotechnologies ouvrent de nombreuses perspectives dans les domaines de
l'industrie, en produisant des molécules nouvelles (Molecular Farming) et en améliorant les
procédés industriels et la qualitédes produits.
Les pâtes àpapier
Les lignines sont l'un des constituants majeurs du bois, mais elles gênent l'industrie papetière
qui ne peut les valoriser et doit les éliminer par des méthodes coûteuses et polluantes.
44
Des travaux conduits par la recherche publique française ont permis de connaître
les gènes impliqués dans la synthèse des lignines et de développer des variétésde peupliers
transgéniques, chez lesquels le taux de lignine est fortement réduit. Ceci facilite le
blanchissement de la pâte àpapier et donc réduit l'impact sur l'environnement. Le même type
de travail a été réalisé sur l'eucalyptus.
Les huiles industrielles
Elles sont synthétisées àpartir de matières premières fossiles, dont les ressources sont limitées.
Il est donc nécessaire de s'orienter vers d'autres ressources renouvelables. Parmi les nombreux
programmes de recherche, on peut citer celui destinéàl'obtention d'un colza transgénique à
haute teneur en acide grasérucique ou ricinoléique pour la production de lubrifiants, de
matières plastiques, etc. Cette stratégie devrait favoriser le développement de lubrifiants et de
plastiques biodégradables.
Les colorants
Un exemple original est l'obtention de cotons transgéniques de couleur grâce à

l'introduction d'un gène bactérien ou végétal codant pour un pigment. Ceci évitera l'utilisation
de teintures chimiques difficilement recyclables.
La santé
Génétiquement modifiées, des plantes de tabac, de maïs, ou de pomme de terre
peuvent produire des molécules thérapeutiques ou des vaccins. Le grand avantage de la
production de ces molécules est l'absence de risques de contamination par des virus
pathogènes pour l'homme.
Les produits sanguins
Des recherches menées en France ont déjà permis de faire produire

des protéinesplasmatiques à des plants de tabac transgéniques, permettant l'obtention
d'hémoglobine humaine recombinée.
45
Des travaux montrent qu'il est possible de synthétiser de l'albumine humaine, employée lors
du traitement des traumatismes, à partir de tabac ou de pomme de terre. Cette albumine
devrait être moins chère que celle issue du plasma sanguin. Cette nouvelle source permettrait
de répondre àl'augmentation des besoins.
Les vaccins
Des chercheurs américains travaillent à la mise au point d'une banane vaccin pour
l'homme, prévenant les cas de gastro-entérites provoquées par la bactérie E. coli. Il serait alors
envisageable de vacciner àfaible coût les populations de pays en voie de développement, les
plus touchées par ces diarrhées d'origine bactérienne.
Les protéines humaines
Des travaux sont actuellement en cours pour faire produire des protéines ou des
glycoprotéines àusage thérapeutique àpartir de soja, de tabac, de pomme de terre, de riz ou
de colza.
L'environnement
Le recours àdes variétés transgéniques permet une moindre utilisation d'insecticides et

d'herbicides et ouvre le champ de la recherche sur les pratiques culturales simplifiées.
Des herbicides au profil écotoxicologique favorable
La création de plantes tolérantes aux herbicides permet l'utilisation de matières actives au

profil écotoxicologique favorable, c'est àdire àfaible durée de vie, àbiodégradabilitérapide,
respectant l'environnement et à large efficacité.
Ces cultures peuvent supporter ce traitement grâce à l'introduction d'un gène
de tolérance spécifique. En 1996, un nouveau système de désherbage a étélancéen Amérique
du Nord sur des cultures comme le soja, le colza et le maïs.
La réduction de l'utilisation des insecticides
46
Une étude sur l'impact du coton bt (résistant aux insectes) montre qu'en 1999, les agriculteurs
chinois ayant adoptédes variétés bt ont consomméen moyenne 10 kg/ha d'insecticides contre
58 kg/ha pour les agriculteurs ayant cultivé des variétés non transgéniques ("impact of bt
cotton in china", Carl E. Pray et al, center for chinese Agricultural Policy, Chinese Academy
of Sciences, China, may 2001).
La diminution de l'érosion des sols
Une étude sur 5 ans (1996 à 2001) auprès de 450 cultivateurs américains de soja
montre que pour 63 % d'entre eux, le développement des techniques culturales sans labour,
qui permet une réduction de l'érosion des sols de l'ordre de 90 %, est rendu possible en
premier lieu par l'introduction de variétés de soja transgéniques tolérant à un herbicide.
L'enrichissement du patrimoine végétal
La sélection classique a déjàfait la preuve de sa capacitéàenrichir les espèces et variétés. Par

la création de variétés nouvelles qui constitue l'objectif premier de son activité, la sélection
classique a ainsi doté le "patrimoine végétal" de spécimens nouveaux. Dès les prémices de
l'agriculture, cette activité de sélection empirique a été à l'origine de nombreuses variétés
aujourd'hui partie intégrante de ce patrimoine.
Les biotechnologies modernes, et le génie génétique, s'inscrivent dans cette continuité avec
une diversitéd'objectifs. Elles ont àleur disposition des outils qui ouvrent davantage encore le
champ des possibles. Dès lors, les biotechnologies vont contribuer encore à l'extension du
patrimoine végétal.
Le maïs transgénique utilisant mieux l’eau disponible
L’amélioration des rendements du maïs est due à un grand nombre de facteurs, dont
l’un des plus importants est la tolérance aux stress environnementaux. Cette amélioration est
surtout attribuée à une augmentation de la performance des lignées parentales, qui sont en
partie tolérantes à un déficit d’eau. En effet, pour le maïs, la période pendant la pollinisation
et le début du remplissage des grains est la plus sensible à un stress hydrique.
Pourtant, l’eau est une ressource limitée dont l’agriculture est la première utilisatrice, devant
47
l’industrie et la consommation humaine. Pour la culture du maïs, une façon de diminuer

l’utilisation d’eau consiste à créer des variétés qui tolèrent une disponibilité réduite en eau,
sans que leurs capacités de production n’en soient affectées.
Grâce à des études génétiques, plusieurs variétés de maïs transgéniques ont été créées par
l’introduction de gènes impliqués dans la réponse àun déficit hydrique. Par exemple, un maïs
plus tolérant à la sécheresse a été mis au point grâce à l’introduction par transgénèse d’un
gène de sorgho, céréale africaine particulièrement tolérante à la sécheresse.
Ce gène code pour une protéine impliquée dans la photosynthèse, la PEPc

(Phosphoénolpyruvate carboxylase). Les plantes transgéniques obtenues surexpriment cette
protéine. Des analyses du comportement photosynthétique de ces plantes en situation de
contrainte hydrique en serre ont permis de montrer que l’efficacité d’utilisation de l’eau est
significativement augmentée (+ 25 %).
La résistance des plantes aux insectes ravageurs

La lutte contre les ravageurs, notamment les insectes, est réalisée essentiellement par
l'utilisation d'insecticides chimiques. Suivant les cultures, les zones géographiques et les
années, la fréquence et la sévérité des attaques d'insectes sont très variables. Selon les cas,
l'application d'insecticide est systématique ou décidée sur la base de comptages des insectes
(ou de larves) "nuisibles" lors de contrôles dans les champs.
La transgénèse offre aujourd'hui un outil supplémentaire aux agriculteurs pour limiter les
traitements chimiques et protéger leurs récoltes contre les insectes et les maladies et ainsi
réduire les pertes.
Pour rendre une plante résistante àun insecte, un gène codant une protéinetoxique pour cet
insecte a été introduit dans le génome de la plante. Jusqu'à présent, pour toutes
les variétés mises sur le marché, les gènes introduits proviennent de la bactérie Bacillus
thuringiensis (d'où l'abréviation Bt donnée aux plantes de ce type), bien connue depuis
longtemps pour ses propriétés insecticides et largement utilisée en agriculture biologique,
ainsi que par les exploitants forestiers et les jardiniers.
2.4 La sélection assistée par marqueurs et la génomique
48
L’amélioration des plantes consiste pour l’essentiel à réunir les allèles des gènes les
plus favorables dans un même génotype. Le séquençage des génomes de plantes permet de
dresser une liste des gènes présents dans un génome et de les cartographier sur les
chromosomes.
Ce nombre est important (de l’ordre de 30000 gènes chez une plante diploïde). Les
techniques d’identification de locus impliqués dans la variation des caractères quantitatifs
(QTL) permettent d’identifier parmi les 30000 gènes ceux qui jouent un rôle important dans
un caractère agronomique (ex : précocité, taille de la plante).La génomique permet d’analyser
la variabilité génétique présente dans les ressources génétiques et d’identifier les allèles
performants présents dans ces ressources. L’accès à ces informations aide le sélectionneur à
faire un assemblage de ces allèles favorables dans une variétéde façon plus rapide et avec une
meilleure utilisation de la variabilité génétique qu’avec les méthodes conventionnelles : c’est
la sélection assistée par marqueurs (SAM)
2.5 La recombinaison entre génomes
Pour accroî
tre la variabilité génétique et introduire des gènes de résistance aux
maladies le sélectionneur fait souvent appel aux croisements interspécifiques. Ceux-ci, sont
souvent associés au sauvetage d’embryons, suivi ou non de doublement chromosomique pour
restaurer la fertilité. Après plusieurs cycles de sélection et de rétrocroisements par l'espèce
dite receveuse que l’on veut améliorer, on aboutit à une plante qui n’a gardé qu’un fragment
de chromosome de la plante donneuse, fragment qui porte le gène à transférer. C’est ainsi que
l’on a pu transférer la résistance au piétin verse d'Aegilops (une graminée sauvage) au blé,
malgré la grande distance génétique entre ces deux espèces. La réunion dans un même
génome de deux génomes d’espèces différentes peut aussi être réalisée par fusion de
protoplastes (cellules sans leur paroi cellulosique).
49

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Master 2 UAMO Biotech veg

Les biotechnologies végétales

1. Les biotechnologies pour accélérer ou maîtriser la production de plantes

La reproduction à l'identique par multiplication végétative permet de reproduire

Certains végétaux se multiplient naturellement sans passer par la reproduction sexuée.

- La multiplication par stolons. Dans le cas du fraisier, il y a formation de tiges aériennes

- La multiplication par tubercules. Pour la pomme de terre, des tiges souterraines

1.2 L’accélération des générations

La technique de culture d'embryons immatures permet d'éviter la phase de maturation

La culture in vitro d'embryons permet de réduire fortement la dormance des graines

Une technique simplifiée de sauvetage d'embryons de tournesol a également étémise au point.

Lors de croisements interspécifiques, des barrières naturelles empêchent le

a tomate cultivée, Lycopersicon esculentum, du fait de son autogamie, possède une

L'embryon est prélevé avant la phase de maturation de la graine.

L'hybride obtenu est souvent croisépar le parent de l'espèce cultivée (rétrocroisement) et sa

- Autres exemples d'application

- La technique du sauvetage d'embryons

Le transfert sur un milieu riche en hormones de croissance permet la production de plantes.

2. Les biotechnologies pour modifier les caractéristiques des plantes

2.1.1 Le doublement du nombre chromosomique

Un grand nombre d’espèces végétales sont polyploïdes, c’est-à- dire qu’elles

Cette technique est entrée dans la pratique courante de l'amélioration de certaines

La maîtrise du doublement chromosomique permet de restaurer la fertilité d’hybrides

A partir de la dédifférenciation d’une cellule reproductrice (microspores ou ovules)

Le processus d'haplodiploïdisation comprend l'obtention de plantes haploïdes à partir

- Production de plantes mères

Le sélectionneur effectue un croisement entre deux lignées parentales présentant des

- Obtention de la phase haploïde

- Retour à l'état fertile diploïde

- Sélection des lignées

- Traitement àla colchicine

La colchicine bloque la mitose après la duplication des chromosomes et les cellules

- Déterminisme du niveau de ploï

2.2 Les échanges d’organites cytoplasmiques

La stérilitémâle obtenue àpartir de celle du radis était déficiente en chlorophylle, or

Au cours de la reproduction sexuée, les informations génétiques contenues dans le

Les travaux de sélection commencent sur la descendance de l'hybride somatique.

Les techniques de fusion de protoplaste

Ce système semble être plus efficace.

Les hybrides somatiques retenus

Fusion des noyaux et des cytoplasmes

On cherchera notamment àobtenir des hybrides somatiques asymétriques, où seuls quelques

Fusion unique des cytoplasmes : les cybrides

On constate souvent une recombinaison des mitochondries.

L'obtention de ces cybrides peut être également provoquée.

Une application de la fusion de protoplastes

- Introduction dans le colza de la stérilitémâle du radis par voie sexuée. La stérilitémâle du

sélectionner des régénérants à chloroplastes de colza, mais ayant des mitochondries

2.3 La modification de l’information génétique nucléaire

Au sens large, la mutagénèse artificielle correspond à l’induction de nouveaux

Ce type de mutagénèse est de même nature que celle à la base de la variation à

D’une façon générale, la transgénèse consiste à introduire un gène supplémentaire

* soit indirectement, par l’intermédiaire d’une bactérie, Agrobacterium tumefaciens.

Le génie génétique désigne l'ensemble des techniques permettant d'introduire et de faire

Plusieurs découvertes scientifiques ont permis d'aboutir à l'obtention de la première plante

classique basée sur la reproduction sexuée sont :

La transgénèse : différentes stratégies

Introduire un nouveau caractère

C'est un cas où le transfert de gènes s'accompagne d'un transfert de caractère. Une