Diagnostic Biochimique Des MHM-Schiff

LE DIAGNOSTIC BIOCHIMIQUE
DES
MALADIES HEREDITAIRES DU
METABOLISME
RIGAL Odile / Manuel SCHIFF

Laboratoire de Biochimie -Hormonologie
Hôpital Robert DEBRE
1
Diagnostic biochimique d’un déficit
enzymatique sur une voie métabolique
X Y
A B C D E
E1 E2 E3 E4
2
Plusieurs niveaux d’investigation
 bilan d ’orientation
tests de screening : famille de molécules

(acides aminés, acides organiques)
dosages spécifiques de métabolites (ac orotique)
épreuves dynamiques in vivo (épreuve de charge)
 bilan de confirmation
épreuves ex vivo (enzymologie, tests d ’oxydation ou

d ’incorporation de substrat, polarographie)
biologie moléculaire
3
Exemple :déf icit du cycle de l’urée
Ac.Aminés
NH 3 AMMONIEMIE
carbamylphosphate CHROMATOGRAPHIE
AC.AMINES
ornithine citrulline
DOSAGE SPECIFIQUE
urée
Ac.Orotique AC. OROTIQUE
arginine arginosuccinate
Dosage
Enzymatique
Et /ou
Biologie 4
Moléculaire
Analyse en fonction de la nature physico-chimique des
métabolites étudiés
Matrice biologique complexe
1) Le plus souvent petite molécules solubles, souvent diffusibles.
soit des techniques de screenning :
• exploration d ’une famille de molécules ayant des parentés structurales ou physico-

chimiques:
• technique de séparation (chromato ou electrop) avec détection non ou peu
spécifique
-AA (NH2-R-COOH) HPLC --> aminoacidopathie

-AO (R-COOH) GC-MS ---> acidurie organique
désordre de la B-oxydation
-Acylcarnitine (MS-MS) --> B-oxydation
acidurie organique
-neurotransmetteurs (HPLC) --> Déficit neuromédiateurs
-Polyols (GC)
-Bases puriques/pyrimidiques (HPLC) 5
-sucres urinaires (CCM)
1)Le plus souvent petite molécules solubles, souvent diffusibles
soit des techniques de dosage spécifique :
• Dosage spécifique permettant le diagnostique différentiel et /ou de renforcer

l ’orientation diagnostique fournie par les test de screening .
• Détection spécifique ou séparation spécifique
Exemples de diagnostics différentiels

-AMM : vitamine B12
-anomalies du cycle de l ’urée : acide Orotique
-anomalie de la béta-oxydation : carnitine
Renforce ou fait l ’orientation diagnostique

-métabolites : Gal-1P
créatine, guanidinoacétate
CoQ10
7Dehydrocholesterol
-ala ...
6
2) des macromolécules, peu solubles et peu diffusibles
Soit techniques de screenning
• exploration d ’une famille de molécules ayant des parentés structurales ou

physico-chimiques:
• technique de séparation (chromato ou electrop) avec détection non ou peu
spécifique
-MPS dosage total (DMB) -->lysosome

electrophorese -->lysosome
-Oligosaccharides CCM -->lysosome
-Acides gras a très longues chainesGC/MS -->Peroxysome
-Formes glycosylées des protéines WB,isofocalisation -->CDG
dosages spécifiques ????
7
HIERARCHISATION
DES MOYENS DIAGNOSTICS
8
LES TESTS FONCTIONNELS IN VIVO
 Exploration des hyperammoniémies:
 Cycle d’ammoniémie avant et après repas  dosage NH3
 Charge en allopurinol  dosage acide orotique urinaire
 Charge en protides (aigue ou chronique):
. dosage NH3
. dosage acides aminés plasma
. dosage acide orotique urinaire
 Exploration des hyperlactacidémies:

- cycle redox, avant et après repas  points redox sang
 Exploration des hypoglycémies:

 Epreuve de jeûne:
. dosage de la glycémie
. dosage lactate, pyruvate, 3-hydroxybutyrate, acétoacétate, AGNE
. dosage acides aminés plasma: alanine, acides aminés ramifiés
. acides organiques urinaires
9
Suspicion d’un déficit du cycle de l’urée
CYCLE D’AMMONIEMIE
(sous régime habituel calculé par le diététicien)
Repas Repas Repas Repas

1 2 3 4
SANG Avt Apr Avt Apr Avt Apr Avt Apr
Ammoniémie + + + + + + + +
Gaz du sang + +
Chr. + +
Ac.Aminés
Faire un bilan nutritionnel, hépatique et hémostase
URINES: Recueil des urines de 24 heures
Pour Chr.Ac.Aminés, Ac. Organiques, Ac. Orotique
10
Suspicion d’une maladie métabolique
CYCLE COURT / LONG

(sous régime habituel calculé par le diététicien)
Repas Repas Repas Repas

1 2 3 4
SANG Avt Apr Avt Apr Avt Apr Avt Apr
Glycémie + + + + + + + +
Lactate/Pyruvate
Corps cétoniques + + + + + + + +
Ac.gras libres
11
LES TESTS EX VIVO
LES DOSAGES ENZYMATIQUES
 Les tests ex vivo
Explorer une voie métabolique complexe à partir de cellules isolées en
partant de substrats marqués (radioactifs ou isotopes lourds) et en
mesurant les produits formés
 Exemple de l’oxydation des acides gras
utilisation de substrats de longueur de chaîne différente marqués avec
3H ou 14C  mesure de 14CO , 3H O et produits acido-solubles marqués
2 2
 Le dosage enzymatique
- étape ultime du diagnostic
- à réaliser dans tous les cas de figure: formes aigues ou chroniques
- confirme le diagnostic porté aux étapes précédentes
- établit un diagnostic supposé mais non supporté par des éléments
objectifs évidents
12
LA BIOLOGIE MOLECULAIRE
 Initialement elle était utilisée quand les autres moyens diagnostics

(substrats, enzymes) étaient insuffisants
 Et quand le gène suspecté était caractérisé
 Actuellement elle constitue un moyen diagnostic de plus en plus utilisé
 L’Exome permet de mettre en évidence des mutations nouvelles mais

l’existence de polymorphismes va conduire obligatoirement à un retour au
phénotype pour valider les déficits
 La biologie moléculaire est utile pour le diagnostic anténatal
13
LES PRELEVEMENTS
QUAND? COMMENT?
14
LES PRELEVEMENTS (1)
 Situation aigue sans pronostic vital défavorable immédiat:
- sang: 3 ml sur tube hépariné
 dosage ac. aminés, AGTLC, carnitine
- sang: 1ml sang total hépariné + 2 ml ac. Perchlorique  points redox
- sang total sur carton Guthrie  acylcarnitines, CDG
- LCR: 0.5 ml sur tube sec  dosage glycine
- urines: recueillies au décours de l’épisode aigu ou juste après
 ac. organiques, ac. orotique
 Situation aigue avec pronostic vital immédiat défavorable (périmortem):

- sang: 3 ml sur tube hépariné  ac. aminés , AGTLC
- sang: 5 ml sur tube EDTA  biologie moléculaire
- sang total sur carton Guthrie (ADN)
- LCR: maximum sur tube sec
- urines: recueil naturel ou ponction suspubienne
- tissus: peau  culture de fibroblastes
muscle
foie
lignées lymphoblastes 15
LES PRELEVEMENTS (2)
 Situation chronique sans accès aigus:
- sang: 3 ml sur tube hépariné le matin à jeun  plasma
. valeurs de référence
- sang total sur carton Guthrie
- LCR: 0.5 ml sur tube sec
- urines: de la nuit ou des 24 heures
. valeurs de références
. exception pour les mucopolysaccharides  mictions de la journée OK
- pour l’analyse des acides aminés toujours envoyer sang, LCR, et urines
prélevés concomitamment  diagnostic LPI, NKH
- les tissus: se conformer aux protocoles de chaque laboratoire
16
LES TEMPS DE REPONSE
 Chromatographie des acides aminés

- en urgence: 2 à 3 heures
 Chromatographies des acides organiques urinaires
- en urgence: 4 à 5 heures
 Acide orotique
- en urgence: 4 heures
 Acides gras à très longue chaîne
 Acylcarnitines (tandem MS/MS)
 Mucopolysaccharides
- 24 à 48 heures
17
INTERPRETATION DES RESULTATS
LES PIEGES
 Résultats caractéristiques:
- diagnostic OK
 Résultats non caractéristiques et /ou suggestifs:

- respect des conditions de prélèvement ?
- traitement médicamenteux en cours ?
- traitement diététique en cours: régime hypo ou hyperprotidique, NEDC,
lait hydrolysé, TCM, etc…?
- confrontation des résultats de la biochimie spécialisée
. entre les différentes techniques utilisées: CAA vs CAO
acylcarnitines vs CAO
. avec ceux de la biochimie générale: glycémie, NH3, ac. urique
18
CONCLUSION
 3 niveaux d’investigation pour le diagnostic des MHM:
- analyses de biochimie générale
- analyse des métabolites spécifiques
- étude enzymologique
 Réalisation du diagnostic:
- but curatif
- but préventif  diagnostic prénatal
19

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LE DIAGNOSTIC BIOCHIMIQUE

RIGAL Odile / Manuel SCHIFF

tests de screening : famille de molécules

dosages spécifiques de métabolites (ac orotique)

épreuves dynamiques in vivo (épreuve de charge)

épreuves ex vivo (enzymologie, tests d ’oxydation ou

1) Le plus souvent petite molécules solubles, souvent diffusibles.

soit des techniques de screenning :

• exploration d ’une famille de molécules ayant des parentés structurales ou physico-

-AA (NH2-R-COOH) HPLC --> aminoacidopathie

soit des techniques de dosage spécifique :

• Dosage spécifique permettant le diagnostique différentiel et /ou de renforcer

• Détection spécifique ou séparation spécifique

Exemples de diagnostics différentiels

Renforce ou fait l ’orientation diagnostique

Soit techniques de screenning

• exploration d ’une famille de molécules ayant des parentés structurales ou

-MPS dosage total (DMB) -->lysosome

-Oligosaccharides CCM -->lysosome

-Acides gras a très longues chainesGC/MS -->Peroxysome

-Formes glycosylées des protéines WB,isofocalisation -->CDG

dosages spécifiques ????

DES MOYENS DIAGNOSTICS

 Exploration des hyperlactacidémies:

 Exploration des hypoglycémies:

Repas Repas Repas Repas

CYCLE COURT / LONG

Repas Repas Repas Repas

 Initialement elle était utilisée quand les autres moyens diagnostics

 Actuellement elle constitue un moyen diagnostic de plus en plus utilisé

 L’Exome permet de mettre en évidence des mutations nouvelles mais

 La biologie moléculaire est utile pour le diagnostic anténatal

 Situation aigue avec pronostic vital immédiat défavorable (périmortem):

 Chromatographie des acides aminés

 Résultats non caractéristiques et /ou suggestifs:

- analyses de biochimie générale

- analyse des métabolites spécifiques

- but préventif  diagnostic prénatal

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