Enzymologie Appliquée: - Biocapteurs Enzymatiques
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Enzymologie Appliquée
(Chapitre 5)
- Biocapteurs enzymatiques
1. Historique
Le professeur Leland C. Clark est le père des biocapteurs. En 1956, il a construit une
électrode à oxygène pour mesurer la concentration d’oxygène dissous dans le sang. En 1962,
ce même biocapteur a été adapté afin de quantifier la concentration de glucose dans le sang.
Il a immobilisé la glucose-oxydase à une électrode à oxygène en utilisant une membrane de
dialyse et a estimé la concentration de glucose en surveillant la diminution de la concentration
d'oxygène. En 1973, Guilbault et Montalvo ont décrit un capteur d'urée basé sur l'uréase
immobilisée sur une électrode à membrane liquide sélective de l'ammonium pour doser l'urée
dans le sang et l'urine. Finalement, en 1975, le premier biocapteur commercial pour la
détection du glucose a été développé par Yellow Spring Instruments (YSI).
Depuis, des progrès remarquables ont été réalisés dans la construction des biocapteurs.
Ce domaine est désormais un domaine de recherche multidisciplinaire qui fait le pont entre les
principes des sciences fondamentales (physique, chimie et biologie) et les bases de la
micro/nanotechnologie, de l'électronique et de la médecine appliquée. Diverses enzymes
appartenant aux classes des oxydo-réductases, hydrolases et lyases ont été intégrées pour
construire des biocapteurs destinés à des applications dans le domaine de la santé, la médecine
vétérinaire, l'industrie alimentaire, la surveillance de l'environnement et la défense.
2. Définition
Les biocapteurs sont des dispositifs analytiques fondés sur le couplage d’une
substance bioactive, spécifique de l’espèce à détecter ou à doser, que l’on appelle « ligand »
ou biorécepteur, avec un transducteur physico-chimique fournissant un signal électrique de
sortie qui peut être ultérieurement amplifié, stocké et visualisé.
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Chargé de cours : BENAMMAR Leyla Année universitaire 2019-2020
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3.1. Sélectivité
La sélectivité est la caractéristique la plus importante d'un biocapteur. La sélectivité
est la capacité d'un biorécepteur à détecter un analyte spécifique dans un échantillon
contenant d'autres mélanges et même des contaminants. Le meilleur exemple de sélectivité est
représenté par l'interaction d'un antigène avec l'anticorps. Classiquement, les anticorps
agissent comme des biorécepteurs et sont immobilisés à la surface du transducteur. Une
solution (généralement un tampon contenant des sels) contenant l'antigène est ensuite exposée
au transducteur où les anticorps n'interagissent qu'avec les antigènes. Pour construire un
biocapteur, la sélectivité est la principale considération lors du choix des biorécepteurs.
3.2. Reproductibilité
La reproductibilité est la capacité du biocapteur à générer des réponses identiques pour
un dispositif expérimental dupliqué. La reproductibilité est caractérisée par la précision et
l'exactitude du transducteur et de l'électronique d'un biocapteur. La précision est la capacité
du capteur à fournir des résultats identiques chaque fois qu'un échantillon est mesuré et
l'exactitude indique la capacité du capteur à fournir une valeur moyenne proche de la valeur
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réelle lorsqu'un échantillon est mesuré plus d'une fois. Les signaux reproductibles offrent une
grande fiabilité et robustesse à l'inférence faite sur la réponse d'un biocapteur.
3.3. Stabilité
3.4. Sensibilité
La quantité minimale d'analyte pouvant être détectée par un biocapteur définit sa
limite de détection (LOD= Limit Of Detection) ou sensibilité. Dans un certain nombre
d'applications de surveillance médicale et environnementale, un biocapteur est nécessaire
pour détecter une concentration d'analyte aussi faible que ng/ml ou même fg/ml(*) afin de
confirmer la présence de traces d'analytes dans un échantillon.
(*)
1fg= 10−15 g.
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3.5. Linéarité
La linéarité est l'attribut qui indique la précision de la réponse mesurée (pour un
ensemble de mesures avec différentes concentrations d'analyte) à une ligne droite,
mathématiquement représentée par y=mc, où c : est la concentration de l'analyte, y : est le
signal de sortie, et m : est la sensibilité du biocapteur. La linéarité du biocapteur peut être
associée à la résolution du biocapteur et à la gamme des concentrations de l'analyte testé. La
résolution du biocapteur est définie comme le plus petit changement de la concentration d'un
analyte qui est nécessaire pour modifier la réponse du biocapteur.
Selon l'application, une bonne résolution est nécessaire car la plupart des applications
de biocapteurs nécessitent non seulement la détection de l'analyte mais aussi la mesure des
concentrations de l'analyte sur une large gamme de travail. Un autre terme associé à la
linéarité est la plage linéaire, qui est définie comme la plage des concentrations d'analyte pour
laquelle la réponse du biocapteur change de façon linéaire avec la concentration.
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Sa spécificité,
Sa stabilité,
Sa durée de vie,
La nature des substances chimiques ou biologiques à analyser.
Biorécepteurs Analytes
Les enzymes : les biocapteurs enzymatiques sont les plus utilisées et les plus
commercialisées. La réaction enzymatique assure donc la transformation d'un substrat,
par exemple la choline, le glucose, l'urée, etc. en produit de réaction détectable par le
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Les acides nucléiques : les biocapteurs nucléique sont basés sur les acides
nucléiques, ils utilisent les brins complémentaires des acides nucléiques comme
élément de reconnaissance biologique, par exemple en utilisant la réaction de liaison
entre deux chaînes d'ADN simple brin (ADNs) pour constituer un ADN double brin
(ADNd). Les séquences qui sont complémentaires d'une séquence d'acide nucléique
cible reconnue peuvent être générées, suivies et éventuellement immobilisées sur le
capteur.
Les cellules : Les biocapteurs cellulaires utilisent des cellules vivantes comme
capteurs bio-spécifiques pour mesurer les conditions du microenvironnement
intracellulaire et extracellulaire, les paramètres physiologiques, puis produisent une
réponse par l'interaction entre les stimuli et la cellule. Les capteurs cellulaires peuvent
également être composés de dérivés d'organismes vivants (organelles…etc.). Au cours
des dernières années, des progrès importants ont été réalisés dans le domaine des
capteurs cellulaires pour le diagnostic précoce du cancer de la bouche et
l’identification des agents pathogènes. Apparemment, la principale limite des capteurs
cellulaires est la viabilité des cellules, qui peut être remarquablement affectée par des
facteurs tels que la durée de vie des cellules, la stérilisation et la biocompatibilité du
dispositif. Un autre facteur qui limite l'application des capteurs cellulaires est leur
faible sélectivité.
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Les aptamères : sont de courtes molécules d'ADN ou d'ARN simple brin (ssADN
ou ssARN)(*) qui peuvent se lier sélectivement à une cible spécifique, y compris les
protéines, les peptides, les glucides, les petites molécules, les toxines et même les
cellules vivantes. Les aptamères prennent des formes variées en raison de leur
tendance à former des hélices et des boucles à un seul brin. Ils sont extrêmement
polyvalents et se lient à des cibles avec une grande sélectivité et spécificité (Figure 2).
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L'élément transducteur peut être classé selon leur mode de transduction (principe de
détection) en biocapteurs électrochimique, optique, thermique, gravimétrique …..etc.
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Les transducteurs électrochimiques restent parmi les plus utilisés grâce à leurs
multiples avantages liés à leur simplicité, leur faible coût et leur rapidité de réponse.
A. Transducteur potentiométrique
Un biocapteur potentiométrique mesure la différence de potentiel entre l'électrode
active et l'électrode de référence dans une cellule électrochimique. Ce potentiel est considérée
comme un signal mesuré dans des conditions d'équilibre (dans lesquelles il n'y a pas de
circulation de courant= un flux de courant pratiquement nul), afin de ne pas provoquer
d'interférence avec la réaction. Les signaux mesurés sont en fonction de la concentration de
l'analyte cible calculé de manière logarithmique et sont utilisés pour la quantification de ce
dernier. En d'autres termes, la potentiométrie fournit des informations sur l'activité ionique
dans une réaction électrochimique.
B. Transducteur ampérométrique
Les biocapteurs enzymatiques ampérométriques constituent la majorité des
biocapteurs commerciaux disponibles sur le marché aujourd'hui. Ces biocapteurs fonctionnent
à un potentiel fixe par rapport à une électrode de référence dont la surface est recouverte d'un
matériau dans lequel sont immobilisées des biomolécules, des enzymes, par exemple et le
courant généré par l'oxydation ou la réduction des espèces à la surface de l'électrode active
qui sera mesuré et dont l'intensité est proportionnel à la concentration en solution de l’analyte
à doser.
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C. Transducteur conductimétrique
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A. Absorbance et réflectance
Dans un biocapteur enzymatique basé sur l'absorption de la lumière, les réactions qui
se produisent à la surface du transducteur entraînent des changements dans l'environnement
chimique, qui pourraient modifier les propriétés d'absorption de la lumière de l'élément de
bio-reconnaissance à des longueurs d'onde spécifiques.
Une seule fibre ou un faisceau de fibres est généralement utilisé pour apporter de la
lumière à la surface du transducteur du catalyseur d'analyse. Tout au long des réactions
enzymatiques, la lumière transmise ou réfléchie est renvoyée au détecteur par
l'intermédiaire de la ou les fibres, et est mesurée sous forme de signal pour surveiller les
modifications induites par l'élément de reconnaissance, l'analyte ou le produit des réactions
enzymatiques. Donc l’interaction entre le biorécepteur et l’analyte se traduit par l’apparition
d’une coloration dans le milieu réactionnel détectable à une longueur d’onde bien déterminée
provoquant une modification de l’absorbance.
B. Fluorescence
De nombreux biocapteurs optiques à base d'enzymes ont reposé sur la détection d'un
signal fluorescent provenant d'une réaction enzymatique dans laquelle les modifications du
signal de fluorescence peuvent être le résultat de :
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Les biocapteurs ont un très large éventail d'applications qui visent à améliorer la
qualité de la vie. Cette gamme couvre leur utilisation pour la surveillance de l'environnement
et l’agriculture, la détection des maladies, la sécurité alimentaire et les industries alimentaires,
la défense et la découverte de médicaments.
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3. Détection des toxines, produits chimiques toxiques et métaux lourds : Les métaux
lourds, tels que Ag+, As3+, Cd2+, Hg2+, Pb2+ et Zn2+, sont classés dans la catégorie des
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produits toxiques ; les contaminants forment des états d'oxydation stables et interfèrent
avec les voies métaboliques, ce qui conduit à des problèmes de santé.
4. Les procédés de fermentation : Les biocapteurs peuvent être utilisés pour surveiller
la présence de produits (enzymes, d'anticorps, antibiotiques, hormones ou de sous-
produits) ou de biomasse afin de mesurer indirectement les conditions du processus.
Les biocapteurs contrôlent avec précision l'industrie de la fermentation et produisent
des résultats reproductibles grâce à leur instrumentation simple, leur formidable
sélectivité, leur faible coût et leur automatisation aisée. Aujourd'hui, plusieurs types de
biocapteurs commerciaux sont accessibles ; capables de détecter des paramètres
biochimiques (glucose, lactate, lysine, éthanol, etc.) et sont largement utilisés en
Chine, occupant environ 90% de son marché.
L’une des principales applications des biocapteurs est la détection de biomolécules qui
sont soit des indicateurs d'une maladie soit des cibles d'un médicament. Par exemple, les
techniques de bio-détection électrochimique peuvent être utilisées comme outils cliniques
pour détecter les biomarqueurs protéiques du cancer.
Le diagnostic du taux de cholestérol dans le sang est important dans les applications
cliniques dans domaine les maladies cardiovasculaires.
La troponine cardiaque est le seul marqueur actuellement utilisé couramment dans le
cadre de diagnostic des maladies cardiovasculaires, car il est spécifique du tissu
myocardique, facilement détecté, et utile pour la prise de décision thérapeutique.
La CRP, qui reflète différents aspects du développement de l'athérosclérose ou de
l'ischémie aiguë, est l'une des protéines plasmatiques connues sous le nom de
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