Détection Des Résidus Des Antibiotiques Dans Les Viandes de Volailles - Khadija HALMAOUI
Détection Des Résidus Des Antibiotiques Dans Les Viandes de Volailles - Khadija HALMAOUI
Détection Des Résidus Des Antibiotiques Dans Les Viandes de Volailles - Khadija HALMAOUI
www.fst-usmba.ac.ma
Filière ingénieurs
Industries Agro-Alimentaires
Khadija HALMAOUI
Encadré par:
- Mme Fadma GHARRABI LRAR ONSSA MEKNES
- Pr. Laila MANNI FST FES
Présenté le 21 Juin 2018 devant le jury composé de:
-Pr. Abdelali TAZI
-Pr. Amal HAOUDI
- Pr. Laila MANNI
Remerciements
Je tiens à remercier dans un premier temps, toute l’équipe pédagogique de la Faculté des
Sciences et Techniques de FES.
Mes chaleureux remerciements vont à l’équipe de LRAR ONSSA MEKNES pour leur
collaboration et leur contribution à la réussite de mon stage.
Mes sincères remerciements vont aussi au Pr. Laila MANNI mon encadrant au sein de la
FST et Mme Fadma GHARRABI mon encadrant au sein de laboratoire LRAR/ONSSA
responsable d’unité de microbiologie alimentaire pour leur générosité en matière de
formation et d’encadrement et l’aide qu’elles m’ont apporté tout au long de mon stage. Sans
oublier M. Omar AMAR responsable d’unité de bactériologie au sein de la DPIV
« Division de ma Pharmacie des Intrants Vétérinaires » pour ses conseilles pédagogiques
professionnelles et ainsi qu’à toute l’équipe de laboratoire.
J’adresse mes sincères et chaleureux remerciements au Dr Réda EDERAR, Responsable
d’unité de biologie moléculaire, Mme Safae GOUIT responsable d’unité de phytopathologie
aussi M. Abderrahim EDDAHBY responsable d’unité de chimie alimentaire, Dr Réda
MEZOUG médecin vétérinaire au service de l’ONSSA sans oublier Mme Nadia
ADARKAOUI et M. EL Bachir ATFANI pour leurs soutien.
Je tiens à exprimer mon respect et remerciements aux membres du jury Pr Abdelali TAZI et
Pr. Amal HAOUDI qui ont bien voulu donner de leur temps pour corriger ce rapport et
assister à la présentation et l’évaluation de ce travail, ainsi qu’à tout le corps professoral de la
Faculté des Sciences et Techniques de Fès.
Sans oublier toutes les personnes qui m’ont aidée de près ou de loin pendant la période de
stage.
[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
Dédicace
Je dédie ce travail en signe de respect et d’amour à mes très chers parents qui ont partagé
mes joies et mes peines, qui ont été toujours à mes côtés, et qui ont fait de moi ce que je suis
aujourd’hui. Que Dieu les garde toujours en bonne santé.
Khadija HALMAOUI
[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
6. Validation du test....................................................................................................................... 19
B : Détection des résidus des antibiotiques par la méthode alternative : PremiTest............................ 20
I. Principe ......................................................................................................................................... 20
II. Méthode ......................................................................................................................................... 20
III. Mode opératoire ........................................................................................................................ 20
IV. Lecture des résultats .................................................................................................................. 21
C : Détection des résidus des antibiotiques par la méthode de diffusion .............................................. 22
I. Principe ......................................................................................................................................... 22
II. Mode opératoire ............................................................................................................................ 22
1. Etude de la sensibilité des souches de référence aux antibiotiques recherchés ......................... 22
1. Protocole.................................................................................................................................... 22
a. Préparation de l’inoculum ..................................................................................................... 22
b. Préparation du milieu d’ensemencement ............................................................................... 23
c. Ensemencement : Technique par écouvillonnage ................................................................. 23
d. Traitement des échantillons ................................................................................................... 23
e. Dépôt des échantillons........................................................................................................... 23
f. Lecture des résultats .............................................................................................................. 24
D : Détection des résidus des antibiotiques par la méthode des quatre boites ..................................... 24
I. Principe ......................................................................................................................................... 24
II. Mode opératoire ............................................................................................................................ 24
1. Préparation des microorganismes sensibles .............................................................................. 24
a. Bacillus subtilis Réf : ATCC 6633 LT 161006 DPIV RABAT. ........................................... 24
b. Micrococcus luteus Réf ATCC 9341 DPIV RABAT ............................................................ 25
2. Préparation des solutions témoins des antibiotiques ................................................................. 26
a. Solution de triméthoprime TMP : « SIGMA référence T 7883 ».......................................... 26
b. Solution témoin contenant de la pénicilline : « SIGMA référence PENNA » ...................... 26
c. Solution témoin contenant de la dihydrostreptomycine DHS : « SIGMA D 7253 »............. 26
d. Solution témoin contenant de la sulfadimérazine « SIGMA référence S 6256 » .................. 27
e. Solution témoin contenant de l’érythromycine « SIGMA référence E6376 » ..................... 27
3. Traitement des échantillons ....................................................................................................... 27
a. Echantillonnage ..................................................................................................................... 27
b. Prélèvements et stockage....................................................................................................... 27
c. Traitement des échantillons ................................................................................................... 28
4. Technique de diffusion .............................................................................................................. 28
[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
Introduction générale
La production de viande blanche a connu un essor important au Maroc au cours de ces dernières
années, ce qui a rendu le prix de ce produit relativement bas et très attractif pour le
consommateur. Elle se présente ainsi comme la principale source de protéines d’origine animale
pour la population. Dans l'élevage de volailles, les agriculteurs utilisent plusieurs variétés de
produits pharmaceutiques et en particulier des antibiotiques. Ils sont utilisés soit en tant que
promoteurs de croissance pour augmenter les rendements de production ou en tant que remèdes
thérapeutiques pour traiter et prévenir contre les maladies spécifiques.
Les antibiotiques occupent une place de choix. Néanmoins, leur utilisation sans contrôle peut
conduire à la formation des résidus dans les produits issus de ces animaux, surtout lorsque les
délais d’attente ne sont pas respectés par les utilisateurs.
Les risques potentiels liés à la présence des résidus dans les denrées alimentaires d’origine
animale sont de plusieurs ordres : risques cancérigènes (Nitrofuranes), risques allergiques
(Pénicillines, Streptomycine), risques toxiques (Chloramphénicol), modification de la flore
intestinale (Tétracyclines).
C’est dans ce cadre que s’inscrit ce travail réalisé au sein du Laboratoire Régional d’Analyses et
Recherches, qui vise la détection des résidus d’antibiotiques dans les viandes de volailles en
utilisant différentes méthodes qualitatives et quantitatives.
Pour ce faire, ce présent travail est divisé en trois parties :
Dans la première partie qui concerne la bibliographie, nous rappelons brièvement la progression
de la production des viandes blanches au Maroc ainsi l’utilisation des antibiotiques en aviculture
et ses effets néfastes sur la santé du consommateur.
La deuxième partie représente le matériel et les méthodes, nous abordons dans cette partie le
protocole expérimental des différentes méthodes de détection des résidus des antibiotiques
réalisé au sein de la DPIV et LRAR « ONSSA ».
La troisième partie comporte les principaux résultats et discussions.
1
[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
I. Description de l’ONSSA
L’Office National de Sécurité Sanitaire des Produits Alimentaires (ONSSA) est un établissement
public doté de la personnalité morale et de l’autonomie financière crée par la loi n° 25-08 et
placé sous la tutelle de l’Etat. Il exerce, pour le compte de l’Etat, les attributions relatives à la
protection de la santé du consommateur et à la préservation de la santé des animaux et des
végétaux. Il est appelé à appliquer la politique du gouvernement en matière de sécurité sanitaire
des végétaux, des animaux et des produits alimentaires depuis les matières premières jusqu’au
consommateur final, y compris les aliments pour animaux.
2
[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
Sérologie Réception
Phytopathologie Biologie Toxicologie
moléculaire alimentaire
Secrétariat
Virologie
Contrôle des
semences et Régie des recettes
Bactériologie
plants
Gestion d’inventaire
Parasitologie
et magasins
3
[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
Partie I: Synthèse
bibliographique
A : Filière avicole au Maroc
2. Définition de la volaille
Le terme « volaille » englobe : les poulets, canards, oies, dindes, pintades….etc. De tous, ce sont
les poulets dont l’élevage est le plus répandu. L’aviculture prend une place de choix dans les
plans de développement de nombreuses nations tant pour des raisons nutritionnelles et
économiques que de goût.
4
[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
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[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
Phosphore mg 480
Potassium mg 287
Calcium mg 13,7
Manganèse mg 0,02
Fer total mg 0,74
Cuivre mg 0,04
Zinc mg 0,86
Vitamine D µg 0
Vitaminique E mg 0,28
Vitamine C mg 17
Vitamine B1 ou Thiamine mg 0,15
Vitamine B2 ou Riboflavine mg 0,09
Vitamine B3 ou Niacine mg 10,7
6
[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
4. Mode d’action
L’action d’un antibiotique est le résultat des interactions organisme-antibiotique d’une part et
antibiotique-bactérie d’autre part ; pour résumer ces dernières, on peut dire que pour être actif,
un antibiotique doit :
Pénétrer jusqu’à sa cible bactérienne ;
Ne pas être inactivé ;
Etre capable de se lier à sa cible.
Ce sont là les conditions nécessaires à l’activité antibactérienne ; l’antibiotique exercera son
action qui pourra être de deux types :
Bactériostatique s’il n’y a qu’une simple inhibition de la croissance bactérienne ;
Bactéricide s’il y a mort de la bactérie.
Le mécanisme d’action des antibiotiques n’est pas toujours parfaitement élucidé mais on
distingue cinq grands modes d’action : (figure 2).
Action sur la synthèse du peptidoglycane ;
Action sur la membrane cytoplasmique ;
Action sur l’ADN ;
Action sur la synthèse des protéines ;
7
[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
8
[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
9
[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
b. Risque cancérigènes
Certains antibiotiques ont des propriétés cancérigènes connues. En effet, les résidus de ces
antibiotiques peuvent avoir un effet cancérigène sur le long terme, suite à une consommation
régulière d’aliments contenant ces résidus. Certains antibiotiques ou composés utilisés comme
antibiotiques sont alors interdits d’utilisation chez les animaux de reproduction ; c’est le cas des
nitrofuranes, des nitroimidazoles utilisés chez les poissons (Stoltz, 2008).
10
[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
d. L’antibiorésistance
L’utilisation des antibiotiques en thérapeutique humaine ou vétérinaire s’accompagne de
l’apparition de résistances à ces mêmes antibiotiques chez les bactéries ce qui constitue un
problème très préoccupant du fait des répercussions directes sur les possibilités thérapeutiques.
Pour de nombreux auteurs, les résidus d’antibiotiques entraînent une sélection des souches
bactériennes résistantes dans le tractus gastro-intestinal des consommateurs mais jamais une
induction de la résistance, sauf rares exceptions, comme pour l’érythromycine. La pression de
sélection favorise l’augmentation du nombre de micro-organismes résistants, que cette résistance
soit naturelle ou acquise, et que ces microorganismes soient pathogènes ou non (Van-Den
Bogaor, 2001).
11
[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
12
[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
3. Antibiogramme
Il s’agit d’une technique de mise en évidence de la sensibilité d’un germe déterminé, isolé par
culture vis-à-vis de certains antibiotiques. Il est pratiqué selon deux méthodes : (pharmacopée
européenne 6.0)
a. Méthode de dilution
Elle permet d’établir la concentration minimale inhibitrice (CMI) en mettant le germe en
présence de différentes concentration d’antibiotique en milieu liquide « bouillon de culture ».
13
[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
14
[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
1. Test Charm II
Selon le référentiel (Charm Science, 2016) Le test Charm II est un essai rapide de radiorécepteur
pour la détection des résidus des déférentes familles des antibiotiques et peut être utilisé sur trois
produits alimentaires : les viandes, les œufs et le lait.
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[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
Partie II : Matériel
et Méthodes
A : Test Charm II
D : Détection des résidus des antibiotiques par la méthode des quatre boites
A : Test Charm II
Ce travail a été effectué au service bactériologique au sein de la division pharmaceutique des
intrants vétérinaires à RABAT. Il a pour objectif la contribution à la validation de la méthode de
détection des résidus des antibiotiques dans les viandes de volailles selon le référentiel Charm
Science INC OM-237-009 Août 2016.
I. Principe
Le test Charm II β-lactamine utilise un réactif de liaison avec des sites récepteurs spécifiques qui
lient tous les médicaments bêta-lactamines. Le liant est ajouté à un extrait d'échantillon avec une
quantité de pénicilline marquée au [3H] (traceur). Tous les médicaments bêta-lactamines de
l'échantillon sont en concurrence pour les sites de liaison avec ce traceur.
La quantité de traceur qui se lie aux sites récepteurs est mesurée et comparée à un point de
contrôle préalablement déterminé. Le point de contrôle est le point de coupure entre un
échantillon négatif ou positif. Plus la quantité de traceur mesurée est grande, plus la
concentration de béta-lactamines dans l'échantillon est faible. Plus la quantité de traceur mesurée
est petite, plus la concentration de bêta-lactamines dans l'échantillon est élevée.
Reconstituer le réactif MSU-MA avec 10,0 mL d'eau distillée. Bien agiter. Puis mettre au
réfrigérateur ou dans la glace pendant 15 minutes. Mélanger avant utilisation. La concentration
finale de MSU-MA est 1000 ppb de pénicilline G.
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[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
Reconstituer le TPNC avec 10,0 mL d'eau distillée. Bien agiter. Laisser le TPNC reposer au
réfrigérateur ou dans de la glace pendant 15 minutes. Mélanger avant utilisation. Le TPNC
reconstitué peut être conservé au réfrigérateur pendant 48 heures maximum.
Reconstituer le MSU-EB avec 1000 mL d'eau distillée dans un récipient propre. Bien mélanger.
Laisser MSU-EB atteindre la température ambiante avant utilisation. MSU-EB reconstitué peut
être réfrigéré jusqu'à 2 mois. Ne pas congeler.
d. M2 Buffer
Reconstituer avec 50,0 mL d'eau distillée. Bien mélanger. Le tampon M2 reconstitué peut être
réfrigéré jusqu'à 2 mois. Ne pas congeler.
1. Pour préparer le contrôle négatif, diluer 2,0 mL de concentré négatif de performance tissulaire
(TPNC) avec 6,0 mL de tampon d'extraction MSU (MSU-EB). Bien mélanger.
2. Utiliser 2,0 mL de contrôle négatif à l'étape 3 de la méthode de dosage du bêta-lactame
Charm II - Procédure de dosage.
b. Contrôle positif
1. Ajouter 0,3 mL du réactif de standard multi-antimicrobienne de MSU-MA à 5,7 mL de TPNC
dans un tube à centrifuger. Bien mélanger.
2. Dans un nouveau tube à centrifuger, diluer encore 2,0 mL du mélange TPNC / MSU-MA avec
6,0 mL MSU-EB. Bien mélanger. Utilisez ceci comme contrôle positif.
3. Utiliser 2,0 mL de contrôle positif à l'étape 3 du test du bêta-lactame Charm II - Procédure de
dosage.
c. Point de contrôle
Le point de contrôle est un nombre de compte par minute entre un négatif et un positif. Le point
de contrôle pour les tissus est calculé à partir des données obtenues en utilisant le contrôle
négatif.
1. Diluer 4,0 mL de TPNC avec 12,0 mL de MSU-EB à température ambiante pour obtenir le
contrôle négatif.
2. Réaliser 6 répétitions du contrôle négatif et déterminez la moyenne du contrôle négatif.
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[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
4. Echantillonnage
Pour la validation de cette méthode, on a utilisé juste deux échantillons de viande de volaille.
Le premier échantillon, c’est une viande dopées par la pénicilline avec une concentration de la
LMR (50 ppb / mL), à partir de cette échantillon nous avons réalisé les tests de capacité de
détection de l’antibiotique CCβ et le test de reproductibilité avec changement de deux paramètres
(le temps et l’opérateur).
Le deuxième échantillon est un poulet qui ne contient pas des traces de pénicilline et cet
échantillon utilisé pour le test de spécificité.
5. Extraction de l'échantillon
Les essais sont effectués à des températures ambiantes qui peuvent être comprises entre 4 et
35°C. On utilise dans ce test du muscle frais ou congelé.
4. Placer le tube dans un incubateur à 80 ± 2 ° C pendant 30 minutes puis dans un bain d'eau
glacée pendant 10 minutes.
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[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
Etape 1 Ajouter le comprimé vert fourni par le kit dans un tube à essai vide.
Etape 11 Mettre le tube dans l'analyseur pendant 60 secondes. Lire cpm (coups
par minute) sur le canal [3H].
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[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
Selon (ANSES, 2014), Pour la validation, chaque échantillon doit être répété 20 fois.
La répétabilité c’est la fidélité dans les conditions de répétabilité, ces conditions de réalisation
de l’analyse sont :
Spécificité : est définie comme l’accord négatif qui signifié qu’un échantillon réellement négatif
est détecté négatif par cette méthode.
Reproductibilité : c’est la fidélité dans les conditions de reproductibilité, ces conditions sont :
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[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
7-Mettre les ampoules dans l’incubateur à une température de 64°C pendant 3 heures.
8-Retirer les ampoules dès qu’un changement de couleur du contrôle négatif a lieu.
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[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
Concentration
10µg 25µg 15µg 30µg 10µg
d’antibiotique
1. Protocole
a. Préparation de l’inoculum
Prélever stérilement une à plusieurs colonies de même aspect et mettre en suspension dans 5 mL
d’eau physiologique alors que pour Listeria, on utilise uniquement 2 ml d’eau physiologique. Un
trouble identique à celui de l’étalon 0,5 de la gamme de McFarland doit être obtenu.
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[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
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[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
D : Détection des résidus des antibiotiques par la méthode des quatre boites
L’objectif de ce travail est la validation de la méthode de détection des résidus des antibiotiques
par la méthode des quatre boites selon le référence AFSSA LMV/90/01 version 7/ Décembre
2011.
La présente méthode a pour objectif, à l’aide de micro-organismes sensibles, la mise en évidence
de résidus de substances à activité antibiotique sensible (les β-lactamines et les tétracyclines, les
sulfamides, les aminosides, et les β-lactamines et les macrolides).
I. Principe
La détection des résidus des antibiotiques nécessite l’application d’une technique de diffusion en
gélose qui comporte :
L’ensemencement par un microorganisme sensible aux substances à activité antibiotique,
d’un milieu nutritif solide coulé en boite de Pétri.
Le dépôt à la surface du milieu ensemencé, d’une rondelle de muscle congelé, suivi d’une
incubation à la température optimale de développement du microorganisme test.
Les substances à activité antibiotique éventuellement présentes inhibent la croissance du
microorganisme test : il en résulte la formation d’une zone d’inhibition autour de l’échantillon.
Cette méthode requiert l’utilisation des deux espèces suivantes : B. subtilis cultivé à deux pH
différents (6 et 8) et Micrococcus luteus cultivé également à deux pH différents (7,4 et 8).
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[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
TSA (Tryptone Soja Agar, annexe 2.2). En parallèle ensemencer en stries une boite de TSA pour
isolement et confirmation de l’identification. Incubation est réalisée pendant 18h à 30°C.
A partir du troisième repiquage et à l’aide d’une dizaine de billes de verre et de 2 mL d’eau
physiologique, on récolte la culture sous forme d’une suspension.
Dans une boite de roux, répartir cette suspension à la surface du milieu de sporulation. (Annexe
2.2). Incuber à 30°C pendant 7 jours.
Récolter dans un tube stérile les spores obtenues avec les billes de verre et 25 mL d’eau
physiologique.
Incuber le tube contenant la suspension de spores à 70°C pendant 30 min.
Centrifuger cette suspension de spores 15 min à 4400 rpm. Eliminer le surnagent, répéter le
lavage deux fois.
Reprendre le culot avec environ 50 mL d’eau physiologique.
Répartir 1,5 mL de SS dans des eppendorfs stériles, cette suspension de spores aliquotée est
conservée à 4°C pendant une année.
Numération des suspensions de spores :
Au hasard, prendre 3 eppendorfs pour déterminer la concentration de lot de suspension de
spores (carte de contrôle de B. Subtilis en annexe 1).
Réaliser des dilutions décimales dans de l’eau physiologique jusqu’à 10-10, ensemencer 1
mL de chaque dilution en profondeur avec 15 mL de milieu TSA. Incuber à 37°C
pendant 18 heures.
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[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
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[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
La concentration de cette solution est de 1000 µg de pénicilline par mL. Elle est conservée à -
18°C pendant 6 mois. La concentration de cette solution est de 1000 µg/mL.
Préparer une dilution au 1/200 de la solution mère dans l’eau. La concentration finale est de 5
µg/mL de DHS active.
a. Echantillonnage
20 échantillons de viande blanche de type poulet ont été prélevés par un médecin vétérinaire de
l’ONSSA dans la région de Meknès.
4 échantillons (TP1, TP2, TP3 et TP4) de viande blanche considérés comme témoin positif sont
dopés par les quatre familles d’antibiotiques pour la validation de la méthode au niveau du
laboratoire. Les antibiotiques utilisés dans cette méthode sont la pénicilline, la
dihydrostreptomycine, la sulfadimérazine et l’érythromycine.
Un échantillon (TN) considéré comme témoin négatif ne subit aucun traitement par les
antibiotiques.
b. Prélèvements et stockage
Le prélèvement s’est effectué juste après l’abattage, on a découpé à l’aide d’un couteau et une
pince stérile 50 g de la viande à analyser.
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[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
Chaque échantillon est mis dans un sachet stérile, fermé et numéroté puis conservé au
congélateur à une température de -18°C.
c. Traitement des échantillons
Mettre l’échantillon congelé à température ambiante pendant quelques minutes.
Prélever sur chaque échantillon une carotte cylindrique de 8 mm de diamètre et de 2 cm de long
à l’aide d’un emporte-pièce.
Découper à l’aide d’un bistouri huit rondelles de viande de 2 mm d’épaisseur. Puis placer deux
rondelles en positions diamétralement opposées sur chacune des quatre boites d’essai en utilisant
des pinces.
4. Technique de diffusion
a. Bacillus subtilis à pH 6
Déposer au centre de la boite du milieu test agar un disque de papier filtre. Déposer sur le disque
10 µL de la solution témoin contenant l’antibiotique.
Tableau 6: Les antibiotiques standards et le temps d'incubation de chaque souche
B. Subtilis M. luteus
pH 6 8 7,4 8
antibiotiques pénicilline DHS sulfadimérazine érythromycine
standard
temps et 30°C/18h 30°C/18h 37°C/24h 37°C/24h
température
d'incubation
5. Lecture des résultats
Selon Afssa (2011), les deux souches bactériennes de B. Subtilis et M. luteus permettent la
détection de nombreuses familles d’antibiotiques à savoir :
B. Subtilis à pH 6 : Cette souche permet de détecter plus particulièrement les résidus de
substances à activité antibiotique de la famille des β-lactamines ou des tétracyclines.
B. Subtilis à pH 8 : Cette souche permet de détecter plus particulièrement les résidus de
substances à activité antibiotique de la famille des aminosides.
M. luteus à pH 7.4 : Cette souche permet de détecter plus particulièrement les résidus
de substances à activité antibiotique de la famille des sulfamides et des β-lactamines.
M. luteus à pH 8 : Cette souche permet de détecter plus particulièrement les résidus de
substances à activité antibiotique de la famille des β-lactamines et des macrolides.
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[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
1. Matériel biologique
L’échantillon correspondant au témoin positif, est un poulet qui a reçu l’antibiotique
« pénicilline » par injection. L’échantillon qui n’a reçu aucun traitement d’antibiotiques
correspond au témoin négatif. Pour la détection des résidus d’antibiotiques, 9 parmi les 20
échantillons traité par la méthode de diffusion sont poulets choisis aléatoirement Pour l’analyse
et sont respectivement : E1, E15, E12, E6, E11, E18, E19, E20, E16.
2. Appareillage et réactifs
Spectrophotomètre.
Acétonitrile
Iso-propanol
Acide chlorhydrique 1N et 0.01N
Chlorure de méthylène
Ether de pétrole
Formaldéhyde
Pénicilline (antibiotique standard)
3. Méthodes
a. Technique turbidimétrique
Elle consiste à incuber des tubes calibrés contenant à la fois le milieu de culture inoculé avec une
bactérie sensible et les solutions d’un antibiotique. Après la période d’incubation, l’effet de
l’antibiotique sur la croissance bactérienne est mesuré par le changement de l’absorbance
mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre.
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[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
b. Dosage turbidimétrique
Prélever 1 mL de chaque extrait obtenu et ajouter 9 mL de milieu inoculé (milieu BTS
annexe 2.4). Homogénéiser, puis incuber les tubes dans l’étuve à 37°C pendant 24h.
Après incubation, arrêtez la croissance des micro-organismes par addition de 0,5 mL de
formaldéhyde. La lecture de l’absorbance est effectuée au spectrophotomètre à une longueur
d’onde de 530 nm.
c. Courbe d’étalonnage
Préparer une gamme d’étalons aux concentrations finales de 0,1 à 0,8 µg/mL à partir d’une
solution mère à 1000 µg/mL obtenue par dissolution de 30 mg de pénicilline dans 25 mL de
méthanol et ajuster à 50 mL avec l’eau distillée. 1 mL de chaque solution de la gamme étalon est
traité de la même façon que les échantillons pour le dosage turbidimétrique.
Le tableau 7 montre les résultats de l’absorbance des témoins positifs et négatifs ainsi que les
étalons qui nous a permettent de tracer la courbe d’étalonnage (figure 6).
30
[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
y = 0,2444x + 0,1091
Courbe d'étalonnage R² = 0,9439
0,4
0,35
0,3
Absorbance
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Concentration en µg/ml
31
[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
Partie III :
Résultats et Discussion
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Dans ce travail nous avons appliqué cinq méthodes différentes pour la détection des résidus des
antibiotiques dans les viandes de volailles.
I. Test Charm II
Le test Charm II est un test très rapide qui permet la détection des résidus des antibiotiques par
famille.
La validation de la méthode de détection des résidus des antibiotiques nécessite l’utilisation des
tests statistiques tels que :
La capacité de détection
La spécificité
La reproductibilité
La répétition du contrôle négatif six fois permet de déterminer le point de contrôle. Les résultats
sont résumés dans le tableau suivant.
Tableau 8: Détermination de point de contrôle
La validation de la méthode de détection des résidus des antibiotiques dans les viandes par ce
test permet de donner un point de contrôle de l’ordre de 1277 cpm (coups par minute).
Le tableau 9 présente les résultats de capacité de détection de la pénicilline. Pour le même
échantillon répété 20 fois
L’analyse des résultats montre que les 20 répétitions donnent des résultats inférieurs au point de
contrôle donc l’échantillon contient des traces d’antibiotiques de pénicilline supérieure à la
LMR.
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Le tableau 10 résume les résultats de la spécificité de test Charm II pour le même échantillon
(échantillon ne contient pas des traces des antibiotiques) répété 20 fois.
La répétabilité 20 fois de l’échantillon donne des résultats supérieurs au point de contrôle (1277).
Donc l’échantillon traité ne contient pas des résidus des antibiotiques ou bien ne contient pas des
traces des antibiotiques de la famille des β-lactamines.
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Pour le même échantillon traité, la répétition 20 fois a donné des valeurs inférieures au point de
contrôle donc on peut conclure qu’il y a présence des résidus de pénicilline.
E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10
- + - - + + - - + +
E11 E12 E13 E14 E15 E16 E17 E18 E19 E20
+ + - + + - - + + +
E21 E22 E23 E24 E25 E26 E27 E28 E29 E30
+ + - + + - - - - -
E : Echantillon/- : Résultat négatif/+ : Résultat positif
positif
47% négatif
53%
Dans 47% des échantillons, le changement de couleur du violet au jaune sur les deux tiers
inferieurs de l’ampoule, indique l’absence d’une substance inhibitrice. Ainsi, 53% des
échantillons contiendraient des résidus d’antibiotiques. En considérant les seuils de sensibilité du
PremiTest et les limites fixées par la règlementation (Tableau 13), les échantillons positifs
contiendraient :
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Tableau 13: Seuils de déectabilité des principales familles d'antibiotiques par le PremiTest
par rapport aux LMRs dans les viandes de volailles (AFNOR,2006)
Gentamyci
Antibiotique Sulfadimérazine Oxytétracycline Tylosine Amoxicilline
ne
LMR (µg/kg 100 100 100 50 50
Limite de dét
2*LMR 2*LMR LMR 0.5*LMR >2*LMR
ection
Ces résultats nécessitent la confirmation par d’autres méthodes qui permettront d’identifier la
famille des antibiotiques présentent dans les échantillons.
Tableau 14: Diamètre des zones d'inhibitions obtenues pour les antibiotiques testés avec les
souches de références et normes
Les résultats de l’analyse de 20 échantillons par la méthode de diffusion sont résumés dans le
tableau15.
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Tableau 15: Diamètre moyen des zones d'inhibitions en mm des échantillons obtenus
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Figure 8 : Comparaison de la sensibilité des échantillons téstés par rapport des souches
utilisées
Les résultats montrent que la souche de S. aureus, est sensible à l’ampicilline avec une
concentration de 10 µg, et un diamètre de la zone d’inhibition de l’ordre de 30 mm. Parmi les 20
échantillons traités on a seulement 20% échantillons qui sont sensibles alors que les 80% des
échantillons sont résistants.
Pour E. coli la zone d’inhibition de la tétracycline est de l’ordre de 28 mm. Donc cette souche est
très sensible à cet antibiotique. Dans 20 échantillons traités, 80% sont résistants à cette souche
alors que 20% sont intermédiaires donc tous les échantillons ne contiennent pas des traces de
tétracycline ou bien contiennent des résidus mais inférieurs à la concentration de 30 µg.
La souche de B. Subtilis est très sensible à la pénicilline car elle présente une zone d’inhibition
de 33 mm de diamètre. On note également que plus de 25% des échantillons contiennent des
résidus d’antibiotiques de pénicilline avec une concentration minimale de 10 µg alors que 55%
sont résistants.
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La méthode des quatre boites permet l’identification de la famille des antibiotiques présente dans
les viandes. L’utilisation des disques imprégnés de solutions d’antibiotiques témoins pour
chaque milieu nous permet de vérifier la fiabilité de la technique. C'est-à-dire la bonne
concentration en microorganismes tests et la sensibilité de ces derniers vis-à-vis de
l’antibiotique, ce qui nous permet de déduire que les conditions opératoires sont crédibles. La
présence de la zone d’inhibition s’explique par la présence des résidus d’antibiotiques dans les
échantillons analysés, inhibant ainsi la croissance des microorganismes tests autours du disque
de viande. (Pavlov et al., 2008).
La validation de la méthode des quatre boites nécessite une répétition 20 fois de chaque
échantillon « TP1, TP2, TP3, TP4 et TN ». Les zones annulaires moyennes obtenues sont
résumées dans le tableau 16.
Tableau 16: Zone annulaire moyenne des témoins positifs et négatifs avec les normes
Antibiotique
Souches pH standard
Norme Antibiotique TP1 TP2 TP3 TP4 TN
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Les résultats de la validation de la méthode des quatre boites (tableau 16) montrent que la
répétabilité 20 fois de chaque échantillon « TP1, TP2, TP3 et TP4» donne des zones annulaires
identiques à la norme, donc les souches bactériennes utilisées dans cette méthode sont très
sensibles aux familles des antibiotiques testées.
Pour le TN, c’est le témoin négatif qui ne subit aucun traitement d’antibiotiques. Les résultats
montrent une zone annulaire nulle pour les 20 répétitions. Donc les souches de B. Subtilis et M.
luteus permet de détecter l’absence ou bien la présence des résidus des antibiotiques.
Après la validation, nous avons utilisé la méthode des quatre boites pour l’analyse des 20
échantillons.
Pour chaque échantillon, la répétabilité deux fois permet de donner une zone annulaire moyenne
qui doit être comparée avec la zone annulaire de l’antibiotique standard.
Le tableau 17 résume les résultats de la méthode des quatre boites pour les 20 échantillons.
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zone annulaire en mm
Antibiotique
Souche pH Norme Antibiotique E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10
standard
zone annulaire en mm
Antibiotique
Souche pH Norme Antibiotique E11 E12 E13 E14 E15 E16 E17 E18 E19 E20
standard
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nombre des échantillons 12
10
8
6
4
2
0
Bacillus Bacillus Micrococcus Micrococcus
Subtilis pH6 Subtilis pH8 luteus pH7,4 luteus pH8
positif 8 14 12 14
négatif 12 6 8 6
Figure 9 : Comparaison de la présence des résidus des antibiotiques entre les souches
de B. Subtilis et M. luteus
Pour la souche de Bacillus à pH 8, 70% des échantillons sont considérés comme positifs donc il
y a la présence des traces de pénicilline, alors que pour la même souche à pH 6, seulement 40 %
des échantillons sont positifs donc il y a présence des résidus des antibiotiques de la famille de
DHS.
La souche de Micrococcus à pH 8 représente un pourcentage de 70% des échantillons positifs
alors que pour la même souche à pH 7,4 un taux de 60 % des échantillons contenant des traces
de sulfadimérazine a été enregistré.
Donc les deux souches de Bacillus et Micrococcus à pH 8 permettent de détecter les résidus des
antibiotiques présents dans les échantillons avec un pourcentage de plus de 57%.
Pourcentage des
échantillons positifs Bacillus
Micrococcu Subtilis
s luteus pH6
pH8 17%
29%
Bacillus
Micrococcu Subtilis
s luteus pH8
pH7,4 29%
25%
Figure 10: Pourcentage des échantillons positifs selon les souches de références
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Les résultats obtenus par cette méthode (tableau 17) permettent la détection de nombre de
famille d’antibiotiques présentés dans chaque échantillon. Par exemple, l’échantillon E5 contient
des résidus des quatre familles d’antibiotiques utilisées.
10%
une seule famille d'antibiotiques
15%
45%
deux familles d'antibiotiques
30%
plus de deux familles d'antibiotiques
Figure 11: Répartition des résultats selon le nombre des familles d'antibiotiques détectés
D’après la figure 11, seulement 10% des échantillons ne présente pas des résidus d’antibiotiques.
Ce résultat pourrait s’expliquer soit par l’absence de ces molécules, soit par leur présence mais à
une quantité indétectable.
Nous observons que 45% des échantillons analysés étaient positifs à plus de deux familles
d’antibiotiques, 30% sont positifs à deux familles d’antibiotiques et 15% positifs à une seule
famille d’antibiotique. Certains échantillons sont apparus positifs pour plusieurs familles
d’antibiotiques. Ce qui suggère que ces animaux ont reçu plusieurs familles d’antibiotiques, soit
pour des fins thérapeutiques (association d’antibiotiques), soit comme promoteurs de croissance.
On peut donc conclure que l’utilisation de la méthode des quatre boites pour l’analyse de nos
échantillons, montre que les souches de B. subtilis et M. luteus sont les souches les plus
fréquemment utilisées pour la recherche des résidus d’antibiotiques dans la viande après avoir
testé leur sensibilité vis-à-vis des quatre molécules couramment utilisées en médecines
vétérinaires.
Selon Oufella et Smail (2012), plus de 30% des échantillons analysés étaient positifs à plus de
deux familles d’antibiotiques simultanément, 10% à deux familles d’antibiotiques simultanément
et 3,33% positifs à une seule famille d’antibiotique. Selon Duval et soussy (1990), l’association
d’antibiotiques est prescrite dans le souci d’élargissement du spectre d’activité et cela soit à titre
de traitement d’urgence en cas de maladie grave non diagnostiquée avec précision. Soit pour
traiter une infection mixte, à plusieurs germes, ou supposée telle.
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[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
Alors que Brugère (1992), considère l’association de plusieurs antibiotiques comme étant une
issue afin d’éviter tout échec thérapeutique et aussi pour élargir le spectre d’activité.
La présence des résidus d’antibiotiques est probablement liée à un traitement des animaux suivi
d’un délai d’attente insuffisant. En effet, le non-respect de ce délai cause l’augmentation de la
teneur des résidus d’antibiotique dans les denrées alimentaires, d’où leur inconformité (Laurentie
et sanders, 2002).
L’utilisation abusive et anarchique des antibiotiques comme facteurs de croissance serait due à :
Aux vétérinaires qui ont tendance à prescrire des traitements sans visite, ni consultation
des animaux.
Aux éleveurs dont la consultation des vétérinaires est instable et pratiquant souvent
l’automédication Abiola et al. (2005).
Les résultats obtenus montrent la présence de l’antibiotique recherché (pénicilline) dans six
échantillons parmi les neuf analysés à une concentration variant de 0,10 à 0,79 µg/g. Cette
situation pourrait s’expliquer par le fait que les pénicillines sont considérées parmi les
antibiotiques les plus utilisés en médecine vétérinaire et que leur délai d’attente est assez long de
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[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
l’ordre de 21 j.
Alors que pour la même méthode réalisée par Ramdane (2015), la recherche des résidus de
l’antibiotique (oxytétracycline) pour le même nombre d’échantillons analysés présente une
concentration variant de 0,61 à 0,96 µg/g. donc la présence des traces des antibiotiques dans tous
les échantillons. Cela est dû à l’utilisation abusive de cet antibiotique par les médecins
vétérinaires, et le délai d’attente de l’oxytétracycline qui est de l’ordre de 7j.
Tableau 19: Comparaison entre les différentes méthodes de détection des résius des
antibiotiques
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[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
Conclusion
Notre travail nous a permis d’établir un protocole d’analyse avec différentes méthodes de
détection des résidus des antibiotiques dans les viandes de volailles.
La méthode des quatre boites a révélé la présence des échantillons contaminés par plusieurs
familles d’antibiotiques, soit 45% sur la totalité des échantillons analysés.
Les pourcentages élevés des résidus d’antibiotiques présents dans le muscle est de l’ordre de
70% pour Bacillus Subtilis et Micrococcus leutus à pH 8. Ceci, nous renseigne sur l’usage abusif
et anarchique des antibiotiques dans l’élevage des volailles.
Le contrôle de ces résidus dans les denrées alimentaires est un processus complexe et coûteux,
mais il reste indispensable pour garantir la protection de la santé publique, le respect des règles
qui régissent le commerce, et la production de matières premières de qualité pour l’industrie
agroalimentaire.
Vu les résultats obtenus dans notre étude, les causes majeures de la présence des résidus des
antibiotiques dans les viandes de volailles sont probablement:
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[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
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[MEMOIRE DE PROJET DU FIN D’ETUDE] LRAR-ONSSA MEKNES
Sites Internet :
www.agrimaroc.ma
www.onssa.gov.ma
www.fisamaroc.org.ma
www.salon-agriculture.ma
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Annexes
Annexe 1 : Carte de contrôle de Bacillus Subtilis
Exp:19-04-2019
100
LIC
80
LSA
60
LIA
40
X
20
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Essais
5. Préparation
Dissoudre la composition de chaque milieu dans 1 L d’eau distillée, chauffer au bain marie en
agitant jusqu’à l’obtention d’une phase homogène vérifier le pH et éventuellement le corriger
puis mettre le milieu dans autoclave à une température de 121°C pendant 15 minutes puis laisser
refroidir.
www.fst-usmba.ac.ma
Résumé
Durant ce présent travail, nous avons utilisé différentes méthodes qualitatives et quantitatives de
détection des résidus des antibiotiques dans les viandes de volailles.
La validation de la méthode de référence des quatre boites permet de vérifier la fiabilité des souches
utilisées, En effet les deux souches bactériennes de Bacillus Subtilis et Micrococcus leutus sont très
sensibles à plusieurs familles des antibiotiques utilisés en médecine vétérinaire.
Les résultats des différentes méthodes aboutissent à un pourcentage élevé des échantillons positifs qui
contient des traces des antibiotiques supérieurs à la LMR. Cela est dû aux nombreux facteurs parmi
lesquels, le non-respect du délai d’attente, l’usage de ces molécules comme promoteur de croissance à
titre préventif et l’usage abusif sans diagnostic et sans contrôle officiel.
Mots clés : Volaille, résidus d’antibiotiques, délai d’attente, LMR, antibiotique, Contrôle.
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