RAPPORT DE STAGE

Le laboratoire Régional de Diagnostic Epidémiologique et

d’Hygiène du Milieu

REALISER PAR :

FATHALLAH ASMAE
TOURAOUINE SARA
YASSINE TAHA

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 INFORMATIONS CONCERNANT LE STAGE

ENCADRER PAR : Dr AIT MELLOUL ABDELAZIZ

FILIERE : TECHNIQUES DE SANTE
OPTION : LABORATOIRE – S4
PERIODE : 01/03/22 à 25/03/22.
PROMOTION : 2020-2023
SITE DE STAGE : Le laboratoire Régional de Diagnostic Epidémiologique
et d’Hygiène du Milieu

OBJECTIFS DE STAGE
Les stages en laboratoire nous ont permet :

D'apprendre à De conduire D'acquérir et d'approfondir ou

travailler en une réflexion d'appliquer des méthodologies
situation critique sur les
et des techniques nouvelles.
réelle. résultats
obtenus.

De s'insérer dans une équipe de

D’Apprendre le sens de la
professionnels et de percevoir
responsabilité et la
l'importance des facteurs humains et
collaboration.
des relations sociales au sein de
l'entreprise.

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 REMERCIEMENTS

Grâce à Allah le tout puissant on est maintenant ici

pour vous envoyer nos sincères remerciements.
Nous remercions tous ceux qui ont contribué au succès de
notre stage, y compris toute l'équipe pédagogique de
L’institut supérieure des professions infermières et de
techniques de santé de Marrakech, en particulier notre
coordinatrice, Mme EL MOUAHID SOUAD, vue à ses efforts
immenses qu'elle fait pour nous suivre, nous encadrer, et nous
conduire à développer ce travail. Nous souhaitons encore adresser
nos remerciements au corps professoral de notre institut, pour la
qualité de leur enseignement, et leur patience envers les
inondations de nos questions.

Nous voulons aussi adresser toute notre gratitude, au personnel du

laboratoire régional de diagnostic épidémiologique et d’hygiène du
milieu, en particulier le chef du laboratoire DR AIT MELLOUL
ABDELAZIZ pour ces conseils et pour nous avoir fait confiance, et
nous avoir donné la chance de travailler et de découvrir le monde
de la microbiologie surtout celle des eaux et des aliments.

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 SOMMAIRE

I. Introduction

II. Description du laboratoire

III. Définitions

IV. Réception des échantillons

1. Les critères de la réception des denrées alimentaires

2. Les critères de la réception des échantillons d’eaux

V. Traitement des échantillons

1. Microbiologie des aliments

2. Microbiologie des eaux

VI. Diagnostic des maladies parasitaires

1. Le paludisme

2. La leishmaniose

VII. Conclusion

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 I. Introduction :

La Microbiologie Ensemble des disciplines biologiques qui traitent des organismes

microscopiques, qu'ils appartiennent au règne végétal (bactéries, algues,
champignons) ou au règne animal. Elle est aujourd'hui divisée en de multiples
branches : bactériologie, mycologie, parasitologie et virologie. On distingue deux
types (Microbiologie médicale & alimentaire) dont l’alimentaire sera le sujet traité
dans ce rapport.

La microbiologie alimentaire est l'étude des micro-organismes qui habitent,

forment ou contaminent les aliments. Si l'étude des micro-organismes à l'origine de
la détérioration des aliments est une composante essentielle de cette branche de
la science agro-alimentaire, les « bonnes » bactéries, telles que les probiotiques,
prennent désormais une importante croissante. Par ailleurs, les microorganismes
sont absolument essentiels pour la production d'aliments tels que le fromage,
le yaourt, le pain, la bière, le vin et d'autres aliments fermentés.

L'épidémiologie est une discipline scientifique qui étudie les problèmes

de santé dans les populations humaines, leur fréquence, leur distribution dans le
temps et dans l’espace, ainsi que les facteurs exerçant une influence sur la santé
et les maladies de populations.

L'étude de la répartition et des déterminants des événements de santé sert de

fondement à la logique des interventions faites en matière de santé publique et
de médecine préventive.

Les actions du LREHM ont pour objectifs :

 L’amélioration de la qualité de surveillance épidémiologique et de la santé

de l’environnement.
 le renforcement des actions d’hygiène et d’assainissement.
 la détection des sources de contamination et des facteurs de risque.
 l’augmentation du taux de confirmation des maladies transmissibles.
 l’amélioration des prestations de contrôle sanitaire.

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 II. Description du laboratoire :

 Adresse : Rue Abdelouahab Derraq, Marrakech 40000

 Chef du laboratoire : Dr. AIT MELLOUL Abdelazizgion Marrakech

Tensift Al Haouz

o Le laboratoire régional de diagnostic épidémiologique et d’hygiène du milieu

a été mis en service en Mars 2004, rassemblant en une seule structure toutes les
unités d’analyse et diagnostic à caractère préventif.

o Implanté au niveau de la préfecture de Marrakech et attaché à la Direction

régionale Marrakech Safi, le LRDEHM est lié à la DELM du point de vue
fonctionnement et à l’INH du point de vue technique. Il représente le support
technique des programmes de prévention épidémiologique du ministère de la
santé au niveau de la région.

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 Le laboratoire Régional de Diagnostic Epidémiologique et d’Hygiène du Milieu
est structuré comme suit :

Réception

Réception d’unité Dépistage

de dépistage d’hypothyroïdie
d’hypothyroïdie congénitale
congénitale

Bureau de Unité de Microbiologie des

aliments
Chef du
laboratoire
Salle de stock

Salle de L
réunion A
Salle de stock V
Salle de E
R
Stérilisation I
E
Unité de diagnostic des Unité Unité de chimie Unité de
maladies parasitaires d’Entomologie des Eaux Microbiologie des
Eaux

Les équipements du laboratoire couvrent ses différents domaines de compétences,

notamment pour :

 l’analyse bactériologique des eaux et des aliments.

 l’analyse parasitologique.
 l’analyse chimique des eaux …

Ces équipements renferment des Hôtes et étuves bactériologiques, des autoclaves

et fours de stérilisation des appareils à distillation des pompes de filtration des
centrifugeuses des spectrophotomètres des lecteurs de colonies des microscopes
des milieux de culture des réactifs … etc

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 III. Définitions :

Hygiène : est un ensemble de mesures destinées à prévenir les infections et

l'apparition de maladies infectieuses. Elle se base essentiellement sur trois actions
le nettoyage et la détersion ; la désinfection ; la conservation.

Épidémiologie : est une discipline scientifique qui étudie les problèmes de santé
dans les populations humaines, leur fréquence, leur distribution dans le temps et
dans l’espace, ainsi que les facteurs exerçant une influence sur la santé et les
maladies de populations.

Micro-organismes : Être vivant microscopique tel que les bactéries, les virus, les
champignons unicellulaires (levures), et les protistes. (Appelés autrefois microbes,
les micro-organismes jouent un rôle essentiel dans les cycles écologiques, mais
certaines espèces sont pathogènes).

Bactérie : est un micro-organisme ubiquiste, unicellulaire et sans noyau

(procaryote) dont le génome est constitué d'ADN. Celui-ci consiste en un seul
chromosome, et on note éventuellement la présence de plasmides (petit morceau
d'ADN circulaire). L'ensemble des bactéries forme le règne des eubactéries
(Eubacteria). Certaines bactéries peuvent être pathogènes. Chez l'Homme, les
symptômes d'une infection bactérienne sont similaires à ceux observés lors d'une
infection virale (éruption cutanée, toux, écoulement nasal, larmoiement, fatigue,
nausées, fièvre et douleurs musculaires). Parfois, elles sont mortelles. Les
infections bactériennes peuvent être traitées avec des antibiotiques.

Champignons : sont des eucaryotes pluricellulaires ou unicellulaires. Le taxon «

champignon » est devenu ambigu et considéré par la science actuelle comme
obsolète car il ne désigne pas un groupe monophylétique mais plusieurs taxons
distincts.

Coliformes fécaux : ou coliformes thermo tolérants, sont un sous-groupe des

coliformes totaux capables de fermenter le lactose à une température de 44,5 °C.
L’espèce la plus fréquemment associée à ce groupe bactérien est l'Escherichia coli
(E. coli) et, dans une moindre mesure, certaines espèces des genres Citrobacter,
Enterobacter et Klebsiella.

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Coliformes totaux : sont des entérobactéries qui incluent des espèces bactériennes
qui vivent dans l’intestin des animaux homéothermes, mais aussi dans
l’environnement en général (sols, végétation et eau). Ce groupe bactérien est
utilisé comme indicateur de la qualité microbienne de l’eau parce qu’il contient
notamment des bactéries d’origine fécale, comme Escherichia coli.

Listeria monocytogenes : est une bactérie responsable de la listériose, maladie

infectieuse rare mais grave.
Caractéristiques de la Listeria
Listeria monocytogenes est une bactérie de type Gram positif, mobile et qui ne
produit pas de spores. Cellule de 1 à 4 micromètres sur 0,5 micromètre, elle se
présente sous forme de chaînes courtes ou de petits amas.

Staphylococcus aureus : autrement appelé Staphylocoque à coagulase positive,

est une bactérie à gram positif. C’est un coccus, de forme arrondie, qui se
présente sous la forme de diplocoques (des coccis associés par deux) ou sous la
forme d’amas ayant la forme de grappes de raisin.

Salmonella : est une bactérie susceptible de provoquer une maladie appelée

salmonellose chez les humains. Il s'agit d'une zoonose, ce qui signifie qu'elle peut se
transmettre directement ou indirectement entre les animaux et les humains.

Escherichia coli (E. coli) : est une bactérie (bacilles à Gram -) qui réside dans le
tube digestif de l’homme et des animaux à sang chaud. La majorité des souches de
E. coli sont inoffensives, quelques-unes seulement sont pathogènes pour l’homme.

Milieu de culture : est une préparation au sein de laquelle des micro-organismes

peuvent se multiplier. Il doit donc satisfaire les exigences nutritives du micro-
organisme étudié et posséder les propriétés physico-chimiques convenant à cette
culture.

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 IV. Réception des échantillons :

1. Les critères de la réception des denrées alimentaires :

Au cours de la réception des échantillons, il faut tenir compte de certains facteurs

qui peuvent modifier le résultat de l'analyse. Pour cela, il faut :
 S'assurer des conditions de la température au cours du transport (0 à 4 C°
pour les produits pasteurisé, -18C° pour les produits congelés ou surgelés).
 Avoir une information suffisante de la nature de l'échantillon.
 Vérifier l'identité du prélèvement : prélèvement doit être effectué et
acheminé au laboratoire par un technicien d'hygiène (ou médecin).
 Vérifier la date du prélèvement : les échantillons doivent parvenir au
laboratoire le même jour du prélèvement.
 Tenir compte de la quantité de l'échantillon (au moins 100g). • 5 unités
identiques pour les conserves.
 Vérifier l'étiquetage.
 Etablir des fiches de réception ou seront mentionnées :

 la date de prélèvement
 la date de la réception
 les caractéristiques du prélèvement
 l'identité du client

 le code du prélèvement
 En cas d’une Toxi-infection alimentaire collective un rapport comportant le
nombre des cas ainsi que les symptômes des patients doit être établi.
 Les échantillons doivent être enregistrés dans le registre du laboratoire
avant leur acheminement à la salle technique d’analyse.

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 2. Les critères de la réception des échantillons d’eaux :

Tableau

Critères Contrôle Echantillon Valeur(s) / Donnée(s)

d’acceptation attendu(s)

Feuille de Visuel Tous Données obligatoires

demande sur le bulletin
D’analyse
Eaux embouteillées Bouteille propre non
Conditionnement Visuel cassé
Les autres Eaux Flacon propre stérile
Eaux d’alimentation
humaine Au moins 500 ml
Volume non conditionnées
Eaux de baignade
Eaux embouteillées Au moins 150 cl
Eaux usées Au moins 1000 ml
Eaux de source Au moins 250 cl
Eaux embouteillées Date de péremption
Délai Date de
d’acheminement prélèvement Les autres Eaux Ne dépasse pas 24H
Eaux embouteillées Température
Température Eaux usées ambiante
de réception Thermomètre

Les autres Eaux De 0°C à +4°C

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 V. Traitement des échantillons :

1. Microbiologie des aliments :

Tableau des différents micro-organismes recherchés

Micro-organismes Milieu de culture utilisé T° Temps

recherchés d’incubation d’incubation
Coliformes totaux DL (désoxycholate- lactose)
(1 ml) 37°C 24 à 48 h
Coliformes fécaux DL (désoxycholate- lactose)
(1 ml) 44°C 24 à 48 h
Staphylocoques Chapman
aureus Baird Parker 37°C 24 à 48 h
(0.1 ml)
Levures et Sabouraud
moisissures (0.1 ml) 25°C 48 à 72 h
Salmonella SS, Hektoen
(0.1 ml) 37°C 24 à 48 h
Germes totaux PCA (Plate Count Agar)
(0.1 ml) 30 à 37°C 24 à 48 h
Listeria Palcam
Oxford 37°C 24 à 48 h
(1 ml)
ASR SPS
(1 ml) 44°C 24 à 48 h

Nature d’aliment Code d’aliment

Lait et dérivés A
Pâtisserie et crèmes pâtissières B
Plats cuisinés (denrées animales) C
œufs et ovo produits D
Poissons et produits pêches E

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 Viandes et produits carnés F
Semi-conserves G
Boissons et limonades H
Plats cuisines (D. végétales) I
Sauces d’assaisonnement J
Conserves végétales K
Végétaux et crudités L

Procédure de la recherche de Salmonella (exemple de millefeuille)

Etape de pré-enrichissement

25 g de produit + 225 ml d’eau peptonée

Incubation à 37°C pendant 18 à 24h

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 Etape d’enrichissement
sélectif

10 ml de bouillon
0.1 ml de culture + Rappaport - Vassiliadis

Isolement
dans milieu
Hektoen

Incubation à 37°C pendant 18 à 24h

Colonies grisâtres souvent à centre noir

Repiquage sur Kligler

Galerie biochimique

Confirmation sérologique 14
Les Salmonelles donnent en générale les caractères suivent :

Gram : Bacilles Gram négatif (BGN)

Oxydase : Réaction négative
Glucose : Fermentation positive
Lactose : Fermentation négative
Saccharose : Fermentation négative
Formation du gaz : Réaction positive
H2S : Réaction positive

Procédure de la recherche de Listeria monocytogenes (exemple de yaourt)

Etape de pré-enrichissement

25 g de produit + 225 ml de Fraser demi

Incubation à 37°C
pendant 24h
15
 Etape d’enrichissement

1 ml de culture + 10 ml de bouillon Fraser

Incubation à 37°C
pendant 48h

Isolement sur milieu

Palcam et Oxford

Incubation à 37°C pendant 24 à 48h

Repiquage des colonies grisâtres incolores ou souvent à centre noir

entourées d’un halo noir sur milieu TSYEA

Galerie biochimique 16
 Procédure de dénombrement des Staphylocoques pathogènes
(Staphylococcus aureus)

0.1 ml de la suspension mère et des dilutions

Etalement sur milieu Baird-Parker ou

Chapman-Mannitol

Incubation à 37°C
pendant 24 à 48h

Dénombrement des colonies caractéristiques et repiquage de 5

colonies sur milieu BHI (Bouillon-Heart-Infusion)

Incubation à 37°C pendant 24 h

Test de coagulase (0.5 ml de culture de BHI) + 0.5 ml de plasma de lapin

Lecture après 1h, 2h, 3h …, 24h

Test (+) caillot ferme Test (-) pas de formation de caillot

Staphylococcus aureus
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 Clé d’identification

Bacilles

Gram (-) Gram (+)

Listeria monocytogenes

Oxydase (+) Oxydase (-) Esculine (+) Catalase (+)

Mobilité à 22°C
Pseudomonas Entérobactéries
Immobilité à 37°C

Agglutination avec
Identification
sérum polyvalent
biochimique
anti-Listeria

Identification Mise en culture

biochimique
King A & King B

Cocci à Gram (+)

Catalase (+) Catalase (-)

Staphylocoque Staphylocoque

Coagulase
Identification
biochimique et Identification
sérologique biochimique

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 Au cours du traitement des échantillons : ++
Eviter :

* La contamination de l’échantillon à analyser.

* La contamination des milieux de cultures.

* Les risques d’infection du personnel.

* Tout risque de contamination de l’environnement et de la prise d’essai.

 Conservation des échantillons après leur traitement : ++

* Les échantillons analysés doivent être conservé jusqu’à ce que tous les
résultats aient été obtenus.

* Les échantillons contenant les germes pathogènes doivent être décontaminés

avant leur élimination.

* Elimination des échantillons qui ne contiennent pas les germes pathogènes.

 Une zone stérile : ++
L'échauffement de l'air autour de la flamme assure une zone de convexion de

10- 15 cm autour du bec dans laquelle l'air est stérile. C'est dans cette zone

qu'il faut se situer pour travailler.

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 2. Microbiologie des eaux :

L’eau est un élément essentiel au fonctionnement de tout écosystème, mais

aussi des activités humaines (agriculture, industrie) et de notre vie de tous
les jours (usage domestique, loisirs).
La contamination microbiologique de l’eau peut être directe ou indirecte
par les excrétas humain ou d’animaux et surtout de la contamination fécale

Tableau des différents micro-organismes recherchés

Micro-organismes Milieu de culture T° Temps

recherchés utilisé d’incubation d’incubation
Salmonelles Gélose XLD
BGA et nutritive 36°C 24h

Microorganismes Gélose à l’extrait Boite A : 36°C Boite A : 44 h

revivifiables des levures Boite B : 22°C Boite B : 21 h

Gélose lactosée
Bactéries coliformes au TTC et Gélose 36°C 44h

non sélective 36°C 21h

Escherichia coli Gélose lactosée 21h

au TTC 44°C

Entérocoques Gélose Slanetz et

intestinaux Bartley 36°C 44h

Milieu BEA 36°C 2 à 24h

Pseudomonas Milieu selectif de

aeruginosa cétrimide 42°C 22 à 44h

Spores des ASR Milieu selectif 36°C 22 à 44h

Staphylocoques Chapman
pathogènes Baird Parker 36°C 44h

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 Méthode générale de manipulation

Dénombrement Concentration
Détermination
directe des d’eau par
bactériologique
colonies filtration

Méthode générale de dénombrement après concentration

Concentration par filtration

sur membrane

Appareil de filtration de l’eau sur membranes

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 Méthodes générales de dénombrement direct par numération des colonies après
ensemencement sur (ou dans) une gélose.

Dénombrement par incorporation Dénombrement par étalement en

en gélose surface

Un faible volume d’échantillon est

La méthode fréquemment utilisée réparti avec un étaleur stérile
(bactéries aérobies revivifiables) (pipette Pasteur repliée « en rateau
consiste à mélanger dans une » sur la surface d’une gélose en
boîte de Pétri d’échantillon et boîte de Pétri.
milieu gélosé, fondu et ramené à
Cette technique est
un étuve pour incubation.
particulièrement favorable pour les
germes aérobies stricts

Procédure de la recherche des Salmonelles dans les eaux

Etape de pré-enrichissement

1 Ajout de l’eau, les dilutions ou le filtrat à l’eau piptonée tomponée

2 Incubation à 36°C pendant 18h

3 0.1 ml + 10 ml de bouillon RVS (Rappaport Vassiliadis Soja)

4 Incubation à 42°C pendant 24h si nécessaire 48h

22
 Etape d’enrichissement

1
Gélose XLD Gélose BGA

2 Incubation 36°C pendant 24h

3 Isolement des colonies et ensemencement en stries sur gélose nutritive

4 Incubation à 36°C pendant 24h

5 Test de confirmation biochimique et sérologique

Procédure de la recherche d’Escherichia coli

1 Volume d’eau (100 ml à 250 ml)

2 Filtration sur membrane filtrante

23
3 Déposer de la membrane sur gélose lactosé au TTC

4 Incubation à 44°C pendant 21h

5 Repiquage

Gélose non sélective Bouillon tryptophane

36°C pendant 21h 44°C pendant 21h

Test oxydase Test de production d’indole

Colonies jaunes suspectes

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 Procédure de la recherche des Entérocoques intestinaux

1 Volume d’eau (100 ml à 250 ml)

2 Filtration sur membrane filtrante

3 Déposer de la membrane sur milieu Slanetz & Bartley

4 Incubation à 36°C pendant 44h

5 Lecture : colonies rouge brique suspectes

6 Milieu BEA

7 Incubation à 36°C

8 Lecture à partir 2h jusqu’ a 24h

25
 VI. Diagnostic des maladies parasitaires :

1. Le paludisme :

 Définition :

Le paludisme est une maladie humaine potentiellement mortelle causée par des
parasites (Plasmodium) que transmettent les piqûres de moustiques anophèles
femelles infectées. Il s’agit d’une maladie évitable et dont on peut guérir

Parasitose Transmise par la piqûre d'un moustique du genre Anophèles.

Nous décrirons successivement les 4 espèces de parasite :

1. Plasmodium falciparum, le plus fréquent.

2. Plasmodium vivax.
3. Plasmodium ovale.
4. Plasmodium malariæ.

 Morphologie : 3 stades
Trophozoïte (jeune et mûr)
 Une chromatine nucléaire rose

 Un cytoplasme bleu

 Du pigment

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 Schizonte Gamétocytes

 Diagnostic biologique (Goutte épaisse et frottis sanguin) :

NB : Toute fièvre au retour d’une zone tropicale est un paludisme jusqu’à preuve
du contraire.

Frottis sanguin : est du sang étalé sur une lame de microscope, dans le but
d'observer ses cellules et aussi les dénombrer. Dans le cas de diagnostic du
paludisme le frottis sanguin mise en évidence le présence ou l’absence du parasite
ainsi que son espèce.

Goutte épaisse : La goutte épaisse est un examen lent mais qui offre l'avantage de
concentrer les parasites sur une surface restreinte.

Coloration à GIEMSA (3 % de colorant + 97 % de l’eau distillé stérille) pendant 45

min.

Goutte
épaisse
Frottis
sanguin

27
 Observation microscopique Observation microscopique
de la goutte épaisse du frottis sanguin

1. Leishmanioses :

 Définition :

Les leishmanioses sont des maladies parasitaires provoquant des affections

cutanées ou viscérales très invalidantes, voire mortelles si elles ne sont pas
traitées. Elles sont dues à différents parasites du genre Leishmania, transmis par la
piqûre d'insectes communément appelés phlébotomes.

 Morphologie :
Formes amastigotes (formes immobiles, parasites intracellulaires)
Ovoïdes – 2 - 6 µm
Noyau, kinétoplaste

28
 Formes
amastigotes

Formes promastigotes (formes mobiles présentes chez le vecteur)

Allongées – 15 - 25 µm –
Noyau, kinétoplaste, flagelle

Formes
promastigotes

 Diagnostic biologique :

Lame d’un
prélèvement
d’une leishmaniose
cutanée colorée au
GIEMSA

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 VII. Conclusion :

L’objectif principal de ce stage était la découverte du monde de

la microbiologie, et ce stage a totalement répondu à nos attentes.
Durant ce stage, nous avons eu l’opportunité d’appliquer des
connaissances déjà acquises lors des cours théoriques et d’en
développer de nouvelles.
Ce stage nous a permis aussi de nous faire découvrir dans le mode
de fonctionnement d’un établissement public.
En effet, nous avons pu remarquer que le travail en équipe était
très important et permettait une production efficace avec un
rendement meilleur.
Cette expérience a été en tout point bénéfique tant sur le plan
professionnel qu’humain, car nous étions confrontés aux exigences
de la vie professionnelle.

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