2012 These Al Kaddissi

THESE
UNIVERSITE BORDEAUX 1
Ecole Doctorale Sciences et Environnements
Par Mlle AL KADDISSI Simone

Pour l’obtention du grade de
DOCTEUR
Spécialité : écotoxicologie
Comparaison de la réponse (en termes

d’accumulation, d’impacts cellulaires et génétiques)
de l’écrevisse Procambarus clarkii après exposition à
un polluant métallique (cadmium) et un polluant
radiologique (uranium 238 et 233).
Soutenue le : 13 janvier 2012
Après avis de :
M. COUTURE Patrice, Professeur titulaire/ INRS ETA Quebec (rapporteur)

MME. GIAMBERINI Laure, Directeur Adjoint (HDR)/ Université de Lorraine (rapporteur)
Devant la commission d’examen formée de :
M. DÖRR Martin, Chercheur, Université de Pérouse (examinateur)

M. LAROCHE Jean, Professeur, Université de Bretagne Occidentale LEMAR (examinateur)
M. CACHOT Jérôme, Professeur, Université de Bordeaux 1 (examinateur)
M. SIMON Olivier, Chargé de recherche, IRSN (tuteur de thèse)
MME. LEGEAY Alexia, Maître de conférences, Université de Bordeaux 1 (tuteur de thèse)
M. MASSABUAU Jean-Charles, Directeur de recherche EA/Bordeaux 1/CNRS (directeur de thèse)
A mes parents et mon grand-père.
«Incertitude, ô mes délices

vous et moi nous nous en allons
comme s’en vont les écrevisses
à reculons, à reculons.»
Guillaume Apollinaire.
Remerciements
D’abord je tiens à remercier l’Institut de Radioprotection et de Sureté Nucléaire

(IRSN), le Laboratoire de Radioécologie et d’Ecotoxicologie (LRE)puis l’Unité Mixte de
Recherche Environnements et Paléoenvironnements Océaniques et Continentaux commune à
l’université de bordeaux 1 et au Centre National de la Recherche Scientifique(UMR 5805-
CNRS-Bordeaux1 -EPOC) et le laboratoire d’Ecotoxicologie aquatiques (EA). J’ai eu la
chance de bénéficier des savoirs et des moyens de chacune de ces équipes durant ma thèse. Je
tiens à remercier vivement le directeur du LRE, Rodolphe Gilbin pour son implication dans ce
travail et pour avoir été toujours présent dans les moments difficiles. Je tiens aussi à remercier
le directeur du EA et mon directeur de thèse Jean-Charles Massabuau ainsi que Jaqueline
Garnier-Laplace et Antoine Grémare pour m’avoir accueillie et permis la réalisation de ce
projet pluridisciplinaire. Je remercie également le laboratoire d’écotoxicologie du
département de Biologie environnementale et cellulaire de l’université de Pérouse-Italie qui
m’a accueillie pour me former aux dosages enzymatiques.
Cette étude a été réalisée dans le cadre du programme de recherche ENVIRHOM de

l’IRSN et financée en partie par cet institut et par le CNRS. Je tiens à adresser mes
remerciements à ces deux structures surtout à L’IRSN qui m’a permis la réalisation de ce
projet dans d’excellentes conditions.
J’exprime toute ma reconnaissance aux membres du jury qui ont accepté d’évaluer ce
travail.
J’adresse un grand merci à mes encadrants de thèse qui m’ont emmenée sur ce sujet
dès le master 2, Alexia Legeay et Olivier Simon. Merci d’avoir accepté de m’encadrer et de
me diriger pendant toutes ces années.
Alexia merci pour la confiance que tu m’as accordée pour mener ce projet à distance,
merci pour tes remarques constructives et les corrections que tu as apportées à ce manuscrit,
aux articles et aux divers rapports rédigés au cours de cette thèse.
Olivier…Merci, de m’avoir fait partager ton expérience et de m’avoir guidée tout le
long. Merci d’avoir toujours fait tout ton possible pour m’aider sur tous les plans que ce soit
professionnels ou humains. Merci pour ton soutien et tes conseils depuis le début jusqu'à la
fin. Tu m’as accompagnée dans les moments les plus importants de ma vie professionnelle,
depuis l’audition de thèse à l’IRSN jusqu'à la soutenance. Je n’oublierai jamais cette
motivation et cette énergie que tu as investie dans la réalisation de ce projet. Je garderai aussi
en mémoire toutes ces heures de travail passées auprès de toi et les longues discussions que
nous avons pu avoir. Je n’oublierai surtout pas tes venues au laboratoire les weekends pour
prendre le relais durant les expériences, sans toi ce travail n’aurait pas vu le jour... Les mots
me manquent pour t’exprimer toute l’amitié, l’affection, la reconnaissance et le respect que je
te porte.
Patrice Gonzalez, je te remercie énormément pour ton investissement dans ces travaux
et les corrections des articles. Je te dois toutes mes connaissances en génétique.
J’adresse un grand merci à Antonia-Concetta Elia d’avoir accepté de collaborer avec
moi, de m’avoir si bien accueillie au sein de son laboratoire et de m’avoir consacré du temps
pour me sensibiliser à l’enzymologie.
Mes remerciements s’adressent également à tous ceux qui de près ou de loin ont
contribué à l’aboutissement de ces travaux de thèse et à rendre ces 3 années aussi agréables.
Nicolas Gauthier, je tiens à te remercier pour ta grande contribution à la réalisation de
ce projet. Merci de nous avoir offert les écrevisses tout au long de la thèse. Le jour où je t’ai
connu fut un grand soulagement pour moi. Il faut dire que notre laboratoire a vu défiler une
bonne variété d’espèces d’écrevisses (Astacus astacus, Astacus leptodactylus, Orconectes
limosus…) provenant de divers grossistes et pêcheurs. Cependant il n’y a que toi qui as pu
satisfaire nos exigences et nos commandes.
La réalisation de cette thèse a été possible surtout grâce au travail et à la coopération
de l’ensemble de l’équipe du LRE.
Fred Coppin, mon voisin de bureau, quand j’ai appris à te connaître, j’ai réalisé que tu
étais quelqu’un de très serviable et pédagogue, toujours là pour aider les autres surtout les
thésardes en galère. A tes côtés, la chimie devenait moins barbare, j’ai vraiment beaucoup
appris en collaborant avec toi. Je te remercie pour toutes tes explications, pour l’aide que tu
m’as apportée pour la fabrication de l’eau synthétique et pour les simulations sur JCHESS.
Merci de ne pas avoir baissé les bras au moment où nous avons eu des problèmes de gestion
de rejets de l’uranium et du cadmium au laboratoire. Je te remercie d’avoir pris le temps de
m’aider à développer des techniques pour piéger ces métaux afin que je puisse réaliser mes
expériences.
Magali Floriani, un énorme merci pour ton implication dans ce travail et pour toutes
les belles images de microscopie. Virginie Camilleri, etIsabelle Cavalié, les soldats inconnus
de cette thèse, je n’imagine même pas comment j’aurai pu m’en sortir sans votre aide pour les
dosages des métaux. Claire Della-Vedova, les statistiques sont devenus moins pénibles à tes
233
cotés. Daniel Orjollet, un grand merKi pour les dosages de U. Sandrine Frelon, merci
pourles dosages à l’ICP-MS, pour tes corrections et tes bons gâteaux. Karine Beaugelin-
Seiller pour les calculs de débit dose. Sylvie Pierrisnard, merci pour ton soutien quand j’en ai
eu besoin et pour toutes les analyses de chromatographie ionique. Laureline Fevrier, l’experte
en ACP,merci pour ton aide dans les analyses et pour avoir été là pour m’écouter et discuter
de tout et de rien. Jean-Marc, merci pour les séances « photo-shoot », tu sais bien faire croire
aux femmes qu’elles sont des stars !
Claudine Van Crasbek, la personne qui a le plus galéré avec moi du coté administratif.
Franchement, chapeau pour ta réactivité et ton efficacité, tu m’as tant aidé et soutenu…grand
merci.
Nadine, Cathy, Katy (bis), Arnaud, Pascale, Pierre, Beatrice, Christelle, Karine, Jean-
François, Julien, les SPR, Bruno, Damien, Jean-Paul, Magalie, Flo et tous les thésards, merci
pour votre bonne humeur, pour les échanges qu’on a pu avoir et pour la bonne ambiance qui
régnait dans les locaux qui me motivait à travailler.
Benji, tu as joué un grand rôle dans cette thèse… Je te remercie d’abord pour ton aide
au laboratoire quand tu étais encore au LRE (la dissection des écrevisses, mise en place de
l’élevage…)et pour tout le partage scientifique que nous avons eu ensemble. Tu as subi mes
investissements dans cette thèse, mes concessions, mes peines, mes paniques, mes coups de
gueule, mes angoisses et mes sacrifices. Je te remercie d’avoir été toujours là pour m’écouter,
m’apaiser, m’encourager, me soutenir et me conseiller quand j’en avais besoin. Sans ton
support j’aurais eu plus de difficulté à accomplir ce travail. Tu es quelqu’un que j’admire pour
ta force, ton caractère et pour ta façon de tirer les gens vers le haut.
Je tiens aussi àremercierdu plus fort que je peux celui qui a été près de moi tout au
long de la troisième année de thèse, avec complicité, attention et un soutien sans faille, mon
colloque de labo, mon récupérateur de badge, mon technicien informatique et mon meilleur
ami Guigui.
Nico ma bouffée d’oxygène, mon rayon de soleil tu m’as permis de tenir la plus dure
des années de thèse.Merci d’avoir cru en moi, tes encouragements m’étaient d’un grand
support. Ta bonne humeur, ta façon d’être étaient tout ce dont j’avais besoin. Merci du fond
du cœur pour avoir été là pour moi durant les périodes difficileset parfois douloureuses. Je
n’oublierai jamais tout ce que tu as pu faire pour moi et tous les bons moments que nous
avons passé ensemble.J’ai eu de la chance de t’avoir dans ma vie, tu es quelqu’un de précieux.
Mes Parents,je vous dois tout ! Déjà mon existence et mon caractère! C’est grâce à
tous vos efforts et tous vos sacrifices que je suis devenue ce que je suis. Chacun de vous deux
à apporter sa pierre à l’édifice et ceci pendant déjà 26 ans. J’espère que le résultat est à la
hauteur de vos attentes et de vos mérites. C’est surtout votre soutien moral et affectif qui m’a
toujours donné la force de me battre, de réaliser et entreprendre ce que je veux. Je ne pourrai
jamais assez vous remercier.
Enfin j’adresse un grand remerciement à tous les membres de ma famille qu’ils soient
encore de ce monde ou pas, pour leur amour, leur soutien et toutes les valeurs inculquées.
Communications
Ecrites
Effects of uranium uptake on transcriptional responses, histological structures

and survival of the crayfish Procambarus clarkii.
[Al Kaddissi S., Simon O., Legeay A., Gonzalez P., Floriani M., Camileri V. and Gilbin
R.](Article publié)
Effects of uranium on crayfish Procambarus clarkii mitochondria and antioxidant

responses after chronic exposure: what have we learned?
[Al Kaddissi S., Legeay A., Elia A.C., Gonzalez P., Camilleri V., Gilbin R., and Simon
O](Article publié)
Mitochondrial gene expression, antioxidant responses, and histopathology after

cadmium exposure.
[Al Kaddissi S., Legeay A., Elia A.C., Gonzalez P., Floriani M., Cavalie I., Massabuau J.C.,
Gilbin R., and Simon O](Article soumis)
An attempt to descriminate the radio and chemo-toxicity of uranium

inProcambarus clarkii using molecular responses.
[Al Kaddissi S., Frelon S., Legeay A., Elia C., Gonzalez P., Beaugelin-Seiller K, Coppin F.,
Orjolet D., Gilbin R., and Simon O.] (Article soumis)
How toxic is depleted uranium to crayfish Procambarus clarkii? A comparative

study to the uptake and biological effects of cadmium.
[Al Kaddissi S., Legeay A., Elia A.C., Frelon S.,Gonzalez P., Floriani M., Camilleri V.,
Cavalie I., Massabuau J.C., Gilbin R., and Simon O](Article en cours de préparation)
Orales
The use of Procambarus clarkii as a bioindicator of cadmium and uranium

pollution.
“ICC7 7th international meeting”. (Qingdao-Chine, 20-25 juin 2010).
Comparaison de la réponse (en termes d'accumulation, d'impacts cellulaires et

génétiques) de l’écrevisse Procambarus clarkii après exposition à un polluant métallique
(cadmium) et un polluant radiologique (uranium).
Séminaire des « Journées scientifiques IRSN ». (Arles-France, 21-24 Septembre 2010).
Affichées
Etude comparative de la bioaccumulation et des effets (à différentes échelles de

l’organisation biologique) de l’uranium et du cadmium chez P. clarkii.
« journée des thèses CEA » (Cadarache, CEA-France, 21 septembre 2011). (3éme prix).
The use of molecular responses of crayfish Procambarus clarkii as biomarkers of

cadmium and uranium contamination.
“SETAC Europe 21th meeting”. (Milan-Italie, Mai 2011).
A comparative study of molecular responses during acute exposures to uranium

and cadmium in crayfish Procambarus clarkii: linkage between gene expression and
higher-level effects.
“SETAC Europe 20th meeting”.(Seville-Espagne, 23-27 Mai 210).
Etude comparative de l'impact de l'uranium et du cadmium chez l'écrevisse

Procambarus clarkii.
« SEFA ». (Versailles-France, 31 mars 2010).
Comparaison des réponses de l’écrevisse Procambarus clarkii après

exposition à un polluant métallique (cadmium) et un polluant radiologique (uranium).
Séminaire des « Journées des thèses IRSN ». (Aussois-France, 28 Septembre 2009).
Résumé
L’étude des effets des radionucléides dispersés dans l’environnement est un thème
majeur dont l’un des enjeux est d’évaluer le risque écologique pour les organismes vivants. Le
programme EnvirHom-Eco de l’IRSN a pour objectifs d’évaluer la toxicité des radionucléides
et de mieux comprendre les réponses biologiques induites suite à une bioaccumulation de ces
contaminants chez les organismes vivants. Une des approches proposées par ce programme
est de comparer les effets des radioéléments (tel l’uranium) aux effets chimiotoxiques de
polluants plus connus (en termes de spéciation biologique et d’études des effets sur les
organismes) tels que les métaux (en particulier le cadmium). Une autre partie vise aussi à
discriminer la radiotoxicité de la chimiotoxicité de ces éléments radioactifs. Cette thèse
s’inscrit directement dans ce projet.
Pour répondre à cette problématique, notre approche a visé dans un premier temps à
étudier les impacts du cadmium (Cd) sur différents niveaux biologiques de l’écrevisse
Procambarus clarkii, retenue comme espèce modèle. En effet, nous avons évalué l’impact de
ce métal sur les mitochondries, le fonctionnement de la chaîne respiratoire et sur les réponses
face à un stress oxydant (expressions transcriptionnelles et activités enzymatiques). Durant
cette étude, les gènes mt et atp6 codant respectivement pour la metallothionéine (une protéine
de stress) et l’ATP synthase ont été clonés, séquencés puis enregistrés dans GenBank sous les
numéros d’accessions respectifs GU220368.1 et GU220369.1. De même, nous avons étudié
les impacts au niveau histologique. Nous avons tenté de lier ces effets entre eux et à la
bioaccumulation du Cd dans les branchies et l’hépatopancréas, organes cibles de l’exposition.
Dans un second temps, nous avons étudié les mêmes paramètres biologiques après exposition
à différentes durées (4, 10, 30 et 60 jours) et concentrations (0,1- 40 µM) de l’uranium (U) et
appliqué la même démarche. De plus, nous avons essayé de différencier la chimio- et la
radiotoxicité de ce radionucléide en exposant des lots d’écrevisses soit à l’U appauvri soit au
233U (présentant une activité spécifique plus élevée) au travers des mêmes critères d’effets.
Enfin nous avons comparé les effets du Cd et de l’U après exposition aigüe (40 µM-10 jrs) et
chronique (0,1 µM-60 jrs).
Nous avons démontré que le gène mt était toujours surexprimé en présence du Cd dans
nos conditions d’exposition, et qu’il semble être un bon biomarqueur de toxicité du Cd chez
P. clarkii. Nous avons mis en évidence que l’U et le Cd affectent les mitochondries grâce au
suivi des niveaux d’expressions des gènes mitochondriaux (12s, atp6 et cox1), et que les
mécanismes d’action de ces deux métaux ne semblent pas être toujours les mêmes. Nous
avons aussi prouvé que l’U génère plus de stress oxydant que le Cd grâce à la comparaison
des niveaux d’expression de gènes qui codent pour des antioxidants (sod(Mn) et mt) et des
réponses enzymatiques de la superoxyde dismutase, la catalase, la glutathion peroxydase et la
glutathion S transférase. Toutefois, les symptômes des atteintes histo-pathologiques semblent
être les mêmes pour les deux métaux. En comparant les effets des métaux sur la survie des
écrevisses, nous avons conclu que le Cd était plus toxique que le radioélément. D’autre part,
nous avons démontré que les effets toxiques de l’U, aux concentrations rencontrées dans
l’environnement, sont plus liés à la chimiotoxicité qu’à la radiotoxicité de cet élément. Nous
avons démontré que les réponses moléculaires varient en fonction de l’intensité et la durée du
stress chimique imposé aux organismes. Nous avons proposé d’utiliser les expressions de
l’ensemble des gènes étudiés en tant que biomarqueurs de toxicité de l’U plutôt que les
activités enzymatiques. Ce travail de thèse propose surtout des modes d’actions
transcriptionels, responsables des effets toxiques de l’uranium. Il confirme la nécessité
d’approfondir l’étude du profil écotoxique de l’uranium.
Sommaire :
Liste des tableaux ....................................................................................................................... 1

Liste des figures ......................................................................................................................... 2
Liste des abréviations ................................................................................................................. 8
Chapitre I : Introduction ........................................................................................................... 11
Chapitre I-A : Contexte et objectifs ......................................................................................... 12
Chapitre I-B : Etude bibliographique ....................................................................................... 17
1. Le modèle biologique Procambarus clarkii................................................................. 18
1.1. Systématique, origine et distribution .................................................................... 18
1.2. Biologie de l’écrevisse ......................................................................................... 21
1.2.1. Morphologie ................................................................................................. 21
1.2.2. Anatomie et physiologie ............................................................................... 24
1.2.3. Croissance et mue ......................................................................................... 26
1.3. Ecologie et comportement .................................................................................... 28
1.4. Intérêt économique ............................................................................................... 29
1.5. Intérêt scientifique et écologique ......................................................................... 30
2. Evaluation de risques de contamination des milieux aquatiques ................................. 31
2.1. Bioindicateur et espèce sentinelle ........................................................................ 31
2.2. Biomarqueurs ....................................................................................................... 33
3. Généralités sur le Cadmium ......................................................................................... 39
3.1. Description ........................................................................................................... 39
3.2. Origine et distribution .......................................................................................... 39
3.3. Spéciation du Cd .................................................................................................. 41
3.4. Mécanismes de contamination en milieu aquatique ............................................. 45
3.5. Effets biologiques du Cd ...................................................................................... 46
3.5.1. Au niveau de l’organisme et des tissus ........................................................ 46
3.5.2. Effets Sub-cellulaires ................................................................................... 47
3.5.2.1. Stress oxydant......................................................................................... 48
3.5.2.2. Effets sur les mitochondries ................................................................... 55
3.5.2.3. Effets sur l’ADN et l’expression génique .............................................. 58
4. Généralités sur l’uranium ............................................................................................. 62
4.1. Description ........................................................................................................... 62
4.2. Origine et distribution .......................................................................................... 64
4.3. Spéciation chimique ............................................................................................. 67
4.4. Mécanismes de contamination ............................................................................. 69
4.5. Effets biologiques de l‘U ...................................................................................... 70
4.5.1. Au niveau de l’organisme et des tissus ........................................................ 70
4.5.2. Effets sub-cellulaires .................................................................................... 71
4.5.2.1. Stress oxydant......................................................................................... 72
4.5.2.2. Effets sur les mitochondries ................................................................... 74
4.5.2.3. Effets sur l’ADN et l’expression génique .............................................. 75
Chapitre I-C :Choix stratégiques et démarche expérimentale .................................................. 79

1. Choix du modèle biologique ........................................................................................ 80
2. Objectifs détaillés et justification de la démarche expérimentale ................................ 80
3. Choix des concentrations ............................................................................................. 82
4. Choix de l’exposition par voie directe et de la composition ionique de l’eau ............. 84
5. Choix des paramètres biologiques ................................................................................ 84
6. Choix des marqueurs de contamination ....................................................................... 88
7. Choix des organes ........................................................................................................ 90
Chapitre II : Matériels et méthodes .......................................................................................... 92

1. Conditions expérimentales ........................................................................................... 93
1.1. Dispositifs expérimentaux .................................................................................... 93
1.2. Modélisation de la spéciation de l’U .................................................................... 95
1.3. Gestion de l’exposition aux radionucléides en laboratoire .................................. 98
2. Prélèvement des organismes et dissection ................................................................. 100
3. Dosage des métaux et des ions ................................................................................... 101
3.1. Dosage des métaux dans la matrice biologique et l’eau. .................................... 101
3.1.1. Préparation des échantillons ....................................................................... 101
3.1.2. Techniques analytiques utilisées ................................................................ 102
3.1.2.1. Dosage du cadmium par spectrophotométrie d'absorption atomique
électrothermique (SAAE) ....................................................................................... 102
3.1.2.2. Spectrométrie d’émission atomique par plasma à couplage inductif (ICP-
AES) ...................................................................................................... 104
3.1.2.3. Spectrométrie de masse par plasma à couplage inductif(L’ICP-MS)... 105
3.1.3. Calculs des débits de doses ........................................................................ 107
3.2. Chromatographie ionique ................................................................................... 110
4. Analyses des paramètres biologiques ......................................................................... 111
4.1. Microscopie ........................................................................................................ 111
4.1.1. Préparation des échantillons ....................................................................... 111
4.1.2. Microscopie optique ................................................................................... 112
4.1.3. Microscopie Electronique à Transmission couplée à une sonde EDX ....... 112
4.2. Dosages enzymatiques ....................................................................................... 113
4.2.1. Préparations des échantillons ..................................................................... 113
4.2.2. Dosage des protéines .................................................................................. 114
4.2.3. Dosage de l’activité de la superoxyde dismutase (SOD) ........................... 115
4.2.4. Dosage de l’activité de la catalase (CAT) .................................................. 117
4.2.5. Dosage de l’activité de la glutathion peroxydase (GPX) ........................... 119
4.2.6. Dosage de l’activité de la glutathion S transférase (GST) ......................... 120
4.3. Expression des gènes .......................................................................................... 121
4.3.1. Recherche et séquençage des régions codantes d'intérêt ............................ 121
4.3.1.1. Extraction des ARN totaux................................................................... 122
4.3.1.2. Rétro-transcription................................................................................ 123
4.3.1.3. PCR classique ....................................................................................... 124
4.3.1.4. Electrophorèse ...................................................................................... 125
4.3.1.5. Purification des fragments d'intérêt ...................................................... 126
4.3.1.6. Clonage et transformation bactérienne ................................................. 127
4.3.2. PCR quantitative en temps réel .................................................................. 128
Chapitre III : Etude de l’impact du cadmium sur la survie, l’histologie, les mitochondries et
les antioxydants chez P. clarkii. ............................................................................................. 131
Abstract .............................................................................................................................. 133
1. Introduction ................................................................................................................ 134
2. Materials and methods ............................................................................................... 136
2.1. Biological model and acclimatization ................................................................ 136
2.2. General experimental protocol for acute exposure ............................................ 136
2.3. General experimental protocol for chronic exposure ......................................... 137
2.4. Tissues sampling and preparation ...................................................................... 138
2.5. Metal quantification ........................................................................................... 138
2.6. Total RNA extraction, reverse transcription of RNAs and Real-time quantitative
PCR .................................................................................................................... 138
2.7. Enzymatic activities analysis ............................................................................. 139
2.8. Histological methods .......................................................................................... 140
2.9. Statistical analysis .............................................................................................. 140
3. Results ........................................................................................................................ 141
3.1. Survival rate ....................................................................................................... 141
3.2. Cd bioaccumulation in crayfish organs .............................................................. 141
3.3. Gene expression levels and enzymatic activities ............................................... 142
3.4. Biological responses and bioaccumulation ........................................................ 144
3.5. Histological alterations ....................................................................................... 144
4. Discussion .................................................................................................................. 145
4.1. Effects on survival rate ....................................................................................... 145
4.2. Accumulation ..................................................................................................... 146
4.3. Molecular responses ........................................................................................... 147
4.3.1. Mechanisms of toxicity in acute exposure ................................................. 147
4.3.2. Mechanisms of toxicity in chronic exposure .............................................. 149
4.3.3. Histopathology ........................................................................................... 151
5. Conclusions ................................................................................................................ 152
Acknowledgments .................................................................................................................. 152

References .............................................................................................................................. 153
Chapitre IV : Etude de l’impact de l’uranium sur la survie, l’histologie, les mitochondries et

les antioxydants chez P. clarkii. ............................................................................................. 161
Chapitre IV-A: Effet de la bioaccumulation de l’uranium sur les réponses transcriptomiques,

les structures histologiques et la survie chez P. clarkii. ......................................................... 162
Abstract .............................................................................................................................. 164
1. Introduction ................................................................................................................ 165
2.1. General experimental protocol ........................................................................... 167
2.2. Tissues sampling and preparation ...................................................................... 168
2.3. Metals quantification .......................................................................................... 168
2.4. Histochemical and histological methods ............................................................ 169
2.5. Genetic analyses ................................................................................................. 169
2.5.1. Total RNA extraction and reverse transcription of RNAs ......................... 169
2.5.2. Cloning and sequencing of mt and atp6 genes ........................................... 169
2.5.3. Real-time quantitative PCR ........................................................................ 170
3. Results ........................................................................................................................ 172
3.1. Survival rate ....................................................................................................... 172
3.2. U bioaccumulation in crayfish organs ................................................................ 172
3.3. U localization and histological alterations ......................................................... 173
3.4. Gene expression levels ....................................................................................... 174
3.5. Gene expressions vs bioaccumulation ................................................................ 175
4. Discussion .................................................................................................................. 176
4.1. Effects on survival rate ....................................................................................... 176
4.2. Accumulation ..................................................................................................... 176
4.3. Histopathological effects .................................................................................... 177
4.4. Molecular responses ........................................................................................... 178
5. Conlusions .................................................................................................................. 179
References .............................................................................................................................. 180
Chapitre IV-B : Effets de l’uranium sur les réponses moléculaires chez l’ecrevisse P. clarkii
après une exposition chronique :Les enseignements à tirer ................................................... 186
Abstract .............................................................................................................................. 188
1. Introduction ................................................................................................................ 189
2.1. General experimental protocol ........................................................................... 190
2.2. Uranium quantification ...................................................................................... 191
PCR 192
2.4. Enzyme activity .................................................................................................. 193
3. Results ........................................................................................................................ 195
3.1. Experimental conditions ..................................................................................... 195
3.2. Uranium bioaccumulation .................................................................................. 195
3.3. Gene expression levels after long term exposure ............................................... 195
3.4. Enzyme activity .................................................................................................. 196
4. Discussion .................................................................................................................. 197
4.1. Bioaccumulation................................................................................................. 197
4.2. Transcriptional responses after long-term exposure to U .................................. 198
4.3. Evolution of transcriptional responses over time and their use as biomarkers .. 200
4.4. Oxidative stress responses after long-term exposure to U ................................. 201
4.5. Linking cellular oxidative stress to the dysfunction of mitochondria ................ 202
5. Conclusions and perspectives..................................................................................... 203
References .............................................................................................................................. 204
Chapitre IV-C : Les antioxydants et les réponses transcriptomiques sont-ils des biomarqueurs
pertinents pour discriminer la chimio et la radiotoxicité de l’uranium chez P. clarkii ? ....... 209
Abstract .............................................................................................................................. 211
1. Introduction: ............................................................................................................... 212
2.1. Experimental design ........................................................................................... 213
2.2. U analyses .......................................................................................................... 214
2.3. Enzyme activity determination........................................................................... 215
2.4. Gene expression level determination ................................................................. 216
2.5. Dose rate calculation for the hepatopancreas ..................................................... 216
2.6. Statistical analyses .............................................................................................. 218
3. Results ........................................................................................................................ 218
3.1. U in water, in organs, and related dose rates ...................................................... 218
3.2. Effects on enzyme activities and gene expression levels ................................... 219
4. Discussion .................................................................................................................. 221
4.1. Accumulation of U ............................................................................................. 221
4.2. Dose rate in the hepatopancreas ......................................................................... 222
4.3. Effect on enzyme activities ................................................................................ 223
4.4. Effect on gene expression levels ........................................................................ 224
4.5. Linking effects to radio or chemotoxicity .......................................................... 225
5. Conclusions ................................................................................................................ 225
References .............................................................................................................................. 226
Chapitre V : Comparaison des effets de l’uranium et du cadmium chez P. clarkii. .............. 232
Abstract .............................................................................................................................. 234
1. Introduction ................................................................................................................ 235
2.1. Experimental design ........................................................................................... 236
2.2. Metal quantification ........................................................................................... 237
2.3. Histochemical and histological methods ............................................................ 237
2.4. Genetic analysis .................................................................................................. 238
2.5. Enzymatic activities analysis ............................................................................. 238
3. Results ........................................................................................................................ 239
3.1. Survival rate ....................................................................................................... 239
3.2. Bioaccumulation of DU and Cd ......................................................................... 240
3.3. Cd localisation and histological alterations by U ............................................... 241
3.4. Enzymatic responses in gills contaminated chronically ..................................... 243
3.5. Expression factors of the studied genes ............................................................. 245
4. Discussion .................................................................................................................. 247
4.1. Comparison of the mortality rates ...................................................................... 247
4.2. Comparison of the bioaccumulation and detoxification .................................... 248
4.3. Comparison of histopathological effects between Cd and U ............................. 250
4.4. Comparison of the antioxidant responses ........................................................... 251
4.5. Comparison of the variations in transcriptional responses................................. 252
References .............................................................................................................................. 255
Chapitre VI : Synthèse générale et perspectives .................................................................... 262
1. Rappel du contexte, des objectifs et de la démarche expérimentale .......................... 263
2. Niveau d'atteinte des objectifs .................................................................................... 264
2.1. Le modèle biologique ......................................................................................... 264
2.2. La bioaccumulation et la détoxication................................................................ 265
2.3. Les effets histopathologiques ............................................................................. 269
2.4. Les effets moléculaires ....................................................................................... 270
2.5. Chimiotoxicité vs radiotoxicité .......................................................................... 279
2.6. Classification de la toxicité des métaux ............................................................. 281
3. Perspectives de recherche ........................................................................................... 281
3.1. Eclaircir les mécanismes de toxicité de l’U sur les mitochondries .................... 281
3.2. Eclaircir les mécanismes de toxicité de l’U sur la balance oxydative................ 282
3.3. Lien entre le niveau génique et enzymatique ..................................................... 283
3.4. Distribution de l’U dans différentes fractions cellulaires ................................... 283
3.5. Etude d’impact de la mue sur les biomarqueurs retenus .................................... 284
3.6. Etude des effets chez des organismes présentant différentes résistances à l’U.. 284
3.7. Etude des effets in situ ....................................................................................... 285
Références .............................................................................................................................. 286

Annexes .................................................................................................................................. 330
Liste des tableaux
Tableau 1 : Position systématique de Procambarus clarkii. .................................................... 18
Tableau 2 : Bruit de fond du cadmium dans l’environnement ................................................. 40
Tableau 3 : Emissions de Cd en Europe. .................................................................................. 41
Tableau 4 : Bilan des concentrations des ions majeurs (µmol/L) présents dans les différents
types d’eau étudiés au sein du laboratoire ................................................................................ 44
Tableau 5 : Bilan des différents radicaux libres centrés sur l’oxygène. ................................... 48
Tableau 6 : Composition isotopique en masse et en activité de l’uranium naturel et de

l’uranium appauvri à 0.2% en 235U .......................................................................................... 63
Tableau 7 : Concentrations mesurées dans l’eau de consommation humaine issue de puits ... 64
Tableau 8 : Bilan de la démarche expérimentale retenue. ........................................................ 82
Tableau 9 : Comparaison de la similarité des séquences nucléotidiques et des acides

aminésdes gènes mt et atp6 de P. clarkii à celles présentes dans la banque de données de
NCBI ........................................................................................................................................ 89
Tableau 10 : Concentration des solutions mères de sels nécessaires pour la préparation de

l’eau synthétique. ..................................................................................................................... 94
Tableau 11 : Pourcentage d’espèces d’U majoritairement présentes dans une eau douce
synthétique adaptée aux besoins des écrevisses à pH 6.5 et 7 (simulation de 30 µg U/L avec le
programme de spéciation géochimique J-CHESS). ................................................................. 96
Tableau 12: Nominal and measured Cd (µg/L) concentrations in water throughout the acute
(n=20) and chronic (n= 60) experiments. Cd bioaccumulation (µg /g DW, mean ± SEM, n= 4
to 5 in each treatment condition) in gills and in hepatopancreas of the crayfish P. clarkii after
4, 10, 30 and 60 days exposure to Cd(10 to 5000 µg/L). ....................................................... 137
Tableau 13: Gene names, accession numbers, specific primer pairs used in the quantitative
PCR analysis of the six studied genes of P. clarkii and their function. ................................. 139
Tableau 14: Expression factors (EF) of the five genes studied in P. clarkii compared to the
basal level of controls (n= 4 to 5 in each treatment condition) .............................................. 142
Tableau 15: Nominal and measured U (mg/L) concentrations in water throughout the
experiment (n=20).U bioaccumulations (µg /g DW, mean ± SEM, n= 4 to 5 in each treatment
condition) in gills and in hepatopancreas of the crayfish Procambarus clarkii after 4 and 10
days exposure to U (0.03 to 8 mg/L). ..................................................................................... 168
1
Tableau 16: Gene names, primers deduced from alignment of corresponding sequences from
different species and their accession numbers. ...................................................................... 170
Tableau 17: Gene names, accession numbers and specific primers pairs used in the
quantitative PCR analysis of the 6 studied genes of P.clarkii................................................ 171
Tableau 18: Expression’s factors (EF) of the 5 genes studied in P.clarkii compared to the
basal level of controls (n= 4 to 5 in each treatment condition). ............................................. 175
Tableau 19: Genes, accession numbers, specific primers pairs used in the quantitative PCR
analysis of the 6 studied genes of P.clarkii and their function. ............................................. 193
Tableau 20: U bioaccumulation (µg /g dry weight (DW), mean ± SEM, n= 5 in each treatment
condition) in gills and in hepatopancreas of the crayfish Procambarus clarkii exposed 30
(T30) and 60 days (T60) to 0 (control) and 30 µg/L of U. ..................................................... 195
Tableau 21: Expression’s factors (EF) of the 5 studied genes in gills and hepatopancreas of P.
clarkii compared to the basal level of controls (n= 5 in each treatment condition) at day 30
(T30) and 60 (T60). ................................................................................................................ 196
Tableau 22: Isotopic lists of uranium (233U, 234U, 235U, 236U and 238U), their related daughters
selected for the source composition (obtained by Nuclides 2000) and corresponding DCC
values (Gy/d)/[Bq/g] of U accumulated in Hepatopancreas after 10 days of exposure obtained
by EDEN 2 software (Elementary Dose Evaluation for Natural Environment, developed by
IRSN). .................................................................................................................................... 217
Tableau 23: Expression factors (EF) of the 5 genes studied in P. clarkii compared to the basal
level of controls (n=5) ............................................................................................................ 221
Tableau 24 : Gamme de variation des concentrations accumulées dans la branchie et

l’hépatopancréas après exposition aigüe au Cd et à l’U. ........................................................ 267
Liste des figures
Figure 1 : Distribution mondiale de P. clarkii. ........................................................................ 19
Figure 2 : Evolution de la répartition de Procambarus clarkii. ............................................... 20
Figure 3 : Aspect d’une écrevisse Procambarus clarkii. ......................................................... 21
Figure 4 : Morphologieexterne d’une écrevisse. ...................................................................... 22
Figure 5 : Critères de détermination de P. clarkii. ................................................................... 23
Figure 6 : Différence d’aspect entre une écrevisse mâle et une écrevisse femelle.. ................ 24
Figure 7 : Anatomie interne d'une écrevisse ............................................................................ 26
Figure 8 : Cycle de la mue des écrevisses ................................................................................ 28
2
Figure 9 : Production mondiale de Procambarus clarkii. ........................................................ 29
Figure 10 : représentation des différents niveaux de l’organisation biologique pouvant être

affectés par les polluants et de leur rapidité de réponse. Ce schéma illustre aussi l’intérêt
écologique et mécanistique des différents niveaux dans la recherche ..................................... 34
Figure 11 : Représentation des méthodologies permettant d’évaluer les risques

écotoxicologiques. .................................................................................................................... 34
Figure 12 : Progression de l’état de santé d’un individu à l’exposition d’une augmentation de

la concentration d’un polluant. ................................................................................................. 35
Figure 13 : Illustration des différentes voies de contamination d’une écrevisse et de

complexation du Cd avec des phases organiques et inorganiques (dissoutes et particulaires). 43
Figure 14 : Spéciation chimique de 10µg/L de cadmium dans une eau douce synthétique
adaptée aux besoins des écrevisses (simulation avec le programme de spéciation géochimique
J-CHESS). ................................................................................................................................ 44
Figure 15 : Origine extra- et intracellulaire des radicaux libres dérivés de l’oxygène.. .......... 49
Figure 16 : Systèmes enzymatiques impliqués dans la défense contre le stress oxydant ........ 50
Figure 17 : Schéma de la balance anti-oxydants/pro-oxydants représentant un stress oxydant

.................................................................................................................................................. 52
Figure 18 : Mécanismes possibles expliquant la génération de stress oxydant par le cadmium

.................................................................................................................................................. 54
Figure 19 : Schéma de la chaîne respiratoire mitochondriale .................................................. 56
Figure 20 : Effets du cadmium sur les mitochondries. ............................................................. 58
Figure 21 : Lésions de l’ADN formées par attaque radicalaire du patrimoine génétique des
cellules ...................................................................................................................................... 59
Figure 22 : Chaîne de désintégration de l’234U, 235U et de l’238U............................................. 63
Figure 23: (A) Production mondiale d’uranium à partir de sites miniers en 2010 présentée en
tonnes par pays. (B) Inventaire des résidus miniers d’uranium recensés dans le monde en 2009
exprimés en million de tonnes ou en tonnes suivant les pays .................................................. 66
Figure 24 : Carte des mines d'uranium et sites de stockage en France (2009) superposée à la
carte de distribution de P. clarkii ............................................................................................. 67
Figure 25 : Spéciation chimique de 30 µg/L d’uranium dans une eau douce synthétique
adaptée aux besoins des écrevisses (simulation avec le programme de spéciation géochimique
J-CHESS). ................................................................................................................................ 69
3
Figure 26 : Peroxydation d'une portion d’une chaîne d’acide gras insaturée........................... 73
Figure 27 : Effets biologiques des rayonnements ionisants. Evolutions possibles au niveau

cellulaire en fonction du temps ................................................................................................ 76
Figure 28 : Les cinq grands types de dégradation de l’ADN, présentés sur les quatre bases
pouvant être touchées, les pyrimidines (cytosine C et thymine T) et les purines (adénine A et
guanine G) ................................................................................................................................ 77
Figure 29 : Représentation schématique d’un feuillet branchial d’une écrevisse. ................... 86
Figure 30 : Représentation schématique des différents types de cellules de l’hépatopancréas

des écrevisses ........................................................................................................................... 87
Figure 31 : Séquences partielles de nucléotides et les séquences d’acides aminés déduits (5’3’
cadre de lécture +1) du gène de la métallothionéine (mt) et de l’adénosine triphosphate
synthase-sous unité six (atp 6) de l’écrevisse Procambarus clarkii ........................................ 89
Figure 32 : Photos illustrant la taille des branchies et de l’hépatopancréas par rapport au corps
entier de l’écrevisse P. clarkii .................................................................................................. 91
Figure 33 : Carte du lieu de prélèvement des écrevisses. ......................................................... 94
Figure 34 : Dispositif expérimental .......................................................................................... 95
Figure 35 : Spéciation chimique de 600, 4000 et 8000 µg/L d’uranium dans une eau douce
synthétique adaptée aux besoins des écrevisses (simulation avec le programme de spéciation
géochimique J-CHESS)............................................................................................................ 97
Figure 36 : Système de filtration de l’eau contaminée au Cd ou à l’U par la calcite pour

minimiser les rejets................................................................................................................... 99
Figure 37 : Suivi des concentrations de Cd ou d’U dans l’eau filtrée en continu par la calcite
en fonction du temps. ............................................................................................................... 99
Figure 38 : Photo illustrant une mesure de la taille d’une écrevisse ...................................... 100
Figure 39 : Photo illustrant une écrevisse disséquée .............................................................. 100
Figure 40 : Procédure de digestion des échantillons biologiques. ......................................... 102
Figure 41 : Phototographie d’un SAAE 4110 ZL Perkin-Elmer. ........................................... 103
Figure 42 : Phototographie d’un ICP-AES Perkin Elmer Optima 4300 DV. ........................ 105
Figure 43 : Photographie d’un ICP-MS Agilent 7500 Cx et schéma de la trajectoire des ions
dans le quadripôle................................................................................................................... 106
Figure 44 : Schéma de fonctionnement du comptage en scintillation liquide et photographie

d’un compteur en scintillation liquide de type Wallac quantulus 1400 ................................. 107
4
Figure 45 : Schéma de fonctionnement d'une chromatographie ionique en phase liquide (ILC)
et photographie d’une ILC Dionex ICS 3000 ........................................................................ 110
Figure 46 : Illustration de l’ultramicrotome équipé d’un couteau de diamant (Leica

Microsystems, Rueil-Malmaison, France). ............................................................................ 112
Figure 47 : Observation de l’hépatopancréas de P. clarkii au microscope optique ............... 112
Figure 48 : Photographie d'un microscope électronique à transmission TecnaiG2 12 BioTwin

avec sa sonde microanalyse EDX .......................................................................................... 113
Figure 49 : Différentes gammes d’étalon pour le dosage des protéines totales ..................... 115
Figure 50 : Spectrophotomètre (SOFTmax® PRO) ............................................................... 115
Figure 51 : Principe du dosage de la SOD. ............................................................................ 116
Figure 52 : Pourcentage d’inhibition de la réaction colorimétrique par la présence de

différentes concentrations de SOD (U/ml) (n=3 par concentration). ..................................... 117
Figure 53 : Absorbances de différentes concentrations de catalase allant de 0 (blancs) à 100

U/ml en fonction du temps. .................................................................................................... 118
Figure 54 : Mise au point du dosage de la GPX : suivi de l’absorbance de blancs et des

fractions S100 des hépatopancréas (Hp) et des branchies (Br) en fonction du temps. .......... 120
Figure 55 : Mise au point du dosage de la GST: suivi de l’absorbance des blancs et des
fractions S100 des hépatopancréas (Hp) et des branchies (Br) en fonction du temps. .......... 121
Figure 56 : Extraction des ARN totaux. ................................................................................. 123
Figure 57 : Schéma simplifié de la rétro-transcription ........................................................... 124
Figure 58 : Principe d’un cycle de PCR classique ................................................................. 125
Figure 59 : Gel d’agarose renfermant les ADN d’intérêt. ...................................................... 126
Figure 60 : Purification des fragments de gènes d’intérêts .................................................... 126
Figure 61 : Clonage et transformation bactérienne ................................................................ 127
Figure 62 : Principe général de la PCR quantitative en temps réel ........................................ 130
Figure 63: Antioxidants activities (SOD, CAT, GPX, and GST) (mean ± SEM, n=5) in gills
and hepatopancreas of crayfish P. clarkii exposed 30 and 60 days to 0 and 10 µg/L of Cd. 143
Figure 64: Histopathological alterations in P. clarkii hepatopancreas tubules after 10 days of

acute exposure to Cd: (1) 0 mg/L; (2) 0.05 mg/L; (3) 0.5 mg/L (4) 5 mg/L; and 60 days of
chronic Cd exposure: (5) 10 µg/L .......................................................................................... 145
5
Figure 65 : Kaplan-Meier’s presentation of the survival rate of Procambarus clarkii exposed
to U during 240 h of exposure ................................................................................................ 172
Figure 66: Transmission electron micrographs coupled with energy dispersive X-ray results of
P.clarkii gills exposed for 10 days to 4 mg/L of U ................................................................ 173
Figure 67: Histopathological alterations in P.clarkii hepatopancreas tubules after 10 days of

exposure to dissolved heavy metals: (1) control; (2) 0.6 mg/L U; (3) 4 mg/L U; (4) 8 mg/L U
................................................................................................................................................ 174
Figure 68: Spearman correlation coefficients (r) between U concentrations in organs and gene
expression levels of the 5 genes studied.. ............................................................................... 175
Figure 69: Enzymatic activities of superoxide dismutase (SOD) (U/mg Prot, mean ± SEM, n=
5 in each treatment condition), catalase (CAT) (µmol /min/mg Prot, mean ± SEM, n= 5 in
each treatment condition), glutathione peroxidase (GPX) (nmol /min/mg Prot), and
glutathione S transferase (GST) (µmol /min/mg Prot, mean ± SEM, n= 5 in each treatment
condition) in gills and in hepatopancreas of the crayfish Procambarus clarkii exposed 30 and
60 days to 0 (control) and 30 µg/L of U. ................................................................................ 197
Figure 70: Concentrations (µg/g dW, mean ± SEM, n=5) of depleted uranium (DU) and
enriched uranium (233U) in: gills, hepatopancreas, stomach, intestine, green glands, muscles
and carapace of the crayfish P. clarkii exposed 4 (4d) to 10 (10d) days to 0 (control) and 30
µg/L of the metals .................................................................................................................. 219
Figure 71: Enzymatic activities of catalase (CAT) (µmol/min/mg Prot, mean ± SEM, n=5),
glutathione peroxidise (GPX) (nmol/min/mg Prot, mean ± SEM, n=5), glutathione S
transferase (GST) (µmol/min/mg Prot, mean ± SEM, n=5) and superoxide dismutase (SOD)
(U/mg Prot, mean ± SEM, n=5) in the hepatopancreas and gills of crayfish P. clarkii exposed
4 (4d) and 10 (10d) days to 0 (control) and 30 µg/L of depleted uranium (DU) or enriched
uranium (233U) ........................................................................................................................ 220
Figure 72: Concentrations of U and Cd in gills and hepatopancreas of crayfish P. clarkii

exposed to 40 µM of Cd or U for 4 to 10 days (µg/g, mean ± SEM, n=4 except for U
contaminated organs at T10, where n=5). .............................................................................. 240
Figure 73: Concentrations of U and Cd in gills and hepatopancreas of crayfish P.clarkii

exposed to 0.1µM of Cd or U for 30 to 60 days (µg/g, mean ± SEM, n=4 except for U
contaminated organs at T10, where n=5) ............................................................................... 241
Figure 74: Transmission electron micrographs coupled with energy X-ray results of P.clarkii
gills exposed for 10 days to 40 µM of Cd .............................................................................. 242
Figure 75: Histological alterations in P.clarkii hepatopancreas tubules after 60 days of

exposure to dissolved U: (1) control, (2 and 3) 0.1µM U ...................................................... 243
Figure 76: Principal components analysis (PCA) ordination of gills of crayfish P.clarkii
exposed to 0.1 µM of U or Cd at T30 and T60 characterized by the activities of SOD
6
(Superoxide dismutase: U/mg Prot), CAT (Catalase: µmol/min/mg Prot), GPX (Glutathione
peroxidise: µmol/min/mg Prot), and GST (Glutathione S transferase: µmol/min/mg Prot). . 244
Figure 77: Principal components analysis (PCA) ordination of hepatopancreas and gills of
crayfish P.clarkii exposed to 40 µM of U or Cd at T4 and T10 using the expression factors of
12s, atp6, cox1, sod(Mn) and mt compared to the basal level of controls (n=5) ................... 245
Figure 78: Principal components analysis (PCA) ordination of hepatopancreas and gills of
crayfish P.clarkii exposed to 0.1 µM of U or Cd at T30 and T60 characterized by the
expression factors of 12s, atp6, cox1, sod(Mn) and mt compared to the basal level of controls
(n=5).. ..................................................................................................................................... 246
Figure 79 : Présentation du ratio entre l’écart-type à la moyenne et la moyenne des

concentrations de Cd ou d’U accumulées dans les branchies ou l’hépatopancréas (en
pourcentage) en fonction des concentrations d’exposition. ................................................... 269
Figure 80 : Corrélation de Spearman (r) entre la bioaccumulation des métaux dans les
branchies et l’hépatopancréas et l’expression des 5 gènes étudiés suite à l’exposition aigüe (0,
0.05, 0.5 et 5 mg Cd/L ; 0, 0.6, 4 et 8 mg U/L ; à 4 et 10 jours). ........................................... 272
Figure 81 : Corrélation de l’expression des 5 gènes étudiés dans les branchies et les
hépatopancréas contaminés en fonction du temps (4, 10, 30 et 60 jrs) suite à une exposition de
30 µg/L d’U. ........................................................................................................................... 273
Figure 82 : Cinétique d’expression du gène atp6 normalisée par rapport au témoin après
exposition chronique (4 ; 10 ; 30 ; 60 jours) à faible dose d’U (30 µg/L). ............................ 273
Figure 83 : Synthèse de la tendance de l’expression des gènes étudiés suite à une forte (0.6, 4
et 8 mg/L) ou faible (30 µg/L) exposition à l’U. (↑) surexpression. (↓) répression. .............. 276
Figure 84 : Proposition d’un mécanisme de cytotoxicité induit par la présence de l’U......... 279
7
Liste des abréviations
Note : les mots en italique désignent des gènes.

·
OH radical hydroxyle
12S ARN ribosomal 12S
18S ARN ribosomal 18S
Ac eau activité de l’élément
ADN acide désoxyribonucléique
ADP Adénosine 5’-diphosphate
AF accumulation factor
ALA acide α-lipoique
ANCOVA analysis of covariance
ANOVA analyse de la variance
ARN acide ribonucléique
ARNm Acide ribonucléique messager
Asc•− radical ascorbyle
AscH− ascorbate monoanion
ATP adenosine triphosphate
atp5f1 ATP synthase H+ transporting mitochondrial F0 complex subunit b isoform 1
atp6 ATP-synthase sous unité six
ATPase adenosine triphosphate synthase
BCA acide bicinchoninique
BSA albumine sérum bovin
CAT catalase
CBR critical body residues
Cd cadmium
cDNA complementary acid desoxyribonucleide
CDNB 1-chloro-2.4-dinitrobenzene
coQ coenzyme Q
coQH2 coenzyme QH2
COX I/ cox1 cytochrome c oxydase sous unité I
COX IV cytochrome c oxydase sous unité IV
Ct threshold cycle
cytP450 cytochrome P450
DCCs dose conversion coefficient
ddext débit de dose externe
ddint débit de dose interne
ddt débit de dose total
DEPC diéthylpyrocarbonate
DNA acid desoxyribonucleotide
8
DNase I désoxyribonucléase
dNTP désoxynucléotide triphosphate
DTT 1,4-dithiothreitol
DU depleted uranium
DW dry weight
EA laboratoire d’écotoxicologie aquatique
EDX energy-dispersive X-ray
EF expression factor
ERO espèce réactive de l’oxygène
FAO food and agriculture organization of the United Nations
FIAM free ion activity model
gls1 glutaminase like
GPS global positioning system
GPX glutathione peroxidase/glutathion peroxydase
GR ou Gred glutathion réductase
GSH reduced glutathione/glutathion réduit
GSSG oxidized glutathione/glutathion oxydé
GST glutathione s transferase/glutathione s transférase
H 2O 2 peroxyde d’hydrogène
HO hème oxygénase
HO2· radical perhydroxyle
HOO· radical hydroperoxyle
HP hepatopancreas
HSP70 heat shock protein de 70 kilodalton
ICP-AES spectrométrie d’émissionatomique par plasma à couplage inductif
ICP-MS spectrométrie de masse par plasma à couplage inductif
J-CHESS java chemical equilibrium with species and surfaces
L• radical lipidique
LB milieu Luria Bertani
LC50 concentration létale entrainant 50% de mortalité
LOO• radical lipidique peroxylé
LOOH hydroperoxyde lipidique
LRE laboratoire de radioécologie et d’écotoxicologie
MDA malondialdéhyde
MET microscopy electronic transmission
MMP mitochondrial membrane potential
MPT mitochondrial permeability transition pore opening
MT/mt metallothionein/ métallothionéine
NaDPH nicotinamide adénine dinucléotide phosphate
NCBI national center for biotechnology information
9
NO· monoxyde d’azote
NOEC no observed effect concentration
·-
O2 radical superoxyde
oligodT deoxy-thymine nucleotides
ONOO- peroxynitrite
PCA principal component analysis
PCR polymerase chain reaction
Pi phosphate inorganique
PMSF phenylmethanesulfonyl fluoride
PS poids sec
PTP permeability transition pore
PVC polychlorure de vinyle
QQplot quantile-quantile plot
RNA ribonucleic acid
RNAse ribonucléases
·
RO radical alkoxyle (R est une chaîne carbonée)
·
RO2 radical peroxyle (R est une chaîne carbonée)
ROH alcool
ROOH hydroperoxyde
ROS reactive oxygen species
RT reverse-transcriptase
RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction
SAAE spectrophotométrie d’absorption atomique électrothermique
SEM standard error of the mean
SH groupement sulphydrile
SOD superoxide dismutase
sod(Mn) superoxyde dismutase mitochondriale
Tm temperature de fusion
U uranium
UA uranium appauvri
UV ultra-violet
vchat vesicular acetylcholine transporter
10
Chapitre I
Introduction
11
Chapitre I-A
Contexte et objectifs
12
Les écosystèmes aquatiques sont depuis longtemps menacés par les activités
anthropiques génératrices de pollutions (accidentelles ou chroniques). Avec l'urbanisation
croissante et le fort développement économique de certains pays, les rejets des polluants sont
de plus en plus importants au niveau mondial. Rejetés directement dans les eaux de surfaces,
émis dans l'atmosphère, évacués dans les eaux usées ou répandus sur les sols, la plupart des
polluants finissent par rejoindre les milieux aquatiques. Par conséquent, l’accroissement des
activités humaines constitue un risque potentiel pour la biocénose. La prise de conscience de
la nécessité de protéger l’environnement pour une bonne conservation ou une remise en l’état
rapide des milieux naturels est grandissante. Cette préoccupation de la société et de la
communauté scientifique a ainsi fait émerger certaines questions, notamment celles du
devenir des polluants dans l’environnement ainsi que leurs effets sur les organismes vivants.
La préoccupation européenne pour la préservation des ressources aquatiques et pour l’entrée
sur le marché de substances chimiques potentiellement toxiques a fait l’objet de nombreux
projets. Récemment, l’Europe a adopté en 2000 la Directive Cadre sur l’Eau (DCE) qui vise à
atteindre un bon état chimique et écologique des eaux en 2015. Trente-trois substances ont été
ainsi qualifiées de substances prioritaires et dangereuses prioritaires. De plus, le règlement
européen REACH (Registration, Evaluation, Autorisation, and Restriction of Chemicals)
entré en vigueur en 2007, a pour objectif principal de protéger la santé humaine et celle de
l’environnement tout en maintenant le développement des activités industrielles. Pour cela, il
vise à améliorer la connaissance des usages et propriétés des substances chimiques fabriquées
ou importées dans l’union européenne, à assurer la maitrise des risques liés à leurs
utilisations, et à restreindre ou interdire leur emploi en cas de besoin. Parmi les contaminants
majeurs de l’environnement, les métaux traces-tel le cadmium- posent de sérieux problèmes
écologiques surtout par leur rémanence et leur toxicité élevées. La démarche d’évaluation du
risque des substances chimiques a été éprouvée et fait l’objet de consensus tant réglementaires
que scientifiques. Actuellement, les 33 substances prioritaires et dangereuses prioritaires ont
fait l’objet d’études écotoxicologiques spécifiques qui conduisent à l’établissement de
Normes européennes de Qualité Environnementale (NQE). Parmi ces éléments métalliques,
certains présentent aussi des caractéristiques radioactives- tel l’uranium1- qui induisent des
risques pour les écosystèmes et l’homme par la combinaison de leur chimio- et radio-toxicité.
1
L’uranium, contrairement au cadmium n’appartient pas aux groupes des 33 substances prioritaires. Cependant, il fait partie
des substances pertinentes de la classification de la DCE.
13
Par ailleurs, le développement de méthodes d’évaluation du risque environnemental, associé
aux rejets ou à la présence de radionucléides dans l’environnement, a fait l’objet de deux
programmes de recherche européens, le projet ERICA (Environmental Risk for Ionising
Contaminants : Assessment and Management) et le FASSET (Framework for Assessment of
Environmental Impact). Ces programmes ont mis en évidence les lacunes de connaissances
concernant les expositions chroniques des radionucléides à faibles doses. L’étude des effets
des radionucléides dispersés dans l’environnement est devenue un thème majeur dont l’un des
enjeux est d’évaluer le risque écologique pour les organismes vivants. Ceci a mené au
lancement du programme ENVIRHOM (Radioprotection de l’ENVironnement à l’HOMme) à
l’Institut de Radioprotection et de Sureté Nucléaire en 2001 (Garnier-Laplace et Paquet,
2001). Ce programme a pour objectifs d’évaluer la toxicité des radionucléides et de mieux
comprendre les réponses biologiques suite à une bioaccumulation de ces contaminants chez
les organismes vivants. Depuis de nombreuses années, la radioécologie concerne l’étude des
transferts des radioélements dans les différents compartiments de la biosphère. A l’IRSN, et
plus particulièrement au LRE, la démarche d’évaluation du risque suit et utilise les mêmes
concepts que ceux développés pour l’écotoxicologie des éléments chimiques stables.
L’approche retenue dite intégrée, étudie les interactions entre les facteurs de contamination
(analyse fine de l’exposition au travers du concept de biodisponibilité) et la biocénose
(analyse des effets). L’analyse des effets se divise en deux sous parties, concernant
l’identification de marqueurs d’exposition/d’effet (biomarqueurs) et la caractérisation à
différentes échelles d’organisation biologique des effets et des mécanismes responsables de la
toxicité. Ce programme se consacre en partie à l’étude du devenir et des effets induits après
exposition à l’uranium. Plusieurs thèses ont été consacrées à l’acquisition de premières
données d’écotoxicologie sur différents modèles biologiques. Ces données concernent
principalement la caractérisation de l’exposition à travers l’étude de la spéciation chimique de
l’uranium associée à l’évaluation de la biodisponibilité. L’originalité de ce travail consiste à
évaluer les effets de l’U chez une espèce sentinelle. Une des approches proposées par le
programme ENVIRHOM est de comparer les effets des radioéléments (tel l’uranium) aux
effets chimio-toxiques de polluants plus connus (en termes de spéciation biologique et
d’études des effets sur les organismes) tels que les métaux (en particulier le cadmium). Une
autre partie vise aussi à discriminer la radio-toxicité de la chimio-toxicité de ces éléments
radioactifs. Cette thèse s’inscrit directement dans ce projet. Notre travail devra in fine
permettre d’identifier d’une part des marqueurs d’effets pouvant être utilisés dans l’évaluation
du risque environnemental et d’autre part, les mécanismes de toxicité.
14
Dans ce contexte, nous nous sommes consacrés à cinq objectifs majeurs au cours des
travaux de cette thèse2. Un des buts a été (i) d’étudier les paramètres toxicocinétiques
(bioaccumulation, distribution des éléments dans l’organisme et dans les tissus) de l’uranium
(U) et du cadmium (Cd) chez l’écrevisse Procambarus clarkii retenue comme espèce modèle.
Ensuite, le second objectif a été (ii) d’évaluer les effets des deux métaux à différentes échelles
de l’organisation biologique ; allant de l’étude d’impact au niveau de l’expression des gènes
mitochondriaux et des gènes marqueurs de stress oxydant, des activités des enzymes de stress
oxydant, des impacts histologiques, jusqu’à la survie des individus. La troisième approche a
concerné (iii) la mise en évidence du lien entre les effets des différents paramètres biologiques
étudiés entre eux, de les corréler à la bioaccumulation des contaminants et d’essayer
d’identifier des biomarqueurs pertinents de toxicité. Le 4ème axe de recherche s’est attaché à
(iv) évaluer la part relative des effets chimiques et radiologiques de l’U chez l’écrevisse.
Enfin, le dernier objectif(v) a visé à évaluer la toxicité de l’U en la comparant à celle du Cd
afin de classifier la toxicité de ce radioélément.
Afin de présenter l’étude menée en ce sens, ce manuscrit s’articule en 6 chapitres

majeurs.
Le premier chapitre vise à introduire les objectifs des travaux de thèse. En effet, le
présent sous chapitre décrit le contexte et les objectifs de nos études. Dans un second sous
chapitre, une description du modèle biologique, une synthèse bibliographique sur les
propriétés physico-chimiques du Cd et de l’U, leurs répartitions dans l’environnement, ainsi
que leurs mécanismes de contamination et leurs effets à différents niveaux de l’organisation
biologique d’intérêts sont développés. De plus, un résumé sur les connaissances concernant
les biomarqueurs et les bioindicateurs des polluants sera présenté. Dans un troisième sous
chapitre, nous avons présenté une justification de la stratégie expérimentale.
Le chapitre II concerne la description du matériel et des méthodes, en présentant plus

particulièrement les différentes techniques analytiques utilisées. Un point particulier est
consacré au clonage de deux gènes d’intérêt.
Le chapitre III est consacré à l’approche expérimentale menée pour évaluer les
impacts du Cd sur les différents paramètres biologiques retenus après exposition aigüe et
2
Pour plus de détails voire chapitre I-C.
15
chronique de l’écrevisse P. clarkii. Cette approche sera présentée sous la forme d’un article
(soumis).
Le quatrième chapitre aborde les expériences réalisées dans le but d’étudier les effets
de l’U sur les différents niveaux d’intégration biologiques déjà mentionnés. Un sous chapitre
(chapitre IV-A) sera dédié à la présentation des réponses génétiques, les structures
histologiques et la survie des écrevisses après une exposition de courte durée (4 et 10 jours) à
différentes concentrations (0,1 µM à 40 µM). Dans un second sous chapitre (chapitre IV-B),
nous présenterons les impacts de l’U au niveau moléculaire (génétique et enzymatique) après
une longue durée d’exposition (60 jours) à une concentration environnementale (0,1 µM). Un
troisième sous chapitre (chapitre IV-C), sera consacré à présenter l’approche utilisée pour
discriminer la radio de la chimio-toxicité de l’U. Ces études seront présentées sous forme de
trois articles dont les deux premiers sont publiés (Ecotoxicology and Environmental Safety) et
le dernier soumis (Ecotoxicology and Environmental Safety).
Dans le cinquième chapitre, nous avons comparé les effets du Cd et de l’U après
exposition aigüe (40 µM-10 jrs) et chronique (0.1 µM-60 jrs). Cette approche est aussi
présentée sous forme d’un article en cours de préparation.
Enfin, la partie finale (chapitre VI) du document présente une synthèse générale et les
perspectives de recherches issues de ce travail.
16
Chapitre I-B
Etude bibliographique
17
1. Le modèle biologique Procambarus clarkii
1.1. Systématique, origine et distribution
Avec plus de 640 espèces différentes, les écrevisses forment un groupe de crustacés
décapodes très diversifié (Crandall et Buhay, 2008). Il existe deux super-familles
d’écrevisses, Les Astacoidea (hémisphère nord) et les Parastacoidea (hémisphère sud). La
première est formée deux familles, les Cambaridae et les Astacidae alors que les
Parastacoidea sont composés d’une seule famille, les Parastacidae (Crandall et Buhay,
2008). La division entre les super-familles (astacoidae et parastacoidea) des hémisphères nord
et sud est d’origine pangéenne datant au moins du triasique (185-225 millions d’années). Des
fossiles d’écrevisses et des traces de terriers observées dans le Colorado et d’Utah datant de
265 millions d’années sont la preuve de cette phylogénie (Crandall, 2006). Procambarus
clarkii, appartient à la famille des Cambaridae (Crandall, 2010) (Tableau 1). Originaire du
Nord de l’Amérique et de l’Est de l’Asie (Crandall, 2006), elle est maintenant largement
répandue sur le territoire français au détriment des espèces endémiques principalement
rattachées à la famille des Astacidae.
Tableau 1 : Position systématique de Procambarus clarkii (Systema Naturae, 2011).
Classification
Domaine Eukaryota
Règne Animalia
Sous-règne Bilateria
Division Protostomia
Infra-règne Ecdysozoa
Super-embranchement Panarthropoda
Embranchement Arthropoda
Sous-embranchement Mandibulata
Infra-embranchement Crustaceomorpha
Super-classe Crustacea
Classe Malacostraca
Sous-classe Eumalacostraca
Super-ordre Eucarida
Ordre Decapoda
Sous-ordre Pleocyemata
Infra-ordre Astacidea
Super-famille Astacoidea
Famille Cambaridae
Genre Procambarus
Espèce clarkii
18
L’écrevisse de Louisiane, P. clarkii, est comme son nom l’indique très abondante en
Louisiane. Elle est native du Nord-Est du Mexique et du Sud des Etats-Unis (Henttonen et
Huner, 1999; Boets et al., 2009) C’est une espèce largement répandue dans le monde entier et
sur presque tous les continents (FAO; ISSG; NatureServe, 2003; Crandall, 2010) (Figure 1).
Netherlands
Belgium
United
Kingdom
Germany
France
Switzerland
Spain Georgia
USA Japan
Italy
Portugal China
Cyprus
Egypt Taiwan
Mexico Belize Dominican Republic
Philippines
Costa Rica
Uganda
Ecuador Kenya
Brazil Zambia
South Africa
Figure 1 : Distribution mondiale de P. clarkii (Adapté de Holdich, 2002; FAO; ISSG;

NatureServe, 2003;Crandall, 2010).
En effet, P. clarkii colonise les milieux avec succès grâce à sa forte compétitivité :
fécondité élevée (200-500 œufs/femelle : strategy-R) (ISSG) et sa maturité sexuelle précoce.
Une enquête réalisée en France en 2006 confirme la progression constante de cette espèce qui
est désormais recensée dans 61 départements. En une quinzaine d’années, l’espèce a colonisé
plus de la moitié du territoire national, confirmant par la même son extraordinaire capacité
d’expansion. La carte de répartition de l’espèce en France (Figure 2) indique de fortes
densités sur toute la façade atlantique, de la Loire-Atlantique, jusqu’au département des
Landes, mais aussi sur la façade méditerranéenne (Hérault, Gard, Bouches-du-Rhône). Une
explosion des densités de populations en Gironde, Charente-Maritime, Loire-Atlantique et
dans les Deux-Sèvres a été observée ces dernières années. Cette espèce est sans doute celle
qui présente le spectre écologique le plus large : elle est capable de coloniser des milieux
variés allant des zones à truites aux étangs côtiers en passant par les marais. Elle peut
supporter des mises à sec d’étangs de plusieurs mois. On la rencontre également dans certains
19
milieux temporaires (Loire Atlantique) et dans des milieux soumis aux marées (Pyrénées
atlantiques) (Collas et al., 2007).
Figure 2 : Evolution de la répartition de Procambarus clarkii. Pour les cartes des années
1977 à 2001, le signalement de l’espèce est figuré par un grisé. Pour la carte 2006,
l’intensité du gris reflète l’abondance de l’espèce à l’intérieur de chaque département
(Collas et al., 2007).
20
1.2. Biologie de l’écrevisse
1.2.1. Morphologie
Comme toutes les écrevisses, P. clarkii possède une carapace (Figures 3 et 4)
composée essentiellement de chitine et de carbonate de calcium. Leurs corps sont segmentés
comme tous les arthropodes. Le corps est divisé en deux parties, l’une antérieure qui est le
céphalothorax, l’autre postérieure qui est l’abdomen. Le céphalothorax est formé de la tête qui
est fusionnée au thorax. Cet organe est terminé en avant par un éperon, le rostre, dont la
pointe est l’apex. De part et d’autre du rostre, se trouvent deux yeux pédonculés. La tête porte
les antennules, les antennes (organes sensoriels), les mandibules, maxilles et maxillules
(appendices dévolus à la fonction de nutrition). Le sillon cervical sépare la partie céphalique
du céphalothorax d’une région comprenant deux aires branchiales de part et d’autre d’une aire
cardiaque. Sur cette région thoracique se trouvent trois paires de maxillipèdes (ou pattes
mâchoires) impliquées également dans la fonction de nutrition, et cinq paires de périopodes
(ou pattes locomotrices), la première paire se terminant par de grandes pinces. Les deux paires
qui suivent se terminent par de petites pinces et les deux dernières paires se terminent par des
griffes. L’abdomen est segmenté, chaque segment portant une paire de pléopodes et se
termine par le telson qui porte l’anus.
Figure 3 : Aspect d’une écrevisse Procambarus clarkii (Lukhaup, 2005).
21
Figure 4 :Morphologieexterne d’une écrevisse. Mp: maxillipède; Ma: mandibule; Mx:
maxille (Arrignon, 1991).
La taille des écrevisses varie entre les espèces, allant de 2 cm chez les écrevisses
naines adultes du genre Cambarellus à 40 cm (et plus de 5kg !) chez l’espèce la plus grande
parmi les invertébrées d’eau douce Astacopsis gouldi actuellement en danger (Horwitz, 1994).
Dans des conditions favorables à la croissance (bonne qualité de l’habitat, densité de
population faible), P. clarkii peut atteindre 14 cm pour un poids de 76 à 84 g (Huner et
Romaire, 1979; Dörr et al., 2006). Les couleurs des écrevisses sont aussi variées ; rouge (chez
P. clarkii), bleue, orange, verte, marron et même sans pigment (blanche). La diversité
morphologique se traduit aussi par l’existence d’écrevisses tachetées, rayées ou portant
d’autres dessins (Crandall, 2006). P. clarkii présente des aspects morphologiques
spécifiques qui aident à la détermination de cette espèce (Figure 5). Son céphalotorax
présente une série d’épines bien visibles de part et d’autre du sillon cervical. La crête
22
postorbitale est simple ; on ne voit qu’une épine. Le rostre, a des bords convergents
régulièrement pour se terminer par un triangle. La crête médiane dorsale est peu marquée et
non denticulée. Les pinces possèdent des protubérances alternées sur leur tranchant ainsi que
des épines et un ergot bien visible. Adulte, cette espèce est de couleur rougeâtre. Dörr et al.
(2006) ont montré une corrélation entre les stades de croissance (maturité sexuelle) de P.
clarkii et la couleur de l’écrevisse. Il semble que les écrevisses n’ayant pas atteint la maturité
sexuelle présentent un gradient de couleur allant d’un vert-grisâtre pour les plus jeunes jusqu'à
atteindre un marron-verdâtre.
Figure 5 : Critères de détermination de P. clarkii (Roqueplo, 1992). (1) Le céphalotorax

de cette espèce, présente une série d’épines bien visibles en arrière du sillon cervical. (2)
La crête médiane dorsale est peu marquée et non denticulée. (3, 4) Les pinces possèdent
des protubérances alternées sur leur tranchant ainsi que (5) des épines et un ergot bien
visible.
Une différenciation bien apparente permet la détermination aisée des sexes (Figure 6).
 La morphologie des pinces, plus développées chez le mâle que chez la femelle.
 La largeur de l’abdomen, supérieure chez la femelle.
 Et surtout par la morphologie des deux premières paires de pléopodes :
 L’examen de la face ventrale permet de différencier le mâle de la femelle : chez le

mâle les deux paires antérieures d’appendices abdominaux sont dirigées en avant
et transformées en stylets copulateurs en vue de l’écoulement du sperme.
 Chez la femelle, toutes les pattes abdominales sont identiques, à l’exception de la
première qui est atrophiée. Les orifices génitaux sont placés au niveau de la
23
troisième paire de pattes locomotrices chez la femelle et de la cinquième paire chez
le mâle.
L’écrevisse est une espèce dite « gonochorique » dans le sens où les sexes sont séparés
et qu’elle effectue une fécondation externe (Parnes et al., 2003).
Procambarus sp. mâle Procambarus sp. femelle
Figure 6 : Différence d’aspect entre une écrevisse mâle et une écrevisse femelle.
(A) Stylets copulateurs. (B) Les orifices génitaux.(Source: Shi-wei Zhao/ NIGP:
http://www.mutagenes.net/yixian-formation/yanbin-shen.html).
1.2.2. Anatomie et physiologie

Le tube digestif (Figure 7) des décapodes est caractérisé par un court œsophage, un
estomac volumineux aux parois chitineuses, un intestin moyen ou mésentéron et un intestin
postérieur ou proctodeum. Seul l’intestin moyen, d’origine endodermique, joue un rôle
fonctionnel en termes de digestion et d’absorption. Les parties antérieures et postérieures,
d’origine ectodermique, présentent un revêtement chitineux renouvelé à chaque mue et n’ont
donc qu’un rôle mécanique dans la digestion. L’intestin postérieur aboutit à l’anus et est
entouré par la masse musculaire abdominale. L’estomac est divisé en 2 régions par un sillon
médian et transverse : une région antérieure ou cardiaque et une région postérieure nommée
chambre pylorique. En fonction du stade de mue, la partie antérieure peut contenir une paire
de pièces calcaires, discoïdes, les gastrolithes, réserve de calcium, nécessaire à l’élaboration
de la carapace nouvelle. Cet appareil est doté de 3 dents chitineuses ou calcaires qui
constituent un véritable broyeur gastrique, appelé « moulin gastrique ». Les glandes
24
antennaires (vertes) sont des organes excréteurs situés dans la région ventrale de la tête près
de la bouche. Elles sont accompagnées d’un canal excréteur et d’une vessie. La glande
digestive (ou hépatopancréas) est un organe plurilobé qui occupe la quasi-totalité de la cavité
du céphalothorax. Elle est impliquée dans l’absorption et le stockage des nutriments. Chaque
lobe est constitué de tubules fermés à une extrémité et s’ouvrant de l’autre dans un canal qui
débouche au niveau de la chambre pylorique de l’estomac. Les glandes antennaires (ou
glandes vertes) sont des organes excréteurs situées dans la région ventrale de la tête près de la
bouche. Elles sont constituées d’un canal excréteur et d’une vessie. Les organes reproducteurs
se situent près de la glande digestive. Les testicules des mâles sont blanchâtres et lisses, et les
ovaires des femelles sont de couleur jaune orangée et d'aspect grenu. L’appareil circulatoire
des crustacés est de type lacunaire : l’hémolymphe (sang incolore) est propulsée par le cœur
dans des artères puis des capillaires qui s’ouvrent librement dans la cavité générale. Après
avoir irrigué les différents organes, l’hémolymphe est collectée par des sinus veineux qui la
ramène finalement aux branchies, lieu de l’hématose. Ce sang bien oxygéné va alors retourner
au péricarde. Les branchies, véritable appareil respiratoire, se situent dans deux chambres
latérales indépendantes à la périphérie de la carapace. La convection ventilatoire est assurée
par les battements de deux appendices dérivant des deuxièmes maxilles, les scaphognathites :
leurs mouvements de pompage créent une dépression dans les cavités branchiales qui entraîne
le passage de l’eau sur les branchies (Figure 7A). Des chémorécepteurs périphériques
sensibles à l’O2 et au CO2 sont localisés dans les cavités branchiales, ils sont responsables du
réflèxe de ventilation et jouent un rôle fondamental dans le maintien du métabolisme aérobie
(Massabuau et al., 1980; Massabuau et Burtin, 1984). Ainsi, l’écrevisse est capable d’ajuster
sa respiration et garde son indépendance à l’égard de la teneur en oxygène : elle est capable
d’accroitre son taux de ventilation dès que l’oxygène diminue. Les organes respiratoires
jouent également un rôle dans les échanges ioniques. En effet, le milieu intérieur des
écrevisses est plus concentré en ions que le milieu aquatique extérieur, ainsi l’osmorégulation
se fait grâce à de nombreux transporteurs membranaires au niveau des branchies. Le système
nerveux de l’écrevisse est essentiellement ganglionnaire, le cerveau (masse ganglionnaire) se
situe dorsalement près de l’œsophage (Arrignon, 1991).
25
A
Branchies
B Intestin
Intestin
Figure 7: Anatomie interne d'une écrevisse.(A) Branchies: Les flèches indiquent le sens
d’écoulement de l’eau dans la masse branchiale (d'après Massabuau, 1984). (B) reste des
organes.
1.2.3. Croissance et mue

En moyenne, les écrevisses P. clarkii peuvent vivre jusqu'à trois ans (Dörr et al.,
2006). Frutiger et al., (1999) ont trouvé que cette espèce peut atteindre l’âge de cinq ans. Il est
possible de déterminer l’âge des écrevisses à partir de la mesure de la longueur du corps
(šmietana et Krzywosz, 2006). La croissance des crustacés se fait grâce à des mues. Ces
changements périodiques de l’exosquelette dominent toute la physiologie des crustacés car ils
sont précédés et suivis par une série de modifications tissulaires et comportementales, comme
la formation et la calcification de l’exosquelette à chaque fois (Adelung, 1971) (Figure 8).
Les jeunes écrevisses muent un grand nombre de fois (Arrignon, 1991). Par exemple, dans
une eau de 18 à 20°C, les juvéniles Astacus leptodactylus muent tous les 17 à 20 jours
pendant les premiers mois (Lassalle, 1985). Chez P. clarkii, les adultes mâles et femelles (~
7.5-9.6 cm) muent surtout en avril quand la température de l’eau se réchauffe. Seules les
femelles muent une seconde fois entre juin et juillet. Puis une autre période de mue pour les
deux sexes peut survenir vers novembre (11.2°C) (Dörr et al., 2006). Le phénomène de mue
26
semble être lié étroitement aux changements de la température de l’eau (Huner, 1978) et au
cycle de reproduction (mue avant et après la période de frai) (Dörr et al., 2006).
On distingue principalement quatre étapes :
a. L’intermue ou inter-ecdysis:
Ce stade est défini comme étant la période de stabilité de l’animal.

b. La prémue ou Proecdysis :
Avant la mue, les réserves de calcium ne sont pas uniquement contenues dans la carapace.
Elles sont principalement constituées par les gastrolithes (60%), par le calcium contenu dans
l’hépatopancréas (0.6 à 1%) et dans l’hémolymphe (un peu plus de 1%). Durant cette période
les gastrolithes vont se constituer et grossir.
c. La mue ou ecdysis ou exuviation:
C’est le moment où s’effectue le changement de l’exosquelette. La jointure membraneuse qui

relie l’arrière du céphalothorax au premier segment abdominal se déchire et le corps fait
saillie, couvert de sa nouvelle carapace molle. Pendant ce temps l’animal est mou, sans
défense et ne se nourrit pas. Il ne peut se déplacer que faiblement.
d. La postmue ou post-ecdysis :
Au cours de la postmue, l’exosquelette se constitue et se consolide. Les gastrolithes y

contribuent et, de ce fait, diminuent rapidement. Au début de la postmue, la quantité de
calcium de l’animal mou est de 10 à 14 fois supérieure à celle de l’animal calcifié. Les
gastrolithes ne peuvent donc suffire. De plus, l’animal, faute d’un appareil masticateur
solidifié, ne peut trouver le complément de calcium dans sa nourriture. L’apport se fait alors
au niveau de l’appareil branchial. La calcification de la nouvelle carapace est conditionnée par
la teneur de l’eau ambiante en calcium. Simultanément se manifeste une croissance accélérée
des tissus, à partir du moment où l’appareil masticateur s’est solidifié, la phase d’inanition
s’achève (Arrignon, 1991).
27
Figure 8 : Cycle de la mue des écrevisses (Arrignon, 1992)
1.3. Ecologie et comportement

Procambarus clarkii est adaptée pour vivre dans une grande variété de milieux
aquatiques, comme les rivières, les étangs, les ruisseaux, les canaux, les marais et les
marécages alternativement dans des zones inondées et exondées (FAO ; ISSG ; NatureServe,
2003). De plus, elle habite fréquemment les environnements perturbés comme les champs de
riz, les canaux d’irrigation et les barrages (Oliveira et Fabiao, 1998). Cette espèce tolère une
grande variation des facteurs abiotiques : elle supporte des niveaux bas en oxygène, des
températures extrêmes (10-22 °C à 30 °C ou plus), une salinité modérée et la pollution (FAO;
NatureServe, 2003; Gherardi et Vadim, 2006; Cruz et Rebelo, 2007). P. clarkii peut tolérer
des périodes de sècheresse allant jusqu’à 4 mois (Henttonen et Huner, 1999). On trouve les
plus fortes densités d’écrevisses dans les plans d’eau ensoleillés de moins de 40 cm de
profondeur. Les fonds les plus propices sont turbides et couverts d’herbiers (Arignon, 1991).
Son comportement fouisseur s’accompagne de la construction de terriers. Ces organismes
sont omnivores (Rodriguez et al., 2005). Les écrevisses sont des animaux nocturnes (Miranda-
Anaya, 2004), elles sortent de leur passivité et de leur cachette (herbier, racines, pierres,
galeries) le soir, période au cours de laquelle elles se déplacent et cherchent leur nourriture.
Dans les cours d’eau à forte biomasse d’invertébrés, les écrevisses occupent une position
28
trophique supérieure et ont un taux de croissance plus élevé que les écrevisses dans les cours
d’eau à faible biomasse d’invertébrés (Olsson et al., 2008). Le cannibalisme est courant chez
les écrevisses (Holdich, 1993). Dans des situations extrêmes, elles peuvent réduire ou éliminer
d’autres animaux ou plantes de l’écosystème (Momot, 1995). C’est une source de nourriture
pour les mammifères et les oiseaux, jouant un rôle important entre les interactions trophiques
terrestres et aquatiques (Correia, 2001). Elles peuvent même servir de nourriture pour les
insectes (Herberholz et al., 2004), les amphibiens (Hirai, 2004), les reptiles (Bondavalli et
Ulanowicz, 1999), les poissons (Garvey et al., 1994) et pour d’autres écrevisses. Une
compétition existe aussi inter-spécifiquement et ceci pour des raisons diverses comme pour
l’espace et l’abri (Garvey et al., 1994).
1.4. Intérêt économique

L’écrevisse est un animal fort ancien dont la capture, plus aisée que celle du poisson, a
constitué à l’aurore de la vie humaine, une source de nourriture souvent vitale pour certaines
hordes d’hommes préhistoriques (Arignon, 1991). L’une des premières mentions de
l’écrevisse a été faite par Aristote en 300 A.J.C et c’est surtout au moyen âge que sa
popularité a augmenté et d’énormes quantités ont commencé à être consommées (Skurdal et
Taugbol, 2001). Ceci continue jusqu’à nos jours, où au moins 85% de la consommation
mondiale des écrevisses est assurée par P. clarkii (Kerby et al., 2005) en relation avec ses
capacités de croissance rapide et d’adaptation aux changements saisonniers (Henttonen et
Huner, 1999) (Figure 9). Le commerce de P. clarkii participe d’une façon importante à
l’économie de certains pays (Antón et al., 2000).
Figure 9 : Production mondiale de Procambarus clarkii (FAO Fishery Statistic).
29
En 2003, la production de P. clarkii aux Etats-Unis était évaluée à 48.6 millions de dollars
(~35.33 millions d’euros). La production mondiale (Figure 9) de cette espèce provient
principalement de Louisiane et d’autres états du Sud des Etats-Unis, mais aussi de Chine, du
Kenya et d’Espagne où cette espèce a été introduite (FAO). En 2005, la FAO a enregistré une
production significative de cette espèce en Chine, s'élevant à plus de 88 000 tonnes, avec une
valeur excédant 303 millions d’USD. Le succès commercial de cette espèce en Europe est
surtout lié à sa résistance à coloniser les milieux perturbés et à la peste de l’écrevisse,
Aphanomyces astaci à qui les écrevisses indigènes sont sensibles (Lindqvist et Huner, 1999).
La production d'écrevisse en France est faible. Il y a pourtant un marché de
consommateurs puisque la France importe environ 1 000 tonnes/an et ne produit qu'environ
10 tonnes. 98% des importations se font sous forme d'écrevisses surgelées, voire cuisinées
(majoritairement Procambarus clarkii), les 2% restant correspondent à des écrevisses
importées vivantes, essentiellement de Turquie et de Grèce (majoritairement Astacus
leptodactylus). L'exploitation de la ressource sauvage de Procambarus clarkii en France est
faible car elle conditionnée par deux points réglementaires:
 le transport d'animaux vivants est interdit de façon à éviter sa propagation dans des
endroits où l'espèce n'est pas présente ;
 la vente d'animaux ne peut être effectuée que par des pêcheurs professionnels
(Miossec, 2004).
Tout au long de notre étude, nous avons donc bénéficié tes techniques de pêches d’un
professionnel (N. Gauthier) et des autorisations réglementaires pour l’approvisionnement et
pour le transport de cette espèce vivante.
1.5. Intérêt scientifique et écologique

‎En recherche, les écrevisses servent d’organismes modèles depuis plus de 25 ans, dans des
champs disciplinaires variés tels que la neurobiologie, la vision, la toxicologie,
l’écophysiologie, la biologie de la conservation et l’évolution, etc. Parmi les écrevisses, le
maintien et l’élevage de P. clarkii dans les laboratoires sont relativement faciles à gérer. Il y a
déjà 125 ans que Huxley (1880) a rédigé des textes d’études zoologiques sur ces animaux. Par
ailleurs, du fait de son caractère invasif, cette espèce se trouve en abondance dans les milieux
naturels et son prélèvement, en période favorable, est aisé.
Au Kenya, P. clarkii a été introduite comme moyen de lutte biologique contre les
parasites trématodes Schistosoma haematobium, vecteur de la schistosomiase, car elle
30
s’alimente de gastéropodes d’eau douce, hôte intermédiaire de ces parasites. Sous certaines
conditions, P. clarkii a significativement réduit la dispersion de la schistosomiase dans
certaines régions du Kenya (Mkoji et al., 1999; Lodge et al., 2005; Foster et David, 2007).
De même, P. clarkii sont souvent utilisées comme indicateurs de pollution métallique
aquatique puisque ces crustacés tendent à accumuler les métaux dans leurs tissus (Anderson et
al., 1997; Sánchez López et al., 2004; Alcorlo et al., 2006; Suárez-Serrano et al., 2010).
2. Evaluation des risques de contamination des milieux aquatiques

Dans un contexte de surveillance de l’état écologique (biomonitoring) des milieux
aquatiques (Loi n°2006-1772 du 30 décembre 2006 sur l'eau et les milieux aquatiques), la
France s’est engagée à caractériser l’état écologique de ses écosystèmes et à surveiller
d’éventuels changements de ses milieux. Les mesures des paramètres physiques, chimiques et
bactériologiques de l’eau renseignent sur la qualité de cette ressource (Li et al., 2010) mais
leur caractère ponctuel ne permettra pas de révéler d’éventuelles perturbations perpétrées en
dehors des périodes de mesures. De même, ces techniques ne renseignent pas sur l’état des
organismes aquatiques ni sur les conséquences écologiques engendrées par les changements
survenus dans ces écosystèmes. Dans le cas d’une pollution métallique, la mesure des
concentrations des métaux dans le biotope (eau, sédiment) peut révéler l’existence d’une
pollution, mais ne met pas en évidence le degré d’accumulation des métaux par les
organismes, ni la toxicité engendrée sur les individus et l’écosystème (Zhou et al., 2008). En
conséquent, ces dernières années, les études en écotoxicologie se sont développées afin de
mettre en place des outils permettant une bonne évaluation de l’état écologique des milieux.
Ces études passent notamment par la recherche de bioindicateur ou d’espèces sentinelles
servant de support pour la mesure de marqueurs biologiques (biomarqueurs). Ces derniers
reflèteront le degré des atteintes de l’environnement.
2.1. Bioindicateur et espèce sentinelle

Un bioindicateur est un organisme (ou partie d’un organisme ou une communauté
d’individus) qui renseigne sur la qualité de l’environnement (ou partie de l’environnement)
(Li et al., 2010). Lorsque ces derniers existent dans l’écosystème, ils sont appelés espèces
sentinelles (surveillance passive). Ils peuvent y être introduits de façon standardisée
(surveillance active) par encagement (caging). D’après Lagadic et al. (1998) et Lagadic et
Caquet (1996), un bioindicateur peut aussi être un organisme qui par sa disparition ou par sa
présence et/ou son abondance, renseigne sur l’état de santé d’un milieu (dans ce cas appelés
31
aussi : indicateurs biologiques). Nous pouvons ainsi distinguer des espèces « pollusensibles »
(bioindicateurs négatifs) et des espèces « pollurésistantes » ou « pollutolérantes »
(bioindicateurs positifs). Des outils tels que les indices biocénotiques reposent sur ce principe
et permettent d’évaluer la structure et la santé d’un écosystème à un instant donné. Cependant,
le recensement des différentes espèces peuplant un écosystème donné présente une tâche
lourde avec plusieurs limites: il apporte peu ou pas d’informations sur la cause réelle de la
disparition des espèces (prédation, facteurs abiotiques…), sur les contaminants
éventuellement responsables de la mortalité des individus, sur les mécanismes de toxicité
ayant conduit à leur mort.
D’après Zhou et. al. (2008), un organisme bioindicateur doit présenter idéalement les
caractéristiques suivantes:
 être capable d’accumuler les polluants à des niveaux élevés sans que ceux-ci ne
conduisent à sa mortalité.
 avoir une mobilité réduite afin de refléter une contamination localisée du
milieu.
 être abondant et présenter une grande distribution pour un échantillonnage
répétitif.
 avoir une durée de vie assez longue pour la comparaison des effets et des
niveaux de contamination entre les différents stades de développement.
 fournir suffisamment de tissus biologiques pour d’éventuelles recherches
d’impacts sur des différents niveaux biologiques.
 être faciles à pêcher et à maintenir au laboratoire.
 vivre dans l’eau.
 occuper une position importante dans la chaîne trophique.
 Présenter des relations effet-dose.
P. clarkii remplit un certain nombre de critères énumérés par Zhou et all. (2008): elle est
présente en abondance dans des milieux aquatiques variés et peut être pêchées aisément. Les
adultes peuvent fournir des quantités de tissus suffisantes pour effectuer diverses analyses
biologiques ou toxicologiques. A ceci s’ajoute le fait que les écrevisses sont des organismes
benthiques en contact étroit avec les sédiments dans lesquels les polluants peuvent être
stockés et concentrés. Ce sont également des animaux qui supportent d’être encagés sur de
longues périodes dans le cadre de programmes de surveillance (Alcorlo et al., 2006). Enfin,
du fait qu’elle occupe une place centrale dans la chaîne trophique, cette espèce est un vecteur
32
potentiel de contamination des niveaux trophiques supérieurs. P. clarkii peut être donc
considérée comme une espèce bioindicatrice pertinente. D’ailleurs, cette espèce a déjà
contribuée à des études de suivi de contaminations des écosystèmes aquatiques par différents
métaux et polluants organiques (ex : PCB, HCB DTT, Cd, Cu, Zn, Hg…) (Anderson et al.,
1997; Sánchez López et al., 2004; Alcorlo et al., 2006; Faria et al., 2010; Suárez-Serrano et
al., 2010).
2.2. Biomarqueurs
Les polluants peuvent impacter différents niveaux de l’organisation biologique
(Figure 10). Les progrès de la biologie cellulaire ont permis une identification des
mécanismes moléculaires de leur action toxique. Ces événements peuvent aussi engendrer à
leur tour des altérations pathologiques à des niveaux biologiques plus élevés. Ces
connaissances fondamentales ont ouvert la possibilité de forger de nouveaux outils
d’évaluation et de surveillance fondés sur les réponses biologiques induites par l’exposition
d’organismes à des xénobiotiques (Figure 11). Ceci a donné naissance au concept de
biomarqueurs, en référence à des mesures de modifications des réponses biologiques suite à
une contamination. La Figure 11 présente la place des biomarqueurs d’exposition et d’effet(s)
dans les différents champs d’investigations de l’écotoxicologie. Plusieurs définitions
concernant les biomarqueurs ont été énoncées au cours de ces dernières années (Schlenk,
1999). Nous retiendrons la suivante: «un biomarqueur est un changement observable et/ou
mesurable au niveau moléculaire, biochimique, cellulaire, physiologique ou comportemental
révélant l’exposition présente ou passée d’un individu à au moins une substance chimique à
caractère polluant» (Amiard et al., 1998). Les biomarqueurs sont mesurés au sein d’espèces
capables d’accumuler les contaminants (ex : bioindicateurs) et vont permettre de réaliser des
études d’écotoxicité des substances chimiques (chemical testing) (au laboratoire) et de
biomonitoring (in situ).De plus, cette figure illustre la diversité des biomarqueurs pouvant être
identifiés et utilisés en écotoxicologie.
33
Figure 10 : représentation des différents niveaux de l’organisation biologique pouvant
être affectés par les polluants et de la rapidité de réponse. Ce schéma illustre aussi
l’intérêt écologique et mécanistique des différents niveaux dans la recherche. Modifié
d’après Snape et al. (2004).
Figure 11 : Représentation des méthodologies permettant d’évaluer les

risques écotoxicologiques modifiée d’après Lagadic & Amiard (1997).
34
L’approche « biomarqueur» peut être illustrée par une relation entre l’état de santé
d’un organisme et sa réponse à des concentrations croissantes de contaminants dans son
environnement. Un organisme est en « bonne santé », dans un état d’homéostasie en absence
de contamination. En présence d’une contamination croissante, cet organisme va présenter des
altérations fonctionnelles visibles pouvant entrainer sa mort à plus ou moins long terme.
Durant cette phase, l’individu peut compenser le stress subi jusqu’à un certain seuil, une fois
ce dernier dépassé il sera incapable d’effectuer une compensation. Si le contaminant est retiré
de l’environnement, il peut retrouver son état normal (l’altération est réversible). Lorsque la
quantité de polluant est trop importante, l’organisme atteint un stade où les altérations
deviennent irréversibles entrainant inéluctablement sa mort (Figure 12).De plus, cette figure
illustre la diversité des biomarqueurs pouvant être identifiés et utilisés en écotoxicologie.
Figure 12 : Progression de l’état de santé d’un individu à l’exposition d’une

augmentation de la concentration d’un polluant (Allen et Moore, 2004). Les
biomarqueurs 1 à 3 peuvent correspondre aux biomarqueurs d’exposition et 4 et 5 aux
biomarqueurs d’effets.
35
Les biomarqueurs ont été classifiés en trois catégories: Les biomarqueurs d’exposition,
d’effet et de susceptibilité (Timbrell et al., 1994; Lagadic et al., 1997; Van der Oost et al.,
2003).
Les biomarqueurs d’exposition sont des indicateurs de la contamination des systèmes

biologiques par un (des) xénobiotique(s). Ils sont en général impliqués dans les mécanismes
de défense cellulaire (ex : enzymes antioxydantes) et de détoxication des xénobiotiques. Leurs
variations n’entrainent pas obligatoirement d’effets délétères. Ils témoignent de la présence
d’un contaminant dans le milieu et par conséquent de sa disponibilité pour l’organisme. Leur
suivi peut aussi consister en la détection au sein d’un individu de métabolites issus de la
métabolisation du xénobiotique ou de produits issus de son interaction avec certaines
biomolécules ou cellules cibles.
Les biomarqueurs d’effet correspondent à des altérations biologiques qui en fonction de

l’intensité des réponses peuvent être associées de manière avérée statistiquement ou possible
du point de vue mécanistique à une pathologie ou un état physiologique altéré.
Les biomarqueurs de susceptibilité/sensibilité indiquent quant à eux la capacité inhérente

ou acquise d’un organisme à répondre au stress induit par l’exposition à un xénobiotique.
Cette sensibilité individuelle peut résulter de polymorphismes des gènes impliqués dans le
métabolisme des xénobiotiques ou dans la réparation des lésions de l'ADN. Néanmoins,
malgré l’intérêt croissant suscité par le phénomène de variation d’origine génétique de la
réponse à la contamination par les polluants, les études incluant le suivi de biomarqueurs de
susceptibilité sont rares. Les facteurs impliqués sont en effet très complexes tant au niveau de
la multiplicité des nuisances rencontrées en milieu environnemental que de la multiplicité des
voies métaboliques et des mécanismes de réponse.
Cette subdivision est quelque peu imprécise du fait que les réponses des biomarqueurs
peuvent être interprétées comme étant des effets biologiques ou biochimiques induits suite à
l’exposition à l’agent toxique; ceci donnant théoriquement à ces réponses la capacité de
mettre en évidence à la fois l’exposition et les effets toxiques. Dans le but d’éviter des
confusions, l’ensemble des marqueurs biologiques (qu’ils soient biochimiques ou
histologiques) mesurés au sein des organismes durant cette thèse sera regroupé sous le terme
de “biomarqueurs”.
36
Différents biomarqueurs ont été proposés dans la littérature pour analyser les impacts
des agents toxiques (polluants métalliques et organiques) sur les écrevisses et pour les utiliser
en biomonitoring. Citons entre autre le suivi des niveaux de composés protéiques (ex:
métallothionéine et vitellogénine) (Martín-Díaz et al., 2006) et non protéiques (ex : GSH,
glutathion total (tGSH), glutathion oxydé (GSSG)) (Kovacevi et al., 2008); des atteintes
(induction/répression) enzymatiques (ex : estérases, topoisomérase, cytochrome P450…)
(Escartín et Porte, 1996; Fernandes et al., 2002; Paolucci et al., 2004; Vioque-Fernández et
al., 2007a; Vioque-Fernández et al., 2007b); des modifications de l’osmorégulation (variation
dans les concentrations de sodium, calcium et chlorure de l’hémolymphe) (Demers et al.,
2006) ; des symptômes histopathologiques (Martín-Díaz et al., 2006) ; des modifications des
systèmes oxydants et pro-oxydants (Stolyar et al., 2006; Elia et al., 2007; Tan et al., 2007;
Dörr et al., 2008; Faria et al., 2010), des variations dans les réponses immunitaires (ex :
lysozyme) et des niveaux des produits de peroxydations lipidiques (ex : le malondialdéhyde
(MDA)) (Tan et al., 2007).
En ce qui concerne plus spécifiquement les biomarqueurs de contamination au Cd
chez les crustacés, nous retrouvons dans la littérature que la protéomique est utilisée
régulièrement comme technique pour évaluer le stress engendré par ce xénobiotique. Le suivi
des niveaux d’induction des métallothionéines (MT) est la méthode la plus utilisée dans la
littérature pour mettre en évidence ce stress (Pedersen et al., 1998; Guan et Wang, 2004;
Martin-Diaz et al., 2005; Wu et Chen, 2005; Amiard et al., 2006; Martín-Díaz et al., 2006;
Nunez-Nogueira et al., 2006; Liberge et Barthélémy, 2007; Erk et al., 2008; Ma et al., 2008;
Wang et Wang, 2009; Wen-Hong et al., 2009; Geffard et al., 2010; Khan et al., 2010) suivi
par l’étude des variations des niveaux de la vitéllogénine (Martin-Diaz et al., 2004; Martin-
Diaz et al., 2005; Martín-Díaz et al., 2006). Nous pouvons trouver aussi des études qui ont
utilisé les réponses histopathologiques (Martín-Díaz et al., 2006; Lei et al., 2011), des
marqueurs de stress oxydants (Silvestre et al., 2006; Liberge et Barthélémy, 2007; Wang et
Wang, 2009; Wen-Hong et al., 2009; Lei et al., 2011) et de peroxydation lipidique (Wang et
Wang, 2009) pour mettre en évidence le stress causé par le Cd.
Par contre, jusqu’à ce jour les études qui portent sur l’utilisation de biomarqueurs
subcellulaires d’U sont rares chez les organismes aquatiques, voire inexistantes chez les
crustacés. En effet, les études écotoxicologiques des effets de ce radionucléide concernent le
zooplancton. Ces études sont basées sur l’observation des individus via des tests de mortalité
ou d’immobilisation (Barata et al., 1999; Semaan et al., 2001; Kuhne et al., 2002; Antunes et
al., 2007a; Antunes et al., 2007b; Zeman et al., 2008; Khangarot et Das, 2009). D’autres ont
37
évalué les impacts sur la reproduction (Semaan et al., 2001; Zeman et al., 2008; Massarin et
al., 2010), sur l’assimilation de la nourriture et la croissance (Kuhne et al., 2002; Zeman et al.,
2008; Massarin et al., 2010; Massarin et al., 2011) et sur d’autres processus physiologiques
(ex : consommation de l’oxygène) (Zeman et al., 2008; Massarin et al., 2010). Une étude s’est
aussi fondée sur l’utilisation des indices biologiques fonctionnels pour évaluer l’état des
écosystèmes près de sites miniers. Les auteurs ont eu recours au recensement des espèces de
micro-crustacés (présence/ absence) in situ et ont évalué les impacts sur la diversité et
l’abondance du zooplancton à différentes périodes (Melville, 1995). Massarin et al., (2011)
ont aussi utilisé l’histopathologie comme biomarqueur pour révéler les atteintes de
l’épithélium intestinal des daphnies après exposition à l’U.
Cooley et al (2000) ont utilisé les MT, le MDA (produit de la peroxydation lipidique)
et l’histopathologie comme marqueurs pour détecter l’impact de l’U sur les poissons
Coregonus clupeaformis. Labrot et al., (1996; 1999) ont évalué l’induction du
malondialdéhyde chez Danio rerio, le mollusque Corbicula sp. et le vers Eisenia fetida pour
mettre en évidence une éventuelle peroxydation lipidique générée par l’U. Dans plusieurs
études d’impacts de l’U sur poissons, mollusques et vers de terre, les changements de
l’activité de certaines enzymes (ex : catalase, glutathion peroxydase, superoxyde dismutase) et
de niveau de molécules hydrosolubles (glutathion total) antioxydantes impliquées dans la
défense contre le stress oxydant ont été utilisés comme biomarqueurs de contamination
(Labrot et al., 1996; Labrot et al., 1999; Barillet et al., 2007; Barillet et al., 2011). Le niveau
de l’acétylcholinesterase a été aussi déterminé pour évaluer la neurotoxicité de l’U chez
Danio rerio (Labrot et al.1996 ; Barillet et al. 2007, 2011) le mollusque Corbicula sp. et le
vers Eisenia fetida (Labrot et al. 1996). Simon et al. (2011a) et Barillet et al. (2011) ont étudié
la génotoxicité (test comète) induite par l’U chez le bivalve Corbicula fluminea et le poisson
zèbre Danio rerio respectivement. De plus, Barillet et al. (2010) ont étudié les atteintes
structurales des cellules (histologie) de cette même espèce de poisson afin d’évaluer la
toxicité de l’U. De même, Lerebours et al. (2009; 2010a; 2010b) ont utilisé l’histopathologie
et les réponses transcriptomiques comme biomarqueurs de contamination à l’U chez cette
espèce.
38
3. Généralités sur le Cadmium
3.1. Description
Quarante huitième élément de la table périodique, le Cd un métal trace non essentiel. À
l’état pur il est malléable, inodore et de couleur métal blanc-argent, légèrement bleuté. Son
poids atomique est de 112.41 g/mol (Lide, 1998-1999) et il possède 8 isotopes naturels stables
109
et 14 isotopes radioactifs. L’isotope radioactif Cd est utilisé comme traceur isotopique
(Martin-Garin et al., 2004). La masse volumique du Cd à 20°C est égale à 8.65 g/cm 3 et sa
température de fusion est égale à 321.07°C (Lide, 1998-1999). Ce métal possède une
température de vaporisation basse de 767°C qui permet l’inhalation de vapeur de cadmium
(ex: cigarette) (Lide, 1998-1999; Pinot et al., 2000). En solution, il se trouve principalement
sous la forme de cation, à l'état d’oxydation +II (Tricot, 1999).
3.2. Origine et distribution

Le Cd est présent dans l’environnement (roches, sédiments, sol, poussière, air, eau,
plantes et animaux, tableau). Il est naturellement présent dans la croute terrestre (0,11 µg/g) et
les roches où il est généralement associé au zinc (WHO, 1992; Pinot et al., 2000). Il est
présent dans des roches phosphatiques et les sols à des concentrations allant de 0,1 à 100 mg/g
(Pinot et al., 2000) et de 0 ,1 à 1 mg/g respectivement (Korte, 1983). La pluie et l’érosion
naturelle font en sorte que le Cd rejoint les milieux aquatiques et intègre le cycle de l’eau
(Tableau 2) (WHO, 1992). L'activité volcanique est une source naturelle majeure d’émission
de cadmium atmosphérique. Les volcans marins sont aussi à l’origine de la présence de ce
métal en mer, mais la quantification de la part de Cd apportée par ces processus n’a pas
encore été réalisée (WHO, 1992). Toutefois, le bruit de fond naturel du Cd (Tableau 2) ne
semble pas avoir de conséquences graves sur la survie et la santé des organismes vivants ni
sur l’environnement (Pinot et al., 2000).
39
Tableau 2 : Bruit de fond du cadmium dans l’environnement (d’après Pinot et al., 2000).
Milieux Concentration du Cd
Croute terrestre 0.11µg/g
Roches phosphatiques 0.1 - 100 mg/g
Sols 0.1- 1 mg/g
Sols de surface 0.07 - 1.1 µg/g
Poussière ménagère 0.42 - 6.6 µg/g
Air de régions inhabitées < 1 ng/ m3
Eau non pollué (en général) < 1 µg/L
Eau de mer 0.02 - 0.1 µg/L
Eaux côtières et eaux douces < 0.1 µg/L
Les activités anthropiques contribuent à l’augmentation des concentrations des métaux

dans l’environnement. Durant la seconde moitié du siècle précédent, la production et la
consommation du cadmium ont augmenté considérablement dans la plupart des pays
industrialisés (Pinot et al., 2000). Les quantités mondiales de Cd retrouvées dans
l’environnement ont été estimées entre 25 000 à 30 000 tonnes par an, dont 4000 à 13000
tonnes sont générées par les activités humaines telles que les exploitations minières et la
consommation des combustibles fossiles (Denmark, 2002). Jackson et Macgillivray, (1995)
ont reporté que le Cd total présent dans les effluents aquatiques provenant de toutes activités
et de toutes les régions du monde est supérieur à 1110 tonnes. Toutefois, Mahler et al. (2006)
rapportent que cette contamination d’origine anthropique tend à diminuer dans certains pays
certainement grâce aux réglementations liées à l’utilisation et au rejet du Cd mises en place au
cours de ces dernières décennies (WHO, 1992; Denmark, 2002).
Le Cd est principalement obtenu (comme sous-produit) à partir des extractions minières

de zincafin d’être utilisé dans le secteur industriel et la manufacture de divers produits. Il est
utilisé essentiellement dans les applications suivantes (Thornton, 1992):
 Les batteries (nickel- cadmium)
 Pigments de peinture (plastique, verre et l’émail)
 Stabilisant dans le traitement des polymères de PVC
 Dans l’industrie de plastique
 Dans la préparation d’alliages spéciaux.
40
Ces usages conduisent à répandre le Cd dans l’environnement à cause des émissions
atmosphériques, des effluents liquides, des eaux usées, des déchets solides, de boues et de
vases. Le Tableau 3 résume les sources les plus importantes et les quantités d’émission de Cd
en Europe reportées par Pinot et al. (2000). En France, quelques cours d’eau souffrent de
contaminations importantes au Cd à cause des activités anthropogéniques comme par exemple
le Riou Mort, petit affluent du Lotoù les concentrations annuelles moyennes peuvent atteindre
22µg Cd/L (Morin et al., 2007). Les concentrations en Cd des eaux côtières de Patras en
Grèce peuvent atteindre la concentration de 9 µg/L (Koliadima et Karaiskakis, 1990). Les
concentrations de Cd retrouvées dans le delta de l’Ebre en Espagne sont de l’ordre de 4.24 à
5.22 µg Cd/L (Schuhmacher et al., 1995). Dans l’estuaire Reghaia en Algérie les
concentrations de Cd peuvent atteindre 200 à 1000 µg/L (Belabed et al., 1994).
Tableau 3 : Emissions de Cd en Europe (d’après Pinot et al., 2000).
Cadmium
Émissions du cadmium en Europe (tonnes/an)
Dépôts de déchets solides 4425
Rejets issues des incinérations 29
Emissions des industries d'acides phosphoriques 157
Déchets solides issues de la production du fer et de l'acier 300
Combustion du pétrole 49
Fertilisants 374
Epandages et boues d'épuration 52
Activités industrielles 55
Cycle de l'eau 98
3.3. Spéciation du Cd
La spéciation chimique des espèces dissoutes en solution concerne la distribution d'un
élément selon différentes catégories d'espèces chimiques dans un système (Campbell et
Couillard, 2004). Pour un métal cationique, on peut considérer les formes suivantes (Figure
13):
- L‘ion métallique libre (ex : Cd2+).
- Des complexes impliquant des anions inorganiques (phase dissoute < 10 nm) présents dans
les milieux naturels (HO-, F-, Cl-, HCO3-, CO32-, SO42-, S2O32-…).
- Des complexes impliquant des ligands organiques simples (acides aminés, hydroxamiques,
polycarboxyliques…) ou complexes (acides humiques, fulviques, protéines…) (phase
dissoute < 0.45 µm).
41
Le métal peut aussi s’associer à des phases particulaires (>0.45 µm) organiques (ex : débris de
végétaux, bactéries, zooplancton, phytoplanctons, copépodites…) et inorganiques (ex :
Argiles, oxydes et hydroxydes de fer et de manganèse). L’abondance relative de chaque
espèce chimique va être dépendante de plusieurs facteurs, et notamment de la composition
ionique de l’eau, qui va moduler les caractéristiques physico-chimiques telles que la salinité
(Figure 13) ou le pH (Figure 14), ainsi que la composition et la richesse en matière
organique. Le Cd2+ est l’espèce la plus présente à faible pH et à faible pCl (Figure 13),
exception faite des formes adsorbées.
Les formes ioniques dissoutes ou ion libres, Cd2+, sont les plus biodisponibles pour les
organismes aquatiques (Campbell, 1995), du fait de leur capacité à traverser les membranes
biologiques des branchies (contamination par voie directe) (Di Toro et al., 2001). Selon le
modèle de l’ion libre (FIAM : free ion activity model-(Morel, 1983)), tout ligand capable de
complexer l’espèce Mn+ (avec M un métal et n le nombre d’électrons) peut diminuer ses
capacités de bioaccumulation. En effet, la complexation de Cd2+ avec les phases organiques
ou inorganiques présentes dans l’eau va rendre ce métal moins biodisponible aux organismes
aquatiques par voie directe (Van Ginneken et al., 1999; Niyogi et Wood, 2004; Clifford et
McGeer, 2010), hormis pour les espèces susceptibles d’ingérer ces particules (organismes
fouisseurs, déposivores et mollusques filtreurs), qui peuvent ainsi se contaminer par voie
trophique (voie indirecte). De plus, une diminution de l’accumulation de l’ion libre peut
survenir à cause d’une compétition entre les ligands présents dans le milieu et les sites de
fixation au niveau de la membrane biologique (Di Toro et al., 2001; Niyogi et Wood, 2004).
Afin de s’assurer que les espèces chimiques de Cd sont toujours les mêmes entre les
différentes conditions d’exposition, nous avons choisi d’effectuer toutes nos expériences dans
une eau artificielle à pH 6-7. La composition chimique de cette eau est donnée dans le
(Tableau 4) (eau Al Kaddissi/écrevisses) et la spéciation chimique du Cd dans ces conditions
expérimentales est donnée dans la figure 14. Les espèces chimiques prépondérantes du Cd
dans cette eau à pH 6-7 correspondent aux cations Cd2+ et CdCl+.
42
Figure 13 : Illustration des différentes voies de contamination d’une écrevisse et de
complexation du Cd avec des phases organiques et inorganiques (dissoutes et
particulaires) (source: S.AL.K/IRSN/CNRS).
43
Tableau 4 : Bilan des concentrations des ions majeurs (µmol/L) présents dans les
différents types d’eau étudiés au sein du laboratoire
Ions Eau Eau Eau

Eau- Eau Eau Eau
majeurs robinet- Zeman Al-
Esparron Bourrachot Lerebours robinet-EA
(µmol/L)et LRE (daphnies/ Kaddissi
(écrevisses) (poissons) (poissons) (écrevisses)
pH (écrevisses) écrevisses) (écrevisses)
Ca2+ 1300 1985.8 2000 289 218 2440 1640
2+
Mg 218.9 434.1 500 195 60 610 500
+
Na 783 700.3 870 324 221 490 870
+
K 88 36.6 81 152 25 86 80
-
Cl 1074.7 702.3 4100 919 378 820 4100
2-
SO4 724.5 997.3 510 100 130 650 509
-
NO3 124.7 54.8 3.2 310 148 58 76.5
-
HCO3 n.d n.d 770 X X n.d 15*
2-
CO3 n.d n.d X 7 7.5 n.d X
3-
PO4 <0.1 4.2 2.1 X X n.d X
-
NO2 26.1 X X X X 2 X
pH 8.6 8.37 8 6.5 6.5 8.4 6.7
(X) absent. (n.d) non déterminé. Note : Les concentrations ioniques des eaux synthétiques (Eau
Zeman, Eau Bourrachot, Eau Lerebours, Eau Al Kaddissi) présentées dans le tableau correspondent
aux concentrations apportées par les sels au moment de la fabrication; le reste des résultats correspond
aux concentrations mesurées dans les eaux naturelles (Eau-Esparron, Eau robinet-LRE, Eau robinet-
EA). (*) l’eau adaptée à P. clarkii après équilibre avec la PCO2atmo= 0.000316présente une
concentration de HCO3- égale à 281 µmole/L. (Écrevisses) Eau adaptée aux besoins des écrevisses.
(Daphnies) Eau adaptée aux besoins des daphnies. (Poissons) eau adaptée aux besoins des poissons.
70%
60%
50% Cd[2+]
Espèces de Cd (%)
Cd(OH)2[0]
40% Cd(OH)Cl[0]
CdCl[+]
30% CdCl2[0]
CdCl3[-]
20% CdOH[+]
10%
0%
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
pH
Figure 14 : Spéciation chimique de 10µg/L de cadmium dans une eau douce synthétique
adaptée aux besoins des écrevisses (simulation avec le programme de spéciation
géochimique J-CHESS).
44
3.4. Mécanismes de contamination en milieu aquatique
La bioaccumulation des métaux par les organismes aquatiques implique un transfert du
métal du milieu environnant vers le milieu intérieur, au travers des barrières épithéliales (ex :
branchies, paroi du tractus digestif, revêtement tégumentaire). La première phase
d’accumulation des métaux est donc liée aux phénomènes de traversée des membranes
biologiques (bicouche phospholipidique incluant des protéines). Dans le cas d’une
contamination par voie directe, le Cd de la phase dissoute est absorbé par les surfaces
directement en contact avec le milieu extérieur (ex : branchies). Mentionnons que la présence
de mucus à la surface des échangeurs respiratoires peut représenter une barrière très efficace
limitant l’accessibilité des métaux à la membrane biologique (Lacroix et al., 1993). Les
métaux adsorbés sur la phase particulaire seront plutôt ingérés puis internalisés après
solubilisation dans le tube digestif (Figure 13). Chez les crustacés, l’entrée du Cd par voie
directe ne peut se faire que par les parties perméables de l’exosquelette donc notamment par
les branchies (Rainbow, 1997). Le mécanisme d’entrée du Cd utilise les mêmes voies que
celle du calcium (Verbost et al., 1989; Bjerregaard et Depledge, 1994; Silvestre et al., 2004;
Bondgaard et Bjerregaard, 2005). La substitution des ions Ca2+ par Cd2+ au niveau des canaux
calciques est expliquée par le rayon atomique du Cd très proche de celui du Ca (0.96 et 0.99
Å respectivement) (Silvestre et al., 2004). Le Cd peut être également absorbé par simple
diffusion passive, mais cette voie non spécifique ne serait efficace que pour les fortes
concentrations du métal dans le milieu extracellulaire (Grouselle et al., 1996). Rainbow
(1995) évoque une autre possibilité de transport des ions métalliques libres chez les crustacés
où le métal pourrait se lier à une protéine de transport et être transféré à la cellule par
diffusion facilitée. Le passage du Cd dans le milieu interne des organismes dépend également
de leur état physiologique: en effet la bioaccumulation du métal va augmenter chez les
crustacés après la mue car le pompage du calcium augmente (Bondgaard et Bjerregaard,
2005). Ce phénomène est accru chez les crustacés d’eau douce qui doivent en plus lutter
contre la fuite des ions en milieu hypotonique (Mantel et Farmer, 1983). L’hémolymphe des
crustacés est capable de transporter le Cd vers différents organes (Martin et Rainbow, 1998;
Silvestre et al., 2004). A titre d’exemple, une contamination du crabe Carcinus maenas à 3
µg/L de Cd par voie directe et pour une période de 21 jours a conduit à une bioaccumulation
massive du métal au niveau des branchies puis de l’hépatopancréas(Martin-Diaz et al., 2005).
Une même tendance a été observée chez Procambarus clarkii exposé 21 jours à 10 ou 30
µg/L de Cd par voie directe (Martín-Díaz et al., 2006).
45
3.5. Effets biologiques du Cd
3.5.1. Au niveau de l’organisme et des tissus
Reddy et Fingerman (1995) ont étudié un impact physiologique du Cd conduisant à un
changement de couleur chez le crabe Uca pugilator après 48h d’exposition à 10 mg/L de Cd
(forte dose) par voie directe. Ces auteurs ont démontré que la diminution de la dispersion des
pigments noirs dans les mélanophores (cellules contenant les pigments noirs) était
significative suite à cette contamination. Apparemment, ce métal n’affecte pas directement les
mélanophores, mais agit sur le processus neuroendocrinien qui contrôle le phénomène de
dispersion.
Rodríguez Moreno et al. (2003) ont montré que 0.5 mg/L de Cd administré par voie
directe peut entraîner une inhibition de la mue chez les crabes adultes Chasmagnathus
granulata. Les auteurs reportent que le Cd empêche la production des quantités nécessaires
d’ecdysones (hormone de mue) pour déclencher la mue.
Le Cd peut altérer le comportement des organismes. Une étude a montré que ce
métaldiminue le taux de prise de nourriture de Gammarus pulex (après 168h, diminution de
30% à 7.5 µg/L et de 36% à 15 µg/L). Il diminue aussi sa locomotion (après 120h, diminution
de 20% à 7.5 µg/Let de 31% à 15 µg/L ; après 168h, diminution de 38% et de 39 % à 7.5 et
15 µg/L respectivement) et sa ventilation (après 120h l’effet sur l’hypoventilation est
significatif à 15 µg/L ; après 168h la même réponse est observée dans les deux cas de
contamination) (Felten et al., 2008). Des études ont aussi montré que le Cd est capable de
perturber l’ouverture valvaire du bivalve d’eau douce Corbicula fluminea (Tran et al., 2003),
de perturber l’orientation et la capacité de nage de Neomysis integer (Roast et al., 2000) et de
diminuer la vitesse de locomotion des crevettes Hippolyte inermis (Untersteiner et al., 2005).
Il faut mentionner que le comportement des animaux est de plus en plus utilisé comme une
mesure d’exposition sub-létale aux contaminants toxiques (Felten et al., 2008).
Le Cd peut affecter la reproduction des crevettes Palaemonetes pugio. Une exposition à
2.51 µg/L de Cd a entraîné une diminution de 50% des femelles gravides, une diminution
significative du nombre de larves par portée (diminution de 27% à 1.51 µg/L ; et de 36% à
2.51 µg/L). La fertilité a diminué d’environ 50% à 1.51 µg/L et de 75% à 2.51 µg/L (Manyin
et Rowe, 2008). Chez l’écrevisse Procambarus clarkii, l’injection de 0.5 µg Cd/ g de poids
corporel a entrainé une inhibition de la maturation des ovaires, ce qui peut avoir une
conséquence négative importante sur la reproduction (Reddy et al., 1997). Des femelles
d’écrevisses Procambarus Clarkii exposées par voie directe à 0.5 mg/L de Cd pendant 4 mois
montrent une diminution significative du nombre d’œufs par portée (48 ± 22.97) par rapport
46
au contrôle (203 ± 145.57) et du succès d’éclosion (95% des contrôles ont éclos versus 17%
des contaminés). Ainsi, le Cd a affecté d’une façon considérable la production des œufs et
leur éclosion (Naqvi et Howell, 1993).
Le Cd peut causer des changements structuraux. Citons à titre d’exemple les changements
observés au niveau des épipodites et des branchies chez les crevettes Penaeus japonicus
(Soegianto et al., 1999). L’exposition directe à 2000 et 4000 µg/L Cd durant 4 jours a entraîné
des changements structuraux profonds au niveau des branchies. Les cellules épithéliales
branchiales étaient nécrosées, désorganisées et vacuolisées. Les expositions à 200 µg/L durant
15 jours et à 2000 et 4000 µg/L durant 4 jours, ont provoqué des altérations profondes des
épipodites: augmentation de leur épaisseur, diminution du nombre de microvillosités apicales,
des invaginations basales, des mitochondries... Les auteurs suggèrent que ces altérations
peuvent conduire à une perturbation de la respiration et de l’osmorégulation chez les
organismes contaminés. Une exposition de P.clarkii pendant 21 jours à 10 et 30 µg Cd/L a
conduit à des changements histologiques au niveau des branchies et de l’hépatopancréas, dont
les symptômes majeurs observés étaient une vacuolisation des tissus et une désintégration de
l’épithélium (Martín-Díaz et al., 2006). Les hépatopancréas d’écrevisses Astacus astacus
présentaient des atteintes structurales similaires avec une nette dilatation des tubules après 10
semaines d’exposition à 2 µg/L (Meyer et al., 2006).
3.5.2. Effets Sub-cellulaires

Au sein de la cellule le Cd peut impacter l’ADN, l’expression des gènes, certaines
activités enzymatiques, les mitochondries et/ou induire des espèces réactives de l’oxygène
(Verbost et al., 1989; Almeida et al., 2002; Hartwig et al., 2002; Rainbow, 2002; Wang et al.,
2004; Sokolova et al., 2005; Gonzalez et al., 2006). A ce titre, le Cd est parfois utilisé comme
xénobiotique modèle afin d’exprimer un stress cellulaire et induire une réponse spécifique aux
métaux traces comme les MT(protéines de faibles poids moléculaires capables de séquestrer
le Cd), ou bien afin de générer un stress thermique ou oxydatif, comme l’HSP (heat shock
proteins) ou l’HO (hème oxygénase) (Pinot et al., 2000). Le Cd est surtout connu pour sa
capacité à modifier l’état redox de la cellule. Toutefois certains effets peuvent être liés à sa
structure similaire au calcium (Pinot et al., 2000). En effet, le Cd pénètre dans la cellule par
les mêmes voies d’entrée que le calcium, affectant ainsi sa mobilisation et son homéostasie
dans la cellule (Staessen et al., 1996).
47
3.5.2.1. Stress oxydant
Les espèces réactives de l’oxygène (ERO), ou « Reactive Oxygen Species » (ROS) en
anglais, incluent les radicaux libres dérivés de l’oxygène (Tableau 5), l’oxygène singulet (·O-
O·) qui est un dérivé très réactif de l’oxygène et le peroxyde d’hydrogène (H2O2). Un radical
libre est une espèce chimique (atome ou molécule) instable contenant un ou plusieurs
électrons célibataires (non appariés, noté par un point) (Tessier et Marconnet, 1995). Ce
déséquilibre n’est que transitoire et est comblé par l’acceptation d’un autre électron ou par le
transfert de cet électron libre sur une autre molécule (Afonso et al., 2007). Les radicaux libres
vont oxyder les protéines, l'ADN et les membranes cellulaires (attaque des lipides constitutifs
par peroxydation lipidique) et perturber ainsi le fonctionnement normal des cellules (Wang et
al., 2004).
Tableau 5: Bilan des différents radicaux libres centrés sur l’oxygène (Gardès-Albert et
al., 2003 ; Valko et al. 2006).
Radicaux libres centrés sur l’oxygène

O2·- Radical superoxyde
HO2· Radical perhydroxyle
·
OH Radical hydroxyle
·
RO2 Radical peroxyle (ex: (HOO·) le radical hydroperoxyle)
RO· Radical alkoxyle (où R est une chaîne carbonée)
En plus des radicaux oxygénés libres (Tableau 5), les radicaux libres rassemblent aussi ceux
dérivés d’acides gras insaturés (ex : (LOO·) radical lipidique peroxylé), le peroxynitrite
(ONOO-) et le monoxyde d’azote (NO·). L’origine de la production des ERO peut être
endogène (ex : mitochondrie, peroxysome, cytP450, NADPH-oxydase, Xanthine oxydase,
réactions immunitaires) ou bien exogène (ex : rayons γ, X, UV, électrons, métaux,
xénobiotiques, pathogènes) (Stohs et Bagchi, 1995; Afonso et al., 2007) (Figure 15).
48
Figure 15 : Origine extra- et intracellulaire des radicaux libres dérivés de l’oxygène.
XO: xanthine oxydase. P-450 : cytochrome P-450. RLO : radicaux libres dérivés de
l’oxygène (Afonso et al., 2007).
Ainsi, les cellules des êtres aérobies, en état d’oxydoréduction normal, ont une concentration
basale en radicaux libres de l’oxygène non nulle. Par ailleurs, au sein de certaines cellules
immunitaires, des enzymes interviennent dans la production de radicaux libres pour détruire
les microorganismes, des macromolécules étrangères ou les cellules en décomposition de
tissus nécrotiques (Wilson et Salamatian, 2003). La source principale de génération d’ERO
endogènes dans la cellule est la respiration mitochondriale (Tessier et Marconnet, 1995). En
effet, lors de la respiration cellulaire, la réduction de l'oxygène moléculaire par les
cytochromes respiratoires peut être réalisée de façon incomplète et s'accompagner ainsi d'une
formation parallèle d’espèces extrêmement réactives de l’oxygène. Il faut aussi noter qu’au
sein du cytosol, diverses réactions chimiques peuvent produire ces dérivés de l’oxygène. Pour
lutter contre un excès de production de ERO, l’organisme dispose d’un arsenal important
d’antioxydants (Figure 16) comme les superoxydes dismutases (SOD), les glutathions
peroxydases (GPx), les catalases (CAT), les métallothionéines (MT) et les glutathions S-
transférases (GST)…
49
Figure 16: Systèmes enzymatiques impliqués dans la défense contre le stress oxydant
adaptés d’après Valko et al. (2006).
Note: Les équations ne sont pas équilibrées. (SOD) superoxyde dismutase. (O 2.-) ion
superoxyde. (H2O2) peroxyde d’hydrogène. (GPx) glutathion peroxydase. (GSSG)
glutathion oxydé.(GSH) glutathion réduit. (Gred) glutathion réductase. (.OH) radical
hydroxyle. (Fe2+) ion ferreux. (Fe3+) ion ferrique. (LH) acide polyinsaturé. (L•) radical
lipidique. (LOO•) radical lipidique peroxylé. (T-OH) forme réduite de la vitamine E. (T-
O•) un radical de la vitamine E. (LOOH) hydroperoxyde lipidique. (AscH−) ascorbate
monoanion. (Asc•−) radical ascorbyle. (DHLA) acide dihydrolipoique. (ALA) acide α-
lipoique. (GST) Glutathion S transférase.(LOH) alcools lipidiques. (CAT) catalase.
La superoxyde dismutase (SOD)

La superoxyde dismutase est une enzyme ubiquitaire chez les organismes aérobies. C’est une
métalloprotéine à Cu et à Zn présente dans le cytosol des eucaryotes (Cu/Zn SOD), et à Mn
dans les mitochondries (Mn SOD). Elle catalyse la dismutation du radical superoxyde selon la
réaction (Culotta et Earl, 2001 ; Ruas et al., 2008; Aschner et Jiang, 2009):
2H+ +O2·- + O2·- → O2 + H2O2
Les cellules se protègent ainsi des effets toxiques du radical superoxyde, très réactif avec les
molécules biologiques, en le convertissant en un composé moins toxique: le peroxyde
d’hydrogène. Ce dernier composé demeurant toutefois toxique pour la cellule, d’autres
50
enzymes vont intervenir dans la neutralisation de cette espèce : la catalase et la glutathion
peroxydase (Kono et Fridovich, 1982; Michiels et al., 1994; Arthur, 2000).
La catalase (CAT)
C’est une enzyme héminique, elle contient donc des atomes de fer au sein de hèmes
qui constituent les sites actifs de la protéine. Sa fonction principale est la protection contre les
effets toxiques du peroxyde d’hydrogène en catalysant sa décomposition en eau et oxygène
(Kono et Fridovich 1982; Michiels et al. 1994):
2 H2O2 → O2 + 2 H2O
La glutathion peroxydase (GPx)

La glutathion peroxydase est une enzyme qui intervient, avec la catalase, dans la
destruction de l’H2O2 (Blum et Fridovich, 1985; Labrot et al., 1996), et aussi dans la
neutralisation des hydroperoxydes issus de la peroxydation des acides gras polyinsaturés
(Valko et al., 2006).
Elle catalyse la réduction du peroxyde d’hydrogène par le glutathion (tripeptide constitué de
glutamate, cystéine et glycine):
H2O2 + 2G-SH → 2 H2O + G-S-S-G, ainsi que celle des hydroperoxydes:
R-O-O-H + 2G-SH → ROH + H2O + GSSH
La glutathion S transférase (GST):

La glutathion-S-transférase est une enzyme qui catalyse la conjugaison entre un
peptide, le glutathion réduit, et les composés électrophiles. Elle intervient au niveau de la
phase II du processus de détoxication cellulaire (Elia et al., 2003). Cette conjugaison du
glutathion avec certains substrats permet la formation de composés moins toxiques. La GST
joue également un rôle dans la destruction des peroxydes et des époxydes provenant de
l’oxydation non enzymatique des acides gras (Valko et al., 2006). Des études ont aussi montré
que le H2O2 peut aussi induire la GST (Hayes et Pulford, 1995; Solé et al., 2004).
La métallothionéine (MT) :
Cette protéine de faible poids moléculaire (6 kDa possédant 57-58 acides aminés chez
les crustacés) très riche en cystéine (18 des acides aminés), (Pedersen et al., 1996; Vašák,
2005), possède de fortes potentialités de fixation des métaux (peut lier jusqu’à sept atomes de
métaux divalents) basées sur les propriétés thioloprives de ces xénobiotiques (forte affinité
51
pour les groupements thiols) (Overnell et al., 1988; Sparla et Overnell, 1990). De plus, sa
structure lui confère des capacités redox (Hamer, 1986). Ainsi, cette protéine joue un rôle
important dans l’homéostasie des métaux essentiels, dans la détoxication des métaux toxiques
(Ahearn et al., 2004; Paul-Pont et al., 2010), mais également dans la protection contre les
radicaux libres et les dommages oxydatifs (Palmiter, 1998) en piégeant les ions superoxydes
et les radicaux hydroxyles (Thornalley et Vasak, 1985; McAleer et Tuan, 2001b, a).
Les cellules possèdent également d’autres systèmes de défense contre les espèces
réactives de l’oxygène tels que des molécules antioxydantes hydrosolubles (glutathion,
vitamine C, acide urique) et liposolubles (Vitamine E, caroténoïdes, bilirubine), intervenant
tout particulièrement au niveau des membranes cellulaires et des lipoprotéines plasmatiques.
Ainsi, les antioxydants ont été définis comme des substances capables de concurrencer
d’autres substrats oxydables à des concentrations relativement basses et donc de retarder ou
d’empêcher l’oxydation de ces substrats (Afonso et al., 2007). Lorsque la production des ERO
est maîtrisée par les systèmes de défense, la balance anti-oxydants/pro-oxydants est dite en
équilibre. Lorsque ces espèces sont produites en trop grande quantité et/ou que les défenses
anti-oxydantes sont insuffisantes, une rupture de l’équilibre oxydatif survient et un stress
cellulaire se produit appelé “stress oxydant” (Jensen, 2003) dont les conséquences pour la
cellule peuvent prendre la forme de dommages irréversibles (Figure 17).
Figure 17: Schéma de la balance anti-oxydants/pro-oxydants représentant un stress

oxydant (Barillet, 2007).
52
Le Cd est incapable de générer directement des radicaux libres (Watjen et
Beyersmann, 2004; Jomova et Valko, 2011). Ce métal ne peut pas catalyser de réactions
redox dans les systèmes biologiques. Les métaux « redox-active »quant à eux, (ex : fer,
cuivre) peuvent directement augmenter la production des radicaux hydroxyles (.OH) grâce à
la réaction Fenton(Ercal et al., 2001; Cuypers et al., 2010):
M(n)+ O2.- → M(n-1) + O2
2 O2.- + 2H+ → H2O2 + O2
M(n-1) + H2O2 → M(n)+ .OH + OH-
(avec M un métal « redox-active » et n le nombre d’électrons).
Le Cd peut cependant générer un stress oxydant indirectement en remplaçant dans
diverses protéines le fer et le cuivre (ex : ferritine et apoferritine), contribuant à une
augmentation de leurs concentrations intracellulaires augmentant ainsi la quantité de métaux
« redox-active» (Casalino et al., 1997; Dorta et al., 2003; Watjen et Beyersmann, 2004).
Le Cd peut aussi affecter directement le système de défense cellulaire et les molécules
possédant des groupements thiols (Ercal et al., 2001). En effets, les MT sont chargées de
piéger le Cd pour le rendre inactif (Viarengo et al., 2000). Toutefois, si la synthèse de ces
protéines n’est pas suffisante pour prendre en charge l’ensemble du Cd présent, le métal libre
va alors affecter d’autres systèmes de défenses (Klaassen et Liu, 1997). Vue la forte affinité
de ce contaminant pour les groupements thiols, le Cd peut se lier au glutathion (GSH) (Zalups
et Ahmad, 2003),connu pour ses propriétés antioxydantes, perturbant la balance oxydative de
la cellule (Ercal et al., 2001) (Figure 18). Rappelons que ce métabolite est le substrat de
plusieurs enzymes antioxydantes (GST et GPx) et qu’une diminution du taux de GSH
cellulaire peut conduire à une perturbation du fonctionnement de ces enzymes.
Les effets du Cd sur la balance oxydative sont complexes: il peut aussi bien diminuer
la concentration et/ou l’activité des antioxydants (Figure 18) ou conduire à leur augmentation
dans les cellules en fonction de l’importance du stress (Ochi et al., 1987; Yang et al., 1997;
Dagnino et al., 2007; Cuypers et al., 2010). Casalino et al. (2002) supposent que la diminution
de l’activité de la SOD chez des rats exposés au cadmium peut être liée à une interaction
SOD/ Cd qui conduirait à des changements dans la topographie de la protéine et modifierait sa
fonction catalytique. Une diminution de l’activité CAT est également possible comme le
supposent Wroñska-Nofer et al., (1999) chez la souris où une possible interaction entre le
métal et la sous-unité catalytique de cette enzyme pourrait expliquer une telle diminution.
Jurczuk et al. (2004) ont pour leur part observé une déficience en fer dans le foie de rats
exposés 12 semaines au Cd qui serait à l’origine d’une baisse de l’activité CAT car le fer est
53
un élément essentiel du centre actif de la protéine. Une étude récente chez la crevette
Litopenaeus vannamei a montré que le Cd peut se lier directement au site de fixation du
glutathion dans la GST (Salazar-Medina et al., 2010). Une peroxydation lipidique (oxydation
des lipides insaturés des membranes, cf. chapitre I, 4.5.2.1) peut aussi survenir durant une
contamination au Cd (Manca et al., 1994). Ercal et al. (2001) pensent que des perturbations
dans le système de défense (ex : le niveau de concentrations en GSH et MT) vont conduire les
ERO (ex: .OH et O2.-) à être libres dans la cellule et ainsi déclencher des peroxydations
lipidiques. Le stress oxydant généré par le Cd peut aussi être lié à des impacts au niveau des
mitochondries (Pinot et al., 2000; Ercal et al., 2001) (cf. chapitre I, 3.5.2.2) (Figure 18).
Cadmium
Mitochondria
Figure 18: Mécanismes possibles expliquant la génération de stress oxydant par le

cadmium d’après Ercal et al., 2001 et Cuypers et al., 2010.
54
3.5.2.2. Effets sur les mitochondries
La mitochondrie est le site de la respiration cellulaire, de la phosphorylation oxydative
et de la production d’ATP (principale source d’énergie pour la cellule) (McBride et al., 2006).
Elle intervient également dans le déclenchement de l’apoptose (mort cellulaire programmée).
La chaîne respiratoire des eucaryotes est localisée dans la membrane interne des
mitochondries. Elle comprend quatre étapes d’oxydation catalysées par quatre complexes
enzymatiques membranaires (I, II, III, IV) ; les vecteurs d’électrons entre les complexes sont
deux molécules mobiles dans la bicouche phospholipidique: l’ubiquinone et le cytochrome c.
Lors du fonctionnement de la chaîne, un potentiel électrochimique de protons est généré au
travers de la membrane par les complexes I, III, et IV. Le gradient de protons participe à la
phosphorylation de l’ADP en ATP (Figure 19).Le complexe I ou NADH-déshydrogénase,
oxyde le NADH en NAD+ et réduit le coenzyme Q (coQ) en coenzyme QH2 (coQH2). La
réaction s’accompagne d’un pompage de protons de la matrice vers l’espace
intermembranaire. Le complexe II ou succinate-déshydrogénase, oxyde le succinate en
fumarate et réduit le coQ en coQH2. Le complexe III ou cytochrome-c-réductase oxyde le
coQH2 en coQ et réduit le cytc(Fe3+) en cytc(Fe2+). La réaction s’accompagne d’un pompage
de protons de la matrice vers l’espace intermembranaire. Le complexe IV ou cytochrome c
oxydase, oxyde le cytc(Fe2+) en cytc(Fe3+) et réduit l’O2 enH2O. La réaction s’accompagne
d’un pompage de protons de la matrice vers l’espace intermembranaire. Le complexe V ou
l’ATP-synthase, est une enzyme couplée énergétiquement avec la chaîne respiratoire
mitochondriale. Elle est constituée du complexe extramembranaire F1 associé au complexe
membranaire F0. Ce dernier est un canal ionique à l’intérieur duquelpassent les protons grâce
à l’énergie fournie par le gradient de potentiel électrochimique des protons ΔμH+. La
synthèse d’ATP est alors réalisée au niveau du complexe F1 avec un courant de protons de
l’espace intermembranaire vers la matrice. Lorsque le gradient de protons est favorable,
l’enzyme couple la synthèse de l’ATP (à partir de l’ADP et du Pi) au flux spontané de protons
qui s’effectue à travers Fo vers la face de la membrane où se situe F1 (Figure 19)
(Raisonnier, 2004). Il faut mentionner que dans certains cas pathologiques, l’ATP synthase
peut fonctionner dans le sens inverse de l’état physiologique normal, hydrolysant ainsi l’ATP
au lieu d’en produire (Nevière, 2008). A l’état physiologique normal et en absence de toute
contamination, les mitochondries sont les sources majeures de la production des ERO dans les
cellules (Cuypers et al., 2010). En effet, les ERO sont naturellement produits au niveau du
complexe I et du complexe III à l’état normal (Gao et al., 2008).
55
Figure 19 : Schéma de la chaîne respiratoire mitochondriale. (T) ATP translocase,
facilite le transport d’une molécule d’ATP de la matrice vers l’espace
intermembranaire, en échange d’une molécule d’ADP dans l’autre sens. (P) La Porine,
protéine transporteuse, permet à l’ATP de franchir la membrane externe de la
mitochondrie pour sortir dans le cytoplasme (d'après Raisonnier, 2004).
Le Cd peut inhiber plusieurs enzymes participant aux processus de la chaîne

respiratoire mitochondriale (Ivanina et al., 2008;Garceau et al., 2010). Il peut se lier aux
groupements thiols des molécules mitochondriales critiques et inactiver ainsi les enzymes.
Wang et al. (2004) ont montré que les complexes II et III sont plus sensibles à l’inhibition du
Cd que les autres. De plus, l’inactivation des groupements thiols peut générer un stress
oxydant, une dépolarisation (diminution du potentiel membranaire) et une perméabilité
membranaire conduisant à un dysfonctionnement de la mitochondrie. L’altération du potentiel
membranaire et le découplage de la phosphorylation oxydative par le Cd conduisent à une
diminution de la synthèse de l’ATP. Ceci peut être suivi par l’ouverture des pores de
transition de perméabilité mitochondriale (Pinot et al., 2000). Ces pores sont des canaux
(complexes protéique) au niveau de la membrane mitochondriale dont l’ouverture libère dans
le cytosol plusieurs facteurs pro-apoptotiques à l’origine de la mort cellulaire (Berson, 2005).
56
Les espèces réactives de l’oxygène et le cytochrome c sont alors rejetés de la mitochondrie
vers le cytosol où ils activent les caspases qui à leur tour vont conduire à l’apoptose (Figure
20). De plus, les ERO relâchées vont dégrader des protéines cellulaires. Dans le cas d’une
diminution sévère de l’ATP, une nécrose cellulaire survient, alors que dans le cas d’une
diminution modérée, la cellule va tenter de stabiliser tant que possible la dégradation des
protéines (ex: grâce à la protéine Hsp70 qui va se complexer aux protéines affectées et les
conduire en dehors de la cellule). Suite à cet effet, des mécanismes cellulaires vont être
perturbés et d’autres vont se mettre en place pour essayer d’atténuer la toxicité du Cd (ex:
surexpression de certains gènes de détoxication ou de compensation) (Pinot et al., 2000). Des
études in vitro de fibroblastes- fœtal de poumons humains ont montré que les ERO générés
par le Cd conduisent à une dépolarisation membranaire de la mitochondrie, à une altération
dans le transfert d’électrons de la chaîne respiratoire et à une diminution de l’ATP suite à une
inhibition de l’ATP synthase et à l’oxydation de l’ADN mitochondrial (Freeman et Crapo,
1982; Doelman et al., 1990; Yang et al., 1997). Le Cd est aussi capable de déplacer le zinc des
MT (Dallinger et al., 1997), or une augmentation en ion libre de zinc dans les mitochondries
peut conduire à un blocage de la respiration mitochondriale, qui en conséquence va conduire à
une ouverture du pore de transition de la perméabilité membranaire, puis un rejet du
cytochrome c, la génération de ERO (Bossy-Wetzel et al., 2004) et à l'apoptose.
57
Figure 20: Effets du cadmium sur les mitochondries. (Hsp70) Heat shock protein de 70
Kilodaltons: protéine de stress fonctionne comme un chaperon pour les autres protéines.
(HSF) facteur d’induction de la transcription du gène codant pour la Hsp70 (Pinot et al.,
2000).
3.5.2.3. Effets sur l’ADN et l’expression génique

L’acide désoxyribonucléique (ADN) est présent dans toutes les cellules eucaryotes et
constitue le patrimoine génétique d’une espèce. Il contient toutes les informations permettant
la pérennité d’une espèce par la transmission des caractères héréditaires. L’ADN est formé de
deux brins complémentaires enroulés en hélice (double hélice). Il est constitué par un
enchaînement (séquence) précis d'unités élémentaires que sont les nucléotides. Le nucléotide
est lui-même formé d’un phosphate lié à un sucre (le 2-désoxyribose) lui-même relié à une
base (purique (Adénine, et Guanine) ou pyrimidique (Thymine et Cytosine)) (Figure 21).
58
Figure 21 : Lésions de l’ADN formées par attaque radicalaire du patrimoine génétique
des cellules (d’après Favier, 2003).
Comme nous avons pu le voir précédemment, le Cd peut générer un stress oxydant,

or l’ADN est très sensible à l’attaque par les dérivés réactifs de l’oxygène. En effet, les
espèces réactives de l’oxygène peuvent causer des dommages oxydatifs à l’ADN, à la fois
nucléaire et mitochondrial. La formation de dommages oxydatifs à l’ADN n’est possible que
59
pour les ERO qui possèdent l’énergie suffisante à l’induction des atteintes (ex: 1O2 (oxygène
singulet), H2O2 et .OH). Ces réactions peuvent conduire à la formation de cassures simples
ou doubles brins (Yu et Anderson, 1997; Jacobi et al., 1998). L’attaque de la liaison entre la
base et le désoxyribose est aussi possible créant ainsi un site abasique (Ramana et al., 1998).
Les bases et particulièrement la guanine, sont sensibles à l’oxydation. L’attaque radicalaire
peut être directe et entraîner l’oxydation des bases, engendrant un grand nombre de bases
modifiées (Cadet et al., 1999).L’attaque radicalaire des protéines qui sont en contact avec
l’ADN (ex : protéines d’histones, enzymes et facteurs de réplication ou de la transcription),
entraîne des pontages des protéines (ADN- protéine) (Dizdaroglu, 1998; Favier, 2003). De
plus, les aldéhydes mutagènes qui résultent de la peroxydation lipidique, peuvent se fixer sur
une des bases de l’ADN, formant ainsi des adduits sur les bases (ex : MDA-guanine) (Favier,
2003). L’ion Cd2+ est capable de se lier directement à l’ADN (Yang et al., 2002) et aux acides
nucléiques isolés et induire des changements conformationnels aux ligands (Beyersmann et
Hechtenberg, 1997). Des cassures des brins de l’ADN et les aberrations chromosomiques
peuvent se produire mais seulement quand les concentrations d’exposition sont très élevées
(Beyersmann et Hechtenberg, 1997).
Ce métal provoque également des changements dans l’expression de plusieurs gènes
conduisant soit à leur répression soit à leur induction. Dans une étude récente, Pierron et al.
(2011) ont corrélé les réponses transcriptionnelles de plusieurs gènes à la concentration de Cd
accumulée dans le foie de Perca flavescenssuite à une exposition chronique in situ. Les
corrélations établies étaient le plus souvent négatives. En effet, une diminution dans les
niveaux de transcription de nombreux gènes impliqués dans la biosynthèse de protéine, dans
le système immunitaire, dans le métabolisme énergétique et lipidique a été observée. Les
auteurs suggèrent que cette diminution marquée provient d'un dysfonctionnement du
métabolisme des acides biliaires et de la restriction d'énergie par le Cd. De plus, ils émettent
l'hypothèse que des modifications épigénétiques des histones et de l'ADN peuvent mener à la
mise sous silence d'un gène (gene silencing)/ répression d'un gène. Les analyses de puces à
ADN (appelées aussi puces à gènes, biopuces,DNA chip, DNA-microarray et biochip) en
écotoxicologie sont de plus en plus utilisées pour évaluer les impacts de polluants sur
l’expression d’un grand nombre de gènes (Reynders et al., 2006). Cette biotechnologie
récente permet d'analyser le niveau d'expression des gènes transcrits dans une cellule, un
tissu, un organe, ou encore un organisme, à un moment donné et dans un état donné par
rapport à un échantillon de référence. Une analyse utilisant cette technique a été effectuée sur
le foie de la carpe pour déterminer les mécanismes biologiques affectés par le Cd. Pour cela,
60
les poissons ont été contaminés par voie trophique (9.5- 144 µg/g) et directe (9-480 µg/L)
simultanément pendant 28 jours à différentes concentrations. Les résultats ont montré que
parmi 643 gènes testés, 95 gènes dont le rôle est connu étaient affectés par la présence du Cd.
Ces derniers sont impliqués dans divers mécanismes cellulaires, tels le métabolisme
énergétique, le métabolisme lipidique, les réponses immunitaires, le stress (ex: Hsp, les
marqueurs de stress oxydant et les enzymes de métabolisation des xénobiotiques), la
détoxication… L’expression des gènes codant pour les MT, analysée par la technique de RT-
PCR a montré une surexpression de ces gènes, alors que le gène codant pour la cytochrome c
oxydase était inhibé indiquant la mise en place d’un métabolisme anaérobie (Reynders et al.,
2006). Les résultats d’une analyse de puce à ADN et de RT-PCR chez le poisson Platichthys
flesus montrent aussi qu’en présence du Cd, l’expression des gènes codant pour les protéines
marqueurs de stress oxydant et des gènes codants pour les MT est affectée. De plus, les
mécanismes impliqués dans la synthèse protéique, le transport et la dégradation sont modifiés.
Les gènes de la cytokine, du cytosquelette, de la détoxication (cytochrome P450) et les gènes
impliqués dans l’apoptose et le cycle cellulaire sont impactés (Williams et al., 2006). Chez le
micro-crustacé Daphnia magna après exposition au Cd, les résultats d’une puce à gène ont
montré que 29% des gènes dont l’expression était altérée participent au métabolisme et à la
production d’énergie, 31% sont impliqués dans la transcription et la traduction, et 40% sont
associés aux processus de croissance, de transport d’ions, de la mue et aux réponses de stress
(comme le stress oxydant) (Connon et al., 2008). L’analyse d’une biopuce effectuée sur les
ARNm totaux de Saccharomyces cerevisiae après exposition au Cd a montré que 310 gènes
ont été surexprimés en présence de ce métal et 322 gènes ont été réprimés. Parmi les gènes les
plus surexprimés, 13% participent aux mécanismes de sauvetage, de défense, de
vieillissement et de la mort cellulaire, 9% codent pour des transporteurs, 9% participent dans
les mécanismes énergétiques, 8% dans le métabolisme et 7% sont impliqués dans
l’homéostasie ionique. Les gènes les plus réprimés mis en évidence dans cette étude
participent à la synthèse protéique (surtout les protéines ribosomales) (Momose et Iwahashi,
2001). Plusieurs études sur différents organismes (levures, crustacés, poissons, rats)
confirment que les gènes codant pour les MT et les protéines de stress (ex : Hsp) sont
hautement surexprimés dans les cellules exposées au Cd (Bartosiewicz et al., 2001; Momose
et Iwahashi, 2001; Shaw et al., 2007; Connon et al., 2008; Tokumoto et al., 2011). Le grand
nombre de gènes impliqués dans divers processus biologiques, impactés par le Cd montre la
complexité de la cyto-toxicité de ce métal.
61
4. Généralités sur l’uranium
4.1. Description
L’uranium (U) correspond au quatre-vingt douzième élément du tableau périodique.
C’est un élément radioactif appartenant à la famille des actinides. A l’état pur, c’est un métal
gris et dur, très dense (sa masse volumique est de 19,05 g/cm3), avec une température de
fusion de 1 133 °C et de poids atomique égal à 238,02891 g/mole. Il a dix-sept isotopes, tous
radioactifs (WHO, 2001). L’U se désintègre pour donner un élément plus stable ; ceci
s’accompagne de l’émission de rayonnements ionisants (ASTDR, 1999). L’atome d’uranium
possède 6 électrons périphériques qui sont facilement extractibles. Il peut adopter quatre états
de valence associés aux formes ioniques suivantes: III (U3+), IV (U4+), V (UO2+) et VI
(UO22+). En solution aqueuse, l’uranium est retrouvé en conditions oxydantes sous la forme
soluble de valence VI alors que les composés sous forme U(V) et la plupart des composés
U(IV) sont insolubles.
L’uranium naturel (U nat) se présente sous la forme d’un mélange de trois isotopes :
0.0055% de 234U, 0.72% de 235U et 99.27% 238U (Aigueperse et al., 2001; WHO, 2001). Parmi
235 238
ces trois isotopes, seuls U et U sont primordiaux (c’est à dire qu’ils existent depuis
234
l’origine de la Terre, donc depuis 4,5 milliards d’années). L’isotope U est quant à lui un
238
produit de la décroissance de U (Madic et Genet, 2001) (Figure 22). Les trois isotopes
(234U, 235U et 238
U) présentent les mêmes propriétés chimiques mais possèdent des propriétés
radioactives différentes. Il est donc nécessaire de déterminer le pourcentage des trois isotopes
dans un échantillon pour y déterminer la radioactivité totale de l’U. Cette différence de
234
radioactivité s’exprime à travers la demi-vie des isotopes (244 mille ans pour U, 710
235 238 234
millions pour U et 4.5 milliards d’années pour U).En effet, l’ U très radioactif, possède
238
la plus courte demi-vie, alors que l’isotope le moins radioactif i.e. U, possède la plus
longue. Ainsi grâce à sa forte activité spécifique (2.3 108 Bq/g) (Delacroix et al., 2004), l’234U
contribue à environ 49.5% de la radioactivité de l’U naturel. L’238U (activité spécifique est de
1.24 104 Bq/g) (Aigueperse et al., 2001), quant à lui ne contribue qu’à 48.2% de l’activité
totale en dépit de sa forte abondance dans l’U naturel et les 2.3% restants sont liés à la
235
décroissance radioactive de U (activité spécifique est de 8 104 Bq/g) (Bleise et al., 2003)
(Tableau 6). Il faut cependant noter que l’activité spécifique totale de l’Unat est faible. De ce
fait, sa toxicité est principalement attribuable aux caractéristiques chimiotoxiques et non
radiotoxiques (ASTDR, 1999, Barillet et al, 2007 ; Bourrachot et al., 2008). Les activités
anthropiques contribuent à changer l’isotopie de l’U générant ainsi de l’U appauvri (UA ou
235
DU: « depleted uranium ») et de l’U enrichi. Avec une teneur en U comprise entre 0.2 et
62
0.3 %, l’UA est moins radioactif que l’Unat (Aigueperse et al., 2001) (ATSDR.1999).
L’augmentation de la radioactivité de l’U est réalisée en enrichissant la quantité de 234U et de
235 232
U ou en produisant d’autres isotopes très radioactifs tel le U (7.92 105 Bq/g) et le 233
U
(3.57 108 Bq/g) (ATSDR.1999 ; WHO, 2001, Delacroix et al., 2004).
Figure 22 : Chaîne de désintégration de l’234U, 235U et de l’238U. (U) uranium; (Th)

thorium; (Pa) protactinium; (Ac) actinium; (Tl) thallium; (Fr) francium; (Ra) radium;
(At) astatine; (Bi) bismuth; (Rn) radon; (Po) polonium; (Pb) plomb (Craft et al., 2004).
Tableau 6 : Composition isotopique en masse et en activité de l’uranium naturel et de

l’uranium appauvri à 0.2% en 235U (d’après Aigueperse et al., 2001).
Masse (%) Activité (%) Activité (Bq/g)

238 235 234 238 235 234 238 235 234
Uranium U U U U U U U U U
Uranium naturel 99.274 0.72 0.0055 48.2 2.3 49.5 12400 580 12474
Uranium appauvri 99.797 0.202 0.0008 86.1 1.1 12.8 12400 158 1843
63
4.2. Origine et distribution
L’U est un élément naturel présent dans les roches, le sol, et l’eau. Il est largement
représenté dans la croute terrestre où sa teneur moyenne s’élève de 2 µg/g à 4 µg/g (Ribera et
al., 1996; Bonin et Blanc, 2001; WHO, 2001). La concentration moyenne en U dans les sols
est d’environ 1.8 µg/g. Sa répartition dans le sol va dépendre de la lixiviation (transport par
l’eau), la diffusion, le transport biologique (plantes, microorganismes, insectes…) et la
dispersion par le vent et la pluie (Ribera et al., 1996). Les sources hydrothermales
représentent une des principales sources d’U (Ribera et al., 1996). Dans les eaux douces, les
concentrations sont très variables allant de 0.01 µg/L à plus de 1.5 mg/L (WHO, 2001 ;
Kurttio et al., 2006) et sont le reflet des abondances naturelles en U dans les roches et les sols
environnants. Plusieurs études ont rapporté des concentrations en U élevées dans l’eau de
consommation humaine au niveau de puits (forage en profondeur) (Tableau 7). Les eaux
souterraines se chargent en minéraux et notamment en U au contact des dépôts géologiques.
Les concentrations mesurées peuvent être nettement supérieures à la valeur recommandée par
l’organisation mondiale de la santé dans l’eau de consommation humaine, qui est de 15 µg/L
(WHO, 2004). Dans les océans les concentrations retrouvées sont de l’ordre de 3.3 µg/L
(Ragnarsdottir et Charlet, 2000).
Tableau 7: Concentrations mesurées dans l’eau de consommation humaine issue de

puits
concentration (µg
localisation U/L) références
Canada 2-781 Limson Zamora et al. (1998)
Canada 0.7-19.6 Mao et al., (1996)
Etats-Unis 1.8-7780 Orloff et al., (2004)
Finlande 0.03-1500 Kurttio et al., (2006)
Norvège 0-750 Frengstad et al., (2000)
Les activités anthropiques contribuent à l’augmentation des concentrations en U dans

les différents compartiments de l’environnement et peuvent provoquer localement des
pollutions importantes (Saari et al., 2008). L’U d’origine anthropique peut provenir des
activités médicales (Saari et al., 2008) et de recherche. L’intérêt que suscite l’utilisation de
l’U dans diverses activités industrielles est surtout lié à sa résistance et sa densité.
L’utilisation civile de l’U se fait surtout dans les centrales nucléaires électriques (ATSDR,
1999). De l’UA est généré par l’industrie nucléaire, cet élément peut provenir soit des usines
235
d’enrichissement en U de l’uranium naturel pour la fabrication du combustible des
64
réacteurs nucléaires, soit du retraitement de combustibles irradiés (Aigueperse et al., 2001).
Dans le domaine militaire, l’UA est utilisé pour le blindage de certains chars et la fabrication
d’obus perforants (Aigueperse et al., 2001). Lors des tirs d’armes à l’UA, ce dernier se
disperse sous forme de fines particules d’oxydes d’uranium peu solubles qui se déposent
rapidement sur le sol (Bem et Bou-Rabee, 2004). Certains pays utilisent l’U comme source de
pouvoir et pour la fabrication d’armes nucléaires (ATSDR, 1999). Dans le domaine industriel,
l’UA entre dans la fabrication d’ailes et de gouvernails d’avion, d’hélicoptères, de quilles de
voilier, et de protections contre les effets biologiques des rayonnements ionisants comme les
collimateurs d’appareils d’irradiation médicale. Une très faible quantité est aussi utilisée pour
la fabrication de vernis à céramique, des ampoules électriques, des fertilisants et de certains
produits chimiques ménagers et photographiques (ATSDR, 1999) L’utilisation d’engrais
contenant des impuretés d’U participe à l’augmentation de ses concentrations dans
l’environnement. Ces concentrations dépendent du type de roche utilisée pour la production
de ces fertilisants ; les engrais produits à partir de roches riches en phosphates peuvent
contenir des concentrations d’U pouvant atteindre 129 µg/g (Kratz et Schnug, 2006).
Une partie de l’U est arrachée à la terre par l’activité minière et les phénomènes
naturels (ex : le vent et la pluie) qui peuvent aussi effriter les roches. Ainsi, la pluie va
pouvoir transporter l’U vers les systèmes aquatiques, tandis que le vent va transporter des
aérosols chargés d’U. A leur tour les petites particules d’U dans l’air peuvent tomber sur les
surfaces de sols ou d’eau (ATSDR, 1999). En conséquent, la proximité des milieux
aquatiques d’une zone impactée par l’activité humaine (p. ex. exploitation d’une mine, sites
de stockage de déchets nucléaires) peut résulter en une élévation localement importante des
teneurs en uranium, pouvant aller jusqu’à 10 voire 20 mg/L (Ragnarsdottir et Charlet, 2000).
Il faut mentionner que la capacité des sédiments à fixer l’U est considérable, ils ont un rôle de
stockage de l’élément dans l’environnement. Cette fixation dépend de la granulométrie ; les
plus grandes quantités d’U sont retrouvées dans les fractions granulométriques les plus fines
(< 50 µm). Ainsi, une partie de l’U présent dans la colonne d’eau peut précipiter et/ou se fixer
aux sédiments.
Dans le contexte de l’évaluation des apports anthropiques d’U dans l’environnement
par les activités d’extraction minière, la production mondiale d’U et la localisation des
ressources mondiales (Figure 23) permettent d’avoir un aperçu des risques potentiels de
contamination. D’après la banque de données « World Nuclear association », en 2010 la
contribution la plus importante pour l’approvisionnement mondial en U revient au Kazakhstan
(33%), suivi du Canada (18%) et de l’Australie (11%). Au 1e janvier 2009, les ressources
65
identifiées (< 260 US$/Kg) dans le monde (Figure 23) s'élevaient à 6 298 500 tonnes d'U
(NEA-IAEA, 2010). La France quant à elle n’a produit que 7 tonnes en 2010 (Figure 24).
Figure 23: (A) Production mondiale d’uranium à partir de sites miniers en 2010
présentée en tonnes par pays. (B) Inventaire des résidus miniers d’uranium recensés
dans le monde en 2009 exprimés en million de tonnes ou en tonnes suivant les pays
(d’après NEA-IAEA 2010).
La Figure 24 indique la distribution des sites miniers au niveau national. Près de 210
sites miniers d’U sont répartis en France principalement sur le pourtour du Massif-Central, la
Vendée, la Bretagne et l’Alsace. Suite à 50 ans d’exploitation de l’U (de 1945 à 2001), 52
millions tonnes de résidus de traitement de minerais extraits des mines françaises ont été
traités pour produire au total 76 000 tonnes d’uranium (IRSN, 2009).
66
Figure 24: Carte des mines d'uranium et sites de stockage en France (2009) (source
IRSN) superposée à la carte de distribution (zone en rose)de P. clarkii (Collas et al.,
2007).
4.3. Spéciation chimique

Pour qu’un métal exerce un effet sur la composante biotique, il doit être sous une
forme chimique ayant la capacité d’atteindre les cibles biologiques. Seules certaines formes
(ou espèces) du métal peuvent être assimilables pour les organismes aquatiques. L’ion uranyle
(UO22+) et l’espèce hydroxylée UO2OH+ seraient les espèces responsables à 96% d’un impact
au niveau de la réponse biologique, et l’ion uranyle serait deux fois plus toxique (Markich et
al., 1996). En effet, ces deux espèces sont connues pour être les formes les plus biodisponibles
pour les espèces aquatiques (Markich, 2002; Fortin et al., 2004; Fortin et al., 2007). Toutefois,
une étude plus récente suggère une co-accumulation de l’ion libre et des espèces carbonatées
ou bien avec une des espèces UO2OH+ ou UO2(OH)2 ce qui nuance l’hypothèse précédente
(Denison, 2004). Les études de transfert des métaux nécessitent dans un premier temps, le
développement d’outils permettant d’évaluer la spéciation de l’U dans l’eau (en la mesurant et
non pas juste par modélisation). Dans un second temps, il faudra établir un lien entre cette
spéciation, la fraction d’U bioaccumulée et les effets biologiques engendrés pour mettre en
évidence les espèces biodisponibles.
67
La spéciation de l’uranium en eau douce est complexe et est influencée par la
composition ionique de l’eau (ions inorganiques), le pH, la température, le potentiel
d’oxydoréduction, la présence de ligands organiques, l’alcalinité (concentration des
carbonates), la dureté (concentrations de calcium ou de magnésium) et la matière organique
dissoute du milieu. En effet, les substances humiques représentant jusqu’à 75 % du carbone
organique dissous dans les hydrosystèmes fluviaux favorisent la formation de complexes
organiques stables de l’ion uranyle (Colle et al., 2001). Concernant les échanges avec les
particules, la rétention de l’uranium est d’autant plus faible que les conditions sont oxydantes
et alcalines (Bird et Evenden, 1996). Ainsi dans les eaux fortement carbonatées, on note une
diminution de l’adsorption de l’uranium sur les particules du fait d’une augmentation de la
solubilité de l’élément (complexes uranyles carbonatés dominants). La présence de
phosphates, diminue la biodisponibilité de l’U (Fortin et al., 2004). Elle peut entraîner la
précipitation des ions uranyles et leur transfert vers le compartiment sédimentaire. En effet, la
complexation des métaux avec des ligands (tels les phosphates, les carbonates, les hydroxydes
et les matières organiques) diminue leur disponibilité aux organismes (Fortin et al., 2004). La
toxicité chimique de l’ion uranyle diminue avec l’augmentation de la dureté, de l’alcalinité
(Sheppard et al., 2005) et de la concentration en matières organiques dissoutes de l’eau
(Markish et al., 1996). L’explication de cette diminution de la toxicité repose sur une
compétition de l’ion uranyle avec les espèces cationiques présentes dans l’eau. De plus, le pH
influence significativement la spéciation de l’U et donc sa biodisponibilité. En effet, lorsque
le pH est faible, la concentration en ion uranyle est forte, alors que dans le cas contraire les
formes carbonatées deviennent dominantes (Fortin et al., 2007). Zeman et al. (2008),
confirment que la CL 50-48h du micro-crustacé Daphnia magna varie de 0.39 ± 0.04 mg/L à
pH 7 à 7.8 ± 3.2 mg/L à pH8. Une autre étude a montré que la toxicité de l’U chez cette même
espèce diminue quand la dureté et l’alcalinité de l’eau augmentent (CL 50-48h plus forte)
(Poston et al., 1984). Chez les poissons, les CL 50 à 96 h s’étendent de 0,7 à 135 mgU/L en
fonction des facteurs biotiques (espèce, stade de maturité) et abiotiques (température, dureté,
pH) (Garnier-Laplace et al., 2001). Ainsi, le risque de toxicité que présente l’U pour un
organisme vivant dépend de sa biodisponibilité.
Dans une eau douce synthétique adaptée aux besoins des écrevisses et équilibrée avec
la pression atmosphérique de CO2 (pCO2 atm), la modélisation de la spéciation de 30µg U/L
(logiciel J-CHESS), dans la gamme 5< pH < 6 présente majoritairement les espèces suivantes
(Figure 25): UO22+, UO2OH+, UO2CO30. Dans la gamme 6< pH < 6.5 les espèces
majoritaires sont: (UO2)2CO3(OH)3-, UO2CO30, UO2OH+ et UO2OH20, Tandis que dans la
68
gamme 6.5 < pH <7 les espèces majoritaires sont: Ca2UO2(CO3)3 (aq), (UO2)2CO3(OH)3-,
UO2CO30 et CaUO2(CO3)32-. Au-delà de cette dernière gamme et jusqu’au pH 8, les espèces
dominantes sont le Ca2UO2(CO3)30 et le CaUO2(CO3)32-.
Spéciation théorique de 30 µgU/L
100%
90%
UO2[2+]
80% (UO2)2CO3(OH)3[-]
70% Ca2UO2(CO3)3[0]
Espèces (%)
60% CaUO2(CO3)3[2-]
50% UO2(CO3)2[2-]
40% UO2(OH)2[0]
30% UO2CO3[0]
20% UO2OH[+]
10% UO2SO4[0]
0%
5 5,5 6 6,5 7 7,5 8
pH
Figure 25 : Spéciation chimique de 30 µg/Ld’uranium dans une eau douce synthétique

adaptée aux besoins des écrevisses (simulation avec le programme de spéciation
géochimique J-CHESS).
4.4. Mécanismes de contamination

La capacité des formes chimiques de l’U à accéder et interagir avec les interfaces entre
les êtres vivants et le milieu environnant, à s’y complexer (adsorption) et éventuellement à
traverser ces barrières biologiques (absorption), conditionnent les phénomènes de
bioaccumulation et par conséquent, les atteintes structurales et fonctionnelles pouvant en
découler. Le transfert de l’U aux organismes aquatiques se fait à partir de différents
compartiments : la colonne d’eau (Barillet et al., 2007), les sédiments (cas des fouisseurs)
(Lagauzère et al., 2009), la chaîne trophique (Simon et Garnier-Laplace, 2005) (plantes,
consommateurs primaires et secondaires) et par voie maternelle (la reproduction) (Bourrachot
et al., 2008). L’importance de la contamination dépend de plusieurs facteurs comme les
capacités de l’animal à éliminer le métal, la persistance du contaminant dans le milieu (surtout
les milieux fermés ex : les lacs…) et d’éventuelles désorptions des radionucléides fixés aux
sédiments (Coulon, 1990). Dans le cas d’une contamination directe, c’est par les branchies
que l’U entre dans le corps, mais cet organe peut aussi servir de barrière de protection en
emprisonnant le métal dans le mucus qui les protège (Barillet et al., 2007). La partie de l’U
69
qui arrive à traverser cette barrière biologique est ensuite transportée par le sang (Tran et al.,
2008), et gagne les organes cibles pour le xénobiotique. Suite à une exposition du poisson
zèbre Danio rerio, l’U s’accumule préférentiellement dans deux organes, les branchies et le
foie (Barillet et al., 2007). L’importance de la contamination par voie trophique dépend de
l’absorption et de la rétention du métal par la voie gastro-intestinale. L’absorption de l’U au
niveau de l’intestin dépend de la solubilité du composé, de la valence de l’U et de la taille de
la particule (Durbin et Wrenn, 1975). Citons aussi à titre d’exemple, qu’une exposition de
l’écrevisse Orconectes limosus à l’U par voie trophique a montré que l’hépatopancréas et
l’estomac sont les deux organes cibles de l’U mais l’U était aussi présent en faible proportion
dans les branchies, les muscles et la carapace (Simon et Garnier-Laplace, 2005).
4.5. Effets biologiques de l‘U

4.5.1. Au niveau de l’organisme et des tissus
L’U comme la plupart des métaux cause des changements physiologiques,
comportementaux, structuraux et affecte la reproduction(Domingo, 2001). Chez différentes
espèces de poissons, les symptômes décrivant l’intoxication à l’uranium par voie directe à
forte dose (5.8 mg/L) pendant 96h progressent depuis une augmentation de la ventilation
respiratoire, vers une nage désordonnée, une perte d’équilibre, un changement de couleur
(plus sombre), des hémorragies au niveau des nageoires puis la mort (Bywater et al., 1991).
Tran et al. (2008) ont mis en évidence l’impact de U sur la physiologie du bivalve Corbicula
fluminea qui diminue son débit cardiaque afin de limiter le transport de l’U du sang vers les
organes.U affecte également son comportement valvaire puisqu’une fermeture des valves a
été observée chez 50% des individus suite à une contamination de 0.05 µmol/L (~12 µg/L)
d’U à pH 5.5 après 5h d’exposition (Fournier et al., 2004).
Des effets tératogènes et reprotoxiques de l’U ont été observés chez les poissons
zèbres. Bourrachot et al. (2008) ont montré que l’U (250 µg/L) s’accumule dans l’embryon
après avoir traversé le chorion et induit un effet significatif sur le succès d’éclosion des œufs
du poisson zèbre Danio rerio avec un retard d’éclosion de 42% par rapport au contrôle. Une
diminution temporaire de croissance et une mortalité post-larvaire élevée ont été aussi
observées. Une étude récente a montré que l’exposition de la même espèce de poisson par
voie trophique entraîne une réduction du succès reproducteur, du nombre des œufs (~50%
après exposition à 50 et 500 µg/g) pondus et de leur viabilité après 10 jours de la
fertilisation(Simon et al., 2011b).
70
L’exposition à des effluents d’une extraction minière d’U a conduit à une diminution de la
taille des larves de Rana perezi seoane accompagnée d’une diminution de la réponse face à un
stimulus, d’une augmentation de la pigmentation et des malformations des queues (Domingo,
2001; Marques et al., 2008).
Des atteintes structurales de divers organes ont été observées chez les poissons suite à
une contamination à l’U (Cooley et al., 2000; Barillet et al., 2010; Lerebours et al., 2010a;
Lerebours et al., 2010b). Une exposition du poisson zèbre à des concentrations
environnementales de l’U (15, 30 et 100 µgU/L) a conduit à des atteintes ultrastructurales du
bulbe olfactif (Lerebours et al., 2010a; Lerebours et al., 2010b) et des muscles (Lerebours et
al., 2010a). Des altérations des myofibrilles et des dilatations de l’endomysium (espace inter-
myofibrille) des muscles ont été observées. De plus, l’écartement de l’endomysium a laissé
apparaître des morceaux de structures qui pouvaient correspondre à des débris de
mitochondries, des tubules T ou du reticulum sarcoplasmique (Lerebours et al., 2010a).
Barillet et al. (2010) ont montré des atteintes structurales au niveau des branchies, des
muscles et des gonades de Danio rerio exposé à 100 µg/L de UA ou 93.35 µg/L de UA
233
mélangé à 6.65 µg/L de U (plus radiotoxique). Ces atteintes peuvent avoir des
conséquences graves sur l’organisme puisqu’une diminution des performances reproductives
du poisson, une diminution des échanges gazeux et un impact sur les capacités de nage
peuvent en découler. De plus, l’intensité des impacts au niveau de ces organes semble
dépendre de la radiotoxicité du contaminant. Un des résultats intéressants de cette étude a
révélé que la radiotoxicité de l’U peut conduire à une distribution anormale des mitochondries
dans les muscles. Cooley et al. (2000) ont montré que les atteintes histopathologiques au
niveau des reins et du foie du poisson Coregonus clupeaformis étaient dose (100, 1000 et
10000 µg U/g de nourriture) et temps dépendants (10, 30 et 100 jours). Les lésions les plus
prononcées dans le foie étaient la nécrose cellulaire et des altérations de l’épithélium des
tubules. Au niveau des reins, les symptômes apparents étaient une nécrose des tubules rénaux,
une inflammation, une hémorragie, une diminution des tissus hématopoïétiques, des
altérations des tubules distaux et des canaux collecteurs, une dilatation des tubules, une
prolifération de macrophages pigmentés et des lésions glomérulaires.
4.5.2. Effets sub-cellulaires

La toxicité chimique de l’U est due à son affinité pour les protéines et à la formation
de complexes stables avec des ligands biologiques de faible poids moléculaire. De ce fait, les
ions uranyles affectent sérieusement la réabsorption du glucose et les acides aminés (Bem et
71
Bou-Rabee, 2004). Des études sur la toxicité de l’U appauvri chez les animaux mettent en
évidence ses propriétés carcinogènes et mutagènes (McClain et al., 2001). L’U induit la
génération de ERO (Tasat et al., 2007), perturbe les systèmes de défense antioxydants, génère
une peroxydation lipidique, perturbe les activités métaboliques et celles des enzymes
membranaires (Banday et al., 2008).
4.5.2.1. Stress oxydant

L’U est capable de générer un stress oxydant en induisant la formation de radicaux
hydroxyles en présence du peroxyde d’hydrogène (Taqui Khan et Martell, 1969). Le schéma
réactionnel de ce phénomène a récemment été décrit, basé sur un mécanisme
d’oxydoréduction de type Fenton. Comme certains métaux de transition (ex : Fe2+ et Cu2+),
l’U serait susceptible d’induire une réduction du peroxyde d’hydrogène intracellulaire,
induisant ainsi la formation d’un ion hydroxyde (OH-) mais également d’un radical hydroxyle
(Miller et al., 2002). Yazzie et al. (2003) suggèrent que la première des deux réactions initiées
serait la suivante :
½ U(IV) + H2O2 → ½ U(VI) + HO . + HO-
La seconde étape de réduction du métal assurerait le passage de la forme U(VI) en U(IV)
(insoluble) sous l’action d’agents réducteurs tels que l’ascorbate ou le glutathion (Miller et
al., 2002; Yazzie et al., 2003; Pourahmad et al., 2006; Viehweger et al., 2011). Le schéma
réactionnel dans le cas de la réduction par l’ascorbate serait défini comme suit:
U(VI) + ascorbate (vitamine D) → U(IV) + déshydroascorbate
U(IV) + O2 + 2H+ → U(VI) + H2O2
Ascorbate + O2 + 2H+ → déshydroascorbate + H2O2
Pourahmad et al., (2006) suggèrent que le U(VI) peut être réduit en U(IV) par le glutathion, la
NADPH-P450 réductase et le Cytochrome P450 réduit et générer des ERO (notamment l’ion
superoxyde). Viehweger et al., (2011) ont montré que le GSH réduit U(VI) en U(V) et produit
du glutathion oxydé. Ensuite le U(V) va subir simultanément des oxydations et des réductions
générant ainsi du U(IV) et du U(VI). Notons que le glutathion est aussi un substrat de la
glutathion peroxydase et de la glutathion S transférase, donc une baisse de la concentration en
GSH va diminuer l’activité de ces deux enzymes antioxydantes, ce qui va affaiblir le système
de défense cellulaire contre le stress oxydant et par conséquent générer un stress. D’après
Taqui Khan et Martell (1969) et Miller et al (2002), l’U dans la cellule subit un cycle
d’oxydoréduction, successivement présent sous les formes U(VI) et U(IV), libérant des
espèces réactives de l’oxygène telles que le peroxyde d’hydrogène ou le radical hydroxyle. De
72
plus, l’U est un radionucléide capable d’arracher un électron à la matière (possède un
rayonnement ionisant). Le rayonnement ionisant peut interagir avec la molécule d’eau. Ce
phénomène est appelé radiolyse de l’eau et conduit à la formation d’espèces radicalaires et
ioniques (ex: .OH et H.) (Jones et al., 2003). La production d’espèces réactives de l’oxygène
pourrait être à l’origine d’un stress oxydant cellulaire dont les protéines, les phospholipides
membranaires et les acides nucléiques sont les cibles principales (Ribera et al., 1996). Les
protéines qui comportent un groupement sulfhydrile (SH) sont les plus sensibles aux attaques
radicalaires. L’oxydation altère leurs structures et leurs fonctions (Favier, 2003). Ainsi, les
ERO peuvent oxyder les enzymes impliquées dans la défense contre le stress oxydant et les
inactiver (Davies, 2005). De plus, les membranes étant constituées d’une double couche
phospholipidique, les radicaux générés (surtout les .OH) sont susceptibles de réagir avec les
chaînes d’acides gras insaturés des phospholipides au niveau des doubles liaisons et causer
une peroxydation lipidique (Figure 26) (Gutteridge, 1995).
Figure 26 : Peroxydation d'une portion d’une chaîne d’acide gras insaturée

(représentation topologique). La flèche rouge indique l'endroit de la chaîne qui subira
l'enlèvement d'un atome H°. Le point illustre l'électron célibataire (Source:
http://www2.ulg.ac.be/cord/initiation%20au%20met%20oxygene/peroxlip.html).
La peroxydation lipidique affecte les structures et les fonctions membranaires

(membranes cellulaire et des organites). En effets, les hydroperoxydes instables formés sont
responsables de la diminution de la fluidité membranaire (Rémita, 2001). Or, toute altération
de la membrane peut conduire à la modification des flux calciques, lesquels sont impliqués
par exemple, dans les mécanismes apoptotiques (Stark, 2005). Au niveau de la mitochondrie,
ce phénomène peut conduire à une perte de l’activité du cytochrome oxydase. Les
hydroperoxydes instables en se décomposant vont donner de nouveaux radicaux libres
73
provoquant des oxydations des biomolécules (Cillard et Cillard, 2006). Les produits formés
par la dégradation des hydroperoxydes comme le malondialdehyde (MDA) peuvent s’avérer
toxiques pour le matériel génétique cellulaire via la formation d’adduits sur les groupements
NH2 des biomolécules (acides nucléiques, protéines, lipides) (Breton et al., 2003).
4.5.2.2. Effets sur les mitochondries

Des études ont montré que l’uranium est capable d’impacter les mitochondries
(Gough, 1931; Carafoli et al., 1971; Brady et al., 1989; Pourahmad et al., 2006; Lerebours et
al., 2009; Barillet et al., 2010; Lerebours et al., 2010a; Lerebours et al., 2010b). Cependant,
les mécanismes d’induction de la toxicité sont loin d’être complètement connus. Des
observations histologiques de néphrites de lapins contaminés à l’U (injection, 10µg/g pf) ont
permis de mettre en évidence des altérations structurales de ces organites (Gough,
1931).L’auteur a observé que les mitochondries étaient en forme de petites granules ou étaient
remplacées par des corps sphériques dispersés dans le cytoplasme. Une étude a aussi montré
que l’U affecte le métabolisme calcique dans les mitochondries des rats (injection, 10mg/g pf)
(Carafoli et al., 1971). Les mitochondries impactées ont accumulé environ 10 fois plus de
calcium que le niveau basal. Ceci semble être lié à un impact au niveau des transporteurs
calciques mitochondriaux. Il faut mentionner qu’une augmentation de la concentration en
calcium peut conduire à l’ouverture du pore de transition de perméabilité membranaire des
mitochondries et ainsi conduire à l’apoptose (Budd et al., 2000). Brady et al., (1989) ont
étudié l’action de l’uranium in vitro sur l’activité mitochondriale de tubules proximaux de
lapins. Les auteurs ont remarqué une inhibition de la consommation en oxygène et une
déficience du couplage énergétique à partir d’une exposition à 1 mM (238 mg/L) d’uranium.
Lerebours et al. (2010a) ont mis en évidence une perturbation du couplage énergétique de la
chaîne respiratoire dans les muscles et le cerveau des poissons zèbres Danio rerio exposés à
30 µg U/L après 10 et 28 jours. De plus, les auteurs ont remarqué une modification du
contenu protéique du complexe IV de la chaîne respiratoire mitochondriale à travers
l’induction des deux sous-unités I et IV de la cytochrome c oxydase. Les modifications de la
synthèse protéique diffèrent selon l’organe considéré, la concentration et le temps
d’exposition. Après 10 jours d’exposition à 30 et 100 µgU/L, une augmentation de la synthèse
de COX IV est observée dans le cerveau des poissons. Dans les muscles, une tendance à
l’augmentation de la synthèse de COX I est observée chez les organismes exposés à la faible
concentration et une augmentation significative apparaît chez les organismes exposés à la
concentration la plus élevée après 28 jours d’exposition (Lerebours et al., 2010a). De plus, des
74
études effectuées sur le poisson Danio rerio ont montré que même de faibles concentrations
(15, 30, 100 µgU/L) d’exposition peuvent altérer l’expression de gènes codant pour des
complexes enzymatiques (IV et V) de la chaîne respiratoire mitochondriale (Lerebours et al.,
2009; Lerebours et al., 2010b). De fortes concentrations d’exposition de l’U peuvent conduire
à une diminution du potentiel membranaire des mitochondries. En effet, l’incubation à 50µM
(~ 12 mg/L) d’U(VI) de cellules d’hépatocytes de rats, a conduit à une diminution du
potentiel membranaire de 46%, 55% et 70% après 5, 15 et 60 min respectivement (Pourahmad
et al., 2006). En résumé, ces études révèlent qu’en présence de l’U, les mitochondries de
diverses espèces (rats, lapins, poissons) fonctionnent anormalement quelles que soient les
doses et les voies de contamination (in vitro/ in vivo) administrées.
4.5.2.3. Effets sur l’ADN et l’expression génique

Comme déjà mentionné, l’ADN est particulièrement sensible à l’attaque par les ERO
(cf. chapitre I, 3.5.2.3). Ainsi, la chimio- et la radiotoxicité de l’U, capables de générer un
stress oxydant et d’émettre des rayonnements ionisants (cf. chapitre I, 4.5.2.1) vont augmenter
les risques des attaques à l’ADN. Il existe une très grande variété des degrés d’altération de
l’ADN. Il est en effet classique d’observer des lésions primaires à l’ADN (l’ADN est ainsi
chimiquement modifié: ex: cassures de brins, adduits, alkylations de bases, pontages…) (cf.
chapitre I, 3.5.2.3). La survie de la cellule est assurée dans la majorité des cas par l’action de
mécanismes de réparation de l’ADN qui éliminent les lésions avant qu’elles ne soient
engagées dans des processus vitaux comme la réplication ou la transcription (Hartwell et
Weinert, 1989; Moustacchi, 1999). Ces mécanismes assurent le maintien de la molécule
d’ADN et en conséquence la stabilité de l’information génétique. Lorsque la réparation est
absente ou incomplète (réparation fautive), et selon la nature des lésions, les modifications de
l’ADN peuvent être à l’origine d’événements génétiques anormaux tels que des mutations
géniques (mutations concernant une à quelques paires de bases), chromosomiques (mutations
concernant des dizaines de kilobases) (effets clastogènes) et génomiques (modifications
chromosomiques) (effets aneugènes) (Orsière et al., 2005). A leur tour, ces dommages
pourront avoir des conséquences graves sur la santé de l’organisme, pourront être à l’origine
de cancers ou peuvent encore induire la mort cellulaire (Bootsma et Hoeijmakers, 1991)
(Figure 27). Certains auteurs suggèrent que l’U pourrait agir directement par fixation sur les
groupements phosphate de l’ADN et catalyser une réaction d’hydrolyse de la liaison sucre-
phosphate dont la manifestation directe serait l’apparition de cassures mono ou bicaténaires
(Lin et al., 1993; Stearns et al., 2005). De plus, le rayonnement ionisant peut avoir un effet
75
direct sur le matériel génétique qui consiste en un arrachement d’électron avec formation d’un
radical cation, conduisant notamment à la formation de cassures mono- et bicaténaires mais
également à la formation de bases modifiées identiques à celles induites par le stress oxydant
(Cadet et al., 2002; CEA/DSV, 2002) (Figure 28). Des études effectuées au sein de notre
laboratoire ont déjà montré une augmentation significative des dommages à l’ADN des
cellules d’embryons de poissons zèbres exposées in vitro à 20 et 100 μg/L d’uranium, et des
cellules germinales mâles et femelles après 20 jours d’exposition in vivo à 250 μg/L
(Bourrachot, 2009). Un effet génotoxique a été également observé au niveau des érythrocytes
de D. rerio exposés à 500 μg U/L après 20 jours d’exposition (Barillet et al., 2007) et chez les
bivalves Corbicula fluminea après 90 jours d’exposition à 10 µg U/L (Simon et al., 2011a).
Figure 27: Effets biologiques des rayonnements ionisants. Evolutions possibles au niveau
cellulaire en fonction du temps (Vuillez, 2011).
76
Figure 28 : Les cinq grands types de dégradation de l’ADN, présentés sur les quatre
bases pouvant être touchées, les pyrimidines (cytosine C et thymine T) et les purines
(adénine A et guanine G). Le pontage ADN-protéine, en particulier, est illustré par un
exemple. Dans un premier temps, un électron est arraché à la base guanine, dans un
second temps le groupement amine NH2 de l’acide aminé (ici une lysine) se lie à la
guanine ionisée (CEA/DSV, 2002).
L’U semble aussi altérer l’expression transcriptionnelle. L’exposition de poissons zèbres

pendant 28 jours à 30 et 100 µg/L a induit une modification précoce (dès 3 jours) de
l’expression génique dans le cerveau (synthèse du glutamate (gls1) ou le transport vésiculaire
de l’acétylcholine (vchat)) et dans les muscles (métabolisme mitochondrial (coxI, atp5f1)).
Une réponse tardive (28 jours d’exposition à 30 μgU/L) est observée dans le foie avec
l’induction de gènes impliqués dans le métabolisme mitochondrial (coxI, atp5f1), la réparation
des dommages à l’ADN et la balance oxydative. Une réponse tardive est également observée
dans les branchies après 21 jours d’exposition à 100 μgU/L avec l’induction de gènes
impliqués dans la détoxication, la balance oxydative, le métabolisme mitochondrial et la
réparation des dommages à l’ADN. Après 8 jours de dépuration, des réponses
transcriptionnelles sont particulièrement importantes dans le foie des poissons avec
l’induction de gènes impliqués dans l’apoptose, l’inflammation ou la détoxication (Lerebours
et al., 2009). Pour évaluer l’impact de l’U sur l’expression d’un plus grand nombre de gènes,
Lerebours et ses collaborateurs (Lerebours et al., 2010b) ont effectué une analyse d’une puce
77
à ADN où ils ont testé l’expression de 3479 séquences oligonucléotidiques représentant des
gènes de fonctions connues ou prédites chez le poisson zèbre Danio rerioaprès exposition à
15 et 100 µg/L de UA pendant 3 et 10 jours. L’expression de 67 gènes était modifiée après
exposition à l’U. Ces gènes ont été regroupés dans 8 catégories en fonction de leurs
implications dans différents processus biologiques qui sont la transduction du signal, la
régulation de l’expression des gènes, le processus de transcription, la synthèse protéique,
l’organisation du cytosquelette, la croissance, les récepteurs de surface cellulaires et le
métabolisme cellulaire (métabolisme général, détoxication, turnover protéique, métabolisme
énergétique et lipidique, transport des ions et adhésion cellulaire). De même, Taulan et
al.(2004) ont montré que le nitrate d’uranyle induit des altérations dans l’expression de plus
de 200 gènes chez la souris (contamination via l’eau de boisson 80 et 160 mgU/L- 4 mois)
dont les plus importantes sont impliquées dans la réponse au stress oxydant, le métabolisme
cellulaire, la transduction de signaux, dans les protéines ribosomales et les transporteurs de
solutés.
78
Chapitre I-C
Choix stratégiques et démarche

expérimentale
79
Cette partie vise à présenter les principaux choix ayant guidé l’élaboration du
programme de recherche mis en place dans cette thèse.
1. Choix du modèle biologique

Procambarus clarkii est l’écrevisse la plus cosmopolite du monde. Elle est capable de
tolérer des environnements extrêmes et pollués. Elle a été utilisée comme indicateur de
pollution métallique dans de nombreuses études environnementales (Gherardi, 2006; cf.
chapitre I-A). Ainsi, l‘acquisition de biomarqueurs de toxicité du Cd et de l’U sur P.clarkii a
de fortes de chances d’être utilisable sur le terrain dans des études de
biomonitoring/surveillance ou d’évaluation des risques écologiques.
Ces organismes peuvent accumuler les métaux et possèdent plusieurs caractéristiques
appréciées en écotoxicologie (Finerty et al., 1990; Sánchez López et al., 2004; Higueras et al.,
2006; Hothem et al., 2007; Richert et Sneddon, 2008; Faria et al., 2010; Moss et al., 2010;
Suárez-Serrano et al., 2010). En effet, cette espèce est considérée comme une espèce
sentinelle car elle a une mobilité réduite dans l’environnement et peut donc refléter une
pollution locale. Les individus sont facilement capturés en milieu naturel. Au stade adulte, ils
fournissent assez de matériel biologique pour effectuer plusieurs analyses biochimiques sur un
même spécimen. L’étude mutli-critères d’effet gagne ainsi en cohérence en limitant la
variabilité inter-individuelle. De plus, cette espèce se conserve facilement en laboratoire et sa
maintenance est peu coûteuse. Sa position dans la chaîne trophique fait en sorte que cet
organisme peut être un vecteur potentiel de contamination pour les niveaux trophiques
supérieurs (Gherardi, 2006).
En se basant sur les travaux de Dörr et al. (2008) et de Elia et al. (2007), il semblerait
que les réponses enzymatiques de la plupart des antioxydants chez P. clarkii diffèrent entre
les mâles et les femelles après une exposition au sélénium. Afin d’éviter tout facteur de
confusion relatif à ces questions, il a été décidé de n’utiliser que des individus mâles dans la
suite de notre travail.
2. Objectifs détaillés et justification de la démarche expérimentale

Le but in fine de notre programme de recherche est d’évaluer la toxicité de l’U par
rapport à celle d’un contaminant bien documenté dans la bibliographie, le cadmium. La
première partie de ce travail a consisté à comparer les mécanismes impliqués dans le stress
oxydant, les atteintes mitochondriales et histologiques après une contamination aigüe (fortes
doses, temps courts) et chronique (faible dose, temps longs) au Cd. Ensuite, nous avons
80
essayé d’identifier des biomarqueurs sensibles au Cd quelque soient la durée d’exposition et
la concentration utilisée (Chapitre III). L’originalité de cette première approche consiste
surtout à l’utilisation des réponses d’expression génique représentatives de différents
mécanismes (fonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale, stress oxydant et
détoxication) comme outils pour mettre en évidence les impacts de ce métal sur l’écrevisse P.
clarkii.
Dans un deuxième temps, des expériences de contamination à l’uranium ont été
menées. En effet, les études d’impact de U sur les crustacés font cruellement défaut dans la
littérature. Il a donc été nécessaire de tester différentes concentrations (de 30 à 8000 µg/L de
UA) pendant de courtes durées d’exposition (4 et 10 jours). L’objectif principal de cette étude
était d’évaluer les atteintes de l’U à différentes échelles de l’organisation biologique (gènes,
histologie et survie) et d’essayer de déterminer des biomarqueurs précoces. Nous avons
également tenté de lier les réponses biologiques entre elles et à la bioaccumulation de l’U
dans les organes correspondants (Chapitre IV-A).
Dans un troisième temps, nous avons soumis les écrevisses à une exposition chronique
d’uranium appauvri (30 et 60 jours) à 30 µg/L de UA, ce niveau de contamination étant
représentatif de concentrations rencontrées en milieu naturel. L’objectif était de vérifier
l’évolution des réponses géniques, enzymatiques et histologiques au cours du temps (Chapitre
IV-B) ainsi qu’une éventuelle histopathologie.
Dans une quatrième partie, nous avons essayé de discriminer les effets entre la radio-
et la chimiotoxicité de l’U. Pour cela, nous avons exposé des écrevisses à une faible
concentration soit 30 µg/L de UA ou de 233U (activité spécifique plus élevée) pendant 4 et 10
jours. Le choix de cette concentration et de cette durée d’exposition a été pris en relation avec
l’expérience précédente. Elle permet de vérifier la répétabilité des réponses géniques étudiées
après exposition à l’uranium appauvri. Durant cette étude, nous n’avons pas effectué
d’analyses histologiques car les résultats de l’expérimentation précédente indiquaient que les
atteintes structurales n’étaient pas significatives après exposition à 30 µg/L de UA.
Cependant, les réponses d’un autre niveau de l’organisation biologique ont été testées durant
cette expérience via le suivi d’activités enzymatiques impliquées dans la défense contre le
stress oxydant (Chapitre IV-C).
La dernière partie de ce travail concerne la comparaison des impacts de l’U et du Cd
sur les paramètres biologiques étudiés précédemment après exposition aigüe (40 µM : 8 mg
U/L et 5 mg Cd/L; 4 et 10 jrs) et chronique (0.1 µM : 30 µg U/L et 10 µg Cd/L ; 30 et 60 jrs
(Chapitre V). Il faut mentionner que les expositions au Cd et à l’U ont été réalisées au même
81
moment sur des lots d’écrevisses provenant d’un même lieu afin de limiter les variations des
réponses liées à l’état physiologique des organismes. Un bilan de la démarche expérimentale
retenue est présenté dans le Tableau 8.
Tableau 8 : Bilan de la démarche expérimentale retenue. Note : les organes de P. clarkii

en italique n’ont fait l’objet que d’étude de bioaccumulation. (UA) uranium appauvri.
(Cd) cadmium.
temps Effets étudiés Tissus cibles/ Stade de

Etudes Métaux Concentration(s)
(jrs) Mortalité Histologie stress oxydant Mitochondries bioaccumultion mue
Fortes: 50, 500 et Expression Expression Branchies +
Chapitre III Cd 4 - 10   Intermue
5000 µg/L génique génique hépatopancréas
Expression
génique Expression Branchies +
Faible: 10 µg/L 30 - 60   Intermue
+ activité génique hépatopancréas
enzymatique
Fortes: 600, 4000
Chapitre IV- Expression Expression Branchies +
UA et 8000 µg/L 4 - 10   Intermue
A génique génique hépatopancréas
Faible: 30 µg/L
Expression
Chapitre IV- génique Expression Branchies +
UA Faible: 30 µg/L 30 - 60  Prémue
B + activité génique hépatopancréas
enzymatique
Branchies +
Hépatopancréas
Expression
+ Glande verte +
Chapitre IV- UA vs génique Expression
Faible: 30 µg/L 4 - 10  Estomac + Intermue
C 233U + activité génique
Intestin +
enzymatique
Muscles +
Carapace
Expression Expression Branchies +
Chapitre V UA vs Cd Fortes: 40 µM 4 - 10   Intermue
génique génique hépatopancréas
Expression
génique Expression Branchies +
Faibles: 0.1 µM 30 - 60   Intermue
+ activité génique hépatopancréas
enzymatique
3. Choix des concentrations

Dans l’expérience d’exposition aigüe des écrevisses au Cd, nous avons choisi
d’utiliser une large gamme de concentrations (50, 500 et 5000 µg/L) pendant 4 et 10 jours.
Rappelons que dans les pays en voie de développement, il est possible de trouver des zones
fortement contaminées au Cd avec des concentrations pouvant atteindre 1000 µg/L (Belabed
et al., 1994). La plus forte concentration testée en Cd(5 mg/L) équivaut à la concentration la
plus élevée en U (8 mg/L) en termes de concentration molaire (40 µM). Cette concentration
permet la comparaison des effets de l’U et du Cd à fortes doses. Il faut mentionner que la dose
de Cd qui cause 50% de mortalité des écrevisses P. clarkii pendant 96h (LC50-96h) reportée
dans la littérature varie entre les études. En effet, Del Ramo et al. (1987) ont reporté une
valeur équivalente à 58.5 mg/L pour les adultes (intervalles de confiance à 95%: 41.8- 81.9
82
mg/L), alors qu’une étude plus récente a montré que la LC50-96h de cette espèce (au stade
adulte) est égale à 2.66 mg/L (intervalles de confiance à 95%: 1.57- 4.44 mg/L) (Wigginton et
Birge, 2007). Ces contradictions semblent être liées aux conditions physico-chimiques de
l’eau utilisée durant les expériences, modifiant la biodisponibilité du Cd. Ainsi, nous avons
décidé d’effectuer une exposition aigüe en utilisant notre eau synthétique dans le but de
déterminer une LC50-96h et une LC10 qui auraient pu être utilisées dans la suite des
expériences.
La concentration de 10 µg Cd/L a été choisie pour correspondre à la même
concentration molaire (0.1 µM) de celle de l’U dans la condition d’exposition la plus faible
(30 µg U/L) pour faciliter la comparaison des effets. De plus, cette concentration en Cd peut
être retrouvée dans les milieux aquatiques pollués européens (Koliadima et Karaiskakis, 1990;
Martín-Díaz et al., 2006; Morin et al., 2007).
Dans la première expérience d’exposition de P. clarkii à l’U, nous avons testé une
large gamme de concentrations allant de 30 à 8000 µg U/L représentatives de situations
environnementales. La concentration la plus faible est proche de la valeur conseillée par
l’organisation mondiale pour la santé qui est égale à 15 µg/L (WHO, 2001) et se retrouve
dans des milieux à proximité d’anciens sites miniers en France. La concentration de 600 µg/L
est représentative des niveaux retrouvés dans l’eau de consommation humaine issue de puits
de forage proche de zones industrielles fortement impactées (ex : Canada et la Norvège)
(Limson Zamora et al., 1998; Frengstad et al., 2000). Les deux plus fortes concentrations (4 et
8 mg/L) simulent des conditions fortement impactées par les activités anthropiques et peuvent
refléter des rejets accidentels ou des zones qui sont en aval immédiat de sites miniers
(Ragnarsdottir et Charlet, 2000).
Dans les autres expériences, nous nous sommes focalisés sur la plus faible
concentration d’U (30 µg/L) car le programme de recherche mis en œuvre dans cette thèse
s’insère dans le contexte du programme ENVIRHOM, dédié à la caractérisation des effets
biologiques des substances radioactives (dont l’U) lors d’expositions chroniques à faibles
doses.
83
4. Choix de l’exposition par voie directe et de la composition ionique de l’eau
Les différentes formes chimiques de l’U déterminent sa biodisponibilité et, par
conséquent, son accumulation et les effets potentiels toxiques. Nous avons décidé de favoriser
la biodisponibilité de ces deux métaux. Les connaissances actuelles respectant le modèle de
l’ion libre considèrent que l’ion uranyle et les hydroxyles d’uranium sont les espèces les plus
biodisponibles. Ainsi, nous avons utilisé une eaus ynthétique (Tableau 4) présentant des
spécificités jugées intéressantes vis-à-vis de la spéciation de l’U comme un pH compris entre
6.5 et 7, une absence de phosphates (complexant majeur de l’U) et une faible concentration en
nitrates. La composition ionique de cette eau représente un bon compromis entre le maintien
de conditions physiologiques pour l’animal et l’optimisation de la biodisponibilité de l’U. Peu
d’informations existent dans la littérature concernant les paramètres physico-chimiques
optimaux pour le maintien de P. clarkii. D’après Roqueplo (1992), les écrevisses ont besoin
d’une concentration de calcium dissous entre 5-120 mg/L (la concentration de Ca2+ dans notre
eau est égale à 65.72 mg/L). Dans le tableau 4 figure la composition ionique des eaux dans
lesquelles les écrevisses ont été conservées (eau du lac d’Esparron et eau du réseau). Ce
tableau renseigne sur la gamme de concentrations en ions majeurs tolérée par les écrevisses. Il
présente également la composition des eaux synthétiques utilisées au sein de notre laboratoire
pour assurer la disponibilité de l’U lors des expériences de contamination sur différents
organismes (poissons, daphnies). Nous remarquons que les eaux utilisées pour les poissons
sont très peu minéralisées et potentiellement incapables de fournir les ions nécessaires aux
crustacés. Nous avons donc décidé de modifier la composition ionique de l’eau utilisée par
Zeman et al. (2008) pour les micro-crustacés Daphnia magna en changeant les concentrations
en Ca2+, NO3- et HCO3- afin de diminuer le pH et favoriser une meilleure disponibilité de l’U.
Enfin, nous avons choisi d’exposer les écrevisses par voie directe. En effet, les taux de
transfert trophique de l’U sont généralement faibles (Simon et Garnier-Laplace, 2005).
5. Choix des paramètres biologiques

Comme nous l’avons déjà mentionné, il existe très peu d’informations dans la
littérature concernant les réponses biologiques au niveau sub-cellulaire suite à une
contamination par ce radioélément chez les crustacés. En revanche, la toxicité du Cd est bien
documentée. De nombreuses études ont proposé l’utilisation des MT et des réponses des
antioxydants comme biomarqueurs de contamination au Cd. Nous avons donc décidé de
vérifier si ces biomarqueurs identifiés pour le Cd peuvent témoigner d’une toxicité de l’U
chez l’écrevisse. De plus, les travaux de Barillet et al. (2007, 2011) et de Lerebours et al.
84
(2009, 2010b), sur Danio rerio ont déjà montré que l’U peut générer un stress oxydant chez
les poissons. Vu que ces deux métaux semblent avoir un effet commun, cette piste a donc
suscité notre intérêt. De plus, la comparaison des réponses face au stress oxydant permettra de
mettre en évidence des différences potentielles dans les mécanismes d’action de ces deux
métaux.
De même, nous nous avons étudié les impacts de l’U et du Cd sur les mitochondries.
Ces organites ont un rôle primordial, puisque l'énergie fournie par les molécules organiques
est récupérée sous forme d'ATP (énergie utilisable par les cellules) dans la mitochondrie, la
source principale d'énergie pour la cellule eucaryote, par le processus de phosphorylation
oxydative. Ils interviennent aussi dans des processus critiques pour les cellules comme la
génération du stress oxydant ou la mort cellulaire programmée. D’après Chavez-Crooker et al.
(2002), les mitochondries peuvent séquestrer les métaux. Ces organites peuvent être donc des
cibles potentielles de l’U et du Cd dans le cas d’une contamination des écrevisses. Tout
dysfonctionnement mitochondrial peut entrainer des changements au niveau du
fonctionnement cellulaire, peut avoir des conséquences graves sur la santé des organismes et
dans les cas extrêmes peut conduire à leur mort (Duchen, 2004a; Duchen, 2004b). Rappelons
que Lerebours et al. (2009, 2010a, 2010b) ont montré que l’U peut impacter les mitochondries
des poissons zèbres. De même, Gonzalez et al. (2006) ont mis en évidence des altérations de
l’expression de gènes mitochondriaux chez Danio rerio exposés au Cd. Ces différentes études
ainsi que le rôle important qu’occupent les mitochondries au sein des cellules ont conforté
notre choix de suivre les impacts des métaux sur ce paramètre biologique.
L’histopathologie permet de rendre compte de réponses à un niveau d’organisation
biologique supérieur. Ces réponses sont en effet consécutives de celles observées au niveau
d’organisation inférieurs (interactions chimiques et cellulaires) et sont généralement
indicatrices de pathologies et de dommages irréversibles (nécrose, apoptose). L’un de nos
objectifs étant d’établir un lien entre les atteintes à différentes échelles de l’organisation
biologique de l’écrevisse, ce niveau d’intégration nous semblait pertinent. Les réponses
histopathologiques peuvent être aussi corrélées à des changements au niveau de l’individu tels
des changements physiologiques, des dysfonctionnements des organes et la mortalité
(paramètre biologique choisi pour évaluer l’impact des métaux).
Les tissus choisis pour les analyses d’histopathologie ont été les tissus branchiaux
(Figure 29) et hépatiques (Figure 30). Cependant, la complexité de la morphologie des
branchies (Figure 29) n’a pas permis de bien distinguer les effets des métaux sur les
structures, nous n’avons donc pas donné suite à cette étude.
85
Figure 29: Représentation schématique d’un feuillet branchial d’une écrevisse. (lam)
lamelle branchiale ; (fil) filaments ; (hl) hémolymphe ; (pc) cellules en pilastre ; (cut)
cuticule ; (bl) niveau basal ; (af) plis apicaux ; (m) mitochondries ; (aff) vaisseau
afférant ; (eff) vaisseau efférent ; (lac) lacune (espace) ; (bf) invagination basale. Note les
cellules épithéliales sont très minces (Freire et al., 2008).
86
Figure 30: Représentation schématique des différents types de cellules de
l’hépatopancréas des écrevisses. (R) cellule de type R : absorbe les nutriments, stocke et
métabolise le glycogène et les lipides. (F) cellule de type F : synthétise des enzymes
digestives et les stockent dans des vacuoles. (B) cellule de type B : c’est la transformation
des cellules de type F présentant une énorme vacuole qui résulte de l’engorgement des
enzymes digestives. Ce stade est suivi de l’excrétion des enzymes. (ac) complexe apical ;
(bi) invagination basale ; (bl) lamina basal ; (cm) fibre musculaire circulaire ; (cv)
vésicule ; (dv) corps vésiculaire dense ; (Fe) granules de fer dans des vacuoles ; (gly)
glycogène ; (gol) corps de golgi ; (hem) hémolymphe ; (ld) gouttelettes lipidiques ; (lm)
fibre musculaire longitudinale ; (lu) lumen du tubule ; (myo) réseau myoépithélial ;
(hp ?) processus de neurosecrétion possible ; (pin) vésicules de la pinocytose (absorption
de gouttelettes de liquide) ; (sec) surface d’entrée présentant des invaginations ; (vac)
vacuole (Loizzi, 1971).
87
6. Choix des marqueurs de contamination
Au cours de ces travaux de thèse, comme les concentrations utilisées en U étaient très
inférieures aux doses létales, l’utilisation des marqueurs sensibles s’est avérée judicieuse.
L’échelle moléculaire considérée comme étant la plus fine dans le cadre d’exposition à faibles
doses permet l’analyse de réponses précoces. Les modifications moléculaires sont les
premiers signes de perturbations dues à un stress. Les marqueurs de transcription ont été
choisis dans notre étude non seulement en raison de leur temps de réponse rapide et de leur
sensibilité (He et al., 2011) mais aussi parce qu’ils permettent de caractériser et de mieux
comprendre les modes d’actions toxiques et les cibles cellulaires d’un contaminant. En effet,
l’analyse des profils d’expression de gènes (étude de gènes cibles ou analyse
transcriptomique) constitue une approche puissante pour caractériser les différentes atteintes
moléculaires potentiellement impliquées dans les mécanismes de toxicité de l’U ou du Cd.
Cependant le génome de P. clarkii est loin d’être complètement séquencé. Durant ce
programme de recherche, nous avons réussi à séquencer le gène atp6 codant pour la sous
unité 6 de l’ATP synthase et le gène mt codant pour la métallothionéine (Figure 31). Les
séquences nucléotidiques obtenues et les séquences des acides aminés déduits ont été
comparées aux séquences présentes dans la base de données de NCBI (Tableau 9) pour
vérifier la spécificité des séquences. Nous avons pu ainsi valider que les séquences obtenues
après le séquençage n’appartiennent qu’aux gènes visés. Nos tentatives pour séquencer les
gènes codant pour les enzymes d’intérêt impliqués dans les réponses face au stress oxydant
(SOD cytosolique, CAT, GPX et GST) se sont avérées infructueuses. Les séquences
nucléotidiques obtenues après le clonage et le séquençage n’étaient pas suffisamment
spécifiques aux gènes visés (similarités avec d’autres gènes de la base de données). Ceci était
dû au fait que leurs séquences nucléotidiques étaient la plupart du temps partiellement
séquencées chez d’autres espèces et très rarement chez les crustacés. En conséquence,
l’alignement de séquences provenant d’espèces différentes et codant pour une même enzyme
d’intérêt n’a pas permis de déterminer une région bien conservée et spécifique du gène visé
quelque soit l’espèce considérée. Ainsi, vu le manque d’informations actuelles dans la base de
données (NCBI), nous n’avons pas pu donner suite à cette étude.
88
Figure 31: Séquences partielles de nucléotides et les séquences d’acides aminés déduits
(5’3’ cadre de lecture +1) du gène de la métallothionéine (mt) et de l’adénosine
triphosphate synthase-sous unité six (atp 6) de l’écrevisse Procambarus clarkii. Les
nombres à droites représentent le nombre de nucléotides (pb) et d’acides aminés. Le
codon initial (ATG) est marqué en gras.
Tableau 9: Comparaison de la similarité des séquences nucléotidiques (NCBI-BLASTn)

et des acides aminés (NCBI-BLASTp) des gènes mt et atp6 de P. clarkii à celles présentes
dans la banque de données de NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov).
% de similarité des séquences concernées

Gènes de
séquence concernée chez P. clarkii avec celles des espèces
P.clarkii
présentes dans la banque de donnée de NCBI
mt séquence nucléotidiques 88% avec Homarus americanus

88% avec Pasifastacus leniusculus
séquence des acides aminés 95% avec Astacus astacus
95% avec Pacifastacus leniusculus
93% avec Homarus americanus
atp6 séquence nucléotidiques 70% avec Schistocerca gregaria
séquence des acides aminés 70% avec Cherax dispar
68% avec Cherax destructor
Afin de mieux caractériser le stress oxydant, nous avons étudié les activités
enzymatiques de divers antioxydants (CAT, SOD, GPX, GST). Bien que les réponses de
l’analyse fonctionnelle des protéines d’un mécanisme d’intérêt soient considérées moins
sensibles que les réponses géniques (He et al., 2011), une fois détectées elles permettent
d’approfondir le mode d’action du toxique et d’acquérir une signification biologique plus
importante.
L’analyse des dommages au niveau de l’ultrastructure cellulaire ou tissulaire permet
de confronter les observations aux résultats moléculaires. L’histopathologie pourra aider à
mieux comprendre les effets au niveau moléculaire puisque les dysfonctionnements
89
cellulaires peuvent conduire à des atteintes aux niveauxsupérieurs de l’organisation
biologique (ex : tissus/organes, physiologie, comportement).
Les concentrations tissulaires en U ou Cd permettent d’évaluer les capacités
d’accumulation et d’établir des relations entre les niveaux d’accumulation et les effets
biologiques observés. Les mesures réalisées après différentes durées d’exposition (aigüe
versus chronique) et après différents niveau d’exposition contribuent à l’évaluation de la
distribution de l’uranium dans les tissus.
7. Choix des organes

Deux organes majeurs ont été utilisés dans ce travail de thèse, les branchies et
l’hépatopancréas.
Les branchies sont les principaux sites d’échanges gazeux et d’osmorégulation chez
les organismes aquatiques. De plus, ces organes sont en contact direct avec l’eau, donc dans le
cas d’une exposition via le milieu environnant (par voie directe) ce sont les premiers tissus à
être contaminés. D’après Borovic et al. (2008), les branchies des écrevisses possèdent un seuil
bas de réponse face au stress oxydant. Le système de défense va être stimulé pour former la
première ligne de lutte de l’organisme contre les effets dommageables comme le stress
oxydant.
L’hépatopancréas des crustacés est un organe à plusieurs fonctions. Il joue un rôle

dans la digestion et l’absorption de diverses molécules organiques. De plus, c’est un site de
stockage des métaux et de détoxication (Sterling et al., 2007). En effet, cet organe est un site
important d’accumulation du Cd chez les crustacés (Wang et al., 2001). Martin-Diaz (2006) a
montré que P. clarkii peut accumuler significativement le Cd dans cet organe après exposition
par voie directe. Simon et Garnier-Laplace (2005) et Chassard-Bouchaud (1982) ont démontré
que les écrevisses peuvent aussi accumuler l’U dans ce tissus. Vu les rôles importants que
détient cet organe, l’hépatopancréas est le siège où se déroule de multiples réactions
oxydatives et en conséquence un site où la génération des radicaux libres pourra être
considérable dans le cas d’une contamination métallique (Borkovic et al., 2008).
Ainsi, en raison des fonctions physiologiques assurées par les branchies et
l’hépatopancréas, leurs capacités d’accumulation des métaux et leurs potentielles sensibilités
de réponses face au stress oxydant, nous avons choisi d’effectuer les analyses biochimiques
sur ces deux organes. De plus, ces derniers fournissent assez de matériel biologique pour
effectuer diverses analyses biologiques ou toxicologiques (Figure 32). En parallèle, nous
90
avons mené l’étude de la bioaccumulation de ce métal dans d’autres organes (estomac,
intestin, glande verte, muscles et carapace) après exposition par la voie directe à une faible
233
concentration (30 µg/L de DU ou U) pendant une courte durée (4 et 10 jours) pour
contribuer à identifier l’organotropisme de l’U.
Branchie
s
Hépatopancréas
Figure 32: Photos illustrant la taille des branchies et de l’hépatopancréas par rapport au
corps entier de l’écrevisse P. clarkii(source: J.M.B/IRSN/LRE).
91
Chapitre II
Matériels et méthodes
92
1. Conditions expérimentales
1.1. Dispositifs expérimentaux
Les organismes utilisés durant ces travaux ont été collectés dans le marais de Vigueirat en
Camargue, au sud de la France(coordonnées GPS : 43˚31.863’N- 4˚45.417’E) (Figure 33).
Ces organismes supportent aisément une courte période de transport à sec. Une fois dans le
laboratoire, ils ont été acclimatés environ 3 semaines aux conditions de l'expérimentation :
photopériode jour/nuit de 12/12h; eau synthétique à pH 6.5 à 17 ± 1°C. Afin d’assurer
l’homogénéité de la qualité de l’eau synthétique, celle-ci était fabriquée à partir de solutions
mères de sels fortement concentrées (1000x) (Tableau 10). Le suivi des concentrations des
anions majeurs dans cette eau a été réalisé par chromatographie anionique en phase liquide
(cf. chapitre III 3.2). Lors des expériences de 10 jours, le renouvellement de l’eau synthétique
(50 % par jour) se faisait manuellement et ponctuellement (une fois par jour) alors que pour
les expériences chroniques (60 jours), des systèmes d’exposition spécifiques ont été mis en
place (Figure 34).Dans ce cas de figure, le renouvellement de l’eau se faisait en continu
(système ouvert) impliquant l’utilisation de nourrices de 300L pour servir de sources à ce
système régulé par des pompes péristaltiques. Dans ce genre de dispositif, le taux de
renouvellement quotidien était de 25 % ; compromis entre le respect du maintien de la
spéciation et la réduction des volumes d’effluents. Mise à part cette différence, toutes les
expériences se sont déroulées dans des unités expérimentales contenant environ 3 écrevisses/L
et chaque individu était isolé par un grillage (cylindre, 1 cm de maille et 11 cm de diamètre)
pour éviter le cannibalisme. L’oxygénation de l’eau était assurée par un bullage d’air
permanent. Une pompe à eau placée à l’intérieur des unités expérimentales a permis d’assurer
une circulation de l’eau et par conséquent l’homogénéisation de la contamination. Un système
de régulation automatique du pH (pH-stat) relié à un pH-mètre a permis la rectification directe
du pH par ajouts d’HCl (1 M) quand la valeur mesurée dépassait la valeur de consigne (pH
6.5). Le maintien de la température de l’eau des unités expérimentales a été assuré par
l’utilisation de cryostat (refroidissement de la colonne d’eau par rapport à l’air ambiant) dans
des bains-marie thermostatés. Un système de circulation de l’eau à l’intérieur de ces bains
assurait l’homogénéisation de l'eau et donc de la température.
93
Figure 33 : Carte du lieu de prélèvement des écrevisses (source: http://www.marais-
vigueirat.reserves-naturelles.org/pages/page1.htm).
Tableau 10 : Concentration des solutions mères de sels nécessaires pour la préparation

de l’eau synthétique.
Sels mg/L
CaCl2, 2H2O 233,60
Ca(NO3)2,4H2O 9,03
MgSO4, 7H2O 123,15
NaCl 49,09
NaHCO3 1,26
KCl 5,96
CaSO4, 2H2O 1,55
94
Figure 34 : Dispositif expérimental (source: S.AL.K/IRSN/LRE).
1.2. Modélisation de la spéciation de l’U

La modélisation de la spéciation de l’U dans nos conditions d’exposition a été effectuée
avec le logiciel J-CHESS (base de données thermodynamiques, IRSN LRE V.6) pour les
différentes conditions d’exposition (cf. chapitre II). Dans l’eau synthétique équilibrée avec la
pression atmosphérique de CO2 (pCO2 atm), la modélisation de la spéciation de 30µg U/L a
montré qu’à pH 6.5 les espèces dominantes dans l’eau étaient: 42% de (UO2)2CO3(OH)3-,
25.7% de UO2CO30, 8.8% de UO2(OH)20 (Figure 25 et Tableau 11).
95
Dans le cas où l’eau utilisée était à pH 7, les espèces majoritaires étaient: 52.1% de
Ca2UO2(CO3)30, 20.5% de CaUO2(CO3)32-, 9.4% de (UO2)2CO3(OH)3- et 8% de UO2(CO3)22-
(Tableau 11). Notons que les formes carbonatées étaient les plus prédominantes.
De même, les espèces majoritaires à pH 7 pour une concentration d’U de 600 µg/L,
4000µg/L et 8000µg/L étaient le (UO2)2CO3(OH)3- (41.9%, 73% et 79.6% respectivement), le
Ca2UO2(CO3)30 (35.7%, 15.6% et 7.1% respectivement) et le CaUO2(CO3)32- (13.9%, 6%, et
2.8% respectivement). Il faut mentionner que l’augmentation de la concentration en U dans la
colonne d’eau augmente le risque de formation de précipités. En théorie à pH 7 un précipité
apparait uniquement à la plus forte concentration testée et ceci en proportion négligeable (7%)
(Figure 35).
Tableau 11 : Pourcentage d’espèces d’U majoritairement présentes dans une eau douce
synthétique adaptée aux besoins des écrevisses à pH 6.5 et 7 (simulation de 30 µg U/L
avec le programme de spéciation géochimique J-CHESS).
pH 6.5 7
UO22+ 0.7% 0.024%
(UO2)2CO3(OH)3- 42% 9.4%
Ca2UO2(CO3)30 7.6% 52.1%
CaUO2(CO3)32- 3% 20.5%
MgUO2(CO3)32- 0.1% 0.5%
UO2(CO3)22- 6.8% 8.0%
UO2(CO3)34- 0.04% 0.3%
UO2(OH)20 8.8% 3.1%
UO2(OH)3- 0.4% 0.5%
UO2CO30 25.7% 5.1%
UO2OH+ 4.6% 0.5%
UO2SO40 0.2% 0.01%
96
Figure 35: Spéciation chimique de 600, 4000 et 8000 µg/L d’uranium dans une eau douce
synthétique adaptée aux besoins des écrevisses (simulation avec le programme de
spéciation géochimique J-CHESS). (c) forme cristallisée.
97
1.3. Gestion de l’exposition aux radionucléides en laboratoire
L’utilisation de radionucléides en laboratoire nécessite de respecter des règles de
radioprotection des travailleurs. Ainsi pour chaque type d’émetteur, une quantité maximale
utilisable sur paillasse est définie en fonction de groupes de risque auquel il appartient et de la
zone de manipulation (zone surveillée versus zone contrôlée) (cf. Annexe). C’est une des
raisons qui a limité l’utilisation de l’uranium 233 dans de grands volumes (300 L) et à fortes
doses. Les quantités maximales manipulables étaient respectivement égales à 0.226 mg et 153
mg pour l’233U et pour l’uranium appauvri. De plus, les effluents de déchets radioactifs et de
métaux stables (Cd) nécessitaient une prise en charge particulière. Ils étaient stockés en cuve à
effluents avant évacuation vers la station de traitement alors que les déchets solides très
faiblement radioactifs était répartis dans les diverses filières de traitement en fonction de leur
nature. Afin de minimiser les rejets de Cd et d’U, nous avons développé au cours de cette
thèse une technique de piégeage de ces métaux. Nous avons utilisé un mini réacteur formé
d’une colonne en PVC contenant de la calcite (265g de CaCO3; Ø1mm), à travers lequel l’eau
contaminée passet en circuit fermé de façon continue avec un débit de 15L/h(Figure 36). Ce
système permettait d’épurer l’eau grâce à la sorption des métaux sur la calcite. Ainsi, 97% de
sorption du Cd initialement présent dans 3L d’eau synthétique (10 µg Cd/L) a été observé en
moins d’une heure. De même, 80% de sorption de l’U initialement présent dans 3L d’eau
synthétique (100 µg U/L) a été noté en 24h et plus de 90% en 48h (Figure 37). Ces tests
préliminaires ont été réalisés sur des eaux qui ne contenaient pas d’écrevisses. Au cours de
nos expériences, nous avons noté une moindre efficacité du système probablement liée à la
présence de matière organique excrétée par les organismes. Il est fort probable que cette
matière organique soit entrée en compétition avec les métaux pour s’adsorber à la calcite, et
ainsi diminuer les sites de fixation pour les métaux, ou que les complexes métaux-matière
organique ne soient pas piégés par la calcite. Quoi qu’il en soit, ce système, facilement mis en
place, a permis de réduire la concentration en métaux des effluents.
98
Colonne de calcite Tuyau de
vidange
Sortie de l’eau
Entrée de l’eau
Cuve de rétention
Figure 36 : Système de filtration de l’eau contaminée au Cd ou à l’U par la calcite pour

minimiser les rejets(source: S.Al.K/IRSN/LRE).
Test du système de filtration par calcite (1 mm) pour minimiser les rejets Cd
15
Concentrations de Cd (µg/L)
13
11
conditions
9 Cd à T0: 10µg/L
circulation Calcite #1 volume 3 L
7
témoin debit 15 L/h
5
circulation calcite #2 265 g CaCO3
3
LQ 1
-1 0 5 10 15 20 25
-3
-5
Temps (h)
Test du système de filtration par calcite (1 mm) pour minimiser les rejets U
100
80
conditions
U à T0: 100µg/L
Concentration de U (µg/L)
60 volume 3 L
debit 15 L/h
265 g CaCO3
40
Circulation CaCO3
20 Témoin
LD
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
-20
Temps (h)
Figure 37 : Suivi des concentrations de Cd ou d’U dans l’eau filtrée en continu par la
calcite en fonction du temps (h). (LQ) limite de quantification. (LD) limite de détection.
99
2. Prélèvement des organismes et dissection
A chaque temps d’analyse, quatre à cinq écrevisses ont été prélevées pour chaque
condition d’exposition, pesées (poids total), mesurées du rostre jusqu’au telson par
l’intermédiaire d’un pied à coulisse (Figure 38) puis sacrifiées (broyage du ganglion sous-
œsophagien). Un maximum de 7 organes : les branchies, l’hépatopancréas, la glande verte,
l’estomac, l’intestin, les muscles et la carapace ont été prélevés au cours des différentes
expériences (Figure 39). Les analyses biochimiques et microscopiques ont été effectuées
exclusivement sur les branchies et l’hépatopancréas. Ces deux organes ont été fractionnés au
maximum en 4 parties suivant le type d’analyse auquel ils allaient être destinés. Les fractions
dédiées aux analyses d’expression de gènes ont été congelées à -80% dans du « RNA later »
(Qiagen) afin d’optimiser la conservation des ARNs. Les fractions dédiées aux analyses
enzymatiques et à la bioaccumulation ont été stockées à -80°C. Les fractions des organes
dédiées aux analyses microscopiques (~0.5 cm3)ont été immédiatement immergées dans une
solution assurant la fixation chimique de la matière vivante(cf. chapitre III, 4.1.1).
Figure 38 : Photo illustrant une mesure de la taille d’une écrevisse(source:

S.AL.K/IRSN/LRE).
Muscles
Intestin
Hépatopancréas
Branchies
Estomac
Carapace Glandes vertes
Figure 39 : Photo illustrant une écrevisse disséquée(source: J.M.B/IRSN/LRE).
100
3. Dosage des métaux et des ions
3.1. Dosage des métaux dans la matrice biologique et l’eau.
3.1.1. Préparation des échantillons
La mesure des contaminants dans les prélèvements d’eau effectués pour le suivi de la
pression de contamination durant les expériences nécessitait une acidification à 2% par du
HNO3 (15.5 M). Les échantillons biologiques quant à eux étaient séchés à l’étuve 48h à 45°C
puis pesés afin de pouvoir par la suite rapporter les quantités bioaccumulées à la masse de
poids sec (PS). Une digestion des échantillons a été effectuée dans des tubes en polypropylène
avec 3 ml de HNO3 (15.5 M) pendant 90 min à 95°C afin de décomposer la matière
organique(Figure 40). Ensuite, les échantillons étaient évaporés à sec pendant 60 min à
105°C. Ensuite, une seconde étape de minéralisation devait être réalisée, faisant intervenir du
peroxyde d’hydrogène pour assurer la digestion des derniers résidus. Deux ml de H2O2 (33%)
étaient rajoutés puis chauffés à 105°C jusqu’à évaporation (~20 min). Les matrices
biologiques ainsi digérées étaient remises en solution et acidifiées en fonction de la technique
analytique utilisée. Pour les analyses d’U en spectrométrie par plasma à couplage inductif
(ICP-MS et ICP-AES), 5 ou 10 ml d’eau ultrapure acidifiée à 2% avec du HNO3 (15.5 M)
étaient rajoutés à chaque échantillon biologique. Pour le dosage du Cd par spectrophotométrie
d'absorption atomique électrothermique (SAAE), une dilution à 0.2% avec du HNO3 (15.5 M)
233
a été effectuée. En ce qui concerne l’analyse de U par comptage en scintillation liquide, 1
ml de chaque minéralisat acidifié à 2% avec du HNO3 (15.5 M) a été rajouté dans un flacon
en verre contenant 19 ml de liquide scintillant (Instagel, Packard Instruments, Rungis,
France).
La bioaccumulation a été calculée à partir de la formule suivante :
Concentration organe(µg métal. g-1 PS)= (quantité du métal détectée dans l’échantillon (µg/L)/
masse du tissu en mg de poids sec)* facteur de dilution
Les facteurs de bioaccumulation (AF) observés ont été calculés comme le rapport :
AF Corgane/ C eau
où Corgane est la concentration en uranium bioaccumulée dans l’organe (μg métal.g-1PS) et C
eau la concentration en uranium du milieu d’exposition (μg métal.g-1).
101
Figure 40: Procédure de digestion des échantillons biologiques(source:
S.AL.K/IRSN/LRE).
3.1.2. Techniques analytiques utilisées

3.1.2.1. Dosage du cadmium par spectrophotométrie d'absorption atomique
électrothermique (SAAE)
Le dosage du cadmium dans les échantillons a été effectué par spectrophotométrie
d'absorption atomique électrothermique (4110 ZL; Perkin-Elmer ; équipée d’un correcteur de
bruit de fond à effet Zeeman) qui présente une limite de quantification de 0,1 μg.L-1 pour le
Cd (Figure 41). Le principe de ce dosage repose sur une mesure de l’échantillon ramené à
l’état d’atomes libres (atomisation). L'échantillon liquide est aspiré par un passeur
automatique et introduit dans l’appareil puis porté à une température de 2 à 3000°C pour que
les éléments présents se retrouvent sous forme ionisée. L’atomisation est réalisée sous
atmosphère inerte dans un dispositif d’atomisation électrothermique sans flamme appelé
« four graphite ». Le four est balayé par un flux d'argon (gaz inerte) qui protège les éléments
de l’oxydation. Une lampe à cathode creuse émet un rayonnement spécifique de l’élément
étudié (228 nm pour le Cd) qui traverse le tube graphite dans lequel la solution est déposée
par l’échantillonneur. Les atomes qui apparaissent au cours de l’atomisation absorbent cette
longueur d’onde. L’absorption est dépendante de la concentration d’un élément et peut être
exploitée analytiquement en relation avec un calibrage préalable (en présence de
modificateurs de matrice). Des modificateurs de matrice sont utilisés de manière à éviter toute
102
absorption non spécifique due à des composés présents dans la matrice. Ces derniers peuvent
en effet engendrer un biais très important lorsque des éléments sont dosés à faible
concentration (à l'échelle du μg.L-1).Lors des dosages du Cd, nous avons utilisé un mélange de
palladium (Pd) et de nitrate de magnésium (Mg(NO3)2)comme modificateur de matrice.
Notons que des échantillons certifiés ont été analysés afin de contrôler et valider la qualité des
dosages(TORT-2: 26.7 ± 0.6 µg Cd/g, Lobster hepatopancreas; DOLT-2: 20.8 ± 0.6 µg Cd/g,
Dogfish liver; NCR/CRNC, Ottawa, Canada). Comme une contamination par le Cd aurait pu
survenir lors de la préparation des échantillons, nous avons analysé des blancs représentatifs
des réactifs et de la procédure de préparations. Les valeurs de Cd détectéesétaient ainsi
retranchées de celles décelées dans l’échantillon.
Passeur des échantillons

Échantillons liquides
Four
Poubelle à Liquide de
effluant rinçage
Figure 41 : Phototographie d’un SAAE 4110 ZL Perkin-Elmer(source:

J.M.B/IRSN/LRE).
103
3.1.2.2. Spectrométrie d’émission atomique par plasma à couplage inductif
(ICP-AES)
La spectrométrie d’émission atomique est une méthode photométrique utilisant un
plasma (gaz) maintenu à une température de l’ordre de 8000 ° K. A cette température, les
atomes de l’échantillon sont excités et émettent des radiations électromagnétiques (photons)
caractéristiques. Selon le modèle de Bohr, les électrons constituent autour du noyau un nuage
électronique, réparti en couches et sous-couches, dont le nombre est défini pour chaque
atome. A chacune de ces sous-couches est associé un niveau d’énergie. En règle générale,
plus la sous-couche est éloignée du noyau, plus son niveau d’énergie est élevé. Lorsqu’un
atome reçoit de l’énergie suite à une collision avec une autre particule ou à l’absorption d’un
rayonnement, il va absorber cette énergie, ce processus correspondant à l’excitation. Cette
excitation se traduit par un déplacement d’électron vers les sous-couches d’énergie
supérieure. Pour retrouver un état stable, l’électron aura tendance à retrouver le niveau de
départ. Ce phénomène se traduit par l’émission de photons de longueurs d’ondes
caractéristiques de chaque élément (spectre de raies d’émission).Ainsi l’élément va pouvoir
être quantifié en fonction du nombre de photons émis, puisqu’il est proportionnel au nombre
d’atomes de l’élément considéré. Pour le dosage de l’uranium quatre raies d’émission sont
utilisées 385, 409, 417 et 424 nm. L’échantillon est introduit dans l’ICP-AES (Optima 4300
DV, Perkin Elmer, limite de détection = 10 μg U/L ± 10%)sous forme liquide(Figure 42). Il
est pris en charge par une pompe puis transformé en aérosol par un flux d’argon dans un
nébuliseur. Il est ensuite transporté dans le plasma d’argon par un injecteur où il subit
différentes étapes d’atomisation et d’ionisation, conduisant à une excitation des atomes et des
ions. Une gamme d’étalonnage a été effectuée au préalable de chaque dosage. Les solutions
étalons (10, 25, 60, 160 et 400μg U/L) ont été préparées à partir d’une solution mère
d’uranium à 1 g/L. Le contrôle qualité de ce dosage a été réalisé grâce à la mesure d’un étalon
préparé dans la matrice des échantillons après l’analyse d’une série de dix échantillons. Un
étalon interne, l’indium (50 mg/L ; acidifié à 2 % de HNO3 15.5M) a été aussi utilisé pour
permettre une vérification du bon fonctionnement de l’appareil et de l’injection des étalons et
de chaque échantillon à mesurer. Pour cela, il suffit de vérifier que l’intensité de l’indium est
identique pour les échantillons d’une même matrice.
104
Spectrophotomètre
Echantillons Chambre de
liquides nébulisation
Passeur des Pompe
échantillons péristaltique
Torche
plasma
Etalon
interne????
Figure 42 : Phototographie d’un ICP-AES Perkin Elmer Optima 4300 DV(source:

J.M.B/IRSN/LRE).
3.1.2.3. Spectrométrie de masse par plasma à couplage inductif(L’ICP-MS)

L’avantage de l’ICP-MS pour le dosage de l’U réside dans une meilleure détection
(limite de quantification: 10 ng U/L ± 7%) que l’ICP-AES ainsi que dans la possibilité de
mesures isotopiques. Cette technique instrumentale d’analyse multiélémentaire permet la
quantification des éléments d’un échantillon par analyse du signal émis (nombre de coups
/seconde) à leur rapport masse/charge (m/z). Elle est basée sur le couplage d'une torche à
plasma (argon ionisé, très haute température) qui permet une atomisation et une ionisation des
éléments et d’un spectromètre de masse quadripolaire qui discrimine les ions formés suivant
leur rapport m/z. Pour cela, l’échantillon acidifié est introduit à l'aide d'une pompe
péristaltique dans une chambre de nébulisation où il est transformé en un aérosol à l'aide
d'argon. Ceci est suivi d’une étape d’atomisation et d’ionisation des éléments, ainsi l'aérosol
formé est envoyé dans un plasma d'argon à très haute température (entre 6 000 et 10 000
°C).Un système de vide différentiel permet la transmission des ions de la lentille de
focalisation vers le quadripôle via un ensemble de lentilles ioniques. Ce quadripôle (Figure
43) est constitué de deux paires de barreaux cylindriques amenées à des potentiels électriques
opposés. Seuls les ions présentant un rapport masse sur charge particulier, sont sélectionnés
grâce à la fréquence appliquée au quadripôle et ont un parcours stable. Ils peuvent ensuite être
mesurés. Les autres entrent en collision avec un des barreaux du quadripôle. Les ions arrivant
sur le détecteur permettent la génération d’un signal proportionnel au nombre d’ions d’un
même rapport m/z (nombre de coups/sec). Par le biais d’une courbe de calibration préparée à
105
partir d’un échantillon certifié (10 mg U/L), le signal est transformé en concentration.
L’ensemble des échantillons a été préparé avec du HNO3 2% Suprapur. Notons que le
bismuth a été utilisé comme étalon interne pour corriger un éventuel effet matrice. Au cours
de l’analyse, des blancs HNO3 2% ainsi que des contrôles qualités (étalons certifiés) ont
régulièrement été analysés, respectivement tous les 5 ou 10 échantillons.
Passeur
d’échantillon Analyse des
données
Echantillons
liquides
Pompe
péristaltique
Figure 43 : Photographie d’un ICP-MS Agilent 7500 Cx et schéma de la trajectoire des

ions dans le quadripôle(source: J.M.B/IRSN/LRE).
3.1.2.4. La scintillation liquide alpha

L’uranium 233 a été dosé par scintillation liquide alpha (Quantulus 1220, Wallac-
PerkinElmer, Finland ; limite de détection 0.03 Bq/échantillon)(Figure 44). Cette technique
consiste à convertir l’énergie cinétique de la particule radioactive en émission de lumière
(photons) grâce à un liquide scintillant. Le liquide scintillant est un cocktail de différents
composés organiques : un solvant et deux solutés. Les molécules du solvant s’excitent en
absorbant l’énergie des particules α, puis transmettent cette énergie aux molécules du premier
soluté (ou scintillateur primaire) qui passent à un état excité à leur tour. Lors de leur retour à
un état stable qui s’accompagne de l’émission de photons entre 300 et 400 nm, elles excitent à
leur tour les molécules du second soluté (ou scintillateur secondaire). Enfin, ces dernières en
se désexcitant pour revenir à un état stable, émettent des photons entre 350 et 500 nm qui
106
interagissent avec les photocathodes des photomultiplicateurs. Lors de l’interaction
photon/photocathode, un électron est émis en emportant une quantité d’énergie
proportionnelle à celle du photon qui lui a donné naissance. La quantité de photons émise est
donc proportionnelle à l’activité radioactive présente dans l’échantillon et permet alors de
déterminer l’activité volumique de la solution (exprimée en Bq/mL). La vérification de
l’efficacité de détection des particules α a été faite grâce à l’analyse d’étalons préparés à partir
d’une source certifiée. Des blancs d’échantillons ont aussi été mesurés à chaque série
d’analyse.
Figure 44 : Schéma de fonctionnement du comptage en scintillation liquide et

photographie d’un compteur en scintillation liquide de type Wallac quantulus 1400
(Loffredo, 2011).
3.1.3. Calculs des débits de doses

L’accumulation d’uranium dans les organismes induit une irradiation interne et
externe des tissus. La grandeur utilisée pour quantifier cette irradiation ainsi que l’énergie
délivrée par le rayonnement s’appelle la dose absorbée et s’exprime en gray (Gy). Pour ces
travaux, les doses ont été estimées par modélisation via le logiciel EDEN 2 :2 (Elementary
Dose Evaluation for Natural Environment) conçu pour le calcul de la dose radiologique reçue
par les espèces non humaines exposées à une substance radioactive. Cette dose est estimée par
le biais de facteurs de conversion de l’activité présente qui prennent notamment en compte le
type de rayonnement émis par chaque isotope ainsi que son énergie. Les facteurs de
conversion de dose sont appelés DCCs (dose conversion coefficient), exprimés en gray par
unité (i) de temps et (ii) d’activité par unité de masse du compartiment qui le contient: soit le
107
milieu environnant s’il s’agit d’une irradiation externe, soit de l’organisme même s’il s’agit
d’une irradiation interne (Gy/ j par Bq/g poids frais). On obtient ainsi un débit de dose,
correspondant à l’accroissement de la dose par intervalle de temps et traduisant l’intensité de
l’irradiation (énergie absorbée par matière par unité de temps en Gy/h ou Gy/j).
Dans cette étude, le débit de dose total (ddt) résultant de la somme du débit de dose
interne (ddint) et du débit de dose externe (ddext) a été calculé pour l’hépatopancréas des
écrevisses avec :
ddint=(DCChépatopancréas i _Ac i)
ddd ext= (DCCeau i _Aceau i)
où i est un isotope ou descendant donné ;
DCChépatopancréas i, le coefficient de conversion calculé par EDEN pour l’élément i pour
l’organisme ;
Ac i est l’activité de l’élément i dans l’organisme (Bq/kg) calculée à partir de la concentration
mesurée (g i/kg de poids sec) multipliée par l’activité spécifique de i (Bq/g) ;
DCCeaui, le coefficient de conversion calculé par EDEN pour l’élément i pour le milieu
extérieur (eau).
Ac eau i, i est l’activité de l’élément i dans le milieu (Bq/g) calculée à partir de la concentration
mesurée (g i/kg) multipliée par l’activité spécifique de i(Bq/g).
Les hypothèses utilisées pour ces calculs étaient :
- Géométrie et composition de l’hépatopancréas
Les principes de calcul du logiciel EDEN pour les DCCs sont fonction des radionucléides
étudiés mais aussi du scénario d’exposition ainsi que de la géométrie de l’organe et de sa
composition élémentaire:
(i):Afin de calculer les DCCS pour l’hépatopancréas, la géométrie de cet organe a été
assimilée à une ellipse (longueur : 4 cm ; hauteur : 0.65 cm ; largeur : 2 cm) composée
d’hydrogène, de carbone, d’oxygène et d’azote, contribuant à 10.2, 9.5, 77, et 2.3% de la
masse totale respectivement (valeurs prises par défaut par le programme pour les matières
organiques). Mentionnons que la forme des branchies est trop complexe pour être modélisable
par le logiciel.
(ii):La distribution de l’uranium a été considérée homogène dans l’organe pour l’utilisation du
logiciel.
- Débit de dose externe (ddext) :
Quel que soit l’uranium utilisé, on considère pour le calcul du débit de dose externe l’activité
de tous les isotopes de cet uranium ainsi que celle de l’ensemble des descendants à 10 jours
108
(activité à 10 jours calculée via le logiciel Nuclides 2000) pour les solutions d’uranium
appauvri et 233.
- Débit de dose interne (ddint) :
Pour ce calcul, l’activité de l’uranium accumulé a été calculée à partir des données de
bioaccumulation mesurées par ICP-MS ou par scintillation liquide et de la connaissance de
l’isotopie des différentes solutions utilisées:
Uappauvri:99.65% 238U, 0.33% 235U, 0.0019% 234U, 0.011% 236U.
Uranium 233 :233U (100%).
La modélisation des descendants de l’uranium a été réalisée par le logiciel Nuclides 2000
(Institute for Transuranium Elements, Karlsruhe, Germany). Le débit de dose interne a été
calculé suivant 3 scénarios :
(i) Seuls les isotopes de l’U ont été accumulés dans l’hépatopancréas.
(ii) Les isotopes de l’U présents dans le milieu ont été accumulés dans l’hépatopancréas avec
leurs fils. Dans ce cas, un facteur de transfert (obtenu d’après la littérature) est appliqué pour
chaque élément afin d’évaluer l’activité des descendants de l’U (ex : 110 pour le Th et 10
pour le Pa).
(iii) identique à (ii) + les descendants des éléments accumulés après 10 jours de décroissance
correspondant à la durée d’exposition.
Pour les deux derniers scénarios, tous les radionucléides ont été considérés comme ayant pu
être internalisés dès le premier jour d’exposition tout en ayant la même cinétique (taux de
transfert et d’élimination) et les mêmes cibles biologiques.
Les DDCs calculés pour chaque isotope d’U et les descendants sont présentés dans le
chapitre IV-C.
109
3.2. Chromatographie ionique
La chromatographie ionique est une technique séparative couplée à une technique
analytique (Figure 45). Elle a été utilisée pour mesurer les anions présents dans nos milieux
d’exposition. La solution à quantifier en anions (minimum 10 mL) est entrainée dans une
colonne échangeuse d’anions (Dionex IonPack AS19) à l’aide d’un éluant d’hydroxyde de
potassium (10 mM). La colonne sépare les anions en fonction de leur affinité avec la phase
solide. En sortie de colonne, un conductimètre permet de mesurer la conductivité dont la
valeur est fonction de la concentration en anion en solution. Une gamme étalon de 0 à 2 mg/L
en différents anions (F, Br, Cl, SO4, NO3, NO2, PO4), a été préparée et préalablement
mesurée, permettant de quantifier les anions présents dans la solution à doser.
Figure 45 : Schéma de fonctionnement d'une chromatographie ionique en phase liquide

(ILC) et photographie d’une ILC Dionex ICS 3000 (Loffredo, 2011).
110
4. Analyses des paramètres biologiques
4.1. Microscopie
4.1.1. Préparation des échantillons
Une étape de fixation chimique des échantillons a été réalisée directement après le
prélèvement des organes. Cette étape consistait à baigner les tissus dans un mélange de
solutions(2.5% de glutaraldéhyde dans du tampon cacodylate 0.1 M, pH 7.4) pendant 48h à
4°C afin de bloquer les systèmes enzymatiques et de rendre les molécules insolubles dans
l’eau mais aussi dans les solvants organiques utilisés lors de l’étape de déshydratation. Après
rinçage (2x5 min) dans du tampon cacodylate (0.1M à pH 7.4), une étape de post-fixation
était effectuée. Il s’agissait d’imprégner les échantillons avec du tetroxyde d’osmium
(mélange OsO4 1% dans le tampon cacodylate) pendant 1 heure en absence de lumière pour
obtenir un meilleur contraste lors des observations au microscope électronique en
transmission (MET). Ensuite, les tissus ont été rincés (3x5 min) au tampon cacodylate puis
déshydratés par des bains successifs d’alcool éthylique de concentrations croissantes (de 50 à
100% d’éthanol) et enfin avec de l’oxyde de propylène (2x30min). Une fois déshydratés, les
échantillons ont étaient inclus dans une résine Epoxy monomérique, l’Epon 812préparée en
mélangeant 48 % d’EPON 812, 27 %d’accelerator MNA, et 23,5 % d’ hardener DDSA
magnétiquement, puis 1,5 % de DMP 30 a été rajouté à l’ensemble. Les échantillons étaient
donc placés dans un mélange de cette résine et d’oxyde de propylène (v: 1/1) une nuit à 4°C
jusqu’à évaporation de ce dernier. Enfin, la résine était remplacée et les échantillons étaient
coulés dans une gélule puis placés dans une étuve à 60°C afin que l’EPON polymérise et
forme ainsi un bloc plastique dur prêt à être coupé. Des coupes de 80 à 500 nm ont été alors
réalisées grâce à un ultramicrotome équipé d’un couteau de diamant (Leica Microsystems,
Rueil-Malmaison, France) (Figure 46).Le choix des épaisseurs des coupes dépend des
techniques d’analyses auxquels elles sont destinées. Pour les observations au microscope
optique, des coupes semi-fines de 200 à 500 nm d’épaisseur et des coupes ultrafines de 80 nm
et 140 nm ont été réalisées pour les observations au microscope électronique en transmission
(MET) et pour les analyses chimiques par la sonde EDX respectivement. Ces coupes ont été
déposées sur des grilles de cuivre de 3 mm de diamètre.
111
Résine
Echantillon
Couteau de diamant
Nacelle
Figure 46 : Illustration de l’ultramicrotome équipé d’un couteau de diamant (Leica

Microsystems, Rueil-Malmaison, France)(source: J.M.B/IRSN/LRE).
4.1.2. Microscopie optique

Avant observation, les coupes étaient colorées au bleu de toluidine puis examinées au
microscope photonique (Leica, DM750) équipé d’une caméra ICC50 et du logiciel de capture
des images LAS EZ (Figure 47).
Enregistrement oculaire
des observations Objectifs
Lame
Figure 47 : Observation de l’hépatopancréas de P. clarkii au microscope optique(source:

J.M.B/IRSN/LRE).
4.1.3. Microscopie Electronique à Transmission couplée à une sonde EDX

La microscopie électronique en transmission (MET) est une technique de microscopie
où un faisceau d'électrons est « transmis » à travers un échantillon solide très mince. Les
effets d'interaction entre les électrons et l'échantillon donnent naissance à une image, dont la
résolution est bien plus fine qu’en microscopie optique (0,2 nm vs 0,2 μm). Au contact de
l’échantillon, les électrons incidents (provenant de la source) sont soit arrêtés, soit déviés et
112
ralentis, soit transmis. Le diaphragme objectif éliminant les électrons déviés, la formation de
l’image se fait à partir des électrons arrêtés (zones sombres) et des électrons transmis (zones
claires). Le microscope utilisé (Tecnai 12 G2 Biotwin ; FEI, Eindhoven, Pays-Bas)(Figure 48)
possède un grossissement possible de 390 à 300 000 fois.
Il est aussi possible de caractériser la composition chimique de l'échantillon grâce à
une sonde EDX (Energy dispersive Xray) couplée au microscope qui capture et analyse les
rayonnements X émis suite aux interactions de la matière biologique avec les électrons
incidents (processus de désexcitation). L’énergie de ces photons X est caractéristique des
atomes dont ils sont issus. Enfin, ces photons sont présentés sous forme d’un spectre
élémentaire en fonction de leur énergie (KeV).
Porte échantillon
Sonde EDX Spectre
Enregistrement
des observations
Caméra CCD
Figure 48 : Photographie d'un microscope électronique à transmission TecnaiG2 12

BioTwin avec sa sonde microanalyse EDX(source: J.M.B/IRSN/LRE).
4.2. Dosages enzymatiques

4.2.1. Préparations des échantillons
La décongélation des échantillons stockés précédemment à -80°C a été réalisée
lentement sur glace. Environ 0.2g du tissu d’intérêt était pesé et transvasé dans un tube à
hémolyse dans lequel était ajouté un tampon Tris-HCl (100mM, pH 7.8) contenant 100 µM de
phenylméthanesulfonyl fluoride (PMSF), 0.008 TIU/ml d’aprotimine et 0.1 mg/ml de
bacitracine (inhibiteur des oligopeptides des enzymes protéolytique) afin d’empêcher les
protéinases d’agir (dilution 1 :20 pour l’hépatopancréas et 1 :10 pour les branchies). Une
113
homogénéisation a été ensuite réalisée à l’aide d’un potter sur la glace en moins d’une minute
avec des cycles de 15 secondes, puis le broyat a été centrifugé 30min à 15000 xgetà4°C. Le
surnageant a été ensuite centrifugé à 100000g (Fraction cytosolique S100) pendant 1h à 4°C,
aliquoté dans des tubes eppendorf de 1.5 ml, congelé avec de l’azote liquide (quick freeze)
puis stocké à -80°C pour les dosages ultérieurs des concentrations de protéines totales et des
activités enzymatiques.
4.2.2. Dosage des protéines

Le dosage des concentrations de protéines totales dans les fractions S 100 permet de
normaliser les résultats des dosages enzymatiques réalisés dans ces mêmes fractions. Ce
dosage a été fait à l’aide du kit « Micro BCATMProtein Assay Kit » (Thermo scientific). Ce kit
a été optimisé pour être utilisé dans une gamme de concentrations de 0.5µg/ml à 20 µg/ml. Il
s’agit d’une méthode colorimétrique qui permet la détection et la quantification des protéines
totales. Cette technique est basée sur l’utilisation de l’acide bicinchoninique (BCA) pour
détecter le Cu+ qui est formé quand le Cu2+ est réduit par les protéines dans un milieu alkalin.
Une coloration mauve apparait lorsque deux molécules de BCA chélatent un ion Cu+. Ce
complexe exhibe une absorption optique maximale à 562nm. L’absorbance du mélange des
réactifs et de l’échantillon est linéaire et proportionnelle à la concentration de protéines
présentes. Il faut cependant réaliser avec chaque série d'analyse des échantillons une gamme
d'étalonnage (de 0 à 40 µg/L) avec une protéine référence, l’albumine de sérum bovin (BSA).
Suivant la concentration protéique des échantillons, des dilutions préalables peuvent s’avérer
nécessaires afin que les valeurs d’absorbance des échantillons soient comprises dans
l’intervalle des valeurs d’absorbance de la gamme d’étalon. Ainsi, pour les fractions S100 des
échantillons hépatiques et branchiaux une dilution de 1/100 et de 1/200 était réalisée
respectivement. Nous avons aussi testé l’efficacité du signal suivant l’utilisation de l’eau
UHQ (ultra haute qualité) ou du tampon Tris-HCl (100 mM, pH 7.8) pour les
dilutions(Figure 49). Il s’est avéré que les résultats étaient meilleurs en utilisant l’eau
distillée. Le mélange des réactifs avec les échantillons dilués ou avec les protéines standards a
été déposé dans les puits d’une microplaque suivant les instructions du fournisseur. Ces
analyses ont été réalisées en triplicat, la microplaque était agitée 30 secondes puis parafilmée
et incubée 2h à 37°C. À l’issue de cette incubation, la plaque doit être refroidie jusqu’à
température ambiante puis introduite dans le lecteur du spectrophotomètre (SOFTmax® Pro)
pour mesurer les absorbances (Figure 50). Enfin, l’équation de la droite « absorbance= f
(concentrations protéiques) » a été déterminée à partir des résultats obtenus sur la gamme de
114
BSA. La concentration protéique de chacun des échantillons a alors été déduite en tenant
compte du facteur de dilution initial.
BSA + Tris-HCl (100 mM , pH 7.8)

0,9 y = 0,0197x - 0,0097
BSA+ Tris-HCl (100 mM , pH 7.8) R2 = 0,9988
0,8
BSA + eau y = 0,0178x - 0,0095
0,7 R2 = 0,9988
BSA + eau
0,6
Absorbance
0,5
0,4
0,3
y = 0,0025x - 0,0024
0,2 R2 = 0,9913
0,1 y = 0,0019x - 0,0031
R2 = 0,9754
0
0 10 20 30 40 50
Concentrations de BSA (µg/ml)
Figure 49 : Différentes gammes d’étalon pour le dosage des protéines totales. Note : deux
solutions mères de BSA ont été testées dans deux solvants : l’eau distillée et le tampon
Tris-HCl (100 mM, pH 7.8).
Lecteur
cuvette
Lecteur
microplaque
Figure 50 : Spectrophotomètre (SOFTmax® PRO)(source: J.M.B/IRSN/LRE).
4.2.3. Dosage de l’activité de la superoxyde dismutase (SOD)

Le dosage de l’activité de la SOD a été fait à l’aide du kit «19160 SOD determination
Kit» (Fluka ® Analytical). Rappelons que cette enzyme catalyse la dismutation de l’ion
superoxyde (O2.-) en peroxyde d’hydrogène (H2O2) et en une molécule d’oxygène (O2).Ce kit
permet le dosage de la SOD grâce au sel de tétrazolium WST-1 (2-(4-Iodophenyl)-3-(4-
nitrophenyl)-5-(2.4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium). En présence de l’ion
superoxyde (O2.-), ce sel produit un colorant très soluble dans l’eau, le WST-1 formazan
(Figure 51). La Xanthine oxydase (XO) est ajoutée au milieu réactionnel afin de générer les
115
anions superoxyde. Ainsi, la présence de la SOD dans le milieu réactionnel va diminuer la
concentration des anions superoxyde et en conséquent la quantité du WST1-formazan va
diminuer. De la sorte, la présence de SOD va inhiber la réaction. Le pourcentage d’inhibition
peut être quantifié par la mesure de la décroissance de la coloration à 450 nm. Il faut
cependant réaliser une gamme d'étalonnage avec des concentrations connues de SOD. Une
mise au point du dosage a dû être réalisée avant l’analyse des fractions S 100 (Figure 52). En
effet, la courbe de % d’inhibition en fonction des concentrations de SOD dans le milieu
semble être linéaire entre 10 et 70% d’inhibition. Nous avons donc dilué les échantillons avec
de l’eau distillée de façon à cibler 40 à 60% d’inhibition. Il s’est avéré qu’une dilution 1/5
était suffisante dans la fraction S100 de tous les tissus. Le mélange des produits avec les
échantillons, avec les concentrations de SOD de référence ou avec les blancs a été effectué
suivant les recommandations du fournisseur puis ajouté dans les puits d’une microplaque.
Cette dernière était ensuite parafilmée et incubée 20 min à 37°C puis placée dans le lecteur
microplaque du spectrophotomètre (SOFTmax® PRO). Suite à la lecture des absorbances
faite à 25°C, le calcul des % d’inhibition était effectué suivant les recommandations du
fournisseur. Ensuite, l’activité de la SOD dans les échantillons a été calculée grâce à la
déduction de la droite de calibration « % d’inhibition= f (concentrations SOD (Unité/ml)) »
puis multipliée par le facteur de dilution et normalisée par rapport à la concentration totale en
protéine de la fraction S100 correspondante pour que à la fin les activités soient exprimées en
U/mg de Protéines totales.
Figure 51 : Principe du dosage de la SOD.
116
120
100
% d'inhibition
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60
Concentration de SOD (U/ml)
Figure 52 : Pourcentage d’inhibition de la réaction colorimétrique par la présence de

différentes concentrations de SOD (U/ml) (n=3 par concentration).
4.2.4. Dosage de l’activité de la catalase (CAT)

La catalase a été dosée dans la fraction S100 des branchies et de l’hépatopancréas par la
méthode spéctrophotométrique utilisée par Elia et al. (2006 ; 2007). Il s’agit de mesurer la
chute de l’absorbance liée à la disparition du peroxyde d’hydrogène, le substrat de l’enzyme
(CAT + H2O2 → 2H2O + O2). En effet, l'activité d'une enzyme est évaluée par la quantité de
substrat transformé ou de produit formé par unité de temps et dans les conditions de
fonctionnement optimales de l'enzyme (température, de pH,…). Ainsi, le test a été réalisé
dans un tampon sodium-phosphate (100 mM, pH 7) avec 12 mM de H2O2. L’absorbance du
mélange réactionnel (échantillon/enzymes ou blanc + tampon + substrat) a été suivie à 240
nm pendant une minute (dans une cuve: Vtotal= 1 ml) suite à l’ajout du substrat et ceci à une
température constante de 25°C. La concentration du substrat utilisée a été suffisamment
élevée pour saturer tous les sites actifs des enzymes. En effet, différentes concentrations
connues de CAT ont été testées au préalable avec 12 mM de H2O2(Figure 53). Cette
expérience a été nécessaire pour la mise au point de la dilution à appliquer aux fractions S 100
des échantillons. Il s’est avéré qu’il fallait ajouter 20 et 40 µl de la fraction S 100 de
l’hépatopancréas et des branchies respectivement au volume total qui correspond à 1 ml
(dilution 1/50 et 1/25 respectivement) afin d’être proche de 3 U/ml. Finalement, la loi de
Beer-Lambert a été appliquée pour le calcul de l’activité de la CAT. Rappelons que cette loi
établit une proportionnalité entre la concentration d'une entité chimique en solution,
l'absorbance de celle-ci et la longueur du trajet parcouru par la lumière dans la solution :
117
Où :
 est l’absorbance ou la densité optique (sans unité) de la solution pour une

longueur d'onde λ ;
 (en mol.m-3) est la concentration de l’espèce absorbante ;
 (en m) est la longueur du trajet optique ;
 (en mol-1.m2) est le coefficient d’extinction molaire de l’espèce absorbante en
solution. Il rend compte de la capacité de cette espèce à absorber la lumière, à la
longueur d’onde λ.
Dans le cas de ce dosage, le coefficient d’extinction molaire est de 0.04 mM-1. cm-1. L’activité
de la CAT a été ainsi calculée grâce à cette formule ((∆Aéchantillon-∆ blancs)/ ε l) puis
multipliéepar le facteur de dilution et enfin normalisée par rapport à la concentration des
protéines totales dans la fraction S100 correspondante et en conséquent exprimée en µmoles de
H2O2 consommées par minute et par mg de protéines totales (µmoles/min/mg Prot).
0,7
0,3 rep1
0,6 0,3 rep2
3 rep1
0,5 3 rep2
10 rep1
Absorbance
10 rep2
0,4
30 rep1
30 rep2
0,3
60 rep1
60 rep2
0,2 100 rep1
100 rep2
0,1 blanc 1
blanc 2
0
00:00 00:14 00:28 00:43 00:57 01:12
Temps (min: sec)
Figure 53 : Absorbances de différentes concentrations de catalase allant de 0 (blancs) à

100 U/ml en fonction du temps.
118
4.2.5. Dosage de l’activité de la glutathion peroxydase (GPX)
La technique de dosage de la GPX retenue dans le cadre de ce travail est fondée sur
celle utilisée par Elia et al. (2006, 2007). L’activité de cette enzyme est déterminée via la
formation du glutathion oxydé (GSSG) à partir du glutathion réduit (GSH). Le système
nécessite la présence d’un oxydant (cumène-H2O2) et de la glutathion réductase (GR) qui
réduit le GSSG en oxydant le NADPH en NADP comme suit :
La mesure consiste donc à suivre par spectrophotométrie la disparition du NADPH à 340 nm

à 25°C dans un mélange réactionnel formé par l’ajout: du tampon sodium-phosphate (100
mM, pH 7.5) contenant de l’EDTA (1 mM), du GSH (2mM), du NADPH (0.12 mM), la GR
(1Unité/ml), du DL-dithiothreitol (1 mM) afin de stabiliser les enzymes contenant des
groupements sulphydryles, de l’hydroperoxyde de cumène (0.8 mM) et d’un volume de
l’échantillon ou du tampon pour les blancs qui complètent le volume total (1 ml). Une mise au
point du dosage de la GPX a été réalisée au préalable afin de déterminer la bonne dilution des
échantillons. Cette mise au point consistait à détecter une décroissance de l’absorbance
significativement différente de celle des blancs en testant différentes dilutions. Il s’est avéré
qu’une dilution de 1/12.5 était nécessaire pour les fractions S100 (Figure 54). Dans le cas de
ce dosage, le coefficient d’extinction molaire est de 6.22 mM-1. cm-1. L’activité de la GPX a
été ainsi calculée en appliquant la loi de Beer-Lambert ((∆Aéchantillon-∆ blancs)/ ε l) puis
multipliée par le facteur de dilution et enfin normalisée par rapport à la concentration des
protéines totales dans la fraction S100 correspondante et en conséquent exprimée en µmoles de
NADPH consommées par minute et par mg de protéines totales (nmoles/min/mg Prot).
119
0,8
0,7
blanc 1
0,6 blanc 2
Absorbance 0,5 blanc 3
0,4 Hp 1/12,5
Hp 1/20
0,3
Br 1/10
0,2
Br 1/12,5
0,1
0
00
06
12
18
24
30
36
42
48
54
00
:
:
00
00
00
00
00
00
00
00
00
00
01
Temps (min: sec)
Figure 54 : Mise au point du dosage de la GPX : suivi de l’absorbance de blancs et des

fractions S100 des hépatopancréas (Hp) et des branchies (Br) en fonction du temps.
4.2.6. Dosage de l’activité de la glutathion S transférase (GST)

L'activité enzymatique de la gluthation-S-transférase a été mesurée selon la méthode utilisée
par Elia et al. (2006, 2007). L’activité de cette enzyme est déterminée via la formation du 1-
gluthation-2,4-dinitrobenzène qui sert de chromophore à la longueur d’onde de 340 nm (à
25°C) à partir du 1-Cl-2,4-dinitrobenzène (CDNB) comme il suit :
Cl GS
NO2 NO2
l
+ GSH
C + HCl
l
NO2 NO2
1-Cl-2,4-dinitrobenzène 1-gluthation-2,4-dinitrobenzène
Le mélange de réaction contenait (Vtotal= 1ml): du tampon sodium-phosphate (100mM, pH

6.5), du CDNB (1mM), du glutathion réduit (GSH) (1mM) et un volume d’échantillon ou de
tampon pour les blancs. Une mise au point du dosage de la GST a été réalisé au préalable afin
de déterminer la bonne dilution des échantillons. Cette mise au point consistait à détecter une
augmentation de l’absorbance significativement différente de celle des blancs en testant
différentes dilutions. Il s’est avéré qu’une dilution de 1/100 était au moins nécessaire pour les
fractions S100 des hépatopancréas et des branchies (Figure 55). Dans le cas de ce dosage, le
coefficient d’extinction molaire est de 9.6 mM-1. cm-1. L’activité de la GST a été ainsi
120
calculée en appliquant la loi de Beer-Lambert ((∆Aéchantillon-∆ blancs)/ ε l) puis multipliée par le
facteur de dilution et enfin normalisée par rapport à la concentration des protéines totales dans
la fraction S100 correspondante et en conséquent exprimée en µmoles de 1-gluthation-2,4-
dinitrobenzène formées par minute et par mg de protéines totales (µmoles/min/mg Prot).
2,5
blanc
2 blanc
Absorbance
1,5 blanc
Hp 1/20
1 Hp 1/100
Br 1/100
0,5
Br 1/50
0 Br 1/33.3
0
6
:0
:0
:1
:2
:3
:4
:4
:5
00
00
00
00
00
00
00
00
Temps (min: sec )
Figure 55 : Mise au point du dosage de la GST: suivi de l’absorbance des blancs et des
fractions S100 des hépatopancréas (Hp) et des branchies (Br) en fonction du temps.
4.3. Expression des gènes

La définition d’amorces permettant d’amplifier des gènes par PCR quantitative est
nécessaire pour l’étude de leur expression. Toutefois, le génome de P. clarkii n’est pas
complètement séquencé et la séquence des gènes mt et atp6 chez cette espèce n’a pas été
identifiée auparavant. Une recherche et un séquençage des régions codantes de ces deux gènes
ont donc dû être effectués.
4.3.1. Recherche et séquençage des régions codantes d'intérêt

La recherche des séquences des régions codantes d’intérêt a été effectuée par
bioinformatique. Les séquences connues des gènes mt et atp6 appartenant à d’autres
espècesont été rapatriées à partir de la banque de données ("GenBank" via pubmed-NCBI)
puis alignées à l’aide du logiciel Custalw (Infobiogen). Sur la base de cet alignement, les
régions les plus conservées ont été retenues pour la création de séquences consensus, c'est-à-
dire celles qui ont les plus fortes probabilités d'être retrouvées identiques chezP. clarkii. Des
121
couples d'amorces ont alors été déterminées dans ces régions conservées et synthétisées
(Sigma-proligo®).
La première étape pour séquencer les gènes consistait à extraire les ARN totaux (cf.
4.3.1.1) des tissus et de les rétro-transcrire en ADNc (ADN simple brin) (cf. 4.3.1.2). Une
amplification de ces derniers par PCR classique (cf. 4.3.1.3) était ensuite réalisée, suivie
d’une étape de vérification de la taille des fragments amplifiés en effectuant une
électrophorèse en gel d'agarose (cf. 4.3.1.4) avec les produits-PCR. Cette étape permettait de
comparer la taille de ces fragments à celle attendue de la région relativement conservée du
gène d’intérêt. Les fragments présentant la taille attendue étaient alors purifiés (cf. 4.3.1.5)
puis clonés (cf. 4.3.1.6) et enfin séquencés par l’entreprise Millegen biotechnologies.
4.3.1.1. Extraction des ARN totaux

Afin d’éviter toute contamination de l’échantillon par des ribonucléases (RNAse) lors
de l’extraction des ARN, le port de gants était obligatoire et l'eau utilisée pour la préparation
des réactifs devait être auparavant traitée contre les RNAse. Ainsi, du diéthylpyrocarbonate
(DEPC) 0,1% (v/v) était ajouté à l’eau, le mélange était gardé pendant 12h à 37°C, puis
autoclavé. De même, la paillasse devait être décontaminée (RNAse away, Molecular
BioProducts) et l’ensemble du matériel utilisé (tubes, potters…) lors de l’extraction des ARN
devait être certifié « RNAse free » par le fabricant ou décontaminé puis autoclavé.
Les ARN de l’écrevisse ont été extraits à l'aide de kit « Absolutely RNA RT-PCR
miniprep kit » (Agilent) selon les recommandations du fournisseur (Figure 56). Un broyage
de 20 à 40 mg de tissu aété effectué à l’aide d’un potter en polypropylène dans 600 μL de
tampon de lyse contenant du thiocynate de guanidine auquel était ajouté 4,2 μL de β-
mercaptoéthanol pour inhiber les endonucléases dans les tissus. Cette étape a été suivie d’une
élimination des principaux débris cellulaires. Pour cela, le broyat a été déposé sur une colonne
de préfiltration et centrifugé 5 min à14 100 g à température ambiante. Une étape d’élimination
des protéines et des lipides des filtrats a ensuite été effectuée. Ainsi, duphénol : choloroforme
: alcool isoamylique (25:24:1) a été additionné au filtrat (à volume égal), puis agité à l’aide
d’un vortex de paillasse et centrifugé pendant 10 min à 14 100g. La phase aqueuse contenant
les ARN était prélevée puis additionnée à un volume égal d'éthanol 75%, le mélange était
vortexé puis déposé sur une colonne d'affinité qui ne retient que les acides nucléiques (ADN
et ARN). Cette étape était suivie d’une centrifugation des colonnes pendant 60 sec à 14 100 g
puis d’une élimination du filtrat. Une série de lavages était ensuite effectuée grâce à des
solutions fournies par le Kit. Le premier lavage se faisait par ajout de 600 μL d‘une solution
122
faiblement concentrée en sels, suivi d‘une centrifugation de 60 sec à 14 100g. Les ADN fixés
à la colonne étaient dégradés par incubation avec 55 μL de solution de DNAse I (Tampon
d‘activité + 5 unités de DNAse I) pendant 15 min à 37°C. Les colonnes subissaient ensuite
deux lavages, un premier avec 600 μL d’une solution fortement chargée en sels pour éliminer
la DNAse et les fragments d‘ADN, le second avec 300 μL de tampon faiblement chargés en
sels. Entre chaque lavage, une centrifugation de 60 sec à 14 100gétait appliquée. La colonne
était ensuite séchée par une centrifugation de 2 min puis transférée dans un tube neuf et
incubée 2 min à température ambiante avec 30 μL de tampon d’élution. Enfin, les ARNs
purifiés étaient récupérés par centrifugation (60 sec, 14 100 g) puis rétro-transcrits. Notons
que ces derniers pouvaient être stockés à – 80°Csi la rétro-transcription n’était pas effectuée
immédiatement.
Figure 56 : Extraction des ARN totaux (source: Absolutely RNA RT-PCR miniprep kit).
4.3.1.2. Rétro-transcription
L'ARN a été retro-transcrit en ADNc à l’aide du kit «Stratascript first strand synthesis
system » (Agilent). Le mélange réactionnel était constitué de 2 μL de tampon d‘activité 10X,
additionné d’1 μL de dNTP (100 mM), de 14 μL d‘ARN totaux et des amorces (1μL oligodT :
0.5 μg.μL-1 et 1 μL hexaprimers : 0.1 μg.μL-1) (Figure 57). L’ensemble était incubé 5 min à
65°C dans un thermocycleur (Mastercycler, Eppendorf)afin de linéariser les ARN puis
refroidi progressivement jusqu‘à 42°Cce qui permet aux amorces de se fixer sur les ARN.
Enfin, 0.5 μL de RNAse block (40 U.μL-1) et 1 μL de Reverse-transcriptase (RT) étaient
ajoutés puis les tubes étaient incubés 1 heure à 42°C pour permettre la rétro-transcription. Les
ADNc obtenus étaient conservés à -20°C jusqu‘aux étapes de PCR.
123
Mélange:
ARN à amplifier
5 min 65°C dNTP (A, T, C, G)
OligodT(amorces poly T)
Hexaprimer
Tampon d’activité
Linéarisation
5’ ARN à amplifier 3’
Refroidissement
jusqu’à 42°C
Fixation des amorces

Reste du mélange
1 h 42°C
Reverse-transcriptase (RT)
RNAse block
Figure 57 : Schéma simplifié de la rétro-transcription(source: S.AL.K/IRSN/CNRS).
4.3.1.3. PCR classique

Le mélange réactionnel permettant d’effectuer une PCR classiqueest constitué de 2 μL
d'ADNc, 0.5 μL de chaque amorce à 100 μM, 1 μL de dNTP à 10 mM, 3 μL de MgCl2 à 25
mM (cofacteur de la Taqpolymérase), 5 μL de tampon d‘activité 10X, 37.8 μL d'eau et 0.2 μL
de Taq polymérase à 5 u.μL-1(Promega). Cette dernière permet de synthétiser de façon fidèle
un brin complémentaire à partir d’une matrice ADN présente dans l'échantillon amplifiant
ainsi l’ADN.L’ensemble a été placé dans un thermocycleur (Mastercycler, Eppendorf) qui
réalise plusieurs cycles de PCR. Chaque cycle comportait 3 étapes successives:
A. La dénaturation de l’ADN : séparation des deux brins complémentaires par une
élévation de la température à 95°C pendant 30 secondes à 1 minute.
B. L'hybridation : fixation des amorces au niveau des régions spécifiques, encadrant
le segment à amplifier. La durée de cette étape est de 30 sec et la température est
définie au cas par cas car elle dépend du Tm (température de fusion) du couple
d’amorces utilisées (comprise généralement entre 42 et 65°C).
124
C. L’élongation : synthèse du brin complémentaire par la Taq polymérase pendant 1
minute à 72°C (Figure 58).
Ce cycle est répété entre 30 et 50 fois, et en fin de réaction une étape de 10 min à 72°C permet
à l‘enzyme de finaliser les élongations des brins d‘ADNc.
Figure 58 : Principe d’un cycle de PCR classique(source: S.AL.K/IRSN/CNRS).
4.3.1.4. Electrophorèse
La taille des amplifiats de PCR est vérifiée sur gel d'agarose 1 % (p/v). Ce dernier a
été réalisé par dissolution d’une poudre d’agarose dans du tampon TAE 1X (Tris base à 40
mM + acide acétique à 5.7 % + Na2EDTA.2H2O à 2 mM) par chauffage aux micro-ondes. 2
μL de bromure d'éthidium (10 mg.mL-1, agent intercalant de l‘ADN) ont été ensuite introduits
à ce mélange. Une fois solidifié, le gel a été plongé dans une cuve électrophorétique contenant
un bain de TAE 1X. 20 μL d'amplifiat de PCR mélangés à 5 μL de tampon de charge ont été
déposés dans un puits. Un champ électrique de 100 volts a alors été appliqué pendant 20 à 40
minutes, puis le gel a été transféré sous une lampe à UV. Sous cette lumière, le BET fluoresce
et permet de révéler les différents fragments d'ADN (Figure 59).
125
mt atp6
Répliquats : 1 2 3 4 1 2 3 4 5
Figure 59 : Gel d’agarose renfermant les ADN d’intérêt.
4.3.1.5. Purification des fragments d'intérêt

La purification des fragments d'intérêt s’est faite à partir de l’amplifiat de PCR à l‘aide
du kit « QIAquick PCR amplification extraction kit » (Qiagen), selon les recommandations du
fournisseur. Cinq volumes de tampon PB ont été ajoutés sur l’amplifiat PCR, puis l’ensemble
a été déposé sur une colonne d’affinité retenant les acides nucléiques puis centrifugé 60
secondes à 14 100 g. Le filtrat obtenu a été jeté et un lavage a été effectué. Ce dernier
consistait à ajouter 750 µL de tampon PE suivi d’1 minute de centrifugation à 14 100 g. Cette
étape était suivie d’un séchage de la colonne qui est réalisée grâce à une centrifugation (60 sec
à 14 100 g) après s’être débarrassé du filtrat. Suite à cette étape, la colonne était transférée
dans un nouveau tube de 1,5 mL et 30 μL de tampon d'élution (tampon EB) étaient déposés.
Enfin, après 2 min d‘incubation de la colonne avec le tampon EB à température ambiante, les
fragments étaient récupérés par centrifugation (60 sec à 14 100 g) (Figure 60).
Figure 60 : Purification des fragments de gènes d’intérêts (source: QIAquick PCR

amplification extraction Kit).
126
4.3.1.6. Clonage et transformation bactérienne
Le principe du clonage bactérien est d’isoler un fragment d‘ADN en l‘insérant dans un
vecteur (ex : plasmide) capable de se multiplier dans les bactéries. L‘insertion dans le vecteur
est réalisée à l’aide d’enzymes de restriction qui permettent la linéarisation du vecteur (Figure
61).
Figure 61 : Clonage et transformation bactérienne (Paul-Pont, 2010).
a. Insertion des fragments dans le vecteur

Le plasmide pGEMT, "pGEM®-T easy vector systems"(Promega®) a la capacité
d’attribuer aux bactéries transformées la résistance à l'ampicilline (antibiotique) grâce à la
présence du gène Ampr. Le pGEMT initialement linéaire, présente à chaque extrémité une
base azotée « T » libre, complémentaire à la base azotée « A » libre ajoutée à chaque
extrémité 3' du fragment amplifié par la Taq polymérase pendant la réaction de PCR. Les
liaisons phosphodiester entre le fragment à cloner, appelés insert, et le vecteur sont créés à
l’aide d’une enzyme particulière, la T4 DNA ligase issue du bactériophage T4. Le mélange
réactionnel était constitué d’1 μL de plasmide (50 ng.mL-1), 3 μL de fragment purifié, 1 μL de
ligase (3 U.μL-1) et 5 μL de tampon 2X. L’ensemble était laissé 1 h à température ambiante
puis une nuit à 4°C. Le mélange de ligation obtenu contenait à la fois des plasmides ayant
intégré le fragment d‘intérêt avec succès ainsi que des plasmides vides sans insert.
b. Transformation des bactéries
La transformation bactérienne consiste à mettre le mélange de ligation en présence de
bactéries de façon à ce que le vecteur avec éventuellement l’insert pénètre dans la bactérie
pour s’y multiplier. Les bactéries Escherichia coli thermo-compétentes « JM 109 competent
cells, high efficiency », Promega® sont capables d’incorporer des vecteurs par choc
thermique. Ces bactéries préalablement stockées à – 80°C étaient lentement décongelées sur
glace. 50 μL de bactéries étaient ajoutés à 2 μL du mélange de ligation. L’ensemble était
gardé dans la glace pendant 20 min, puis soumis à un choc thermique en l’incubant 45 s à
127
42°C. Le mélange était replacé immédiatement après dans la glace pendant 2 min, puis 950
μL de milieu de culture liquide LB (milieu LB, Luria Bertani) étaient ajoutés à l’ensemble.
Cette étape était suivie d’une incubation du mélange 1 h à 37°C. Ceci permettait aux bactéries
d‘exprimer le plasmide et ainsi acquérir la résistance à l'ampicilline. Finalement, 200 μL de
cette suspension bactérienne étaient étalés sur milieu LB solide contenant de l'ampicilline
(LB-Amp - 100 μg.mL-1). Sur ce milieu solide, seules les bactéries ayant incorporé et exprimé
le pGEMT parviennent à croître et former une colonie.
Les bactéries peuvent ne pas avoir reçu de vecteurs après transformation. Il faut donc
pouvoir distinguer les bactéries ayant incorporé les vecteurs de celles qui n’ont pas réussi.
Cette distinction, appelée sélection, a été obtenue à l‘aide de gènes particuliers apportés par le
vecteur. En effet, le site d’insertion de l’insert est situé à l’intérieur du gène de la ß-
galactosidase. L’insertion coupe donc ce gène qui ne fonctionnera plus. Il est donc possible de
distinguer les vecteurs qui ont inséré un fragment d‘ADN de ceux qui n’ont rien inséré mais
se sont re-circularisés à l’aide de la ligase, simplement en testant le fonctionnement de la ß-
galactosidase. Ceci a été réalisé en additionnant au milieu de culture des bactéries un substrat
de l‘enzyme (Xgal - 20 μg.mL-1) qui, lorsque celle-ci fonctionne, est transformé en un produit
qui colore les colonies bactériennes en bleu. Ainsi les colonies ayant incorporé un plasmide
vide étaient colorées en bleue, contrairement à celles ayant incorporé un plasmide avec insert
qui restaient blanchâtres.
Après une nuit d'incubation à 37°C, 10 colonies blanchâtres au minimum étaient
isolément repiquées dans 10 tubes remplis avec 3 mL de milieu LB-Amp liquide, puis
incubées une nuit à 37°C sous agitation. La vérification de la présence de l’insert dans le
plasmide incorporé par les bactéries sélectionnées a été fait par une étape de PCR à l'aide
d'amorces universelles présentes sur le plasmide (T7 et Sp6) puis révélation sur gel
d‘électrophorèse en fonction de la taille attendue.
Une fois les colonies contenant le plasmide avec l’insert d‘intérêt repérées, 1 mL de la
suspension bactérienne correspondante était fixé dans 100 μL de glycérol puis envoyé à une
entreprise privée chargée du séquençage du fragment d‘intérêt (MillGen).
4.3.2. PCR quantitative en temps réel

La PCR quantitative permet la détection et la quantification des produits amplifiés en
temps réel en cours de réaction (Figure 62) grâce à l’utilisation du SYBR Green I. Ce dernier
est un fluorochrome qui possède la propriété de s’intercaler entre les bases d'une séquence
nucléotidique double brin et de fluorescer dans cette condition(λ 530 nm).L’intensité de la
128
lumière émise par ce fluorochrome est directement proportionnelle au nombre de copies du
fragment amplifié. Durant cette étude, les PCR quantitatives ont été réalisées à l’aide du
LightCycler (Roche Molecular Biochemicals). Ce thermocycleur est équipé d'un
spectrophotomètre qui mesure la fluorescence émise par chaque échantillon à l'issue de
chaque étape d'élongation. Les amorces complémentaires à la région étudiée ont été définies à
l'aide du logiciel LightCycler Probe design (version 1.0, Roche) après qu’une partie de la
séquence nucléotidique du gène ait été connue. Le mélange réactionnel réalisé dans des
capillaires en verre, était formé d’1 μL de tampon 1b activé (tampon d'activité + SYBR Green
+ Taq polymérase + dNTPs), 3,2 μL de MgCl2 à 25 mM, 2 μL d'amorces (sens et anti-sens) à
3 μM, 1 μL d'ADNc et 12,8 μL d'eau ultra-pure.
Le programme thermique commençait par une étape préalable d'activation de l'enzyme
de 10 min à 95°C, suivie de la répétition de 50 cycles d'amplification (95 °C, 5 s ; 60 °C, 5 s
et 72 °C, 20 s). En fin de réaction, la spécificité de la PCR était analysée par réalisation d‘une
courbe de fusion. En effet, chaque produit d’amplification était caractérisé par une
température de fusion (Tm) qui dépend de sa composition en bases G et C et qui lui est donc
propre. La courbe de fusion était obtenue par le suivi de la fluorescence du SYBR Green I
durant le chauffage progressif allant de 60 à 95 °C. Les Tm étaient déterminées par analyse de
la perte de la fluorescence lorsque les deux brins se séparent.
En plus des gènes étudiés, un contrôle endogène était systématiquement amplifié.
Dans notre cas, le gène de référence choisi était le gène18S. Pour chaque échantillon analysé,
le nombre de copies d'ADNc du gène d'intérêt a d'abord été normalisé par rapport au nombre
de copies d'ADNc du 18S avant d'être utilisé pour comparer l'expression des gènes d'intérêt
chez les individus. Notons que nous avons aussi testé l’expression du gène codant pour
l’actine, cependant l’expression du gène 18S s’est révélé être plus stable.
Les facteurs d’induction et de répression des gènes ont été déterminés par la méthode
2-ΔCt décrite par Livak et Schmittgen (2001) où ΔCt est la différence entre le cycle de sortie
(Ct) du gène d’intérêt et le cycle de sortie du gène de référence. Notons que le Ct est obtenu à
partir de la courbe de fluorescence en fonction du nombre des cycles. C’est le point pour
lequel le signal fluorescent est significativement supérieur au bruit de fond et apparait en
début de la phase exponentielle. Enfin, pour chaque gène étudié, la valeur moyenne de
l‘expression du gène déterminée chez les individus contaminés a été comparée avec celle
observée chez les témoins pour ce même gène.
129
LightCycler
A. Dénaturation: Séparation des 2 brins par augmentation de la
température (96°C). Le SYBR Green en solution émet peu de
fluorescence.
B. Hybridation: Fixation des amorces et intercalation du SYBR Green
entre les 2 brins d’ADN. Légère émission de fluorescence.
C. Elongation: Synthèse du brin complémentaire par la taq polymérase
capillaires
avec incorporation progressive du SYBR Green augmentant ainsi la
fluorescence. Le signal de fluorescence est mesuré par le
thermocycleur à la fin de chaque phase d’élongation.
D. Cycle après cycle: Augmentation du signal de fluorescence à chaque
cycle en relation avec l’augmentation d’ADNc synthétisé.
E. Evolution de la fluorescence en fonction du nombre de cycle de
PCR
Figure 62 :Principe général de la PCR quantitative en temps réel (d'après Paul-Pont,

2010).
130
Chapitre III
Etude de l’impact du cadmium sur la

survie, l’histologie, les mitochondries et
les antioxydants chez P. clarkii.
131
Mitochondrial gene expression, antioxidant responses, and histopathology after
cadmium exposure.
Simone Al Kaddissi1;2, Alexia Legeay2, Antonia Concetta Elia3, Patrice Gonzalez2, Magali
Floriani1, Isabelle Cavalie1, Jean-Charles Massabuau2, RodolpheGilbin1 and Olivier Simon1.
1
Laboratory of Radioecology and Ecotoxicology (LRE), Institute of Radioprotection and
Nuclear Safety (IRSN), Bd 186, BP 3, 13115 Saint-Paul-Lez-Durance, France.
2
Laboratory of AquaticEcotoxicology (EA), University of Bordeaux1/UMR CNRS 5805, Dr
Peyneau square, 33120 Arcachon, France.
3
Ecotoxicology Laboratory, Department of Cellular and Environmental Biology, University of
Perugia, 06123 Perugia, Italy.
132
Abstract
The present study is the first that focuses on the elucidation of cadmium effects on the
transcription of mitochondrial genes of Procambarus clarkii after acute (0.05, 0.5, and 5 mg
Cd/L; 4-10 days) and chronic exposures (10 µg/L; 30-60 days). Transcriptional responses of
cox1, atp6 and 12S using quantitative real time RT-PCR were assessed in gills and
hepatopancreas. Additionally, the expression levels of genes involved in detoxification and/or
oxidative stress responses (mt, sod(Mn)) and enzymatic activities of antioxidants (SOD, CAT,
GPX, GST) were analysed. The histopathological effects in hepatopancreas of crayfish were
evaluated by light microscopy. Relationships between endpoints at different levels of
biological organisation and Cd bioaccumulation were discussed. Results show that molecular
responses can vary depending on the intensity and duration of the chemical stress applied to
the organisms and that the study of mt gene expression levels seemed to be the best tool to
assess Cd intoxication.
Keywords: Cadmium, gene expression levels, histology, metallothionein, mitochondria,

oxidative stress, crayfish, molecular responses, biomarker, enzymatic activities.
133
1. Introduction
Cadmium (Cd) is present naturally in rivers and lakes at concentrations inferior to 0.1
µg/L and is believed to be one of the most abundant and ubiquitously distributed toxins in the
aquatic system (Novelli et al., 2000; Pinot et al., 2000). This heavy metal is principally
obtained as a by-product in zinc refining (Pinot et al., 2000) and is also found in phosphate
fertilizers (Cupit et al., 2002). It is mainly used in industrial production of batteries, plastic,
alloys, and synthetic materials (Thornton, 1992). Cd is released to the aquatic environment
from both anthropogenic sources, such as industrial and urban effluents, agricultural runoffs,
and natural sources, such as rocks and soils (Choi et al., 2007). In France some streams suffer
from anthropogenic Cd contamination, for example the Riou Mort stream can show a mean
annual concentration of 22 μg/L of Cd (Morin et al., 2007).
Major programs of freshwater safeguard have studied the deleterious impacts of Cd at the
ecosystem, community or population levels of organization (Brooks et al., 2004; Issartel et al.,
2010; Morin et al., 2007). However, the molecular mechanism responsible for toxic effects of
Cd is far from being completely understood (Amara et al., 2009; Casalino et al., 2002). A
number of mechanisms of Cd toxicity have been suggested, including ionic and molecular
mimicry (Bridges and Zalups, 2005), interference with cell adhesion and signalling
(Thompson et al., 2005), inhibition of energy metabolism (Cannino et al., 2009; Muller, 1986;
Tang and Shaikh, 2001), oxidative stress (Gonzalez et al., 2006; Jia et al., 2010; Stohs et al.,
2001; Wang and Wang, 2009; Wang et al., 2010), apoptosis (Risso-De Faverney et al., 2004),
genotoxicity (Vandegehuchte et al., 2009) and cell-cycle disturbance (Yang et al., 2004). The
severity of these effects seemed to be dependent on the resistance of the biological model
considered and influenced by the conditions of exposure (duration and concentration) to the
contaminant.
These responses to Cd were observed in various organisms but studies conducted on
crustaceans are scarce. Procambarus clarkii was used in this study as a model to analyse Cd
effects on crayfish health because this species is the most cosmopolitan crayfish around the
world and is able to tolerate extreme and polluted environments (Gherardi, 2006). Moreover,
P. clarkii has been used as indicator of metal pollution in numerous studies of aquatic
environments and is known to be suitable for toxicology and risk assessment studies since it
tends to accumulate metals such as Cd in its tissues (Anderson et al., 1997; Alcorlo et al.,
2006; Sánchez López et al., 2004; Suárez-Serrano et al., 2010). Many biomarkers had been
suggested to assess Cd contamination in the environment. The responses of stress proteins
such as metallothioneins (MT) and antioxidant enzymes are the most commonly used markers
134
of Cd intoxication in crustaceans (Amiard et al., 2006, Downs et al., 2001, Lei et al., 2011,
Ma et al., 2008, Martín-Díaz et al., 2006, Wu and Chen, 2005). However, to our knowledge
no study had focused on the elucidation of Cd effects on the transcription of mitochondrial
genes, genes involved in oxidative stress responses and detoxification of the crayfish P.
clarkii.These genes expression levels could provide detailed information about Cd
mechanisms of toxicity in this species. In fact, transcriptomics provide a holistic overview of
the molecular changes underlying biological processes affected by a toxicant without biases to
anticipated pathways (Poynton et al., 2008). Discovery of perturbed pathways, whether these
be directly related to the mode of action of the pollutant or downstream secondary stress
responses, help to provide toxicity testing strategies toward relevant end points. Additionally,
omic tools (such as gene expression levels) can potentially help screen for biomarkers of
toxicity in ecotoxicological studies. However, linkage must be made between molecular
responses and adverse outcomes on individuals (Poynton et al., 2011). The present study
focused on the elucidation of the effects that Cd exerts on crayfish mitochondria after acute
(0.05, 0.5, and 5 mg Cd/L for 10 days) and chronic exposures (10 µg/L for 60 days).
Mitochondria are key intracellular targets for Cd due to their ability to accumulate this
substance and because of the sensitivity of mitochondrial enzymes to Cd induced damage
(Cannino et al., 2009; Liu et al., 2009; Pulido and Parrish, 2003; Valko et al., 2005). Because
of the central role of mitochondria in critical cellular processes such as bioenergetics, redox
signalling and cell death, Cd-induced mitochondrial damage could have long ranging
consequences for cellular function, energy homeostasis and whole-organism performance and
survival (Kurochkin et al., 2010). Herein, the molecular impact of Cd on the mitochondria
was investigated in gills and hepatopancreas of P.clarkii. Consequently, transcriptional
responses of few mitochondrial genes (cox1, atp6 and 12S) using quantitative real time RT-
PCR were assessed as biomarkers of Cd toxicity. We also evaluated whether there was a
response to oxidative stress and an attempt of detoxification to better understand the
mechanisms of action of Cd. Therefore, expression levels of genes involved in oxidative
stress responses and detoxification (sod(Mn) and mt) were analysed together with enzymatic
activities of antioxidants such as superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione
peroxidase (GPX) and glutathione-S-transferase (GST).As genes of P. clarkii encoding for
these antioxidants are not sequenced, the investigation of oxidative stress induction had to be
done by following the enzymatic activities. Histopathological effects in hepatopancreas of
crayfish were evaluated by light microscopy to investigate whether the structural integrity of
cells was challenged. The survival rates of crayfish after the different types of exposures were
135
also assessed. Relationships between endpoints were further discussed in the attempt of
linking the effects on different levels of biological organisation between each others. The Cd
bioaccumulation levels were also examined in both organs and correlated to the biological
responses.
2. Materials and methods

2.1. Biological model and acclimatization
Adults intermoult males P. clarkii were collected from the Viguerat swamp of Camargue
in the south of France and were acclimatized three weeks to experimental conditions. They
were maintained under a 12/12h light/dark photoperiod in synthetic water at 17± 1°C (water
composition: Ca²+= 1640; Mg²+= 500; Na²+ = 870; K+= 80; Cl-= 4100; SO42-= 509; NO3-=
76.5; HCO3-= 281 all in µmol/L; pH 6.6 ± 0.3). Freshwater ionic constitution was chosen to
maintain low levels of nitrates and to assure an absence of any non essential trace metal in
water. This ionic composition also meets crayfish physiological needs (Al Kaddissi et al.,
2011, 2012). The use of synthetic water was essential to maintain constant and similar
concentrations of ions throughout the experiments and in all conditions of exposure.
2.2. General experimental protocol for acute exposure

The ASTM standard guide lines for conducting acute toxicity tests on macroinvertebrates
were respected (ASTM E729, 1996). Thus, male intermoult crayfish (27.2 ± 5g; 9 ± 0.5 cm
from cephalothorax to telson; n=50) were starved 48 h before the beginning of the
experiment. In each treatment tank a group of ten crayfish was submerged in 6 L of test
solution (three times the height of the test organisms, following ASTM E729-96
recommendations). Groups were exposed to 0 (control), 0.05 (0.44µM), 0.5 (4.45 µM), and 5
mg Cd/L (44.5 µM) (from CdCl2, stock solution, 1g/L). Ionic concentrations of the medium
(i.e. Cl-) were adapted for each condition of exposure to remain constant after Cd addition.
Every single specimen was kept in an individual chamber (cylinder made from plastic netting:
1cm mesh, 11cm diameter) to avoid cannibalism. Crayfish’s mortality was checked regularly.
Half of the water column was renewed manually on a daily basis in order to maintain stable
water composition and contamination levels. Cd water concentrations were measured before
and after the renewal and adjusted to assure mean values significantly close to nominal
concentrations (Table 12, see below for metal quantification). The temperature was
maintained at 17.2 ± 0.4°C and the pH was monitored daily (pH: 7.01 ± 0.24). The
concentrations of the major ions in water (NO3-, NO2-, Cl-, SO42-, PO43-) were checked by an
136
Ion Chromatography System (ICS-3000) during the experiment and were significantly
identical to the desired concentrations already mentioned above.
Table 12: Nominal and measured Cd (µg/L) concentrations in water throughout the
acute (n=20) and chronic (n= 60) experiments. Cd bioaccumulation (µg /g DW, mean ±
SEM, n= 4 to 5 in each treatment condition) in gills and in hepatopancreas of the
crayfish P. clarkii after 4, 10, 30 and 60 days exposure to Cd (10 to 5000 µg/L).
Cd bioaccumulation in gills Cd bioaccumulation in

Nominal Cd Measured Cd
(µg/g DW) hepatopancreas (µg/g DW)
concentrations concentrations
in water (µg/L) in water (µg/L) T4 T10 T4 T10
0 0 0.20 ± 0.02 0.57 ± 0.12 0.70 ± 0.12 a 0.80 ± 0.21 c
(n=5) (n=5) (n=5) (n=5)
Acute exposure
50 43 ± 2 23.80 ± 9.80 12.13 ± 1.77 1.78 ± 0.44 ab 2.26 ± 0.58 c

(n=5) (n=4) (n=5) (n=4)
500 523 ± 13 107.76 ± 23 89.76 ± 21.69 4.55 ± 1.60 b 15.11 ± 2.89 *
(n=5) (n=5) (n=5) (n=5)
5000 5 190 ± 680 348.57 ± 75 460.87 ± 234 53.67 ± 10.8 199.30 ± 60 *
(n=4) (n=4) (n=4) (n=4)
T30 T60 T30 T60
0 0 0±0 0.06 ± 0.06 1.28 ± 0.21 1.95 ± 0.23
exposure
Chronic
(n=5) (n=5) (n=5) (n=5)

10 10.34 ± 0.48 4.42 ± 0.97 2.88 ± 1.28 12.53 ± 5.28 23.54 ± 6.58
(n=5) (n=5) (n=5) (n=5)
(a,b,c,)
Means of each sampling time designated with the same letters are not significantly different (P> 0.05).
(*)
Significant difference between the bioaccumulation at day 4 (T4) and day 10 (T10) (P< 0.05).
2.3. General experimental protocol for chronic exposure

Male intermoult crayfish (22 ± 0.9g; 9 ± 0.1cm from cephalothorax to telson; n=30) were
fed every two days around 0.1g/individual of commercial trout pellets (tested basal Cd
concentration in pellets= 0.28 µg Cd/g ± 0.04). Groups of ten crayfish of the same sex were
exposed to 0 (control) and 10 µg Cd/L for 60 days. Twenty five percent of the water column
was renewed daily by a continuous flow-through technique. A large volume of each test
solution (0 and 10 µg/L) was prepared once a week, solutions flowed through the respective
tanks containing crayfish constantly. Cd concentrations in the water column was measured
once daily and adjusted if necessary to assure a constant contamination pressure. Crayfish
were also isolated in chambers (cylinder made from plastic netting: 1cm mesh, 11cm
diameter) to avoid death by cannibalism. Temperature was maintained at 17°C ± 0.07, pH was
monitored every day (pH: 6.2 ± 0.05) and ionic concentrations were verified twice a week by
137
ICS-3000 (NO3-, NO2-, Cl-, SO42-, PO43- concentrations were stable and equal to the desired
levels already mentioned).
2.4. Tissues sampling and preparation

At days 4 (T4), and 10 (T10) of the acute exposure and at days 30 (T30) and 60 (T60)
of the chronic experiment, four to five living crayfish were randomly sampled and sacrificed.
For all sampling time and all exposure conditions, the hepatopancreas and the gills were
collected from each individual and divided into two parts. One part was divided in several
aliquots and then conserved at -80°C for further bioaccumulation, gene expression and
enzymatic activity analyses. The second part was directly prepared for microscopic analyses.
2.5. Metal quantification

Water samples from each tank were acidified by nitric acid (3.1 mM of HNO3) prior to
metal quantification. Hepatopancreas and gills were first dried at 45˚C over two days,
digested in 3ml of HNO3 (15.5 M) for 90 min at 95°C and then left to dry for 60 min at
105°C. Afterwards, 2ml of H2O2 (30%) were added to complete the digestion and were then
dried again for 20 min at 105°C. Samples were finally dissolved in acidified water (0.2% of
HNO3 15.5M) before analysis. Samples were measured for Cd by atomic absorption
spectrophotometry using a graphite furnace (4110 ZL; Perkin-Elmer; detection limit: 0.4
µg/L). The analytical method was validated by analyzing standard biological reference
materials (TORT-2: 26.7 ± 0.6 µg Cd/g, Lobster hepatopancreas; DOLT-2: 20.8 ± 0.6 µg
Cd/g, Dogfish liver; NCR/CRNC, Ottawa, Canada).
PCR
Total RNA were extracted from 20 to 40 mg of tissue using the “Absolutely RNA
Miniprep kit” (Agilent), according to the manufacturer's instructions. First-strand cDNA was
synthesized from total RNA using the Stratascript First-Strand Synthesis System (Agilent)
according to the manufacturer's instructions. The cDNA mixture was conserved at -20°C until
needed. Real-time PCR reactions were performed in a Light Cycler (Roche) following the
manufacturer's instructions using the DNA intercalating dye SybrGreen I. The amplification
program consisted of one cycle at 95°C for 10 min and 50 amplification cycles at 95°C for 5s,
60°C for 5s, and 72°C for 20s. Specific primer pairs used to determine target genes expression
levels are listed in table 13. PCR specificity was determined for each reaction from the
138
dissociation curve of the PCR product. This dissociation curve was obtained by following the
SybrGreen fluorescence level during a gradual heating from 60 to 95 °C. Relative
quantification of each gene expression level was normalized according to the 18S gene
expression, a housekeeping gene. Relative expression of a gene was generated using the 2 −ΔCT
method as described by Livak and Schmittgen (2001) where ΔCT represents the difference
between the cycle threshold of specific gene and the cycle threshold of the 18S. Therefore, the
Expression’s factor (EF) of each gene in comparison with control corresponds to the
following equation: EF=2- ΔCT(Treatment)/ 2- ΔCT(Control).
Table 13: Gene names, accession numbers, specific primer pairs used in the quantitative
PCR analysis of the six studied genes of P. clarkii and their function.
Gene Primers (5'-3') Function and accession number

cox1:Cytochrome C AATGGGATACCTCGACGTTATTCA (a)
Encoding for an enzyme in the inner
oxydase subunit 1 GCAGGAGGATAAGAATGCTGT (b)
membrane of mitochondrion that helps
(complex IV). establish a transmembrane gradient of
protons. AY701195.1
atp6:ATP syntase subunit 6 GGCAGCAAATATAATTGCTGG (a) Encoding for an enzyme in the inner
(complex V). TTGCAACGGCAGATTCTAATAT (b) membrane of mitochondrion that uses the
gradient of protons created by other
complexes to synthesize ATP. GU220369.1
12S: Ribosomal RNA 12 S. ACTAGAATATTAGGAGTTATGTTCTT(a) Indicator of the amount of mitochondria in
GCTGCACCTTGATCTAATATAC (b) cells. EF012280.1
Sod(Mn):MitochondrialMn- GCCACCACTAAAATACGAGTA (a) Encoding for an enzyme involved in the fight
Superoxyde CCATTGAACTTTATAGCTGGTA (b) against oxidative stress. EU254488.3
dismutase.
mt: Metallothionein. CGAGGGCGGGTGCAAGACT (a) Encoding for MT protein involved in
CTTGGAGCAGGTCTTGGCAC (b) detoxifying Cd and in the protection against
reactive oxygen species. GU220368.1
18s: 18S ribosomal RNA. GCAATAACAGGTCTGTGATGCC (a) House keeping gene. X90672.1
AGGGACGTAATCAGCGCAA(b)
(a)
Forward primer. (b) Reverse primer.
2.7. Enzymatic activities analysis

Enzymatic activities were determined in the cellular cytosolic fractions of tissues sampled
from the chronic exposure experiment to help understand the implication of cellular stress on
the functioning of mitochondria. Thus gills and hepatopancreas of each individual were
homogenized respectively in a 1:10 and 1:20 weight: volume (W/V) proportion in ice cold
Tris-HCl (100mM, pH 7.8) buffer containing 100 µM phenylmethanesulfonyl fluoride
(PMSF), 0.008 aprotinin U/ml and 0.1mg/ml of bacitracin. An aliquot of each homogenate
was centrifuged at 15000g for 30 min at 4°C, supernatants were further centrifuged at
100000g for 1h at 4°C. SOD was determined spectrophotometrically using the “19160 SOD
determination kit” (Fulka) according to the manufacturer's instructions. The absorbance was
139
read at 450 nm using a plate reader. SOD activity was expressed as U/mg prot. CAT activity
was measured by following the decrease in absorbance (for 1 min) at 240 nm due to H2O2
consumption (ε= 0.04 mM-1 cm-1). The assay was carried out in Na-phosphate buffer
(100mM, pH 7) and 12mM H2O2. GPX activity using cumene hydroperoxideas a substrate
was determined and the oxidation of NaDPH was followed for 1 min at 340 nm (ε= 6.22 mM-
1
cm-1). The assay condition was: 100mM Na-phosphate buffer with pH 7.5, 1 mM EDTA,
0.12 mM NaDPH, 2 mM GSH, 1 mM DTT, 0.8 mM cumene hydroperoxide, and 1U of
glutathione reductase. GST activity was measured with 1-chloro-2.4-dinitrobenzene (CDNB)
as substrate. The assay of the activity with CDNB measured the formation of the conjugate
with GSH during 1 min at 340 nm (ε= 9.6 mM-1 cm-1). The assay condition was: 100 mM Na-
phosphate buffer with pH 6.5, 1 mM GSH and 1 mM CDNB. Protein concentration was
determined using “Micro BCATM Protein Assay Kit” (Thermo scientific) according to the
manufacturer's instructions. The absorbance was read at 562 nm using a plate reader.
Biochemical analysis was performed with SOFTmax PRO spectrophotometer at constant
temperature of 25°C.
2.8. Histological methods

Fresh tissues were fixed with 2.5% glutaraldehyde in 0.1M sodium cacodylate buffer (pH
7.4) for 48 h at 4 °C (Al Kaddissi et al., 2011), then washed 3 times for 5 min with 0.1M
sodium cacodylate buffer (pH 7.4), and then post-fixed with 1% osmium tetroxide in the same
buffer for 1 h. Samples were subsequently dehydrated with successive baths of ethanol and
propylene oxide and finally embedded in Epon 812 (TAAB). Embedded samples were cut in
semi-thin sections of 200 to 500 nm and stained with aqueous blue toluidine. Sections were
observed under a light microscope (Leica, DM 750) and images were taken and saved with a
Leica camera ICC50 and a LAS EZ software.
2.9. Statistical analysis

Results are given as mean ± the standard error of the mean (SEM). All analyses were done
using the R language and environment for statistical computing (R Development Core Team,
2009). For all statistical results, a probability of P< 0.05 was considered significant. Survival
rate was presented using Kaplan Meier’s estimator (Kaplan, 1983).This method estimates the
fraction of living organisms for a certain amount of time after treatment and takes into
account "censored" data (i.e. losses of crayfish by sampling at T4 before the final outcome is
observed at T10). The significant effects of factors (i.e. time and metals concentrations in
140
water) on bioaccumulation or on enzymatic activities were performed using analysis of
variance (ANOVA), after checking assumptions of normality and variance homogeneity of
residuals. Normality assumption was visually checked using quantile-quantile plot (QQplot)
of standardized residuals versus normal quantiles. Variance homogeneity assumption was
checked on residuals using standardized residuals versus fitted plot (Faraway, 2002). When
the assumptions were not satisfied, a logarithmic data transformation was applied. If the
assumptions were still not satisfied the Kruskal-Wallis non-parametric test was used. The
relationships between individual metal concentration in organs and gene expression levels or
enzymatic activities or Cd concentration in water were investigated using the non-parametric
Spearman rank correlation test due to the non-linearity of the data (R= spearman’s correlation
coefficient).
3. Results
3.1. Survival rate
In the acute exposure experiment no mortality was recorded in the control group (0 mg/L).
During the ten days period of contamination no mortality was observed among crayfish
exposed to 0.5 mg/L of Cd, and only 20% and 33.3% mortality were detected in groups
contaminated to 0.05 and 5 mg/L of Cd respectively. No mortality was observed among
crayfish in the chronic exposure experiment after 60 days of exposure to 0 and 10 µg/L of Cd.
3.2. Cd bioaccumulation in crayfish organs

Cd measured in gills and hepatopancreas are shown in table 12 and expressed in dry
weight of the tissues (DW).
In the acute exposure experiment, Cd bioaccumulation in tissues were found to be highly
correlated with the increasing Cd concentrations in water (gills: R= 0.94, P< 2.2 10-16;
hepatopancreas: R= 0.87, P= 2.8 10-13). In this experiment, Cd accumulation was not time
dependent (P= 0.073) in gills, yet there was a significant increase in Cd concentrations in the
hepatopancreas for crayfish exposed from 0.5 to 5 mg/L of Cd (p< 0.05) at T4 and T10. Gills
accumulated more Cd than hepatopancreas both at T4 and T10 (T4: P= 4.06 10-8; T10: P=
0.0053). In the chronic exposure experiment, Cd bioaccumulation in tissues of exposed
crayfish was significantly different from that of controls (gills: P= 3.1 10-6; hepatopancreas:
P= 1.3 10-3) at T30 and T60. The metal accumulation was not time dependent in any organ
(P> 0.05). Moreover, Cd concentrations in tissues were highly correlated with waterborne Cd
141
concentrations (gills: R=0.91, P< 3.9 10-8; hepatopancreas: R= 0.76, P= 9.1 10-5). However, in
this experiment, hepatopancreas accumulated more Cd than gills at both times (P< 0.05).
In both experiments, accumulation levels in hepatopancreas do not seem to have reached a
steady state, because concentrations in this organ were tending to increase over time even
though statistically this was not significant in the chronic exposure experiment.
3.3. Gene expression levels and enzymatic activities

The expression of mitochondrial genes of tissues exposed to Cd seemed to be affected at
T4 and T10 in the acute exposure experiment (Table 14). Mainly the results for both organs
showed that cox1 gene expression level decreased significantly with increasing Cd
concentrations especially at T10. The atp6 gene was highly up-regulated at all sampling times
(ex: in gills, T4, 5 mg/L: +103 folds). The mt gene expression level increased with time and
with increasing Cd concentrations (ex: in gills, T10, 5mg/L: +39 folds, in hepatopancreas,
T10, 5mg/L: +11 folds). The 12S gene expression level in gills decreased significantly at T4,
but no difference was noted between contaminated crayfish and controls at T10. No decrease
in the amount of mitochondria was observed in the hepatopancreas since 12S was mostly up-
regulated at both times. The sod(Mn) gene in gills was only up-regulated 2 fold at T10 when
exposed to 0.05 mg/L of Cd, while in the hepatopancreas, sod(Mn) was significantly
repressed in most conditions of Cd exposure at both sampling times.
Table 14: Expression factors (EF) of the five genes studied in P. clarkii compared to the
basal level of controls (n= 4 to 5 in each treatment condition).
Cd treatment cox1 atp6 12s sod(Mn) mt

Organs condition (mg/L) T4 T10 T4 T10 T4 T10 T4 T10 T4 T10
Gills 0.05 2 2 14 2 / / / 2 / 25
0.5 -2,5 -3 5 26 -9 / / / / 8
5 / -3 103 2,5 -6 / / / 5 39
Hepatopancreas 0.05 -2 -6 8 / / / -12 -5 / /
0.5 / -3,5 80 18 3,5 2 / -3,5 2 3
5 -9 -2 183 13 3 2 -5,5 -3 14,5 11
Cd treatment cox1 atp6 12s sod(Mn) mt
Organs condition (µg/L) T30 T60 T30 T60 T30 T60 T30 T60 T30 T60
Gills 10 / / -2 3 -3 / / -3 5 9.5
Hepatopancreas 10 / -2 -10 2 / 7 / -4 3 2
(/)
Equal to control. (-) Down-regulated. (+) Up- regulated. Only EF≥ 2 or EF≤ -2 are considered statistically
significant.
142
In the chronic exposure experiment cox1 gene was repressed only about 2 fold in the
hepatopancreas at the end of the experiment. The atp6 gene was repressed in both organs at
T30 then up-regulated at T60. The amount of mitochondria decreased significantly in the gills
at T30 (12S: -3 folds). The 12S gene expression level in these organs was not significantly
different from that of controls at T60, indicating an increase in the amount of mitochondria
with time until it reached a normal status. In the hepatopancreas an over-expression of the 12S
gene was noted with time (/ at T30, +7 folds at T60). In contrast, sod(Mn) gene expression
level decreased at T60 in all the studied tissues, while mt gene was over-expressed in all
organs at T30 and T60.
Enzymatic activities were evaluated only in organs sampled from the chronic exposure
experiment (Figure 63). No significant changes in activities of SOD, CAT nor GPX were
recorded in presence of low concentrations of Cd even after 60 days of exposure. However, a
decrease in GST activity was evidenced at the end of the experiment in the gills of crayfish
(P= 0.052). Contaminated gills presented a 42.4% decrease in GST activity compared to
controls.
10 160
140
CAT µmol/min/mg Prot
8
120
SOD (U/mg Prot)
0-Hp 0-Hp
6 100
Cd-Hp Cd-Hp
80
4 0-G 0-G
60
Cd-G Cd-G
2 40
20
0 0
30 60 30 60
Time (days) Time (days)
60 3,5
GPX nmol/min/mg Prot
3
GST µmol/min/mg Prot
50
0-Hp 2,5 0-Hp
40
Cd-Hp 2 Cd-Hp
30
0-G 1,5 0-G
20 Cd-G Cd-G
1
10 0,5
*
0 0
30 60 30 60
Time (days) Time (days)
Figure 63: Antioxidants activities (SOD, CAT, GPX, and GST) (mean ± SEM, n=5) in
gills and hepatopancreas of crayfish P. clarkii exposed 30 and 60 days to 0 and 10 µg/L
of Cd. (*) statistical significant differences between contaminated and control crayfish at
a given sampling time.
143
3.4. Biological responses and bioaccumulation
A correlation between molecular responses (gene expression levels or enzymatic activity)
and Cd bioaccumulation was assessed without taking into account possible variations in
responses over time. Thus for every sampling time, Cd bioaccumulation in the organ of
interest of each individual was associated with genes expression levels or enzymatic activities
evaluated in the same organ. The cox1 gene expression was negatively correlated with Cd
concentrations in gills and hepatopancreas of crayfish after acute exposure to Cd (in gills: R=
-0.53, P= 2.3 10-3; in hepatopancreas: R= -0.45, P=0.018). In the highly contaminated organs,
mt and atp6 gene expression levels increased significantly with increasing Cd
bioaccumulation (mt-gills: R= 0.4, P= 0.04; mt-hepatopancreas: R= 0.65, P= 3 10-4;atp6-gills:
R=0.52, P= 2.5 10-3; atp6-hepatopancreas: R= 0.7, P= 8.35 10-5). In the chronic exposure
experiment, the down-regulation of sod(Mn) was significantly correlated to Cd
bioaccumulation in gills (R= -0.58, P= 0.037), while a positive correlation was only observed
for mt gene in both organs (mt-gills: R= 0.67, P= 0.013; mt-hepatopancreas: R= 0.46, P=
0.049). CAT activity seemed to decrease in presence of low concentrations of Cd in
hepatopancreas of crayfish (R= -0.45, P=0.053). Negative correlation was observed between
low levels of Cd concentrations and GST activities in both organs but was only significant in
gills (GST-gills: R= -0.54, P= 0.032; GST-hepatopancreas: R= -0.33, P= 0.17).
3.5. Histological alterations

Damages to tissue structures were discerned in the hepatopancreas after ten days of Cd
exposure to 0.05, 0.5 and 5 mg/L of Cd (Figure 64). Epithelium of several tubules showed an
overall presence of numerous pathologically altered cells with cytoplasmic vacuoles. Cell
walls were disintegrated and epithelial organization of cells was lost. Cell shrinkage, thinning
of the epithelium and lumen dilatation were observed at the highest levels of Cd
contamination. Histological pathologies were less marked in hepatopancreatic tubules of
crayfish exposed 60 days to 10 µg Cd/L. Vacuolisation appeared in some contaminated
tubules at the end of the chronic exposure experiment. However, this phenomenon was
confined to individual tubules and did not affect the entire digestive gland.
144
1 L 2 3
B
R
V V
LD
50 nm 50 nm 50 nm
4 T 5 V
LD CS
50 nm 50 nm
V
Figure 64: Histopathological alterations in P. clarkii hepatopancreas tubules after 10
days of acute exposure to Cd: (1) 0 mg/L; (2) 0.05 mg/L; (3) 0.5 mg/L (4) 5 mg/L; and 60
days of chronic Cd exposure: (5) 10 µg/L. (R) absorptive cells. (B) secretory cells. (L)
Lumen. The pathologies observed were: (V) Vacuolization; (T) thinning of the
epithelium; (LD) lumen dilatation; (CS) cellular shrinkage. Magnification x 40.
4. Discussion
4.1. Effects on survival rate
Crayfish mortality showed that Procambarus clarkii was highly resistant to Cd. Results
did not allow a calculation of a ten days LC50: this value seems to be higher than 5 mg/L in
our experimental conditions. Del Ramo et al.(1987) reported a very high Cd 96h LC 50 value
for this species (15 -20 g) which was equal to 58.5 mg/L (with 95% confidence intervals:
41.8- 81.9 mg/L) at 20˚C. It should be noted that they conducted a static test so their Cd LC 50
was based on the initial amount of Cd added to the water, hence after 96 hours the
concentrations may have been less than those indicated. Recently, Wigginton and Birge
(2007) stated that the 96h Cd LC50 of adult P. clarkii (18.5 g at 25˚C) is equal to 2.66 mg/L
(with 95% confidence intervals: 1.57- 4.44 mg/L). A direct comparison of the toxicity value
obtained between studies in literature is complicated by differences in the water chemistry
(hardness, alkalinity, pH, temperature, and concentrations of other major ions) that affect Cd
toxicity (Garcia-Santos et al., 2006). However, Wigginton and Birge (2007) demonstrated in
the same study that P. clarkii was more resistant to Cd exposure when compared with other
crayfish species (Orconectes sp. and Procambarus sp.). It is well documented that different
species have variable degrees of tolerance to Cd (USEPA, 2001; WHO, 1992). For example,
145
the 96h LC50 value of Cd for the freshwater fish Tilapia Oreochromis niloticus is equal to
24.66 mg/L while the 96h LC50 for Oncorhynchus mykiss and Salmo trutta are in the low
µg/L range (< 2.8 and 1.6 µg/L respectively) (Cusimano et al., 1986; Spehar and Carlson,
1984;). When compared to these last two species P. clarkii seems to be highly tolerant to Cd.
4.2. Accumulation
Cd bioaccumulation in organs was dose-dependent in all the experiments given that metal
concentrations in tissues were highly correlated with those in water. Crayfish were able to
bioconcentrate rapidly the contaminant in their tissues (high accumulation factor (AF): [Cd]
in organ/[Cd] in water at T4: e.g. AF gills-5 mg Cd/L= 65). In the acute exposure experiment,
metal concentrations in gills were higher than those in the hepatopancreas. This result is in
concordance with that reported by Diaz-Mayans et al., (1986) that showed Cd uptake from
solution results in a higher bioaccumulation in gills than in the hepatopancreas of P. clarkii.
Our measured concentrations are in the range of those reported by these authors. They found
that Cd levels in gills of P. clarkii were about 12.76 ± 5.26 and 37.35 ± 10.56 µg/g DW when
exposed four days to 32 and 100 µg/L of Cd respectively; Whereas 0.72 ± 0.46 µg/g DW and
2.41 ± 1.74 µg/g were found in the hepatopancreas. In contrast, in the chronic exposure
experiment the hepatopancreas accumulated more Cd than the gills. All abiotic parameters
were identical in both experiments except for Cd concentrations in water and the slight
changes in pH values. It is well established that the effect of pH on Cd speciation in water is
negligible (Zirino and Yamamoto, 1972)so the difference between bioaccumulation levels in
organs in both experiments is not linked to the pH but rather to the levels of Cd
contamination. In addition, Cd speciation in our synthetic water was simulated at different pH
values using the geochemical speciation software J-CHESS (Java Chemical Equilibrium with
Species and Surfaces, Van der lee, 1998). Results demonstrated that the concentration of the
different species of Cd did not vary between the pH 4 and 8 (results not shown here). Cd
bioaccumulation in gills after high levels of waterborne metal exposure, results in both
adsorption and internalization of the metal. The adsorption rate on the cuticle of gills depends
on the concentration level of Cd in water. The gill seems to be temporary target organ of Cd
accumulation when exposed to low concentrations of waterborne Cd, after which the metal is
transferred to the hepatopancreas. Indeed, the hepatopancreas has a well defined role in
storage, metabolism and detoxification of a number of metals (Alcorlo et al., 2006; Kouba et
al., 2010; Lyon and Simkiss, 1984; Muriana et al., 1993). Moreover, Meyer et al. (1991) and
Simon (2000) reported that freshwater crayfish Astacus astacus bioaccumulated more Cd in
146
hepatopancreas than in gills after chronic exposure to Cd (2 µg/L- 10 weeks and 10 µg/L- 30
days respectively). Both of our experiments showed that the strategy of Cd internalization and
Cd transfer capacity to other organs (hepatopancreas) depends strongly on the exposure
levels.
4.3. Molecular responses

4.3.1. Mechanisms of toxicity in acute exposure
At high concentrations in tissues, Cd had a considerable effect on cox1 gene
expression levels which seemed to be significantly repressed in gills with increasing Cd
bioaccumulation in the organs (R= -0.5; P= 0.002). Such a decrease in cox1 gene expression
level was first described in the liver of carp experimentally exposed to low concentrations of a
mixture of waterborne and dietary Cd (Reynders et al., 2006). Pierron et al (2009) also
observed a down regulation of the gene cox1 in the wild yellow perch (Perca flavescens)
when exposed to environmental concentrations of Cd. This gene seemed to be tightly
modulated by Cd accumulation. Moreover, cytochrome c oxidase activity was determined in
gills and digestive glands of the eastern oyster Crassostrea virginica and showed a significant
decrease in presence of high levels of Cd (50µM-400µM Cd) (Ivanina et al., 2008). Authors
also reported inhibition of the complex I, II and III in the same Cd contaminated oysters.
Other studies have also shown an inhibition of the electron transport chain reaction in
different animal models (Cannino et al., 2009; Kurochkin et al., 2010; Miccadei and Floridi,
1993; Wang et al., 2004). atp6 gene was highly up-regulated in gills in the acute exposure
experiment and was dose-dependent (R=0.52; P=2.5 10-3). Mitochondria could have tried to
produce more ATP synthase to create enough ATP for maintaining cell functions and
compensate for the impairment of the complex IV. However, Dorta et al. (2003) showed a
depression of ATP levels in rat liver mitochondria incubated with 5 µM CdCl2 after
dissipation of the transmembrane electrical potential. High Cd exposure (20-200 µM/L Cd) of
isolated oyster haemocytes also caused a significant depletion in intracellular ATP levels that
was dose-dependent, indicating a severe disturbance of energy metabolism (Sokolova et al.,
2004). A recent study showed that an exposure to 12.5 µM Cd strongly inhibited the substrate
oxidation subsystem and stimulated the proton conductance across the inner mitochondrial
membrane showing a leak of protons from the periplasmic space to the matrix of oyster
mitochondria (Kurochkin et al., 2010). Indeed, a proton leak involves a dissipation of
membrane potential without ATP production (Kurochkin et al., 2010). Authors were also
surprised to see that Cd did not affect the phosphorylation subsystem proving a negligible
147
effect on ATP synthase. By incorporating all these findings, another explanation to the
increase in atp6 gene expression level could be linked to a change in the classic mitochondrial
metabolism. A severe decrease of the proton gradient due to the inhibition of mitochondrial
complexes leads to a decrease in the mitochondrial inner membrane potential which
stimulates the functioning of ATPase in an unusual manner (Nevière, 2008). In this case, the
complex V can reverse itself and hydrolyse ATP to pump protons back to the periplasmic
space (Nevière, 2008; Wang and Oster, 1998). For this reason we can hypothesise that
mitochondria were trying to produce enough ATPase to compensate for the decrease in the
electrochemical gradient. 12s gene expression levels was down-regulated at T4 but was not
different from the control at T10 demonstrating that cells increased the numbers of
mitochondria to balance those who are not functioning correctly. As expected, the mt gene
was over-expressed with the increasing Cd concentrations (R=0.4, P=0.04). Indeed
metallothioneins (MT) are characterized by an important proportion of cysteinyl residues,
which serve as ligands for Cd chelation (Amiard et al., 2006; Baudrimont et al., 1999; Martin-
Diaz et al., 2006). the mt gene was more expressed at T10 than T4 in all exposure conditions.
This could be linked to the natural presence of a sufficient concentration of MT proteins at the
beginning of the exposure. In hepatopancreas sampled from the acute exposure experiment,
the mechanisms of toxicity of Cd at the molecular level were the same as in the gills. The
gene expression level of sod(Mn) was significantly down-regulated in this organ. Numerous
investigations have shown that Cd can indirectly promote oxidative stress in cells (Shi et al.,
2005; Wang et al., 2004). This metal can bind to antioxidants or to their substrate.
Consequently impairment of the defence mechanism against Reactive Oxygen Species (ROS)
leads to an increase in ROS concentrations (Cao et al., 2010). Cd is also capable of displacing
zinc (Zn) from endogenous MT (Dallinger et al. 1997). Therefore, in mitochondria Cd can
bind to MT and displace Zn which increases the concentrations of free zinc ions, which in
turn can induce respiratory block, mitochondrial permeability transition pore opening,
cytochrome C release, and generation of ROS (Bossy-Wetzel et al., 2004). It is also well
established that the expression level of sod increases when ROS production increases.
However a recent report has shown that the cytosolic sod(Cu/Zn) was repressed in the yellow
perch Perca flavescens exposed to environmental concentrations of Cd (Pierron et al., 2009).
The authors hypothesized that the metallothioneins produced to sequester Cd, could have also
scavenged ROS efficiently; since MT is known for its capacity to trap (ROS) (Fang et al.,
2010; Viarengo et al., 2000). In fact, reports have demonstrated that mt gene expression levels
are up-regulated not only by metal exposures but also by ROS generation (Fang et al., 2010;
148
Viarengo et al., 2000). Moreover, authors hypothesized that Cd accumulation could cause an
overall decrease in mitochondrial metabolism which leads to a decrease in ROS production
(Pierron et al., 2009). Such explication is consistent with our results. Moreover the decrease
of sod(Mn) gene expression level was highly correlated with the decrease in cox1 gene
expression level (R= 0.4 ; P= 0.001).
4.3.2. Mechanisms of toxicity in chronic exposure

In the chronic exposure experiment, the mt gene was over-expressed in all organs at all
times, and the expression levels were significantly correlated to the bioaccumulation of Cd.
Increase in expression levels of this gene was higher in gills than in hepatopancreas despite of
the lower concentrations of Cd in gills. Without a doubt, tissues directly involved in metal
uptake, storage and excretion have high capacity to synthesise MT. In some crustaceans, basal
MT concentrations are considerably higher in hepatopancreas than in gills (Amiard et al.,
2006). Therefore, this could explain the reason why mt gene was less over-expressed in
hepatopancreas of crayfish. At T30, Cd accumulation was low thus the metal did not show a
significant impact on the complex IVin the gills. It is well known that Cd itself is unable to
directly generate ROS (Jomova and Valko, 2011; Watjen and Beyersmann, 2004) and that in
absence of any contamination mitochondria are the main source of ROS in the cell (Wang et
al., 2004). CAT, SOD, GPX and GST did not show any statistical significant difference in
activities between contaminated crayfish and controls. Therefore, Cd did not seem to generate
oxidative stress in gills at T30. The decrease in the amount of mitochondria and atp6 gene
repression in gills, surely lead to a decrease in ROS production. This is confirmed by the
result of sod(Mn) gene expression levels which were not altered in presence of Cd at T30. In
gills of the eel Anguilla anguilla Cd caused a decrease in atp6-8 gene expression levels when
exposed 14 days to 10 µg/L of Cd (Pierron et al., 2007). Authors demonstrated that Cd under
normoxia mimics the effect of hypoxia on eels. In fact, as in hypoxia, Cd led to a repression
of genes encoding for proteins involved in the respiratory chain and in the defence against
oxidative stress. At T60 the impact of Cd on mitochondria in gills was also not flagrant: cox1
gene expression levels were not altered and the amount of mitochondria was no longer
different from control. The atp6 gene was slightly up-regulated probably to produce enough
ATP for cellular needs. ROS generation did not seem to be excessive since the antioxidant
defence system was not altered. The activity of SOD, CAT and GPX did not change, and the
sod(Mn) gene was even repressed. This could be due to the effectiveness of the detoxification
mechanisms. MT seemed to have trapped ROS and Cd efficiently (mt: 9.5 folds up-
149
regulated). Moreover depletion in GST activity was observed: inhibition of this enzyme
occurs either via direct action of Cd on the enzyme or via a depletion of its substrate (GSH)
(Cao et al., 2010), either way this demonstrates that Cd was trapped. Salazar-Medina et al.
(2010) determined that Cd binds in GSH-binding site of GST in the shrimp Litopenaeus
vannamei by coordination with Asp and Gln residues. In the hepatopancreas at T30, effects on
mitochondria were only illustrated by the repression of atp6. This gene regulation raises the
possibility that ATP synthase could be modulated indirectly by Cd. Its repression could be an
adaptive response for preventing excessive ROS build-up under stress conditions. It should be
drawn to attention that Cd bioaccumulation in hepatopancreas at T30 was of the same order as
that reported in hepatopancreas exposed to 0.5 mg/L at T10. However transcriptional
responses were different showing that the mechanisms of Cd toxicity are more complex than
imagined. Additionally, kinetics should be taken into account in choosing biomarkers of Cd
toxicity since the responses are different depending upon the type (acute/chronic) and the time
ofexposure (short/long term). It is possible that with a chronic exposure crayfish can
acclimate and have time to put into place effective mechanisms of detoxification. Impacts on
mitochondria were more obvious at T60, cox1 was repressed followed by a decrease of
sod(Mn) indicating a ROS depletion in mitochondria. The 12S gene was up-regulated
demonstrating once again a cellular strategy to combat Cd stress which consists of increasing
the number of mitochondria to compensate for those that were not functioning correctly. It
should be highlighted that at T60 Cd concentrations in hepatopancreas were elevated and
comparable to concentrations found in hepatopancreas exposed to 0.5 mg/L at T10 and to 5
mg/L at T4. The studied genes followed the same pattern as seen in the acute exposure
experiment. Therefore atp6 up-regulation could be explained by the same hypothesis already
mentioned above. Activities of antioxidants were found not to be significantly altered which
are in concordance with gene expression levels results. However, a tendency of GST (R= -
0.33, P= 0.17) and CAT (R= -0.45, P= 0.053) activity to decrease with increasing Cd
concentrations in hepatopancreas was observed. In fact, Almar et al. (1987) showed that
waterborne CdCl2 concentrations higher than 100 μg/l affects GSH content and decreases
GST activity (after 96 hr) in midgut gland of the crayfish P. clarkii. Casalino et al. (2002)
reported a reduction of CAT activity in kidney and liver of rats after acute exposure. Cao et al.
(2010) also demonstrated that a high waterborne Cd concentration (48 µg/L) decreases CAT
activity in Japanese flounder larvae. Such a decrease in CAT activity is related generally to an
interaction between Cd and the catalytic subunit of the enzyme (Wroñska-Nofer et al., 1999).
Cd could also cause a Fe deficiency in organisms which might explain the decrease in the
150
enzyme activity, since CAT has Fe as an essential element in its active centre (Jurczuk et al.,
2004).
4.3.3. Histopathology
Histopathological damages seemed to be dose dependent. This could be seen particularly
in soft-tissues of crayfish in the acute exposure experiment, since increasing vacuolisation
was observed with the increasing Cd bioaccumulation. Moreover, epithelial arrangement
seemed to disintegrate with the increasing doses of Cd in hepatopancreas. It should be noted
that histopathological lesions in the chronic exposure experiment were less severe than those
observed in tissues sampled from the acute exposure experiment. The structural changes
observed in this study were also reported by Martin-Diaz et al (2006) in gills and
hepatopancreas of P. clarkii after 21 days of exposure to 10 and 30 µg/L of Cd. Histological
observations of Cd contaminated hepatopancreas of crayfish Astacus astacus (2µg/L for 10
weeks) showed similar damages in tubules such as enlarged cells, vacuolization, loss of
epithelial organisation and cell disintegration (Meyer et al., 1991). The first morphological
signs of programmed cell death in midgut epithelium cells are alterations in the cytoplasm
connected with shrinkage of the cells (Rost-Roszkowska et al., 2010). In this study cells
shrinkage was observed in highly contaminated tubules. These histopathological alterations
could be linked to the mitochondrial damages caused by Cd (Li et al., 2000; Pal et al., 2011).
In effect, Cd can bind strongly to the sulfhydryl groups of mitochondrial membrane proteins
thereby inducing mitochondrial permeability transition (MPT) as well as disrupting other
mitochondrial functions (Robertson and Orrenius, 2000). The MPT is believed to reflect the
opening of a proteinaceous permeability transition pore (PTP) on the inner mitochondrial
membrane. Opening of this pore causes a decrease in mitochondrial membrane potential
(MMP) and the release of apoptogenic proteins, such as cytochrome c and apoptosis inducing
factor, from the mitochondrial inner membrane space into the cytoplasm, thereby triggering
the apoptotic cascade (Liu et al., 2011). MMP collapse is a critical step that occurs in cells
undergoing apoptosis, regardless of the inductive signal (Huettenbrenner et al., 2003). The
expression levels of atp6 and cox1 genes in highly contaminated crayfish showed a
dysfunction of the mitochondrial chain reaction. By integrating the transcriptional responses
and the histological alterations, the hypothesis of Cd causing a “reverse functioning” of ATP
synthase is most probable since a decrease in MMP could explain such responses.
151
5. Conclusions
Cd induced high levels of bioaccumulation, mitochondrial dysfunction, and caused
histopathological alterations. In the long term, this may have important consequences for
sustainability of crayfish populations in Cd-polluted environments. This study also
demonstrated that the molecular responses can vary depending on the intensity (10 µg/L- 5
mg/L) and duration (10-60 days) of the chemical stress applied to the organisms. The
expression levels ofcox1, mt and atp6 genes seemed to be good biomarkers of acute Cd
contamination in gills as well as in hepatopancreas. The expression of these genes was highly
correlated with the high Cd concentrations in tissues. Between all the studied genes, mt was
the only gene that had the same pattern of expression in both organs in chronic exposure. The
study of mt gene expression levels remain the best tool to assess Cd intoxication, since this
gene was over-expressed in all organs whatever the type of exposure was or the duration.
However, a multi-biomarker approach should be used when assessing Cd toxicity to better
understand the mechanisms of action of this metal. Further experiments are needed to
complete the understanding of the mechanisms of Cd toxicity and to elucidate the impact on
mitochondria. It would be useful to sequence genes of P. clarkii implicated in the apoptosis
mechanism and encoding for some subunits of the complex I, II, and III of the mitochondrial
chain reaction. The measurement of the mitochondrial membrane potential, ATP levels, and
the concentration of the cytochrome c would bring more information to clarify the mechanism
by which Cd induces toxicity. It could also be interesting to sequence genes that participate in
oxidative stress responses and test the sensitivity between variations in gene expression levels
and enzymatic activities of antioxidants in order to choose the best tool for the evaluation of
Cd toxicity.
Acknowledgments
Authors would like to thank N. Gauthier for providing the crayfish, B. Geffroy for his
assistance in dissecting P. clarkii, G. Bucher for J-CHESS simulations, S. Pierrisnard for
ionic chromatography measurements, and C. Della-Vedova for helping in statistical analysis.
This study was supported by the ENVIRHOM research program funded by the institute of
Radioprotection and Nuclear Safety and the CNRS.
152
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160
Chapitre IV
Etude de l’impact de l’uranium sur la

survie, l’histologie, les mitochondries et les
antioxydants chez P. clarkii.
161
Chapitre IV-A
Effet de la bioaccumulation de l’uranium

sur les réponses transcriptomiques, les
structures histologiques et la survie chez
P. clarkii.
162
Effects of uranium uptake on transcriptional responses, histological structures and
survival rate of the crayfish Procambarus clarkii.
Simone Al Kaddissi1;2, Alexia Legeay2, Patrice Gonzalez2, Magali Floriani1, Virginie

Camilleri 1, RodolpheGilbin1, and Olivier Simon1.
1
2
Laboratory of Geochemistry and Ecotoxicology of Metals in Aquatic Systems (GEMA),
University of Bordeaux1/UMR CNRS 5805, Dr Peyneau square, 33120 Arcachon, France.
163
Abstract
This work aims to investigate the accumulation levels and effects (transcriptional
responses, histopathology, survival rate) associated with a wide range of dissolved uranium
(U) concentrations (0, 0.03, 0.6, 4 and 8 mg/L of U) on adult male crayfish Procambarus
clarkii during 4 (T4) and 10 (T10) days of exposure. The follow-up of the crayfish mortality
showed that Procambarus clarkii was highly resistant to U. Increasing waterborne U
concentrations led to increasing bioaccumulation in key crayfish organs and increasing
histological damage. U distribution in tissues was also evaluated using transmission electron
microscopy and showed the presence of a detoxified form of U in the gill’s epithelium in
shape of flakes. Expression levels of mitochondrial genes (cox1,atp6 and 12S gene) and genes
involved in oxidative stress (sod(Mn) and mt) were examined together with the housekeeping
gene 18S. atp6 and mt genes of P. clarkii were cloned and sequenced before analysis.
Significant correlations were observed between U bioaccumulation and the down-regulation
of both cox1 and sod(Mn) genes. This work provides a first U toxicogenomic and
histopathological pattern for P.clarkii, identifies U biomarkers and associates gene expression
endpoints to accumulation levels. It also provides new insights into the mechanisms involved
in U stress.
Keywords: Uranium, crayfish, mitochondria, metallothionein, gene expression.
164
1. Introduction
Uranium’s (U) distribution in ecosystems is currently increasing due to anthropogenic
activities such as mining, milling, agricultural use (e.g. phosphate fertilizers), industrial
activities linked to nuclear fuel production, and laboratory research activities (ASTDR, 1999;
Colle et al., 2001; WHO, 2001). U concentrations in natural waters generally varies from
below 12 ng/L up to 2 mg/L (Betcher et al., 1988) and may reach an excess of 10 to 20 mg/L
in extremely polluted aquatic systems (Ragnarsdottir and Charlet, 2000). It is therefore
essential to understand the potential impact of U on ecosystem components so that measures
can be taken to protect the environment.
Procambarus clarkii is the most cosmopolitan crayfish around the world, is able to
tolerate extreme and polluted environments, and has been used as an indicator of metal
pollution in numerous studies of aquatic environments (Gherardi, 2006). Crayfish tend to
accumulate metals (Alcorlo et al., 2006; Anderson et al., 1997; Sánchez López et al., 2004;
Suárez-Serrano et al., 2010) such as U in their tissues (Chassard-Bouchaud, 1982; Simon and
Garnier-Laplace, 2005). In addition, P. clarkii meets other criteria which made it suitable for
toxicology and risk assessment studies for many decades. For example, it is relatively static,
easily captured and adults provide sufficient tissue for individual analyses. Furthermore, its
central position in aquatic food webs makes this species a potential vector of contaminants to
higher trophic levels (Gherardi, 2006). It is also important to note that, in some countries, P.
clarkii is a species of great commercial interest (Sánchez López et al., 2004).
U toxicity has not been extensively studied in non-human biota, especially in aquatic
invertebrates such as crayfish. In order to address this deficiency, the proposed approach in
this study is to evaluate the impacts of uranium on P. clarkii. The No Observed Effect
Concentration (NOEC) data for aquatic species such as algae, micro-crustaceans, hydra and
fish range from 18 to 810 µg U/L (Hogan et al., 2010). However information regarding the
concentration of U required to cause an impact on crayfish is scarce. Thus, this ongoing
research involves the investigation of the effects associated with a wide range of dissolved U
concentrations extending from environmental relevant concentrations to dose rates found in
extremely polluted sites (0.03 to 8 mg/L) on adult male crayfish Procambarus clarkii during
10 days of exposure. Contaminants exert their toxicity at all levels of biological organization
ranging from molecular levels to ecosystems (Perceval et al., 2006). Consequently,
transcriptional responses using quantitative real-time RT-PCR, histopathological effects,
survival rate, bioaccumulation levels, and metal distribution using transmission electron
165
microscopy coupled with energy dispersive X-ray (TEM-EDX) were assessed as U endpoints.
The investigation of U toxicity was conducted on gills and hepatopancreas of crayfish.
Indeed, gills are the first biological barriers to suffer from heavy metal intoxication via a
water exposure (Meyer et al., 1991; Niyogi and Wood, 2004) and hepatopancreas has a well-
defined role in the storage, metabolism and detoxification of a number of metals (Alcorlo et
al., 2006; Lyon and Simkiss, 1984; Muriana et al., 1993). Pollutants could impair
mitochondrial function (Cannino et al., 2009; Garceau et al., 2010; Lerebours et al., 2010;
Pourahmad et al., 2006; Risso-De Faverney et al., 2004) which could lead to disease, ranging
from subtle alterations in cell function to cell death and from minor to major disability, or to
death (Duchen, 2004a; Duchen, 2004b).Therefore, the expression level of the cox1 gene
encoding for the cytochrome c oxidase subunit 1 (complex IV) was examined in both organs.
This enzyme is involved in the mitochondrial respiratory chain and helps to establish a
transmembrane gradient of protons. The atp6 gene encoding for ATP synthase subunit 6
(complex V) was cloned and sequenced before analyzing its expression in organs. This
enzyme uses the gradient of protons created by the other complexes to synthesize ATP (Wang
and Oster, 1998). The expression level of the mitochondrial gene 12S, encoding for the
ribosomal RNA 12S was used as an indicator of the number of mitochondria in cells (Renault
et al., 2008). Moreover, examination of sod(Mn) gene expression level encoding for
mitochondrial superoxide dismutase, an enzyme involved in the fight against oxidative stress
(Wang et al., 2004) was conducted. The expression levels of mt gene were also determined
after cloning and sequencing. This gene encodes for the protein metallothionein which is
known to be involved in detoxifying excess intracellular metals (Amiard et al., 2006;
Baudrimont et al., 1999) and in the protection of cells against Reactive Oxygen Species
(ROS) (Amiard et al., 2006; Viarengo et al., 2000).The objectives of this study were to
comprehend the mechanisms of U toxicity, identify sensitive biomarkers of U exposure and
clarify the relationships between U accumulation and endpoints at different levels of
biological organisation.
166
2.1. General experimental protocol
The crayfish used in this study were all adult intermoult males (27.2 ± 5g; 9 ± 0.5 cm
from cephalothorax to telson; n=50). Organisms were caught on the same day from the
Vigueirat swamp in Camargue, south of France (GPS coordinates: 43°31.863’N- 4°45.417’E).
They were acclimatized to the experimental conditions for one month (12/12h light/dark
photoperiod, and in 17± 1°C synthetic water composed of: Ca²+ =1640; Mg²+ = 500; Na²+ =
870; K+ = 80; Cl- =4100; SO42- =509; NO3- =76.5; and HCO3- = 281 all in µmol/L; pH 6.7 ±
0.2). Freshwater ionic constitution was based on the composition of artificial medium used by
Zeman et al. (2008) for the microcrustacean Daphnia magna. The synthetic water was
modified to meet the physiological needs of crayfish. The chosen pH value and the voluntary
lack of phosphate ensured high levels of U bioavailability. During the acclimatization period,
crayfish were fed every 48 h on a diet of corn and mussels and then starved for 48h before the
beginning of the experiment, in order to avoid fecal matter and uneaten food to bind to U and
therefore decrease metal bioavailability. During the experiment, animals were exposed for 10
days to a wide range of U concentrations: 0 (controls), 0.03, 0.6, 4 and 8 mg/L of U (from DU
stock solution: UO2(NO3)2, 6H2O, 1g/L). The ionic concentrations of the medium (mainly
NO3-) were adjusted for each condition of exposure to remain constant after U addition. U
speciation in contaminated waters was simulated using the geochemical speciation software J-
CHESS (Java Chemical Equilibrium with Species and Surfaces, Van der Lee, 1998). Groups
of 10 crayfish were placed in each treatment tank with 6L of test solution and so were
submerged to 3 times their height following ASTM E729-96 recommendations. Half of the
water column was renewed manually each day in order to maintain stable water composition
and contamination levels. The concentrations of U in water were measured before and after
renewal and adjusted to assure mean values significantly close to nominal contamination
levels (Table 15). The ASTM standard guide lines for conducting acute toxicity tests on
macroinvertebrates were respected (ASTM E729, 1996). Thus, the temperature was
maintained at 17.2 ± 0.4°C. Several abiotic parameters were monitored daily throughout the
exposure, including dissolved oxygen (73.6 ± 12.4 % O2), pH (7.01 ± 0.24), conductivity
(602.4 ± 25.9µS), and water concentration of ions (NO3-, NO2-, Cl-, SO42-, PO43- byICS-3000;
Ion Chromatography System).The ionic concentrations did not differ significantly from the
optimum concentrations mentioned above. Each crayfish was kept in an individual chamber
(cylinder made from plastic netting (1 cm mesh, 11 cm diameter) to avoid cannibalism.
Crayfish mortality was regularly checked each day.
167
Table 15: Nominal and measured U (mg/L) concentrations in water throughout the
experiment (n=20).U bioaccumulations (µg /g DW, mean ± SEM, n= 4 to 5 in each
treatment condition) in gills and in hepatopancreas of the crayfish Procambarus clarkii
after 4 and 10 days exposure to U (0.03 to 8 mg/L).
Nominal U Measured U bioaccumulation U bioaccumulation in
concentrations Uconcentrations in gills (µg/g DW) hepatopancreas (µg/g DW)
in water in water
(mg/L) (mg/L) T4 T10 T4 T10
0.30 ± 0.15 0.56 ± 0.10 0.29 ± 0.05 0.15 ± 0.01
0 0
(n=5) (n=5) (n=5) (n=5) d
152.87 ± 27.7 129.96 ± 9.00 2.84 ± 0.60 1.15 ± 0.60
0.03 0.033 ± 0.003
(n=4) (n=4) (n=4) a (n=4) d *
603.90 ± 94.00 570.94 ± 107.40 6.73 ± 2.00 10.48 ± 2.80
0.6 0.630 ± 0.060
(n=4) (n=5) (n=4) ab (n=5) e
3950.50 ± 770.00 8483.49 ± 2250.00 21.43 ± 9.30 14.13 ± 4.00
4 3.95 ± 0.14
(n=5) a (n=5) b (n=5) bc (n=5) ef
8005.30 ± 2370.00 12345.74 ± 5403.00 30.39 ± 14.00 78.78 ± 31.20
8 8.34 ± 2.5
(n=4) a (n=5) b (n=4) c (n=5) f *
(a,b,c,d,e,f)
Means of each sampling time designated with the same letters are not significantly different (P> 0.05).
(*)
Significant difference between the bioaccumulation at day 4 (T4) and day 10 (T10) (P< 0.05).
2.2. Tissues sampling and preparation

At days 4 (T4) and 10 (T10), 4 to 5 live crayfish were sampled from each tank and
sacrificed (Table 15). The hepatopancreas and gills were collected from each individual and
divided into 3 parts. Two parts were stored at -80°C for further bioaccumulation and genetic
analyses. The third part was directly prepared for microscopic analyses.
2.3. Metals quantification

Water samples from each tank were acidified using nitric acid (3.1 mM of HNO 3) prior to
analysis of metal content using inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry
(ICP-AES Optima 4300DV, PerkinElmer, Wellesley/USA; detection limit: 10µg/L ± 10%).
Hepatopancreas and gill samples were first dried at 45˚C for 2 days, then digested in 3ml of
HNO3 (15.5 M) for 90 min at 95°C, and then left to dry for 60 min at 105°C. 2ml of H 2O2
(33%) were added afterwards to complete the digestion and left to dry again for 20 min at
105°C. Samples were finally dissolved in acidified water (3.1 mM of HNO3) before analysis.
Samples were analyzed for the highest U concentrations using ICP-AES and inductively
coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS Agilent 7500 Cs; quantification limit: 10 ng/L ±
7%) for the lowest concentrations. Some samples were analyzed using both ICP-AES and
ICP-MS techniques to confirm that there were no significant differences between both
analytical methods.
168
2.4. Histochemical and histological methods
Fresh tissues were fixed with 2.5% glutaraldehyde in 0.1M sodium cacodylate buffer (pH
7.4) for 48 h at 4 °C (Lerebours et al., 2010), then washed 3 times for 5 min with 0.1M
sodium cacodylate buffer (pH 7.4), and then post-fixed with 1% osmium tetroxide in the same
buffer for 1 h. Samples were subsequently dehydrated with successive baths of ethanol and
propylene oxide, and finally embedded in Epon 812 (TAAB). Samples were cut in semi-thin
sections of 200 to 500 nm for light microscopy analysis. Semi-thin sections stained with
aqueous blue toluidine were observed under a light microscope (Leica, DM 750) and
images were saved using a Leica camera ICC50 and LAS EZ software. Ultra-thin sections of
80 and 140 nm were performed for Transmission Electron Microscope (TEM) observation
and Energy Dispersive X-ray (EDX) detection respectively. All sections were obtained using
an ultramicrotome (UCT, Leica). Ultra-thin sections were mounted on copper grids and
observed with a Scanning Transmission Electron Microscope(TEM/STEM, Tecnai G2
Biotwin, FEI company), equipped with a CCD camera (Megaview III, Eloise). Several
different subcellular structures were analyzed using the EDX analyzer equipped with a Super
Ultra Thin Window (SUTW) model sapphire (EDAX), using an accelerating voltage of 100
KeV, in order to investigate the accumulation of U in the different structures. The electron
probe was then focused on specific spots and spectra were recorded after 30 s of analysis. For
each replicate organ, at least 30 micrographs of local detailed structures were taken.
2.5. Genetic analyses

2.5.1. Total RNA extraction and reverse transcription of RNAs
Total RNA were extracted from 20 to 40 mg of tissue using the “Absolutely RNA
Miniprep kit” (Agilent), according to the manufacturer's instructions. First-strand cDNA was
synthesized from total RNA (3µg) using the Stratascript First-Strand Synthesis System
(Agilent) according to the manufacturer's instructions. The cDNA mixture was stored at
−20 °C until needed.
2.5.2. Cloning and sequencing of mt and atp6 genes

To obtain a partial coding sequence for metallothionein and ATP synthase subunit 6,
primers were deduced from alignment of corresponding sequences available in libraries from
different phylogenetically related species (preferentially crustaceans) using Clustalw software
(Table 16). These primers deduced from conserved sequences, were then used on cDNA in
169
PCR experiments (50 amplification cycles at 95°C for 1 min, 48°C for 1 min and 72 °C for1
min). PCR products were cloned into pGEM-T-easy Vector System (Promega) with T4 DNA
ligase. Competent Cells (Promega) were transformed with 3 µl of the ligation mixture.
Positive transformants were selected on ampicillin-containing medium (Luria Broth: 5 g/L of
yeast extract, 10 g/L of bactotryptone, 10 g/L of NaCl supplemented with 100 µg/mL
ampicillin) and recombinant vectors were then purified and sequenced. Partial genes
sequences were determined by Millegen Biotechnologies (La-bège, France) and were
validated by comparing their similarity to other genes in GeneBank using Blastp and Blastn
software (National Center of Biotechnology Information, Bethesda, MD, USA). mt was
registered in GenBank under the accession number GU220368.1 and atp6 under GU220369.1.
Table 16: Gene names, primers deduced from alignment of corresponding sequences
from different species and their accession numbers.
Gene Primers (5'-3') Accession number

ATP syntase subunit 6 (atp6) CGATTGGCAGCAAATATAATTGC (a) Cherax destructor AY383557
ATGATTGCAACGGCAGATTCTA (b) Pseudocarcinus gigas NC006891
Cherax setosus AY153876
Panaeus notialis X84350
Euphausia superba AB084378
Metallothionein (mt) GAGTGTGCCGAGGGCGGGTG (a) Portunus pelagicus AY057395
GCAGGGCTTGGAGCAGGTCTTG (b) Homarus americanus AJ401298
Pacifastacus leniusculus AF199482
(a)
2.5.3. Real-time quantitative PCR

Real-time PCR reactions were performed in a Light Cycler (Roche) following the
manufacturer's instructions using the DNA intercalating dye SybrGreen I. The amplification
program consisted of one cycle at 95 °C for 10 min followed by 50 amplification cycles at
95°C for 5 s, 60°C for 5 s, and 72°C for 20 s. Specific primer pairs used to determine target
gene expression levels are listed in table 17. PCR specificity was determined for each
reaction from the dissociation curve of the PCR product. This dissociation curve was obtained
by following the SybrGreen fluorescence level during a gradual heating from 60 to 95 °C.
Relative quantification of each gene expression level was normalized according to the
expression of the housekeeping gene 18S gene. Relative expression of a gene was calculated
using the 2−ΔCT method as described by Livak and Schmittgen (2001) where ΔCT represents
the difference between the cycle threshold of a specific gene and the cycle threshold of the
18S gene. Therefore, the Expression factor (EF) of each gene compared with control
corresponds to the following equation: EF=2- ΔCT(Treatment)/ 2- ΔCT(Control).
170
Table 17: Gene names, accession numbers and specific primers pairs used in the
quantitative PCR analysis of the 6 studied genes of P. clarkii.
Gene Primers (5'-3') Accession number

Cytochrome C oxydase subunit 1 AATGGGATACCTCGACGTTATTCA (a) AY701195.1
(cox1) GCAGGAGGATAAGAATGCTGT (b)
ATP syntase subunit 6 (atp6) GGCAGCAAATATAATTGCTGG (a) GU220369.1
TTGCAACGGCAGATTCTAATAT (b)
Ribosomal RNA 12 S (12s) ACTAGAATATTAGGAGTTATGTTCTT(a) EF012280.1
GCTGCACCTTGATCTAATATAC (b)
Manganese Superoxyde dismutase GCCACCACTAAAATACGAGTA (a) EU254488.3
Sod(Mn) CCATTGAACTTTATAGCTGGTA (b)
Metallothionein (mt) CGAGGGCGGGTGCAAGACT (a) GU220368.1
CTTGGAGCAGGTCTTGGCAC (b)
18S ribosomal RNA(18s) GCAATAACAGGTCTGTGATGCC (a) X90672.1
(a)

Results are given as means ± the standard error of the mean (SEM). All analyses were
done using the R language and environment for statistical computing (R Development Core
Team, 2009). For all statistical results, a probability of P< 0.05 was considered significant.
Survival rate was calculated using Kaplan Meier’s estimator (Kaplan, 1983). This method
estimates the fraction of living organisms for a certain period of time after treatment and takes
into account "censored" data (i.e. crayfish lost due to sampling at T4 before the final outcome
was observed at T10). To determine whether there is or not a significant effect of contaminant
concentrations on survival rates, a regression using Weibull distribution was performed. The
significant effects of factors such as time and metal concentrations in water on
bioaccumulation were analysed using analysis of covariance (ANCOVA), after checking
assumptions of normality and variance homogeneity of residuals. The assumption of
normality was checked visually using a quantile-quantile plot (QQplot) of standardized
residuals versus normal quantiles. The assumption of variance homogeneity was checked on
residuals using standardized residuals versus a fitted plot (Faraway, 2002). When the
assumptions were not satisfied, a logarithmic data transformation was applied. If significant
effects were detected, Tuckey’s multiple comparison test was used to determine whether
means between pairs of samples were significantly different from one another. The
relationships between metal concentration in organs, and gene expression levels of each
individual were investigated using the non-parametric Spearman rank correlation test due to
the non-linearity of the data.
171
3. Results
3.1. Survival rate
No mortality was recorded in the control group (0 mg/L). Increasing U concentrations had
no significant effect on crayfish survival (P= 0.0794) (Figure 65). 100% survived exposure to
4 mg/L of U at T10 whereas 80% survived exposure to 0.03 mg/L of U. After 10 days of
exposure to 0.6 and 8 mg/L of U, only 10% of the crayfish died.
0,8
Survival rate
0,6
0,4
0,2
0
0 50 100 150 200
Tim e of exposition to U (h)
0 & 4 mg U/L 0.03 mg U/L 0.6 mg U/L 8 mg U/L
Figure 65 : Kaplan-Meier’s presentation of the survival rate of Procambarus clarkii

exposed to U during 240 h of exposure
3.2. U bioaccumulation in crayfish organs

The results of U accumulation in the gills and hepatopancreas at T4 and T10 are shown in
table 15 and expressed in dry weight (DW). Within the control group, U levels were less than
0.6 µg/g DW. As U concentrations in water rose, accumulation of the metal in the gills rose
from 100 to 12000 µg/g, and accumulation of U in the hepatopancreas ranged from 1 to 80
µg/g. A high correlation was found between U bioaccumulation in organs and the
concentrations of U in the test water (gills: Spearman coefficient R= 0.94, P< 2.2 10-16;
hepatopancreas: Spearman coefficient R= 0.88, P= 3.47 10-15). At each time tested U
concentrations in gills were significantly different when compared between each other (P<
0.05), except between the concentrations in gills exposed to 4 and 8 mg/L of U (P= 0.2 at T4
and P= 0.92 at T10). A dose dependency of U bioaccumulation was also observed in the
hepatopancreas. U accumulation was not significantly time dependent (P= 0.069) in gills, yet
there was a significant difference between U concentrations in the hepatopancreas of crayfish
exposed to 0.03 and 8 mg/L of U (P< 0.05) at T4 and T10. Concentrations of U were
considerably higher in gills than in hepatopancreas at T4 as well as at T10 (T4: P= 4.9 10-13;
T10: P= 1.5 10-6).
172
3.3. U localization and histological alterations
Histological localization of U using TEM-EDX showed flake shaped residues of U, co-
localized with phosphorus in the gill epithelium after 10 days of exposure (Figure 66).
Distinct alterations of the tissue structure could be discerned best in the hepatopancreas after
10 days of contamination (Figure 67). The epithelium of several tubules showed numerous
pathologically altered cells with cytoplasmic vacuoles. Epithelial organization of cells was
lost because cell walls were disintegrated. Degenerated tubules were also observed at high
levels of U contamination. However, this phenomenon was confined to individual tubules and
did not affect the entire digestive gland, so some intact glandular epithelium was present even
at high concentrations of exposure.
Counts Cu
Cu
Os
P U
Os
2.10 4.10 6.108.1010.10 12.10 14.1016.10

Energy(KeV)
Figure 66: Transmission electron micrographs coupled with energy dispersive X-ray
results of P. clarkii gills exposed for 10 days to 4 mg/L of U. Elements detected in matrix:
O: oxygen, Os: osmium and Cu: copper. Elements detected in gills epithelium: U:
uranium and P: phosphorus. (Ex M) extra-cellular matrix, (C) cuticle, (G ep) gill
epithelium.
173
L V
B
R
50 nm
50 nm
1 50 nm
3 DE
2
DE V
T
DT LD
50 nm
4
Figure 67: Histopathological alterations in P. clarkii hepatopancreas tubules after 10
days of exposure to dissolved heavy metals: (1) control; (2) 0.6 mg/L U; (3) 4 mg/L U; (4)
8 mg/L U. (R) absorptive cells. (B) secretory cells. (L) lumen. The pathologies observed
were: (V) vacuolization; (T) thinning of the epithelium; (LD) lumen dilatation; (DE)
disorganized epithelium; (DT) degenerated tubule. Magnification x 40.
3.4. Gene expression levels

In contaminated gills, the cox1 gene was repressed tardily in the three highest U conditions
(Table 18). The atp6 gene was over-expressed at T4 at the two lowest U exposure levels, and
at T10 when exposed to 8 mg/L of U. The expression levels of the 12S, mt and sod(Mn) genes
decreased at T4 and then increased at T10.
Contaminated hepatopancreas showed the most pronounced changes at the lowest U
concentration tested. Indeed, at 0.03 mg/L the expression levels of atp6,12S and mt were
increased at T4 but returned to basal level at T10. In contrast, cox1 and sod(Mn) remained
unchanged at T4 and were repressed at T10. No significant variations were observed for most
of the genes in the hepatopancreas when exposed to 0.6 mg/L, except for the atp6 gene at
T10. At 4 mg/L an over-expression was observed at T4 for cox1 and 12S, while reduced
expression levels appeared at T10 for the 12S and the sod(Mn) genes. At the highest U
exposure level, only cox1 and sod(Mn) were repressed at T4, as well as 12S at T10.
174
Table 18: Expression’s factors (EF) of the 5 genes studied in P. clarkii compared to the
basal level of controls (n= 4 to 5 in each treatment condition).
U treatment cox1 atp6 12s sod(Mn) mt

Organs condition (mg/L) T4 T10 T4 T10 T4 T10 T4 T10 T4 T10
Gills 0.03 / / 55 / -2 / -3 / -3 3
0.6 / -3 3 / -7 / -2 2,5 -5 17
4 / -2 / / -7 / / 6 -4 32
8 -3 -2 / 3 -10 -2,5 / / -6 5
Hepatopancreas 0.03 / -7,5 64 / 2 / / -5 2 /
0.6 / / / 10 / / / / / /
4 2 / / / 2 -2,5 / -3 / /
8 -5 / / / / -3,5 -2 / / /
(/)
significant.
3.5. Gene expressions vs bioaccumulation

A correlation between gene expression levels and metal bioaccumulation were assessed
without taking into account any possible variations in molecular responses which might
depend on the type of organs and the period of exposure (Figure 68). Thus, for every
sampling time, the bioaccumulation of U in each organ of each individual was associated with
the genes expression levels which pertaining in that same organ. In both studied organs the
cox1 gene expression level was negatively correlated with U concentration in organs
(Spearman coefficient R= -0.48, P= 1.2 10-5). Moreover, the down-regulation of sod(Mn)
appeared to be highly correlated with U bioaccumulation in gills and hepatopancreas
(Spearman coefficient R= - 0.3, P= 0.021).
0,6 U
Spearman coefficient (r)
0,4
0,2
0
-0,2
-0,4
*
-0,6
cox
1
atp
6 12
s
(M
n) mt
** sod
Figure 68: Spearman correlation coefficients (r) between U concentrations in organs and
gene expression levels of the 5 genes studied (n= 4 to 5 in each treatment condition). (*)
P<0.05. (**) P<0.005.
175
4. Discussion
4.1. Effects on survival rate
The follow-up of the crayfish mortality showed that Procambarus clarkii was highly
resistant to U toxicity since no significant mortality was observed even at the highest
concentrations of exposure. The 10 days U LC50 in our experimental conditions (pH 7) is
probably higher than 8 mg U/L and confirms the resistance capacity of this species to the
tested metal. Few ecotoxicological data concerning the effects of U on aquatic invertebrates
are available in the literature, and to our knowledge the U LC50 values of crustaceans are
limited to those of micro-organisms (Poston et al. 1984; Kuhne et al. 2002; Sheppard et al.
2005; Zeman et al. 2008). Some laboratory studies have shown that the toxicity of U
decreases as pH, conductivity and alkalinity of the water increases (Markich et al. 2000;
Poston et al. 1984; Zeman et al. 2008). Zeman et al. (2008) confirmed that the 48h-LC50 of
Daphnia magna varied from 0.390 ± 0.040 mg/L at pH 7 to 7.8 ± 3.2 mg/L at pH 8. The U
48-hr LC50 of this same species in Columbia River water (with high levels of organic matter)
was 6 mg /L at pH 7.9- 8. Acute toxicity diminished by a factor of 7.5 as mean water hardness
and alkalinity values increased (Poston et al. 1984). The bioavailability and toxicity of
uranium are closely linked to its chemical speciation in solution. Metal uptake and toxicity
normally vary as a function of the concentration of the free-metal ion in solution (Niyogi and
Wood, 2004). The influence of pH is twofold: on one hand, increasing pH results in enhanced
complexation of the uranyl ion by hydroxides and carbonates, hence reducing its
bioavailability; on the other hand, the decrease in competing protons can increase uranyl
bioavailability (Fortin et al. 2007). These considerations led us to conduct our experiments in
synthetic water, which provides a compromise between the conditions necessary for healthy
crayfish physiology and good U bioavailability. The capacity of crayfish to tolerate exposure
to high levels of U could allow the use of this species as a bioindicator of a large range of
contamination levels.
4.2. Accumulation
Elevated concentrations of U in organs were observed despite the low mortality rate. It is
difficult to understand how high levels of U can be tolerated by crayfish without increased
mortality without knowing how toxic metals are distributed at the sub-cellular level in their
tissues (Perceval et al., 2006). Our TEM observations led to the detection of piles of flake
shaped U inside the gill epithelium. This form of U was mainly co-localized with phosphorus
which is insoluble and non-toxic. U detoxification mechanisms have been described by
176
Chassard-Bouchaud (1982) in the crayfish Pontastacus leptodactylus and in the bivalve
Corbicula fluminea by Simon et al. (2011). These authors found that U was stored in
spherocrystals and in lysosomes as a complex with phosphates. Granules containing heavy
metals have been found in epithelial cells of invertebrates. These granules may contain either
calcium or heavy metals such as zinc, copper or iron, complexed with sulfur or phosphorus
(Ahearn et al., 2004). Identical results have been observed in Astacus astacus after direct
exposure to aluminum (Fjeld et al., 1988). Subsequent cellular exocytotic events may extrude
these concretions from the cell as part of an excretory mechanism (Ahearn et al., 2004;
Marigómez et al., 2002). However, in the case of radionuclides, high levels of U (an alpha
emitter) even in precipitated forms could have radiotoxic effects. U bioaccumulation in organs
was dose-dependant since U concentrations in tissues were highly correlated with those in
water (Spearman coefficient R= 0.9 in gills; R= 0.8 in hepatopancreas; P< 0.05). There was a
tendency for metal bioaccumulation to increase with time both organs. Crayfish were able to
rapidly bioconcentrate the contaminant in their tissues (high BCF: e.g.BCF gills-8 mg U/L~
832). Nevertheless, metal concentrations in the gills were higher than those in the
hepatopancreas. Moreover, the bioaccumulation tended to stabilize after exposure to 4 mg/L
of U. The gills are in direct contact with the medium which normally results in both
adsorption and internalization of toxic metals. Adsorption of U on the cuticle could explain
the high accumulation levels, even though the MET and EDX analyses did not show such a
mechanism. High metal concentrations in water increase the occurrence of interactions
between U and conveyors located in the gills epithelium, so it is possible that a high metal
adsorption occurred and could have saturated the sites of entrance of the metal resulting in a
stabilization of the bioaccumulation.
4.3. Histopathological effects

The histological observations revealed information about U effects on another level of
biological organisation and helped better understand the toxicological profile of U. The extent
of the histopathological damage was in line with the bioaccumulation of U determined in the
soft tissues and appeared to be dose-dependent, as evidenced by the increasing vacuolization
and the tendency of the epithelium to disintegrate, and the tubules to degenerate. U exposure
induces a variety of histological impairments in fish (Barillet et al., 2010; Cooley and
Klaverkamp, 2000). The whitefish Coregonus clupeaformis showed significantly altered
hepatocyte morphometrics, hepatocyte necrosis and alterations of bile ductile epithelium
when fed U-contaminated diet (Cooley and Klaverkamp, 2000). Vacuolization in hepatic cells
177
of the juvenile northern pike Esox lucius resulting from contamination with U have also been
reported (Kelly and Janz, 2009). Even though U concentrations in our experiment did not lead
to significant mortality of crayfish, severe histological damages were observed and could be
used as biomarkers of U contamination.
4.4. Molecular responses

The study of gene expression levels helps understanding uranium’s mechanisms of
toxicity and then enables the determination of good biomarkers of contamination. The
molecular responses suggested that mitochondria were affected by the presence of U in both
organs. Gene expression levels were less altered in hepatopancreas than in gills, this could be
due to the lower levels of U in the hepatopancreas. U had a considerable effect on the
cytochrome c oxidase (complex IV) since a significant relationship was observed between U
concentrations and cox1 gene repression (Figure 68). The correlation between U
concentrations in organs and sod(Mn) gene repression was also dose-dependent. Moreover,
the down-regulation of cox1 gene was significantly correlated with sod(Mn) (Spearman
coefficient R= 0.6 ; P< 0.001). It is well known that in the absence of any contamination,
mitochondria are the main source of ROS in the cell (Wang et al., 2004). Thus we can
hypothesize that with the impairment of the mitochondrial metabolism, ROS levels decreased
which led to the repression of sod(Mn) gene. Recent experiments on zebrafish Danio rerio
have shown that the presence of extremely low concentrations of U in the organs could also
result in an impact on the expression of genes involved in resisting oxidative stress and in
mitochondrial metabolism (Lerebours et al., 2010; Lerebours et al., 2009). Over-expression of
the atp6 gene could be explained by two different mechanisms. The first possible explanation
is that mitochondria produced more ATP synthase to create enough ATP to maintain cell
viability and compensate for the impairment of the complex IV. However in the literature it is
more common to find that the gene expression of atp and cox follows the same pattern. For
example, in the eel Anguilla Anguilla Cd caused a decrease in both cox1 and atp6-8 genes
expression levels when exposed for 14 days to 2 and 10 µg/L of Cd (Pierron et al., 2007). At
high levels of exposure to U, a second explanation for the increase of the expression levels of
atp6 gene could be linked to a change in the classic mitochondrial metabolism. It is known
that in some pathological conditions, the complex V can show a “reverse” mechanism. When
the complex IV is inhibited, the proton transfer form the mitochondrial matrix to the
periplasmic space decreases. A severe decrease of the proton gradient leads to a decrease of
the mitochondrial inner membrane potential which stimulates the functioning of ATPase in an
178
unusual manner. In this case, the complex V can reverse itself and hydrolyse ATP to pump
protons back to the periplasmic space (Nevière, 2008; Wang and Oster, 1998). We can
therefore hypothesise that the mitochondria produced enough ATPase to compensate for the
decrease of the electrochemical gradient. Expression levels of the 12s gene indicated that cells
were struggling against the toxicity of U by increasing the numbers of mitochondria to make
up for those which were not functioning correctly. Metallothioneins are characterized by an
important proportion of cysteinyl residues, which serve as ligands for metal chelation (Amiard
et al., 2006; Martín-Díaz et al., 2006) but can also trap reactive oxygen species (ROS) (Fang
et al., 2010; Viarengo et al., 2000). The mt gene was more expressed at T10 than T4 in all
exposure conditions. This could be linked to the natural presence of a sufficient concentration
of MT proteins at the beginning of the exposure. In the presence of large quantities of MT (ex
T10), cells could increase the numbers of their mitochondria since this protein can efficiently
trap the ROS. Consequently cells could reduce their effort in producing ATP synthase (atp6
less up-regulated at T10). The significant up-regulation of the mt gene in the gills at T10
demonstrates that U can generate an important oxidative stress when the organs present high
U accumulations. These results agree with previous studies that have shown oxidative stress
in fish afterexposure to waterborne U (Barillet et al., 2007; Barillet et al., 2011). Information
on MT response in the presence of U is scarce. Cooley and Klaverkamp (2000) found no
increase of MT concentration in the liver of U contaminated fish except for the highest trophic
exposure (10 mg U/g) at day 10. A recent study showed that in the presence of MTs the
percentage of nematode Caenorhabditis elegans mortality, decreased when exposed to
different concentrations of depleted U (Jiang et al., 2009). However, the exact mechanism by
which MTs afford nematodes protection to U exposure remains unclear.
5. Conlusions
Mitochondria appear to be cellular targets for U. The impact on these organelles was
evident from the alteration of mitochondrial gene expression levels. Impairment of the
mitochondrial metabolism was accompanied by alterations in the expression levels of genes
involved in responses to oxidative stress and was followed by histological damage. The study
of gene expression levels could be a promising tool for evaluating stress due to U exposure.
Procambarus clarkii bioaccumulated U rapidly and was highly resistant to the contamination.
It could therefore be a good candidate for use as a bioindicator of U pollution and in
ecological risk assessments. Evaluation of U concentrations in sub-cellular fractions is also
necessary to accurately highlight the distribution of U inside the cell. Further research is also
179
needed to better understand the impairment of the mitochondrial chain reaction.
Measurements of ATP levels, oxygen consumption, ROS production in the cells, and
evaluation of enzyme activities involved in oxidative stress responses could clarify the effect
of U on ATPsyntase.
Acknowledgments
The authors would like to thank Dr F. Coppin for J-CHESS simulations, N. Gauthier for
providing the crayfish, B. Geffroy for his assistance in dissecting P. clarkii, S. Pierrisnard for
ionic chromatography measurements, I. Cavalie for her help in U measurements, C. Della-
Vedova for helping in statistical analysis and R. Al kaddissi for his proofreading support. This
study was supported by the ENVIRHOM research program funded by the institute of
Radioprotection and Nuclear Safety and co-financed by the CNRS.
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185
Chapitre IV-B
Effets de l’uranium sur les réponses

moléculaires chez l’ecrevisse P. clarkii
après une exposition chronique :
Les enseignements à tirer.
186
Effects of uranium on crayfish Procambarus clarkii mitochondria and antioxidant
responses after chronic exposure: what have we learned?
Simone Al Kaddissi1;2, Alexia Legeay2, Antonia Concetta Elia3, Patrice Gonzalez2,Virginie
Camilleri1, RodolpheGilbin1, and Olivier Simon1.
1
2
Laboratory of Aquatic Ecotoxicology, University Bordeaux1/UMR CNRS 5805, Dr Peyneau
square, 33120 Arcachon, France.
3
187
Abstract
We examined the impacts of Uranium (U) on mitochondria and on the response of
antioxidants in the gills and the hepatopancreas of crayfish Procambarus clarkii after long-
term exposure (30 and 60 days) to an environmentally relevant concentration (30 µg U/L).
The expression of mitochondrial genes (12s, atp6, and cox1), as well as the genes involved in
oxidative stress responses (sod(Mn) and mt) were evaluated. The activities of antioxidant
enzymes (SOD, CAT, GPX, and GST) were also studied. U accumulation in organs induced
changes in gene expression. The evolution of these transcriptional responses and differences
between gene expression levels at high and low doses of exposure were also discussed. This
study demonstrated that, after long-term exposure, U caused a decrease in antioxidant
activities and induced oxidative stress. A possible ROS-mediated U cytotoxic mechanism is
proposed. Expression levels of the investigated genes can possibly be used as a tool to
evaluate U toxicity and seem to be more sensitive than the enzymatic activities. However a
multiple biomarker approach is recommended as the perturbed pathways and the mode of
action of this pollutant are not completely understood.
Keywords: uranium, mitochondria, oxidative stress, gene expression levels, antioxidants,

biomarkers
188
1. Introduction
Uranium (U) is a ubiquitous environmental trace metal, often found in water supplies as a
non-essential inorganic component (Bleise et al. 2003). Concentrations in freshwater
ecosystems are highly variable and range from 0.01 µg/L to over 12.4 mg/L, depending on the
geological background (Salonen 1994; WHO 2001). U may occur in different oxidation
states, the major forms being U(VI) in oxic water, and U(IV) in anoxic water (Markich 2002).
In addition to its natural occurrence and distribution in the environment, U has also several
civilian and military applications that could cause its dispersion and increase its abundance in
environmental compartments (Bleise et al. 2003). These anthropogenic activities include the
use of phosphate fertilizers, various mining activities, and the industrial processing of U —
including the use of depleted U— for the manufacture of nuclear fuel and other products
(ATSDR 1999). Depleted U (DU) is artificially obtained as a by-product of the U enrichment
process and is about 60% less radioactive than natural U, which is considered a weakly
radioactive element. Depleted U, however, retains all the chemical properties of natural U
(WHO 2001). Thus, effects from exposure of biota to either natural U or DU are usually
attributed to their chemical toxicity (ASTDR 1999). Nevertheless, the mechanisms by which
this metal induces its toxicity have not been sufficiently investigated (Pourahmad et al. 2006;
Barillet et al. 2007; Al Kaddissi et al. 2011). A greater knowledge of interactions between U
and living organisms is needed in order to select pertinent biomarkers that could be used in
ecological risk assessments. Certain studies have shown that this radioelement is able to
chemically activate oxygen species in the course of redox reactions via the redox chemistry of
transition metals (Miller et al. 2002; Yazzie et al. 2003). Moreover, Jones et al. (2003) stated
that since U is an alpha-emitting radioactive element (WHO 2001; Taulan et al. 2004) it can
enhance the production of free radicals via the ionization phenomenon induced by alpha
particle emissions. High quantities of free oxygen species (generated within cells) sometimes
exceed the cell’s protective controllability, resulting in damage to cell proteins, nucleic acids
and lipids (Labrot et al. 1996; Barillet et al. 2007; Lourenço et al. 2010). In a previous study,
carried out in our laboratory, we demonstrated that U alters the expression of some
mitochondrial genes (atp6, cox1, 12S) and genes involved in oxidative stress responses
(sod(Mn), mt) in Procambarus clarkii after short-term exposure (4 and 10 days) to 30 µg/L
(Al Kaddissi et al. 2011). We supposed that this radioelement can generate oxidative stress.
Further experiments were, however, required to improve our understanding of the effects of U
on P. clarkii and to choose potential markers of U toxicity. Thus evaluation of the responses
of the selected biomarkers after long term exposure was needed. It was also necessary to
189
investigate the responses of the classic major indicators of oxidative stress such as superoxide
dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPX) and glutathione S-
transferase (GST). Since the genes of P. clarkii that encode for these antioxidants have not
been sequenced, the investigation of oxidative stress induction had to be done by following
the enzymatic activities. It is established that P. clarkii is a cosmopolitan species (Gherardi
2006), relatively static, easily captured, bioaccumulates U (Al Kaddissi et al., 2011) and
adults provide sufficient tissue for individual analyses. The use of this species as a biological
model is therefore of great interest. In our current work the expression levels of mitochondrial
genes (12s, atp6, and cox1) and genes involved in oxidative stress responses (sod(Mn) and mt)
were evaluated and the enzymatic activities of antioxidants (SOD, CAT, GPX, and GST)
were studied after 30 and 60 days exposure to 30 µg U/L. The concentration of U that we
selected is within the range commonly found close to drill wells (Kurttio et al. 2006) and
mining sites (e.g. 20 µg/L) (Simon and Garnier-Laplace 2005). It is also double the World
Health Organisation provisional drinking water guideline (15 µg/L) (WHO 2004) but equal to
the recommended levels of the USEPA promulgated in 2000 (EPA, 2000). Gills and
hepatopancreas were collected after various periods of exposure to assess the different
biological parameters and U bioaccumulation levels were studied in parallel. Comparisons
between gene expression levels after short-term (4 and 10 days) (Al Kaddissi et al. 2011) and
long-term exposures, and after high and low levels of contamination, were conducted. This
approach helps identify possible changes in the mechanisms of action of U over time, and
helps gather information to choose appropriate biomarkers of U contamination. The
opportunity was also taken to link the antioxidant responses to the mitochondrial dysfunction.

2.1. General experimental protocol
Adults inter-moult Procambarus clarkii males were used in this study (23.55 ± 1g fresh
weight; 8.96 ± 0.11cm from cephalothorax to telson; n=30). These were obtained from the
Vigueirat swamp of Camargue, France (GPS coordinates: 43°31.863’N- 4°45.417’E).
Crayfish were acclimatized to experimental conditions for 3 weeks under a 12/12h light/dark
photoperiod at 17± 1°C while submerged in synthetic water equilibrated by means of air
bubbling (water composition: Ca²+ =1640; Mg²+ = 500; Na²+ = 870; K+ = 80; Cl- =4100; SO42-
=509; NO3- =76.5; HCO3- = 281 all in µmol/L; pH 6.6 ± 0.3). The artificial water
composition, the pH value (6.5), and the voluntary lack of phosphate were chosen as a
compromise to ensure abiotic conditions that satisfied the physiological needs of crayfish(Al
190
Kaddissi et al. 2011) and to optimise U bioavailability (Fortin et al. 2007; Fortin et al. 2004).
Speciation of 30 µg/L of U in the synthetic water at pH 6.5 was simulated using the
geochemical speciation software J-CHESS (Java Chemical Equilibrium with Species and
Surfaces, Van der Lee, 1998). Based on this simulation 0.7% of UO22+ and 4.6% of UO2OH+
were present in the medium. These forms of U are known to be the most bioavailable species
to aquatic organisms (Markich 2002, Fortin et al. 2004, 2007). The dominant species under
these conditions were (UO2)2CO3(OH)3- (42 %) and UO2CO3(aq) (25.7 %), which can be
accumulated by organisms (Denison 2004). Commercial trout pellets were fed to crayfish, at
dosages of0.1 g/individual, every 2 days. Nourishment continued during exposure conditions.
During the acclimation and experimentation phases, animals were kept at a maximum density
of 3 crayfish/L. Groups of 10 crayfish were exposed to 0 (control) and 30 µg U/L for 60 days.
The stock solution of U used to contaminate water was prepared from depleted uranyl nitrate
UO2(NO3)26H2O (Sigma, France) and acidified with nitric acid (0.016 M). 25% of the water
column was renewed daily by a continuous flow-through technique. A large volume of each
test solution (0 and 30 µg/L) was prepared once a week and maintained at a constant flow
through the respective tanks containing crayfish. U concentration in the water column was
measured once daily and adjusted, if necessary, to ensure constant contamination pressure.
Temperature and pH were monitored daily, whereas NO3-, NO2-, Cl-, SO42- and PO43-
concentrations were verified twice a week byICS-3000, Ion Chromatography System.
Crayfish were isolated in individual chambers (plastic netting: 1 cm mesh, 11 cm diameter) to
avoid cannibalism. Five crayfish were sampled from each tank at Day 30 (T30) and Day 60
(T60). The hepatopancreas and gills of each individual were collected, split into three parts,
and stored at -80°C for further bioaccumulation, gene expression and enzymatic activities
analyses.
2.2. Uranium quantification

Water samples were acidified by nitric acid (3.1 mM of HNO3) prior to metal
quantification by inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry (ICP-AES
Optima 4300DV, PerkinElmer, Wellesley/USA; detection limit: 10 µg/L ± 10%). Organs
were dried at 45˚C for 2 days and, then digestion was performed in a DigiBLOC 3000
digestion system (SCP Science, Champlain, NY, USA). Thereafter, 3 mL of 15.5 M nitric
acid was added to each organ and was heated for 90 min at 95 °C after which samples were
evaporated in a second heating cycle (60 min, 105 °C). The digestion process was then
completed by the addition of 2 mL H2O2 (33%) followed by evaporation (20 min, 105 °C).
191
Samples were dissolved in acidified water (3.1 mM of HNO3) prior to analysis. ICP-AES was
used to determine the highest U concentrations and inductively coupled plasma mass
spectrometry (ICP-MS Agilent 7500 Cs; detection limit: 10 ng/L ± 7%) to determine the
lowest concentrations. Combined tests, using ICP-AES and ICP-MS techniques, were also run
to validate the assumption that there was no significant difference between results from these
two analytical methods.
PCR
Total RNA was extracted from gills (20–40 g samples) or hepatopancreas (n=5 for each
experimental condition and sampling time) using the “Absolutely RNA Miniprep" kit
(Agilent). First-strand cDNA was synthesized from total RNA using the Stratascript First-
Strand Synthesis System (Agilent). First-strand cDNA was synthesized from total RNA using
the AffinityScriptTM Multiple Temperature cDNA Synthesis Kit (Stratagene). In each of the
above three tests, the techniques were carried out according to the manufacturer's instructions.
The cDNA mixture was stored at −20 °C, until required. The accession numbers of the
studied genes and their function are listed in table 19. For each gene, specific primer pairs
were determined using the LightCycler probe design software (Ver 1.0; Roche). The
amplification of cDNA was monitored, using the DNA intercalating dye SyberGreen I
(Roche). Real-time PCR reactions were performed in a Light Cycler (Roche). The
amplification program consisted of one cycle at 95 °C for 10 min and 50 amplification cycles
at 95 °C for 5 s, 60 °C for 5 s, and 72 °C for 20 s. This dissociation curve was obtained by
following the SyberGreen I fluorescence level during a gradual heating from 60 to 95 °C. For
each amplification, a single peak was observed for all the primer-pairs used, indicating the
amplification of a single product. The amplified cDNAs in the first set of experiment were
analyzed by electrophoresis to verify that amplified fragments were of the expected molecular
weight. Results validated the PCR primers specificity. Primer efficiencies were determined
for each quantitative PCR run by a dilution series. Efficiency was always between 90 and
102%, as classically expected. Relative quantification of each gene expression level was
normalized according to the 18S gene expression, a housekeeping gene. 18S gene was chosen
as the reference gene because of its stability over time and treatment in the experiment.
Relative expression of a gene was generated using the 2−ΔCT method as described by Livak
and Schmittgen (2001) where ΔCT represents the difference between the cycle threshold of a
specific gene and the cycle threshold of the 18S. The comparison of the expression’s factor
192
(EF) of each gene with the control therefore corresponded to the following equation: EF=2-
ΔCT
(Treatment)/2-ΔCT(Control).
Table 19: Genes, accession numbers, specific primers pairs used in the quantitative PCR
analysis of the 6 studied genes of P. clarkii and their function.
Gene Primers (5'-3') Function and accession number

cox1:Cytochrome C AATGGGATACCTCGACGTTATTCA (a)
Encoding for an enzyme in the inner
oxydase subunit 1 GCAGGAGGATAAGAATGCTGT (b)
membrane of mitochondrion that helps
(complex IV). establish a transmembrane gradient of
protons. AY701195.1
atp6:ATP syntase subunit 6 GGCAGCAAATATAATTGCTGG (a) Encoding for an enzyme in the inner
(complex V). TTGCAACGGCAGATTCTAATAT (b) membrane of mitochondrion that uses the
gradient of protons created by other
complexes to synthesize ATP. GU220369.1
12S: Ribosomal RNA 12 S. ACTAGAATATTAGGAGTTATGTTCTT(a) Indicator of the amount of mitochondria in
GCTGCACCTTGATCTAATATAC (b) cells. EF012280.1
Sod(Mn):MitochondrialMn- GCCACCACTAAAATACGAGTA (a) Encoding for an enzyme involved in the fight
Superoxyde CCATTGAACTTTATAGCTGGTA (b) against oxidative stress. EU254488.3
dismutase.
mt: Metallothionein. CGAGGGCGGGTGCAAGACT (a) Encoding for MT protein involved in
CTTGGAGCAGGTCTTGGCAC (b) detoxifying Cd and in the protection against
reactive oxygen species. GU220368.1
18s: 18S ribosomal RNA. GCAATAACAGGTCTGTGATGCC (a) House keeping gene. X90672.1
(a)
2.4. Enzyme activity

Enzyme activity was determined in cellular cytosolic fractions of tissues to assess possible
links between cellular oxidative stress and the dysfunction of mitochondria in the presence of
U. The gills and hepatopancreas of each individual were thus respectively homogenized, in
1:10 and 1:20 weight: volume (W/V) proportions, in ice cold Tris-HCl buffer (100 mM, pH
7.8) containing 100 µM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), 0.008 aprotinin U/ml and
0.1 mg/ml of bacitracin. An aliquot of each homogenate was centrifuged at 15000g for 30 min
at 4°C; supernatants were further centrifuged at 100000g for 1 h at 4°C. All biochemical
analyses were performed with a SOFTmax PRO spectrophotometer at a constant temperature
of 25°C. Total protein content of gills and hepatopancreas (S100 fractions) were determined
using the “Micro BCATM Protein Assay Kit” (Thermo scientific) according to the
manufacturer's instructions. Absorbance was read at 562 nm using a plate reader. CAT
activity was measured by following the decrease in absorbance at 240 nm due to H 2O2
consumption (ε= 0.04 mM-1 cm-1). The assay took place in a Na-phosphate buffer (100 mM,
pH 7) and 12 mM H2O2. Superoxide dismutase SOD was determined spectrophotometrically
193
using the “19160 SOD determination kit” (Fulka) according to the manufacturer's
instructions. Absorbance was read at 450 nm using a plate reader. SOD activity was expressed
as U/mg protein (Prot). GPX activity towards cumene hydroperoxide as a substrate was
determined and oxidation of NaDPH was followed at 340 nm (ε= 6.22 mM-1 cm-1). The assay
condition was as follows: 100 mM Na-phosphate buffer with pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.12 mM
NaDPH, 2 mM GSH, 1 mM DTT, 0.8 mM cumene hydroperoxide, and 1U of glutathione
reductase. GST activity was measured using 1-chloro-2.4-dinitrobenzene (CDNB) as a
substrate and the formation of the conjugate with GSH was followed at 340 nm (ε= 9.6 mM-1
cm-1). The assay condition was as follows: 100 mM Na-phosphate buffer (pH 6.5), 1 mM
GSH and 1 mM CDNB.

Results are given as means ± the standard error of the mean (SEM). Statistical analysis
was performed using the R language and environment for statistical computing (R
Development Core Team, 2009). The significant effects of certain factors (such as time and
metal concentration in water) on bioaccumulation or on enzyme activity were estimated using
analysis of variance (ANOVA) when normality and variance homogeneity assumptions were
satisfied. The normality assumption was checked using a quantile-quantile plot (QQplot) of
standardized residuals versus normal quantiles. The variance homogeneity assumption was
checked on residuals using standardized residuals versus fitted plot (Faraway, 2002). When
the assumptions were not satisfied, a logarithmic data transformation was applied. If the
assumptions were still not satisfied, Kruskal-Wallis non-parametric ANOVA was used. To
assess the link between U concentrations in water and in organs, the correlation coefficient
(R) was calculated using Spearman rank correlation test. The same test was also applied to
compare gene expression levels after short and long periods of exposure. Transcriptional
responses in contaminated organs in the previous study (Al Kaddissi et al. 2011) and in the
current study were correlated with varying exposure periods (4, 10, 30, and 60 days). A
probability of P < 0.05 was considered significant for all statistical results.
194
3. Results
3.1. Experimental conditions
Mortality was not observed during acclimation and metal exposure periods.
Physicochemical parameters such as temperature (16.84°C ± 0.06), pH (pH= 6.24 ± 0.04) and
concentrations of major anions (which were significantly identical to desired concentrations)
remained stable. The measured U concentration in water was equal to 28 ± 0.8 µg U/L (n=60)
and thus not significantly different (P> 0.05) from the nominal concentration (30 µg/L).
3.2. Uranium bioaccumulation

The Uranium concentrations in water were strongly correlated to tissue concentrations in
organs (gills: R=0.87, P= 7 10-6; hepatopancreas: R=0.87, P=3.9 10-7). Concentrations of U in
organs of the control crayfish were extremely low and did not exceed 0.13 µg/g of dry weight
(DW) (Table 20). A significant difference was discerned between U concentrations in
contaminated organs and control animals (Pgills= 1.43 10-5; Phepatopancreas= 4.71 10-6).
Bioaccumulation in these organs in exposed crayfish did not, however, differ significantly
over time. U accumulation levels were eight and four times higher in gills than in the
hepatopancreas at T30 and T60, respectively.
Table 20: U bioaccumulation (µg /g dry weight (DW), mean ± SEM, n= 5 in each
treatment condition) in gills and in hepatopancreas of the crayfish Procambarus clarkii
exposed 30 (T30) and 60 days (T60) to 0 (control) and 30 µg/L of U.
Nominal U U bioaccumulation in U bioaccumulation in

concentrations in gills (µg/g DW) hepatopancreas (µg/g DW)
water (µg/L)
T30 T60 T30 T60
0 0.13 ± 0.01 0.11 ± 0.02 0.05 ± 0.01 0.06 ± 0.01
30 165.70 ± 22.15 155.35 ± 30.89 20.11 ± 6.99 39.91 ± 8.07
3.3. Gene expression levels after long term exposure

Transcriptional responses after long term exposure are presented in table 21. In gills, the
genetic analysis indicated a decrease in the number of mitochondria at T30 and T60 as 12S
gene expression levels decreased. A change in the functioning of the mitochondrial chain
reaction was observed by following gene expression levels of both atp6 and cox1 genes. The
expression of the mitochondrial gene atp6 was altered in the presence of U as this gene was
highly down-regulated at T30 (- 88-fold) and then up-regulated at T60 (8-fold). Gene
expression of cox1 was only up-regulated at the end of the experiment in gills of contaminated
195
crayfish. Expression levels of the sod(Mn) gene seemed to increase with time: this gene was
repressed 3-fold at T30 but was up-regulated 4-fold at T60. The mt gene was repressed in the
gills of crayfish exposed to U during both experimental periods.
Expression levels of the 12S gene in the hepatopancreas decreased about 3.5-fold at T30, then
increased 2.5-fold up at T60. Moreover, the atp6 gene was only 3-fold up-regulated at T60,
while the cox1 and sod(Mn) genes were up-regulated in this organ at both times. No
differences were noted between the expression of the mt gene in contaminated hepatopancreas
and controls at T30. Nevertheless, this gene was 2-fold up-regulated at T60.
Table 21: Expression’s factors (EF) of the 5 studied genes in gills and hepatopancreas of
P. clarkii compared to the basal level of controls (n= 5 in each treatment condition) at
day 30 (T30) and 60 (T60).
12s atp6 cox1 sod(Mn) Mt

Organs T30 T60 T30 T60 T30 T60 T30 T60 T30 T60
Gills -4.5 -2 -88 8 / 2 -3 4 -2 -3.4
Hepatopancreas -3.5 2.5 / 3 4 3 3 3 / 2
(/)
significant.
3.4. Enzyme activity

No significant statistical variation in the activity of either SOD or CAT was discerned in
contaminated organs when compared to controls (Figure 69).A tendency of these enzymes to
deplete can however, be observed in exposed gills at T60. Crayfish exposed to U exhibited a
significant depletion (30 ± 3.4%) in GPX activity in gills at T60, when compared to the
control. A significant decrease in GST activity was also discerned in organs at the end of the
experiment at levels of about 46 ± 3.76% and 48.6 ± 14.33% in the gills and hepatopancreas,
respectively.
196
10 160
140
CAT µmol/min/mg Prot

8
SOD (U/mg Prot)
0-Hp 120
0-Hp
6 U-Hp 100
U-Hp
0-G
80
4 0-G
60
U-G U-G
2 40
20
0
0
30 60
30 60
Time (days)
Time (days)
60 3,5
GPX nmol/min/mg Prot
50 3
GST µmol/min/mg Prot

0-Hp 2,5
40 0-Hp
U-Hp
30
* 0-G
2
* U-Hp
1,5 0-G
20 U-G
1 U-G
10
0,5
*
0
0
30 60
30 60
Time (days)
Time (days)
Figure 69: Enzymatic activities of superoxide dismutase (SOD) (U/mg Prot, mean ±
SEM, n= 5 in each treatment condition), catalase (CAT) (µmol /min/mg Prot, mean ±
SEM, n= 5 in each treatment condition), glutathione peroxidase (GPX) (nmol /min/mg
Prot), and glutathione S transferase (GST) (µmol /min/mg Prot, mean ± SEM, n= 5 in
each treatment condition) in gills and in hepatopancreas of the crayfish Procambarus
clarkii exposed 30 and 60 days to 0 (control) and 30 µg/L of U. The symbol (*) indicates
significant statistical differences between control and treated samples (P<0.05). (0-Hp)
control hepatopancreas. (U-Hp) contaminated hepatopancreas. (0-G) control gills. (U-G)
contaminated gills.
4. Discussion
4.1. Bioaccumulation
Significant concentrations of U in the gills (accumulation factor up to 6) and the
hepatopancreas of crayfish were observed at T30 and T60, despite the low level of U
contamination in water. Al Kaddissi et al. (2011) recorded that bioaccumulation levels of U in
gills of P. clarkii were equal to 152.87 ± 27.7 µg U/g DW at T4 and to 129.96 ± 9 µg U/g DW
at T10 after exposition to 30 µg U/L via a direct route. Equivalent results were obtained for
concentration levels in the same organ at T30 and T60. U bioaccumulation in gills thus
seemed to rapidly reach an equilibrium state. As expected, gills accumulated more U than
hepatopancreas at T30 and T60. Such results were also observed in an earlier study when Al
Kaddissi et al. (2011) noted that the bioaccumulation of U in gills was around 50 to 100 times
197
greater (at T4 and T10, respectively) than that recorded in the hepatopancreas of P. clarkii.
Contamination of the crayfish Orconectes limosus to U via a trophic route led to significant
accumulation of the metal in the hepatopancreas (up to 20 µg/g fw), which was up to 20 times
higher than that recorded in gills (Simon and Garnier-Laplace 2005). Thus the type of
exposure (direct/trophic) influences the distribution of U in organs. U concentrations in the
hepatopancreas at T30 (20.11 ± 6.98 µg U/g DW) and T60 (39.91 ± 8.06 µg U/g DW) were
elevated but no statistically significant difference between values was noted. These U
concentrations were much higher than those reported in the hepatopancreas at T4 (2.84 ± 0.6
µg U/g DW) and T10 (1.15 ± 0.6 µg U/g DW) (Al Kaddissi et al., 2011). It thus seems that
there is a significant effect of time on the bioaccumulation of U in the hepatopancreas, when
comparing the concentration levels in the organ after short- and long- term exposure.
4.2. Transcriptional responses after long-term exposure to U

The repression of 12S gene in gills at T30 and T60 indicates a decrease in the number of
these organelles in U-contaminated cells. Such effects, relating to U toxicity, was also
observed in gills of P. clarkii exposed to high U concentrations (0.6, 4 and 8 mg/L) after 4
days of contamination, when the 12S gene was noted to have been down-regulated by 7- to
10-fold (Al Kaddissi et al., 2011). Some heavy metals are known to induce structural damage
to mitochondria, resulting in a destruction of cristae and the outer or inner mitochondrial
membranes (Triebskorn and Köhler 1996; Lei et al. 2011). Structural damage induced by U
could have thus led to a decline in the number of mitochondria in contaminated organs.
Gough (1931) described that mitochondria in renal epithelium of U-contaminated rabbits had
formed small granules or were replaced by large spherical bodies that were scattered in the
cytoplasm. The cox1 gene was only 2-fold up-regulated at T60 in gills. Likewise, this gene
expression levels in gills of Danio rerio exposed to 23 ± 6 µg/L of U for 28 days, did not vary
significantly when compared to control fish (Lerebours et al. 2009). Conversely, the cox 1
gene was reported to be down-regulated (2 to 3-fold) in gills of P. clarkii presenting high
levels of U bioaccumulation (Al Kaddissi et al., 2011). The expression of this gene thus
appears to be modulated by the level of U concentration in tissues. Lerebours et al. (2010)
stated that the intensity of gene response may not correlate positively with toxicant
concentrations and that different gene expression patterns are expected for different
concentrations of exposure. This statement is in concordance with our findings in terms of
comparing the gene response of cox1 after acute exposure to that of chronic exposure to U,
which indicates that a modification in the metabolism might occur in organs presenting
198
different levels of contamination. The over-expression of cox1 in the present study also
coincided with an increase in expression of the atp6 gene in gills at the end of the experiment.
The up-regulation of these two genes indicates an increase in mitochondrial metabolism. This
could be a cellular strategy to compensate for the decrease in the number of functional
mitochondria by increasing ATP production, so as to provide enough energy for cellular
needs. It was also noted that gene expression levels of sod(Mn) correlated with those of cox1
at T30 and T60 (in gills: R= 0.4; in hepatopancreas: R=0.5; P=0,05). In our previous work, we
observed a significant correlation between these two genes expressions (R=0.6, P<0.001) in
organs of crayfish exposed to 0.03, 0.6, 4 and 8 mg/L of U for 10 days (Al Kaddissi et al.
2011). The results of these two studies confirmed that when mitochondrial metabolism
increases in the presence of U, the endogenous ROS production increases and, consequently,
the mitochondrial antioxidant defense mechanism is induced. On the contrary, when the
mitochondrial metabolism decreases, the over-expression of genes encoding for antioxidants
does not seem necessary. This cellular response to U toxicity was also observed in the
hepatopancreas at T30 and T60. The cox1 and sod(Mn) genes were also reported to be up-
regulated, by 5- and 11-fold-respectively, in the liver of Danio rerio exposed to 23 ± 6 µg/L
of U during 28 days (Lerebours et al. 2009). Another interesting response, involving 12S gene
expression, was observed in the contaminated hepatopancreas. In effect, the amount of
mitochondria decreased significantly at T30 and then increased at T60, accompanied by an
increase in mitochondrial metabolism (atp6 and cox1 up-regulated) in this organ at the end of
the experiment. This indicates that cells are able to adopt various compensatory mechanisms
in response to toxicity, including an increase in the amount of mitochondria. The expression
of the mt gene was repressed at T30 and T60 in gills whereas it was 2-fold over-expressed in
the hepatopancreas at T60. The response of metallothionein protein (MT) to U contamination
is not well understood. An in vitro study by Michon et al. (2010) demonstrated that U can
bind to MT, while a study by Cooley and Klaverkamp (2000) demonstrated that, in living
organisms such as fish, no increase of MT was observed in contaminated livers, except in
animals that had been subjected to the highest trophic exposure (10 mg U/g- at day 10). An
increase in mt gene expression in highly contaminated gills of P. clarkii was reported after 10
days of direct exposure to U (0.6-8 mg/L). No such increase was noted in the hepatopancreas
of the same animal, which presented low levels of U bioaccumulation (Al Kaddissi et al.
2011).Moreover, MT is known to bind ROS efficiently (Viarengo et al. 2000; Fang et al.
2010) which leads to the assumption that this protein participates in the antioxidant defense
system particularly in highly contaminated tissues. In the current study, we hypothesized that
199
the basal pool of MT in gills was sufficient and did not necessitate an over-expression of the
corresponding gene with the actual concentration levels. In the hepatopancreas, the over-
expression of the mt gene could be linked to oxidative stress. The increase of the amount of
mitochondria (12S up-regulated), the augmentation of mitochondrial metabolism (atp6 and
cox1 up-regulated), the induction of mitochondrial antioxidant defenses (sod(Mn)
upregulated), and the depletion of cytosolic antioxidants, all indicated an increase in ROS
levels in the organs at T60.
4.3. Evolution of transcriptional responses over time and their use as biomarkers
Expression of mitochondrial genes in gills and the hepatopancreas revealed a dysfunction
in the energetic process after short-term (4 and 10 days) (Al Kaddissi et al, 2011) and long-
term exposure periods (at T30 and T60) to 30 µg/L of U. Overall the 12S gene was down-
regulated over time in both organs (gills: R=-0.45, P=0.052; hepatopancreas: R=-0.51,
P=0.03). This gene seems to be a sensitive biomarker of U contamination in gills since it was
down-regulated soon after exposure (2-fold down-regulated at T4) (Al Kaddissi et al, 2011)
and was also repressed after a long period of exposure (at T30 and T60). It should be noted,
however, that (at T4 and T60) the 12S gene was occasionally over-expressed in the
hepatopancreas. Nonetheless, the expression levels of atp6 gene fluctuated over time in both
organs and did not follow a specific pattern, even though levels of U concentrations in the
gills were identical at the different sampling times (at T4, T10, T30 and T60). Thus, this gene
response seems to be modulated by the energetic demands of the tissue and not directly by U
concentrations. The cox1 and sod(Mn) gene expression levels tended to increase with time in
both tissues (ex: hepatopancreas: R=0.42, R=0.6 respectively, P<0.05). These genes could
thus be used as biomarkers of a long-term exposure to environmentally-relevant
concentrations of U, which would be useful in monitoring programs. The mt gene, on the
other hand, was generally repressed in gills (R=-0.67, P=0.009) but very little is known of the
impact of U on MT. Consequently, the use of this response alone as a biomarker of U
contamination is not sufficiently substantiated. Contrary to results obtained in gills, mt gene
expression tended to increase in the hepatopancreas with time (R=0.45, P=0.067). It therefore
appears that mt gene expression varies in different organs, which possibly relates to the
kinetics of U exchange in different cellular compartments.
200
4.4. Oxidative stress responses after long-term exposure to U
In the cytosolic fraction of contaminated organs, ROS levels were more likely to increase
with time, given that the activity of antioxidants had a tendency to decrease. There is indeed
evidence to indicate that oxidative stress, induced by metals in a biological system, can be
attributed to alterations in the antioxidant defense system (Jemai et al. 2007). For example, it
is known that cadmium indirectly induces oxidative stress by decreasing levels of
antioxidants, which lead to an increase in levels of free radicals (Ercal et al. 2001; Watjen and
Beyersmann 2004; Newairy et al. 2007; Cao et al. 2010; Jomova and Valko 2011). GPX
activity decreased significantly in contaminated gills of P. clarkii compared to that measured
at T60 in the control. An in vitro study (Labrot et al. 1996) indicated that such enzyme
activity decreased significantly in fish (Brachydanio rerio) that were in contact with 500
mg/L of U. These authors hypothesized that inactivation of enzymes could be a consequence
of metals binding to the protein chain backbone. Recent research in U toxicology revealed
that this metal can bind directly to some proteins, such as metallothioneins, ferritin, transferrin
and albumin (Michon et al. 2010). To the best of our knowledge, no studies have been
undertaken to examine the possibility of U binding to enzymes involved in the antioxidant
defense system. A study by Blum and Fridovich (1985) demonstrated that superoxide radicals
O2.- and hydroperoxides can deactivate GPX by converting its reduced form to the oxidized
form, and that the presence of SOD prevents this inactivation. SOD catalyzes the conversion
of reactive superoxide anions (O2.-) to produce hydrogen peroxide (H2O2) (Ruas et al. 2008;
Aschner and Jiang 2009), which is subsequently dealt with by CAT (Kono and Fridovich
1982; Michiels et al. 1994) and GPX activities (Michiels et al. 1994; Arthur 2000). A
decrease in SOD and CAT activities in contaminated tissues can thus increase the levels of
O2.- and hydroperoxides, which in turn could cause an oxidative alteration of GPX, resulting
in its loss of function. In the current study, the activities of SOD and CAT tended to decline
with time, particularly in contaminated gills, which might contribute to a decrease in GPX
activity. In addition, various studies showed that U causes a depletion of glutathione content
in contaminated tissues (Pourahmad et al. 2006; Barillet et al. 2007; Periyakaruppan et al.
2007; Aschner and Jiang 2009;Yapar et al. 2010; Pourahmad et al. 2011; Viehweger et al. in
press). Thus non-protein thiol plays an important role in ROS scavenging, since it is a
substrate for the removal of H2O2 by GPX. Consequently, a decrease in GSH content in
tissues could lead to a decrease of GPX activity. GSH can also be conjugated to other proteins
that are catalyzed by GST. GST transfers GSH groups to proteins to target for cellular export
and subsequent metabolism and detoxification (Dringen 2000; Dickinson and Forman 2002;
201
Hayes et al. 2005). Accordingly a decrease in GSH levels could explain a decrease in GST
activity, observed in both of the contaminated organs of crayfish at T60. It is also possible
that a decrease in antioxidant activity stems from the down regulation of the corresponding
genes (Lerebours et al. 2009; Barillet et al. 2011).
4.5. Linking cellular oxidative stress to the dysfunction of mitochondria

A recent in vitro experiment in contaminated plant cells demonstrated a reduction, of
about 33%, of U(VI) to U(IV) in the presence of GSH (Viehweger et al. in press). Pourahmad
et al. (2006) also stated that the reductive activation of U(VI) by GSH to U(V) and finally
U(IV) provides enough redox cycling to generate considerable amounts of ROS (O2.-). Such
results could explain the depletion of antioxidant activities observed in this study, since
oxidation of enzymes renders them inactive (Davies 2005). Pourahmad et al. (2006) also
reported that U(VI) (50µM) oxidized 85% of the GSH in rat hepatocytes, which resulted in
the formation of oxidized glutathione (GSSG) and thus decreased the GSH content in cells.
These findings reinforce the hypothesis that a depletion of GSH, as a substrate of GPX and
GST, may have occurred in the current study, thus causing a decrease in the activity of these
compounds. The reduction of antioxidant activities in the present study demonstrated that U
generates oxidative stress, which is undoubtedly accompanied by an increase in ROS levels. It
is well established that mitochondria are the primary source of ROS and the target of
excessive ROS generation (Lei et al. 2011; Simon et al. 2000). It is also known that an
exogenous source of ROS can cause oxidation of mitochondrial compounds, accompanied by
direct local membrane perturbation (Zamzami et al. 1995). Pourahmad et al. (2006) found
evidence for a collapse in mitochondrial membrane potential (MMP) of rat hepatocytes in the
presence of U, which results in severe ATP depletion and mitochondrial permeability
transition pore opening (MPT). The authors believe that mitochondrial damage is caused by
ROS formation and that the collapse of MMP and MPT pore opening is the result of oxidation
of thiol groups in the MPT pore region of the mitochondrial outer membrane and consequent
conformational alteration. This suggestion is consistent with our results and could explain
alterations in transcriptional responses in contaminated organs, particularly in gills at T60. An
increase in cox1 gene expression levels could be a response to remediate a possible decrease
of the mitochondrial membrane potential. Moreover, the up-regulation of the atp6 gene could
be a strategy to compensate for a decrease in ATP levels, which is a consequence of
mitochondrial damage caused by ROS, whereas the down-regulation of the 12S gene indicates
a loss of mitochondria, which could be the result of oxidative damage.
202
5. Conclusions and perspectives
In summary, U induces changes in mitochondrial gene expression levels and in the expression
of genes involved in the antioxidant defense mechanism. Nonetheless, some transcriptional
responses may differ between acute (Al Kaddissi et al. 2011) and chronic contamination,
indicating that the mechanisms of U toxicity are different at low and high exposure
concentrations. Moreover, when crayfish P. clarkii are exposed to environmentally-relevant
concentrations of U, the expression of the studied genes may differ over time, indicating that
responses are also time dependent. The 12S, cox1, and sod(Mn) genes seem to be sensitive
biomarkers of U contamination. Nevertheless, a multi-biomarker approach is recommended
for the evaluation of U toxicity because the mechanisms of action of this metal are not
completely understood. This study also demonstrated that U induces oxidative stress and a
loss of antioxidant response. A possible ROS-mediated U cytotoxic mechanism was also
proposed. Moreover, it seems that the study of transcriptional responses is a more sensitive
tool than the follow up of antioxidant activities for assessing U toxicity in crayfish. Further
research is needed to better comprehend cytotoxic mechanisms associated with the presence
of U. The measurement of glutathione (total, reduced and oxidized fractions) and the reduced
form of U(IV) in tissues, as well as their correlation to enzymatic effects and ROS levels,
could be of interest. The sequencing of cytosolic sod(Cu), cat, gpx, and gst is also needed in
order to study their expression in contaminated tissues and to link possible alterations to
enzymatic activities. This approach will partly help to elucidate the origin of the inhibition of
the studied enzymes. We recommend in vitro assays, to ascertain whether U can bind directly
to SOD, CAT, GPX and GST.
Acknowledgments
The authors would like to thank N. Gauthier for providing the crayfish, S. Pierrisnard for
ionic chromatography measurements, I. Cavalie for her help in U measurements, C. Della-
Vedova for helping in statistical analysis, B. Geffroy for his scientific support, and R. Al
Kaddissi for English corrections. This study was supported by the ENVIRHOM research
program, funded by the institute of Radioprotection and Nuclear Safety. The CNRS co-
financed this work.
203
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208
Chapitre IV-C
Les antioxydants et les réponses

transcriptomiques sont-ils des
biomarqueurs pertinents pour discriminer
la chimio et la radiotoxicité de l’uranium
chez P. clarkii ?
209
Are anti-oxidant and transcriptional responses useful for discriminating between
chemo- and radiotoxicity of uranium in crayfish P. clarkii?
Simone Al Kaddissi12, Sandrine Frelon1, Antonia-Concetta Elia3, Alexia Legeay2, Patrice

Gonzalez2, Frédéric Coppin1, Daniel Orjollet1, Virginie Camilleri1, Karine Beaugelin-Seiller4,
Rodolphe Gilbin1, and Olivier Simon1.
1
2
Laboratory of Aquatic Ecotoxicology, University Bordeaux1/UMR CNRS 5805, Dr Peyneau
square, 33120 Arcachon, France.
3
4
Laboratory of Environmental Modelling (LME), Institute of Radioprotection and Nuclear
Safety (IRSN), Bd 159, BP 3, 13115 Saint-Paul-Lez-Durance, France.
210
Abstract
The main objectives of this study were to evaluate uranium (U) toxicity in the crayfish
Procambarus clarkii at a low dose of exposure and to discriminate between the chemotoxicity
and radiotoxicity of U. We conducted two sets of experiments using either 30 µg/L of
233
depleted uranium (DU) or U, which differ from each other only in their specific activity
(DU = 1.7×104 Bq.g−1, 233
U = 3.57×108 Bq.g−1). The endpoints were oxidative stress
responses and mitochondrial functioning in the gills and hepatopancreas, which were
measured in terms of enzyme activities and gene expression levels. U accumulation levels
were measured in different organs (gills, hepatopancreas, stomach, intestine, green gland,
muscles, and carapace), and internal dose rates in the hepatopancreas were compared after DU
233
and U exposures. Significant U accumulation occurred in the organs of P. clarkii, and
mitochondrial damage and antioxidant responses were detected. Despite the huge difference
233
(21,000x) in the specific activities of DU and U, few significant differences in biological
responses were detected in P. clarkii exposed to these two pollutants. This finding indicates
that the radiotoxicity was low compared to the chemotoxicity under our exposure conditions.
Finally, genes expression levels were more sensitive markers of U toxicity than enzyme
activities.
Keywords: uranium, chemotoxicity, radiotoxicity, mitochondria, antioxidants.
211
1. Introduction:
Uranium (U) is a naturally occurring radioactive element found in various chemical
forms in soils, rocks, and water supplies (WHO, 2001; Bleise et al., 2003). Natural U consists
238
of a mixture of three radioactive isotopes that are identified by their mass numbers: U
(99.27% by mass), 235U (0.72%), and 234U (0.0055%) (Aigueperse et al., 2001). Isotopes of U
possess the same chemical properties but have different radioactivity (Delacroix et al., 2004).
234
U contributes 49.5% of the total radioactivity of natural U because of its high specific
activity (2.3 108Bq.g−1), whereas 238
U (1.24 104Bq.g−1) contributes 48.2% despite its high
abundance. The remaining 2.3% is attributed to the activity of 235
U (8 104Bq.g−1) (Bleise et
al., 2003). U is used primarily in nuclear power plants; most reactors require U in which the
235
U content is enriched from 0.72% to about 3%. The U remaining after removal of the
enriched fraction is referred to as depleted uranium (DU) (235U content: 0.2–0.3%), and it is
less radioactive than natural U (Aigueperse et al., 2001; WHO, 2001). DU may also result
from the reprocessing of spent nuclear reactor fuel; under these conditions another uranium
isotope, 236U, may be present (WHO, 2001). Moreover, industrial processes can produce other
isotopes of U such as 232U and 233U, which are much more radioactive than natural U.
Although the occurrence of U in the environment is increasing due to anthropogenic
activities (WHO, 2001; Giovanetti et al., 2010), the ecotoxic profile of this metal has not been
studied extensively for non-human biota, particularly for aquatic invertebrates. The toxic
action of U in organisms potentially originates from both its chemical and radiological
properties, the latter depending on the specific activity of the U isotopes and their associated
energy radiation (Bourrachot et al., 2008; Darolles et al., 2010; Giovanetti et al., 2010).
However, information about distinguishing between the hazardous effects of U chemotoxicity
and U radiotoxicity on aquatic organisms is scarce (Barillet et al., 2007; Bourrachot et al.,
2008; Alves et al., 2009). Identification of the effects and the mechanisms of action of a
pollutant’s toxicity are best done using a multi-biomarker approach at different biological
levels of organization (Adams and Greeley, 2000; Viarengo et al., 2007; Faria et al., 2010).
For example, gene expression profiling can accurately assess and predict toxicity of metals to
aquatic organisms (Neumann and Galvez, 2002). As U impairs mitochondrial function
(Pourahmad et al., 2006; Lerebours et al., 2010; Al Kaddissi et al., 2011, 2012), the
expression levels of cox1, atp6,and 12S are good candidates for use as biomarkers. U also can
generate oxidative stress (Miller et al., 2002; Barillet et al., 2007; Darolles et al., 2010;
Lerebours et al., 2010; Al Kaddissi et al., 2011, 2012), so the study of the expression levels of
sod(Mn) and mt genes and evaluation of enzymatic activities of superoxide dismutase (SOD),
212
catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), and glutathione S-transferase activities (GST)
likely are pertinent endpoints for determining the toxicity of U.
The main aim of this study was to identify the contribution of chemotoxicity and
radiotoxicity to the effects of U on mitochondria and the oxidative balance using
transcriptional responses (mt, sod(Mn), cox1, atp6, 12S) and enzymatic activity as endpoints
(SOD, CAT, GPx, GST). We also evaluated the sensitivity of the biomarkers by comparing
the impacts of a low contamination level on the different biological levels of organization.
Indeed, it is crucial to select sensitive biomarkers which could be suitable for ecological risk
assessments. We selected the crayfish Procambarus clarkii as a biological model because this
species is widespread (Gherardi, 2006), accumulates U, and is an integrator of its effects (Al
Kaddissi et al., 2011, 2012).In addition, P. clarkii has been used as an indicator of metal
toxicity in environmental studies for decades (Alcorlo et al., 2006; Gherardi, 2006; Suárez-
Serrano et al., 2010).
In this study, crayfish were exposed for 10 days to two different types of U (DU and
233
U) at the same concentration (30 µg.L–1). These two types of U differ from each other only
in their specific activity and thus in their radiotoxicity. The U concentration in the water was
close to environmental values measured near U mining sites (Colle et al., 2001; Simon and
Garnier-Laplace, 2005) and was twice as high as the value recommended by the World Health
Organization for drinking water (WHO, 2004). U accumulation was evaluated in different
organs (gills, hepatopancreas (HP), stomach, intestine, green gland, muscle, and carapace),
whereas biological effects of the different isotopes were evaluated only in the gills and the HP
because these organs are known to accumulate metals efficiently (Simon and Garnier-
Laplace, 2005; Alcorlo et al., 2006; Kouba et al., 2010; Suárez-Serrano et al., 2010; Al
Kaddissi et al., 2011, 2012) and they provide sufficient amount of tissue for conducting
various analyses on the same organ. In parallel, to evaluate the radiotoxicity of both DU and
233
U, internal dose rates in the HP were calculated using EDEN-2.2 software.

2.1. Experimental design
All crayfish used in this study were adult premoult males (25.16 ± 0.95 g fresh weight,
9.07 ± 0.08 cm length; n = 50). Organisms were caught in situ from the Vigueirat Swamp of
Camargue in the south of France. They were acclimatized to laboratory conditions for 1
month before being used in the experiments: 12/12 h light/dark photoperiod; 17 ± 1°C
synthetic water composed of Ca²+ =1640, Mg²+ = 500, Na²+ = 870, K+ = 80, Cl– =4100, SO42–
213
=509, NO3– =76.5, HCO3– = 281 (all in µmol.L–1); pH 6.5 (Al Kaddissi et al., 2011, 2012).
The chosen pH value and the voluntary absence of phosphate maintained high levels of U
bioavailability (Fortin et al., 2004, 2007). During the acclimatization period, crayfish were fed
every 48 h with a diet of corn and mussels. The specimens were starved for 48 h before
beginning the experiment to avoid the formation of metal-feces complexes and to maintain
constant U bioavailability. During the test, three groups of 10 crayfish were exposed for 10
days to waterborne U: 0 (controls); 30 µg.L–1 of DU (from depleted uranyl nitrate stock
solution 1 g.L–1 0.016M HNO3; DU isotopic composition: 99.65% 238U, 0.33% 235U, 0.0019%
234
U, 0.011% 236
U, total activity = 1.7×104 Bq.g−1); or 30 µg.L–1 of 233
U (uranyl nitrate,
specific activity = 3.57×108 Bq.g−1, stock solution, 1.3 g.L–1, 4M HNO3, IRMM, Belgium).
The pH value was maintained constant over the experiment. As the two stock solutions of U
233
(DU and U) had significantly different HNO3 concentrations, the exposure media were
adjusted so that they all had identical pH, NO3–,and Na+ concentrations. Each specimen was
kept in an individual chamber (a cylinder made from plastic netting, 1 cm mesh, 11 cm
diameter) to avoid cannibalism (no mortality was observed throughout the experiment). Half
of the water column was renewed manually and daily in order to ensure the stability of both
water composition and exposure levels. DU water concentrations were measured daily before
and after the renewal and adjusted to keep mean values significantly close to the nominal
contamination levels. The temperature was maintained at 17.7 ± 0.1°C. Several abiotic
parameters were monitored on a daily basis throughout the experiment, including dissolved
oxygen (73.6 ± 12.4 % O2), pH (6.51 ± 0.04), conductivity (602.4 ± 25.9 µS), and water
concentration of anions (NO3–, NO2–, Cl–, SO42–, PO43–-) using an Ion Chromatography
System (ICS-3000).At days 4 (T4) and 10 (T10), five crayfish were sampled from each tank
and sacrificed. For both sampling times and the three exposure conditions, HP, gills, stomach,
intestine, green gland, muscle, and carapace were collected from each individual and stored at
–80°C prior to the bioaccumulation analysis. Parts of the gills and HP were also stored at –
80°C for enzymatic and genetic analyses.
2.2. U analyses
Water samples from each tank were acidified (0.31 M HNO3) with nitric acid prior to
metal quantification. Samples containing DU were analyzed by inductively coupled plasma-
atomic emission spectrometry (ICP-AES Optima 4300DV, PerkinElmer, Wellesley/USA;
detection limit: 10 µg.L–1 ± 10%). 1 ml of the acidified water contaminated with 233
U was
added to 19 ml of a liquid scintillation cocktail (Instagel, Packard Instruments, Rungis,
214
France) and then analyzed by alpha liquid scintillation counting (alpha particle detection limit
of 0.03 Bq per sample; Quantulus 1220, Wallac Oy, Turku, Finland). Crayfish organs had to
bedigested in order to determine the U concentrations in the samples. After 2 days at 45 ˚C,
the organs were weighed and then digested in 3 ml of HNO3 (15.5 M) for 90 min at 95 °C and
then were left to dry for 60 min at 105 °C. Next, 2 ml of H2O2 (33%) were added to complete
the digestion, and the preparation was left for 20 min at 105 °C to dry again. Samples were
finally redissolved in acidified water (0.31 M HNO3). Organs exposed to DU were analyzed
by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS Agilent 7500 Cx; quantification
limit: 10 ng.L–1 ± 7%). A liquid scintillation cocktail (Instagel, Packard Instruments, Rungis,
233
France) was added to the tissues (1:19) sampled from U exposure condition and were
analyzed with the same technique as the one used for analyzing water samples contaminated
with 233U.
2.3. Enzyme activity determination

Enzyme activities were determined in the cellular cytosolic fractions of tissues. Gills
and HP (200 mg) from each individual were homogenized, respectively, in a 1:10 and 1:20
weight: volume (W/V) proportion in ice cold Tris-HCl (100 mM, pH 7.8) buffer containing
100 µM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), 0.008 aprotinin U.mL–1, and 0.1 mg.mL–1
bacitracin. An aliquot of each homogenate was centrifuged at 15,000 g for 30 min at 4 °C, and
supernatants were then centrifuged at 100,000 g for 1 h at 4 °C. All biochemical analyses and
absorbance readings were performed at a constant temperature of 25 °C using a
spectrophotometer (Spectramax 384 Plus, Molecular Device) with SOFTmax PRO software.
Protein concentration was determined using the Micro BCATM Protein Assay Kit (Thermo
Scientific) following the manufacturer's instructions; absorbance was read at 562 nm. SOD
was determined spectrophotometrically using the 19160 SOD Determination Kit (Fluka)
according to the manufacturer's instructions; absorbance was read at 450 nm. SOD activity
was expressed as U.mg–1 prot. The enzyme assays for CAT, GPx, and GST were performed
according to the method reported in Dörr et al. (2008). Briefly, CAT activity was measured by
following the decrease in absorbance at 240 nm due to H2O2 consumption (ε = 0.04 mM–1.cm–
1
). The assay was carried out in Na-phosphate buffer pH 7 and 12 mM H2O2. GPx activity
using cumene hydroperoxideas the substrate was determined and the oxidation of NaDPH was
followed at 340 nm (ε = 6.22 mM–1.cm–1). The assay conditions were 100mM Na-phosphate
buffer with pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.12 mM NaDPH, 2 mM GSH, 1 mM DTT, 0.8 mM
cumene hydroperoxide, and 1Uglutathione reductase. GST activity was measured using 1-
215
chloro-2.4-dinitrobenzene (CDNB) as the substrate. This assay measured the formation of the
conjugate with GSH at 340 nm (ε = 9.6 mM–1 cm–1). The assay conditions were 100 mM Na-
phosphate buffer with pH 6.5, 1 mM GSH, and 1 mM CDNB.
2.4. Gene expression level determination

Total RNA were extracted from 20–40 mg of tissue using the Absolutely RNA
Miniprep Kit (Agilent), following the manufacturer's instructions. First-strand cDNA was
synthesized from total RNA using the Stratascript First-Strand Synthesis System (Agilent)
according to the manufacturer's instructions. The cDNA mixture was stored at −20°C until
needed. Specific primer pairs used to determine target gene expression levels (12S, atp6,
cox1, sod, mt) and the explanation of their functions are listed in Al Kaddissi et al. (2011,
2012). Real-time PCR reactions were performed in a Light Cycler (Roche) following the
manufacturer's instructions using the DNA intercalating dye SYBRGreen I. The amplification
program consisted of one cycle at 95 °C for 10 min and 50 amplification cycles at 95 °C for
5 s, 60 °C for 5 s, and 72 °C for 20 s. PCR specificity was determined for each reaction from
the dissociation curve of the PCR product. This dissociation curve was obtained by following
the SYBRGreen fluorescence level during a gradual heating from 60 to 95 °C. Relative
quantification of each gene expression level was normalized according to the expression of
the housekeeping gene 18S. Relative expression of a gene was calculated using the 2−ΔCT
method as described by Livak and Schmittgen (2001), where ΔCT represents the difference
between the cycle threshold of the specific gene of interest and the cycle threshold of the 18S
gene. Therefore, the expression factor (EF) of each gene in comparison with the control
corresponds to the following equation: EF=2-ΔCT(Treatment)/2-ΔCT(Control).
2.5. Dose rate calculation for the hepatopancreas

Taking into account all exposure pathways, a total absorbed dose rate of an organ is
estimated by summing the internal and external dose rates. U concentrations in HP were
converted into internal dose rates using Dose Conversion Coefficients (DCCs, Gy/unit of time
per Bq/unit of volume or mass) calculated using EDEN 2.2 software (Beaugelin-Seiller et al.,
2004) (Table 22). The external dose rate of the crayfish HP was found to be negligible (DCC
value < 10–10). Input data depend on the shapes and the elementary compositions of the
biological target. They also depend on the composition of the exposure media and the
radioactive source (defined as a combination of radionuclides). HP were thus assumed to be
ellipsoids (4 cm long, 0.65 cm high, and 2 cm wide) composed of hydrogen, carbon, oxygen,
216
and nitrogen, which contribute 10.2, 9.5, 77, and 2.3% of the total mass, respectively. The
shape of the gills is complex and thus it is not possible to calculate the radiological dose rate
in such complex organs using EDEN 2.2 software. The radioactive source was determined
according to the U contents in the organ measured by ICP-MS or liquid scintillation, and the
presence of U decay products was modeled using Nuclides 2000 software (Institute for
Transuranium Elements, Karlsruhe, Germany). The U distribution was considered
homogenous in the organ. Internal dose rates were then assessed according to three different
scenarios:
(i) Only U isotopes were accumulated in the HP,
(ii) U isotopes were accumulated in the HP along with the daughters of the U isotopes, which
were initially present in the water before being transferred to the organ (transfer factors of 110
for thorium (Th) and 10 for protactinium (Pa) (Hosseini et al., 2008) were used to assess the
activities of daughters),
(iii) Same as (ii) + decay products accumulated in HP after 10 days of decay, corresponding
to the 10 days exposure duration.
For scenarios (ii) and (iii), all radionuclides were assumed to have entered the organ the first
day of exposure and to have the same biokinetic (same uptake and elimination) rates and the
same biological targets as U.
Table 22: Isotopic lists of uranium (233U, 234U, 235U, 236U and 238U), their related
daughters selected for the source composition (obtained by Nuclides 2000) and
corresponding DCC values (Gy/d)/[Bq/g] of U accumulated in Hepatopancreas after 10
days of exposure obtained by EDEN 2 software (Elementary Dose Evaluation for
Natural Environment, developed by IRSN).
92 U233 90 Th229 88 Ra225 89 Ac225 87 Fr221 85 At217 86 Rn217 84 Po213 83 Bi213 82 Pb209 81 Tl209
1.33E-07 1.37E-07 2.53E-09 1.59E-07 1.74E-07 1.93E-07 2.11E-07 2.28E-07 4.89E-09 1.22E-08 1.19E-08
92 U23492 U234 90 Th230 88 Ra226 92 U235 90 Th231 91 Pa231 89 Ac227 90 Th227

1.31E-07 1.29E-07 1.31E-07 1.22E-07 2.66E-09 1.38E-07 2.17E-09 1.64E-07
92 U236 90 Th232 88 Ra228 92 U238 90 Th234 91 Pa234m 92 U234 91 Pa234

1.24E-07 1.11E-07 4.57E-10 1.16E-07 1.27E-09 1.26E-08 1.31E-07 1.29E-07
217
2.6. Statistical analyses
One-way or two-way analysis of variance (ANOVA) was used to compare variables
among controls and treatments. If significant differences were found (p < 0.05), these data
were then reanalyzed to determine if significant differences existed between (i) exposed and
233
control conditions and (ii) between U and DU exposures. If the data were not normally
distributed, log transformation was conducted; if normality still was not achieved, a non-
parametric test (Kruskall-Wallis) was used to compare the data. Results were presented as
mean ± SEM (standard error of the mean).
3. Results
3.1. U in water, in organs, and related dose rates
The average U concentrations measured daily were close to the nominal
concentrations (28 ± 15 µg DU.L–1 and 35 ± 17 µg 233
U.L–1). No significant difference was
observed between the average concentrations of DU and 233U in water (Kruskal-Wallis test, p
233
= 0.2887, n = 84). As expected, preliminary experiments showed that the DU and U
adsorption on experimental units (tanks) were identical in terms of kinetics and loss in our
experimental conditions. Average ionic concentrations of the synthetic water were not
significantly different from the required concentrations mentioned above. Thus, the exposure
conditions favored U bioavailability.
U accumulated in tissues of crayfish with the following tendencies: gills >> stomach >
intestine > HP > carapace > green gland > muscle (Figure 70). Results showed a significant
233
accumulation of both DU and U in the organs. A significant effect of time on
bioaccumulation was observed in gills, HP, intestine, and carapace (ANOVA, p < 0.05).
Accumulation in the gills was rapid and very high (DU, T10, 400 µg.g–1 dw), whereas
accumulation in muscle was low (DU, T10, 0.7 µg.g–1 dw) but still significantly higher than
in the control (25x) and not time dependent. No significant effect of exposure conditions (DU
versus 233U) was observed, except for the carapace, where accumulation was higher after DU
exposure at T4.
In HP, the total internal dose rate (scenario (iii)) due to 233
U (12900 µGy.h–1) was
significantly higher (15000x) than that due to DU (0.86 µGy.h–1). The three proposed
scenarios led to quasi-identical internal dose rates. The U isotopes accumulated in the HP
233
contributed 99.9997% and 95.9% of the total internal dose of the organ sampled from U
238
and DU exposure conditions, respectively. In addition, for DU the contribution of U and
234
U represented 70% and 27.3% of the total internal dose rate, respectively. Thus, the internal
218
dose rate mainly originated from the U isotopes rather from their related daughters. For
instance, the contribution of the Th isotopes to total internal dose was only 2.1%.
Gills Hepatopancreas
10d
600 60
10d
Stomach
500 Intestine
50
Green gland
400 Muscle
40
Carapace
[U] µg/g, dw
300
4d 30
4d
200 20
100
10
*
0
0
0 DU 233U 0 DU 233U
0 DU 233U 0 DU 233U
Figure 70: Concentrations (µg/g dW, mean ± SEM, n=5) of depleted uranium (DU) and
enriched uranium (233U) in: gills (on the left), hepatopancreas, stomach, intestine, green
glands, muscles and carapace (on the right) of the crayfish P. clarkii exposed 4 (4d) to 10
(10d) days to 0 (control) and 30 µg/L of the metals. (*) indicates significant differences
between DU and 233U treated samples.
3.2. Effects on enzyme activities and gene expression levels

Figure 71 shows the enzyme activities (CAT, GPX, GST, and SOD) over time in gills and
233
HP of control and DU- and U-exposed crayfish. In HP, no statistically significant
difference for any enzyme activity was detected between control and either U exposure
condition (p > 0.05). A significant decrease in CAT activity was observed at T4 in gills of
crayfish exposed to both types of U when compared to controls. The GST activity increased at
233
T10 in this same organ, but only in the presence of U. No statistically significant
differences were recorded for GPx and SOD in the same organ.
219
Hepatopancreas
Gills
CAT (µmol/min/mg Protein)
CAT (µmol/min/mg Protein)

30 50
25 40
20
30
15
20
10
5 * * 10
0 0
0-4d 233U-4d DU-4d 0-10d 233U-10d DU-10d 0-4d 233U-4d DU-4d 0-10d 233U-10d DU-10d
GPX (nmol/min/mg Protein)
GPX (nmol/min/mg Protein)

80
30
25 60
20
15 40
10
5 20
0
0
0-4d 233U-4d DU-4d 0-10d 233U-10d DU-10d
0-4d 233U-4d DU-4d 0-10d 233U-10d DU-10d
Hepatopancreas
Gills
GST (µmol/min/mg Protein)
GST (µmol/min/mg Protein)
6
1
0,8
4
0,6
0,4 * 2
0,2
0
0
0-4d 233U-4d DU-4d 0-10d 233U-10d DU-10d
0-4d 233U-4d DU-4d 0-10d 233U-10d DU-10d
10 12
SOD (U/mg Protein)
SOD (U/mg Protein)
10
8
8
6
6
4
4
2
2
0 0
0-4d 233U-4d DU-4d 0-10d 233U-10d DU-10d
0-4d 233U-4d DU-4d 0-10d 233U-10d DU-10d
Figure 71: Enzymatic activities of catalase (CAT) (µmol/min/mg Prot, mean ± SEM,
n=5), glutathione peroxidise (GPX) (nmol/min/mg Prot, mean ± SEM, n=5), glutathione
S transferase (GST) (µmol/min/mg Prot, mean ± SEM, n=5) and superoxide dismutase
(SOD) (U/mg Prot, mean ± SEM, n=5) in the hepatopancreas and gills of crayfish P.
clarkii exposed 4 (4d) and 10 (10d) days to 0 (control) and 30 µg/L of depleted uranium
(DU) or enriched uranium (233U). (*) indicates significant differences between control
and treated samples (P< 0.05).
220
In contrast, U exposure had a significant effect on the expression levels of the five genes
studied (Table 23). Expression of the atp6 gene varied greatly (e.g. from –36x to +17x in
gills) over time in both gills and HP; it was repressed or not different from the control at T4
and then overexpressed at T10. The same pattern was observed for the mt gene. Expression
levels of the 12S gene decreased at T4 and then increased again at T10 in both organs (from –
5x to 3x). In contrast, the cox1 gene was repressed in gills at all times and only down-
regulated in the HP at T4 in the 233U treatment condition. The sod(Mn) gene was only weakly
233
repressed at T4. Finally, compared to DU exposure, exposure to U had a greater effect
(from 1.7x to 12) on atp6 gene expression, except in the HP at T10.
Table 23: Expression factors (EF) of the 5 genes studied in P. clarkii compared to the
basal level of controls (n=5)
time
organs (days) Isotopes 12S atp6 Cox1 Sod(Mn) mt
233
U -2 -36 -2,5 -2 /
4
DU -2 -3 -2 -2 /
Gills 233
U 3 17 -2 / 4
10
DU 2 10 -6 / 4
233
U -5 -6 / -2 -4
4
DU -3 / -2 / -2
Hepatopancreas 233
U 2,5 17 / / 2
10
DU / 17 / / 4
(/): Equal to control, (-): down-regulated, (+): up-regulated. Only EF≥2 or EF≤-2 are
considered statistically significant.
4. Discussion
4.1. Accumulation of U
As previously observed in different species of crayfish (P. clarkii, Orconectes
limosus), in the bivalve Corbicula fluminea and the fish Danio rerio (Simon and Garnier-
Laplace, 2005; Barillet et al., 2007; Al Kaddissi et al., 2011, 2012), U accumulation varies
among individuals. This variability could be linked to differences in ventilation and
respiration rates, which affect the uptake of waterborne metals. In this study, U accumulation
was highest in the gills, which confirms that they are the main target organs in crayfish after
direct exposure. In contrast to what has been reported for fish (Barillet et al., 2007), crayfish
gills exhibited a strong ability to retain the metal (Kouba et al., 2010; Kurun et al., 2010). The
high levels of U accumulation observed in the gills, stomach, intestine, and carapace are
probably due in part to U adsorption on the cuticle and the mucus of these organs. This could
221
also explain the high individual variation of U accumulation in gills. Electron micrographs
coupled with EDX-probe analysis showed a high U burden on the gill cuticle of Orconectes
limosus after exposure to a high level (500 µg.L–1) of waterborne U (results not shown). The
fact that all organs accumulated U after waterborne exposure illustrates the capacity for U
transfer in P. clarkii. Indeed, contamination of the muscles was detected, even if the
accumulated levels of U were low. As various predators feed on crayfish, including humans,
further experiments should be conducted to assess the potential for trophic transfer of U.
233
The potential additional radiotoxic effect of U did not lead to a significant
difference in accumulation levels in organs, except for the carapace at T4. No explanation for
this result was obvious, which illustrates the need for further tests to determine the relative U
adsorption and absorption burdens. Such a study would also help explain the relationship
between bioaccumulation levels and effects. No difference was observed between the
233
bioaccumulation levels in the prolarval stage of D. rerio after DU and U exposures
(Bourrachot et al., 2008). However, in a study of adult D. rerio exposed to low radiological
233
levels, a significant difference was detected in the accumulation of DU and U due to the
radiotoxic effect on gill epithelium after 3 days of exposure; the effect later disappeared after
10 and 20 days (Barillet et al., 2007).
4.2. Dose rate in the hepatopancreas

The DU exposure led to a total dose rate in HP that was close to 1 µGy.h–1 as observed
by Barillet et al. (2007) in the whole fish Danio rerio after 20 days of DU exposure (100
µg.L-1). This value is lower than the radiological benchmark which was reported to be equal
to 10 µGy h–1 at the ecosystem level (Garnier-Laplace et al., 2006). Note that the biomarkers
used in the current study were able to show effects of U exposure at dose rates lower than the
233
benchmark value. The internal dose rate calculated after U exposure was much higher (1.5
104x) than that calculated after DU exposure. Moreover, the total internal dose rate seemed to
be mainly the result of the contribution of U isotopes, as the contribution of uranium’s
daughters was low. Transfer factors (TF) of daughters are required for precise assessment of
their internal dose rates in organs. However, information on these TF in the literature is
scarce. For example, no information on Th transfer was available for crustaceans in Hosseini
et al.’s (2008) review. Therefore, more data on accumulation of daughters and evaluation of
their TF in crayfish are needed to refine calculations of dose rates. Moreover, the metal
distribution in organs and at the subcellular level is not homogeneous (Simon et al., 2011), yet
the dose rate calculation assumes a homogenous distribution. Dose rates calculated in cellular
222
fractions could provide better information to link exposure to its effects. One possible
approach to making accurate measurements would be to adapt small-scale dosimetry used in
nuclear medicine to calculate the dose rate in heterogeneous distribution conditions (Hofmann
et al., 2007).
4.3. Effect on enzyme activities

CAT is an important enzyme involved in the antioxidant defense system, and its activity is
generally stimulated by metals (Vlahogianni et al., 2007; Faria et al. 2010). However, other
studies demonstrated that metals can inhibit this enzyme. In fact, in vivo studies revealed a
decrease in CAT activity in the presence of U in the mollusk Corbicula sp., the earthworm
Eisenia fetida, and the fish Brachydanio rerio (Labrot et al. 1996). In addition, Barillet et al.
(2007; 2011) showed a significant decrease in CAT activity in D. rerio exposed to
environmental concentrations of DU. In Oreochromis niloticus, CAT activity varied
depending on the tissue, the nature, and accumulation levels of the considered metals (Ag, Cd,
Cr, Cu, Zn) (Alti et al., 2006). Therefore, CAT activity seems to be either induced or inhibited
by metals depending on the dose, the metal species, and/or the route of exposure. Herein, the
activity of CAT in the gills of P. clarkii decreased (x3) after 4 days of U exposure. No effect
of U isotopic composition on the activity of this enzyme was observed (Figure 71). The
reduction of CAT activity could indicate a decrease in the expression levels of the CAT gene
(Barillet et al., 2007). Moreover, a decrease in antioxidant activities could stem from an
oxidative alteration of the enzymes (Davies 2005). Another possible explanation for the
inhibition of this enzyme's activity could be due to a direct binding of U to the enzyme
resulting in its loss of function. To our knowledge, no data concerning the interaction between
U and CAT are available in the literature, although the complexation capacities of U on
metalloproteins (albumin, metallothionein, ferritin) have been reported (Michon et al., 2010).
In this study, the effect of U on CAT activity was higher in the gills than in the HP, which is
in agreement with the accumulation levels of U in these organs. Moreover, the detoxification
system of the gills is not as robust as that of the liver, which suggests that the HP has better
regulation of reactive oxygen species (ROS) (Alti et al., 2006; Borkovic et al., 2008;Pandey et
al., 2008). U exposure seems to have led to transitory oxidative stress in P. clarkii. Other
defense mechanisms not measured in this study could have been induced by U exposure and
contributed to managing the oxidative stress. For example, efficient antioxidants such as
glutathione, glutathione reductase, or ascorbate could have prevented ROS from causing
oxidative cellular damage (Eyckmans et al., 2011). A significant increase in GST activity was
223
233
observed in the gills after U exposure at T10. GST is an enzyme that belongs to the most
important phase II biotransformation system (Doyen et al., 2008), and it also contributes to
resistance against products of oxidative stress (Hayes and Pulford,1995; Elia et al.,2003; Solé
et al., 2004). H2O2 and metal exposure have been shown to induce GST in plant, mammalian
cells (Hayes and Pulford, 1995) and in fish (Elia et al., 2003, Solé et al., 2004). Moreover, this
enzyme protects cells from extremely toxic end products of lipid peroxidation (e.g., HNE4)
(Valko and al., 2006). Thus, at T10, the oxidative stress seemed to have increased, which led
to the increase in GST activity.
4.4. Effect on gene expression levels

The expression of the mitochondrial genes 12S, cox1, and atp6 was altered in the presence
of both types of U, thereby confirming that mitochondria were affected by U exposure. The
over-expression or repression of most of the genes were not as pronounced (–6x to 4x
compared to the control) as for the atp6 gene. It should be noted that the crayfish used in this
study were in the premoult stage. Moulting requires high amounts of energy, which could
explain the high variations in the atp6 gene expression levels as this gene encodes for the
mitochondrial ATP synthase, which in turn is responsible for ATP synthesis (Wang and Oster,
1998). Muhlia-Almazan et al. (2008) demonstrated that atp6 gene expression in Litopenaeus
vannamei varied at different moult stages and concluded that atp6 mRNA levels are
influenced by confounding factors such as environmental and physiological changes. The
results of the current study show that despite natural physiological variation, the atp6 gene
responded to U exposure. The mt gene expression was initially repressed at T4 and then
stimulated by the end of the experiment. This gene encodes for metallothionein (MT), a metal
binding protein, which is capable of scavenging ROS (Amiard et al, 2006; Pandey et al.,
2008). It is possible that at T4, a high basal level of MT protein in the gills could have
compensated the U effect, but by day 10 the level was not sufficient and thus mt transcription
was required. Finally, sod(Mn) gene expression levels did not reflect an increase in
endogenous ROS production in the mitochondria, as this gene encodes for mitochondrial
superoxide dismutase, an enzyme involved in the fight against oxidative stress (Wang et al.,
2004; Gonzalez et al., 2006).
224
4.5. Linking effects to radio or chemotoxicity
Decreased CAT activity highlighted the effects of U exposure on P. clarkii; it
indicated the presence of early oxidative stress in the gills. This stress likely was due to the
233
chemotoxicity of U because no significant difference was observed between DU and U
exposures. However, GST activity increased significantly only in the gills of crayfish exposed
233
to U, thus this increase can be linked to the radiotoxicity of U. Gene expression levels did
233
not allow to distinguish a specific mechanism linked to U toxicity, as all genes exhibited
the same expression pattern in the presence of both types of U. Darolles et al. (2010) did not
observe a great difference between the genotoxic effect of depleted U and enriched U.
However, in our study, greater alterations in atp6 gene expression levels were observed in
233 233
organs contaminated with U than with DU. The radiotoxicity of U could have amplified
the effect in this case. Even if DU and 233U exposure led to different dose rates in the HP, it is
important to note that most of the biological effects were not correlated to the radiological
dose in this organ. In assessing the chemical and radiobiological risks of U exposure,
Mathews et al. (2008) demonstrated that the environmental risk of uranium’s chemical
toxicity, expressed by the chemical benchmark of 3.2 µg.L–1, generally outweighs its
radiological toxicity (10 µgGy.h–1).
5. Conclusions
Three endpoints (U accumulation, enzyme activity, and gene expression levels) were
tested for their usefulness as markers of U exposure and its effects. Results of U
concentrations in the different studied organs identified the gills as the main target organ for
U bioaccumulation. The enzymatic activities of only CAT and GST were modified after U
exposure when compared to the control. Indeed, GPx and SOD were not sensitive markers for
early evaluation of U toxicity in P. clarkii. The CAT and GST responses indicated that U
exposure caused early generation of oxidative stress. The expression levels of the studied
genes were strongly modified by U exposure and confirmed that damage occurs in the
mitochondria. Thus, this endpoint (i.e., gene expression) exhibits better sensitivity to U
contamination than the enzymatic responses. Finally, the tested endpoints showed that the
adverse effects of U were due mainly to its chemotoxicity rather than to its radiotoxicity.
225
Acknowledgments
The authors thank N. Gauthier for providing the crayfish and R. Al Kaddissi for
proofreading the manuscript. This work was supported by the EnvirHom-eco research
program funded by the Institute for Radioprotection and Nuclear Safety and co-financed by
the CNRS.
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231
Chapitre V
Comparaison des effets de l’uranium et du

cadmium chez P. clarkii.
232
How toxic is the depleted uranium to crayfish Procambarus clarkii? a comparative study
to the uptake and biological effects of cadmium.
Simone Al Kaddissi1;2, Alexia Legeay2, Antonia Concetta Elia3, Patrice Gonzalez2, Magali
Floriani1, Isabelle Cavalie1, Virginie Camilleri1, Sandrine Frelon1, RodolpheGilbin1 , Jean-
Charles Massabuau2, and Olivier Simon1.
1
2
Laboratory of Geochemistry and Ecotoxicology of Metals in Aquatic Systems (GEMA),
University of Bordeaux1/UMR CNRS 5805, Dr Peyneau square, 33120 Arcachon, France.
3
233
Abstract
Due to a lack of information on the assessment of uranium’s (U) toxicity, our work
aimed to compare the effects of U on the crayfish Procambarus clarkii with those of the well
documented metal: cadmium (Cd). Impacts on different levels of biological organisation were
assessed after an acute (40µM Cd or U; 4-10 days) and chronic (0.1 µM Cd or U; 30-60 days)
exposures. The survival rates demonstrated the high tolerance of this species toward both
metals and showed that Cd had a greater effect on the sustainability of crayfish. The
concentration levels of Cd and U accumulated in the gills and the hepatopancreas were
compared between both conditions. Distinctions in the adsorption capacities and the mobility
of the contaminants were observed. Differences in the detoxification mechanisms of both
metals using transmission electron microscopy (TEM-EDX) were also pointed out. In
contrast, comparison between the histological structures of the contaminated hepatopancreas
showed similar symptoms. Principal Component Analyses revealed different impacts of each
metal on the oxidative balance and mitochondria using enzymatic activities and gene
expression levels as endpoints. The observation that U seemed to generate more oxidative
stress than Cd in our conditions of exposure is discussed.
Keywords: cadmium, uranium, survival rates, histology, antioxidants, mitochondria.
234
1. Introduction
Trace metals are ubiquitous. If their environmental concentration exceeds a certain
threshold value, they will adversely affect living organisms. Considering their biological
effects, this group is extremely heterogeneous. In fact some heavy metals such as cadmium
(Cd) are toxic even in small quantities. Others such as uranium (U) have the distinctive
feature of being radioactive (Ribera et al., 1996). Even though natural U is radiotoxic, it is
believed that the major hazard rendered by this element results from its heavy metal toxicity
rather from its radiological toxicity (Fisenne and Welford, 1986, Barillet et al., 2007).
Depleted U (DU) is a low-level radioactive product which activity is about 60% lower than
that of natural U (WHO, 2001). Hence, effects from exposure of biota to depleted or natural U
are usually attributed to their chemical properties (ASTDR, 1999). Due to a lack of
information on the assessment of uranium’s toxicity, we choose to compare between studies
previously carried out in our laboratory (Chapter III, IV-A, and IV-B) on the effects of Cd and
U on the crayfish Procambarus clarkii after acute and chronic exposures. Indeed the goal of
this work was to produce more reliable information on the toxicity of U by choosing a
comparative ecotoxicological approach. This approach allows the collection of data on the
different effects and detoxification strategies developed by this species and point out
differences or similarities in molecular or cellular damage caused by Cd or U. In addition this
comparative study also permits to distinguish which of the two metals is the most toxic to
crayfish. It is known that U shares structural similarities with a number of different metals,
primarily Cd and lead (Domingo, 1994; Bleise et al., 2003; Arfsten et al., 2005). Groups of
adult male crayfish were exposed to 0 and 40µM of Cd or DU for 4 to10 days (acute
exposure) (Chapter III and IV-A) while others were exposed to 0 and 0.1µM of the studied
metals for 30 to 60 days (chronic exposure) (Chapter III and IV-B). The impact of the metals
on the survival rates of crayfish were reported in each study. In addition, gills and
hepatopancreas were collected after varying exposure periods (T4, T10, T30 and T60) to
assess the impacts of Cd and U on different biological endpoints and metal bioaccumulation.
The distribution of the metals in the epithelium of organs collected from acute exposure
experiments was evaluated as well (TEM-EDX). Possible effects on the histological structures
of the hepatopancreas were also examined at T10 and T60 after acute and chronic
contamination respectively. The expression levels of mitochondrial genes (12s, atp6, and
cox1) and genes involved in oxidative stress responses (sod(Mn) and mt) were also studied in
all experiments and finally the enzymatic activities of antioxidants (SOD, CAT, GPX, and
GST) were reported after chronic exposure to U and Cd (T30 and T60). New results are also
235
presented in this study to complete the data necessary for the comparison of the effects of the
metals on the different biological parameters of the crayfish.

2.1. Experimental design
All studied crayfish were adult intermoult males of the same size and length and were all
caught from the same swamp (Vigueirat swamp of Camargue, south of France; GPS
coordinates: 43°31.863’N-4°45.417’E). The specimens weighed around 25 ± 2.75g and were
about 9 ± 0.3 cm long. All organisms were acclimatized 3 weeks to experimental conditions
(12/12h light/dark photoperiod, in 17 ± 1 °C synthetic water (Al Kaddissi et al., 2011; 2012)
at pH 6.7 ± 0.2). During the acute exposure tests, groups of 10 animals were exposed up to 10
days to 0 µM Cd, 0 µM U, 40 µM Cd (from CdCl2 stock solution, 0.01M HCl) or 40µM U
(from DU stock solution UO2(NO3)2, 6H2O, 0.01M HCl) (n=40) while during the chronic
exposure experiment, groups of 10 animals were exposed for a maximum of 60 days to 0 µM
Cd, 0 µM U, 0.1µM Cd (from CdCl2 stock solution, 0.016M HNO3) or 0.1µM U (from DU
stock solution UO2(NO3)2, 6H2O, 0.016M HNO3) (n=40). It should be mentioned that for
each type of exposure (acute/chronic) the contamination of crayfish to U and Cd were
conducted simultaneously. This means that all the biological organisms were in the same
physiological state (were of the same age (size/length), the same stage of the molting cycle,
were caught on the same day from the same swamp, acclimatised simultaneously, were fed of
the same diet or starved for the same period) and the abiotic conditions were similar between
studies so only the type of the contaminant varied between conditions of exposure in both
experiments. Consequently, the comparison between effects of the different metals on
crayfish is reliable. All animals were kept at a density of ~3 crayfish/L and each individual
was isolated in a chamber (cylinder made from plastic netting: 1 cm mesh, 11 cm diameter) to
avoid death by cannibalism. Mortality of crayfish was checked on a daily basis. The water
column was renewed daily in all experiments. 50% of the test solution was changed in the
acute experiment while 25% was renewed in the chronic experiment to reduce the volume of
waste water solutions at the end of the tests. Cd and U concentrations were measured at least
once after renewal and adjusted to ensure mean values close to nominal contamination levels.
In the acute exposure experiment, the measured mean concentrations of Cd and U in water
were 46.17 ± 6.05 µM and 35.04 ± 10.5 µM respectively (n=20, mean ± SEM). In the chronic
exposure experiment, the mean measured concentration of Cd was 0.092 ± 4.3 10-3 µM while
that of U was of 0.12 ± 4.36 10-3 µM (n=60, mean ± SEM). The temperature was maintained
236
at 17.06 ± 0.23 °C and the pH was monitored throughout the exposures (pH acute: 7.01 ±
0.24; pH chronic: 6.22 ± 0.045). The concentrations of the major ions in water (NO3-, NO2-,
SO42-, Cl-) were checked by Ion Chromatography System (ICS-3000) during the experiments
and were always identical to the desired concentrations (NO3-=76.5, NO2-<5 10-5,SO42-=509,
Cl-= 4100 µM). At days 4 (T4), 10 (T10), 30 (T30), and 60 (T60) 4-5 live crayfish were
sampled and sacrificed from each exposure conditions. The hepatopancreas and gills were
collected from each individual and divided into parts for further biochemical analyses. The
parts designated for microscopic analyses were freshly prepared to this end, while others were
stored at -80°C until needed.
2.2. Metal quantification

The organs of all the experiments were first dried for 2 days at 45°C and then digested in
the same manner before analyses of the bioaccumulation (Chapter III, IV-A, and IV-B).
Water and biological samples from all experiments were all acidified by nitric acid (3.1 mM)
prior to metal quantification. Samples contaminated with U were analyzed for the highest U
concentrations by inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry (ICP-AES
Optima 4300DV, PerkinElmer, Wellesley/USA; detection limit: 10µg U/L ± 10%) and by
inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS Agilent 7500 Cx; quantification
limit: 10 ng.L-1 ± 7%) for the lowest concentrations. Cd concentrations were measured by
atomic absorption spectrophotometry using a graphite furnace (4110 ZL; Perkin-Elmer;
detection limit: 0.4 µg Cd/L).
2.3. Histochemical and histological methods

Fresh tissues were fixed with 2.5% glutaraldehyde in 0.1M sodium cacodylate buffer
(pH 7.4) for 48 h at 4 °C, then washed 3 times for 5 min with 0.1M sodium cacodylate buffer
(pH 7.4), and then post-fixed with 1% osmium tetroxide in the same buffer for 1 h (Chapter
III and IV-A). Samples were subsequently dehydrated with successive baths of ethanol and
propylene oxide, and finally embedded in Epon 812 (TAAB). Samples were cut in semi-thin
sections of 200 to 500 nm for light microscopy analysis. These semi-thin sections were
stained with aqueous blue toluidine then observed under a light microscope (Leica, DM 750)
and images were saved using a Leica camera ICC50 and LAS EZ software. Ultra-thin sections
of 80 and 140 nm were mounted on copper grids and observed with a Scanning Transmission
Electron Microscope(TEM/STEM, Tecnai G2 Biotwin, FEI company), equipped with a CCD
camera (Megaview III, Eloise). All sections were obtained using an ultramicrotome (UCT,
237
Leica). The localisation of Cd in the ultra-thin sections was conducted using the Energy
Dispersive X-ray analyzer equipped with a Super Ultra Thin Window (SUTW) model
sapphire (EDAX). The electron probe was then focused on specific spots and spectra were
recorded after 30 s of analysis. For each replicate organ, at least 30 micrographs of local
detailed structures were taken.
2.4. Genetic analysis

Total RNA were extracted from gills and hepatopancreas in all experiments and then
cDNA were synthesized using always the same techniques (Chapter III, IV-A, and IV-B).
Real-time PCR reactions (1 cycle: 10min at 95°C, then 50 cycles: 5s at 95°C, 5s at 60°C, and
20s at 72°C) using cDNA of samples from all exposure conditions of both experiments were
performed in a Light Cycler (Roche) following the manufacturer's instructions using the DNA
intercalating dye SybrGreen I. PCR specificity was determined for each reaction from the
dissociation curve of the PCR product which was obtained by following the SybrGreen
fluorescence level during a gradual heating from 60 to 95 °C. Relative expression of a gene
was generated using the 2−ΔCT method as described by Livak and Schmittgen (2001) where
ΔCT represents the difference between the cycle threshold of specific gene and the cycle
threshold of the 18S housekeeping gene (to normalize genes expression levels). Therefore, the
Expression’s factor (EF) of each gene in comparison with control corresponds to the
following equation: EF=2- ΔCT(Treatment)/ 2- ΔCT(Control).
2.5. Enzymatic activities analysis

Biochemical determinations have been described previously (Chapter III and IV-B).
Hereafter we only provide a brief description. Enzymatic activities were determined in the
cellular cytosolic fractions of tissues sampled from the chronic exposure experiment to
determine cellular oxidative stress. After homogenisation of the tissues, activities of SOD
were determined spectrophotometrically using “19160 SOD determination Kit” (Fulka)
(λ=450 nm). CAT activities were measured by following the decrease in absorbance at 240
nm due to H2O2 consumption (ε= 0.04 mM-1 cm-1). GPX activities were assessed by following
the oxidation of NaDPH at 340 nm using cumene hydroperoxide as a substrate (ε= 6.22 mM -1
cm-1). GST activity was measured with 1-chloro-2.4-dinitrobenzene (CDNB) as substrate.
This assay measured the formation of the conjugate with GSH at 340 nm (ε= 9.6 mM-1 cm-1).
Protein concentration was determined using “Micro BCATM Protein Assay Kit” (Thermo
238
scientific) (λ=562 nm). All biochemical analyses were performed with SOFTmax PRO
spectrophotometer at a constant temperature of 25°C.

Results are given as mean ± the standard error of the mean (SEM). All analyses were done
using the R language and environment for statistical computing (R Development Core Team,
2009). For all statistical results, a probability of P < 0.05 was considered significant. Survival
rate was presented using Kaplan Meier’s estimator (Kaplan 1983).This method estimates the
fraction of living organisms for a certain amount of time after treatment and takes into
account "censored" data (i.e. losses of crayfish by sampling at T4 before the final outcome is
observed at T10). The significant effects of factors (i.e. time and types of metals) on
bioaccumulation were performed using analysis of variance (ANOVA), after checking
assumptions of normality and variance homogeneity of residuals. When the assumptions were
not satisfied, a logarithmic data transformation was applied. If the assumptions were still not
satisfied the Kruskal-Wallis non-parametric test was used. In order to compare the effects of
Cd and U on the various gene Expression Factors (EF) and on antioxidant activities in both
organs and at different sampling times for each experiment, Principal Component analysis
(PCA) were necessary to visualize such high-dimensionality and to simplify exploration of
the results. PCAs were performed on a covariance matrix based on the EF and on a correlation
matrix based on enzymes activities. The data were arranged in a matrix of n rows and m
columns, in which n is the number of conditions (Organ-metals-time) and m the number of
variables (genes or enzymes). When the expression levels of certain genes were not different
significantly from control, the EF was indicated as equal to 1 in the ACP matrix. The number
of principal components (PCs) selected for the presentation of the results was based on
Kaiser’s rule (Kaiser and Rice 1974). This criterion retains axes explaining 82% of the total
inertia (variance), thus it was possible to restrict the PCA to the first two PCs.
3. Results
3.1. Survival rate
No mortality was recorded in control groups of both experiments. 33% of mortality was
observed in groups of crayfish exposed 10 days to 40 µM of Cd, while only 10% of the
crayfish died when exposed to the same concentration of U and period of time. Besides that
100% of the crayfish survived the chronic exposure to Cd and DU.
239
3.2. Bioaccumulation of DU and Cd
Cd and DU accumulations in organs in the acute experiment are shown in figure 72
Contaminated gills and hepatopancreas were significantly different from controls at T4 and
T10 (P< 0.05). The bioaccumulation of U and Cd was time dependent only in the
hepatopancreas (P< 0.05). Both metals were more concentrated in the gills rather in the
hepatopancreas when exposed to high concentrations of the metals. Bioaccumulation of U in
gills was about 23 (T4) to 27 (T10) times higher than the bioaccumulation of Cd in the same
type of organ (T4: P=0.018; T10: P=0.001). In fact, in gills the Accumulation Factors (AF=
metal concentration in organ (µg/g)/metal concentration in water (µg/ml)) of U at T4
(AF=942) and T10 (AF= 1480) were much higher than those of Cd at the same sampling
times (T4: AF= 65; T10: AF= 89). No significant difference was noted between the
concentrations of Cd and U in the hepatopancreas in the acute exposure experiment (T4: P=
0.24; T10: P=0.1).
Bioaccumulation of Cd or U in
20 000 300
hepatopancreas (µg/g DW)
a b
250
15 000
gills (µg/g DW)
200
T4 T4
10 000 150
T10 T10
100
5 000
50
a b
0 0
0 Cd 0U 40 µM Cd 40 µM U 0 Cd 0U 40 µM Cd 40 µM U
Exposure conditions Exposure conditions

exposed to 40 µM of Cd or U for 4 to 10 days (µg/g, mean ± SEM, n=4 except for U
contaminated organs at T10, where n=5). (a,b) concentrations designated with the same
letters are significantly different from each other (P< 0.05).
Metal accumulation in organs in the chronic experiment is shown in figure 73. A

significant difference was also observed between contaminated organs of crayfish exposed to
0.1µM of Cd or U and controls (P< 0.05). The accumulation of the metals was not time
dependent in any organ (P>0.05). Even at lower levels of exposure gills accumulated more U
than Cd at T30 (38 times more, P=0.00034) and T60 (22 times more, P=0.0013). The AF of U
in gills was up to 14 times higher than that of Cd (ex: AF U T30= 5918; AF Cd T30= 427).
Moreover, U accumulation levels were higher in gills than in hepatopancreas whereas, the
opposite was observed in the Cd exposure conditions. In fact, Cd concentrations in
hepatopancreas were 3 times higher than Cd concentrations in gills at T30 and T60. No
240
significant differences were observed between the bioaccumulation levels of U and Cd in the
hepatopancreas in the long term exposure experiment (T30: P= 0.412; T60: P= 0.154).
a b
200 200
Bioaccumulation of cd or U in
hepatopancreas (µg/g DW)
160 160
gills (µg/g DW)
120 T30 120 T30

80 T60 T60
80
40 a b 40
0 0
0 Cd 0U 0,1 µM Cd 0,1 µM U 0 Cd 0U 0,1 µM Cd 0,1 µM U
Exposure conditions Exposure conditions

exposed to 0.1µM of Cd or U for 30 to 60 days (µg/g, mean ± SEM, n=4 except for U
contaminated organs at T10, where n=5). (a,b) concentrations designated with the same
letters are significantly different from each other (P< 0.05).
3.3. Cd localisation and histological alterations by U

Cd was hard to localize by TEM-EDX, however flocculent forms of this contaminant
were found in the epithelium and cuticle of gills exposed to 40µM at T10 (Figure 74). In the
epithelium, Cd was co-localized mainly with phosphorus, chlorine, and calcium, and to a
lesser extent with silicon, aluminium, magnesium, sulfur and chlorine. In the cuticle, the
contaminant was chiefly associated to phosphorus and to a lesser extent to chlorine and the
other elements already cited above.
A distinct impairment of tissue structure was discerned in the hepatopancreas after 60 days of
contamination to 0.1µM of U (Figure 75). The epithelium of several tubules showed an
overall presence of numerous pathologically altered cells with cytoplasmic vacuoles. A lumen
dilatation and thinning of the epithelium were also observed, probably due to a loss of
epithelial organization. However, this phenomenon was confined to individual tubules and did
not affect the entire digestive gland, so some intact glandular epithelium was present even
after a long period of contamination.
241
Figure 74: Transmission electron micrographs coupled with energy X-ray results of P.
clarkii gills exposed for 10 days to 40 µM of Cd. Elements detected in matrix: O: oxygen,
Os: osmium and Cu: copper. Elements detected in the cuticle: Cd: cadmium, Al:
aluminium, Si: silicon, S: sulphur, Cl: chlorine, and Ca: calcium. (EX M) extra-cellular
matrix, (C) cuticle, and (G ep) gill epithelium.
242
L 1 2
T
R 50nm
LD
B V
3
T
LD
50 nm 50 nm V
Figure 75: Histological alterations in P. clarkii hepatopancreas tubules after 60 days of

exposure to dissolved U: (1) control, (2 and 3) 0.1µM U. (R) absorptive cells. (B)
Secretory cells. (L) Lumen. The pathologies observed were: (T) Thinning, (V)
Vacuolisation, and (LD) Lumen Dilatation.
3.4. Enzymatic responses in gills contaminated chronically

Results of PCA where the gills of crayfish contaminated 30 and 60 days to 0.1µM of Cd
or U were characterized by antioxidant activities, are given in figure 76. Results concerning
the hepatopancreas were not presented here because the enzymatic activities in the
contaminated conditions for the most part were not significantly different from controls. The
gills which had similar enzymatic activities tended to plot near one another forming
distinctive groups. In this analysis the first PC (PC1) accounted for 51.79% of the variance in
the enzymatic responses, while the other PC (PC2) accounted for 30.34%. The variables GPX
(28.6%), GST (29.26%), and SOD (30.31%) participated the most in the construction of PC1,
whereas CAT contributed 50.75% to the construction of PC2. Control groups at T30 and T60
were correlated the most to the variables CAT and GST while contaminated gills at T30
seemed negatively correlated to these two variables and positively correlated to GPX and
SOD. The distribution of Cd-contaminated gills sampled at T60 was difficult to assess
visually. However the coordinates of these individuals (given by the R program) were closest
to the coordinates of CAT and GST. On the other hand U-contaminated organs at T60 seemed
negatively correlated to all the variables.
243
CAT
GST
G-60-0
G-60-U
G-30-0
G-60-Cd
G-30-U
G-30-Cd
GPX
SOD
Figure 76: Principal components analysis (PCA) ordination of gills of crayfish P. clarkii
exposed to 0.1 µM of U or Cd at T30 and T60 characterized by the activities of SOD
(Superoxide dismutase: U/mg Prot), CAT (Catalase: µmol/min/mg Prot), GPX
(Glutathione peroxidise: µmol/min/mg Prot), and GST (Glutathione S transferase:
µmol/min/mg Prot). Note: arrows with dot heads represent replicate samples in each
exposure condition.
244
3.5. Expression factors of the studied genes
PCA ordination of the contaminated organs at different sampling times characterized by
the expression factors of 12s, atp6, cox1, sod(Mn) and mt are reported in figures 77 for the
acute exposure experiment and in figure 78 for the chronic exposure experiment. Both
ordinations (Acute/chronic) successfully arranged hepatopancreas and gills according to
transcriptional responses. Organs having similar gene expression levels tended to plot near
one another forming clusters. In the acute exposure experiment the first PC (PC1) alone
accounted for 95.53% of the variance of genes expressions in the organs, whereas the PC2
explained only 3.97% of the variance. The variable atp6 contributed 99.82% to the
construction of PC1 while mt contributed the most to the construction of the PC2 (95.93%)
followed by 12S (3.79%). The lengths of the arrows of the vectors (variables) are proportional
to the contribution of the variables to the construction of the axes. Thus it is obvious that
cox1and sod(Mn) present the least contribution to the arrangement of the axes (0.19% for PC2
and 0.05% for PC1 respectively). However, the coordinates of individuals representing DU
exposure conditions were closest to the coordinates of the variables cox1 and sod(Mn). Cd
contaminated organs that were sampled at T4 loaded highest on the first axis while the T10-
Cd contaminated organs loaded the most on the second axis.
mt
G-Cd-T10
12S
Hp-Cd-T4 Hp-Cd-T10
atp6 sod.Mn G-U-T10

G-Cd-T4 Hp-U-T4
Hp-U-t10
cox1
G-U-T4
Figure 77: Principal components analysis (PCA) ordination of hepatopancreas and gills
of crayfish P. clarkii exposed to 40 µM of U or Cd at T4 and T10 using the expression
factors of 12s, atp6, cox1, sod(Mn) and mt compared to the basal level of controls (n=5).
Note: clusters were manually added for better visualisation.
245
In the chronic exposure experiment the first PC (PC1) alone accounted for 96.45% of the
variance of genes expressions in the organs. The first two components (PC1+PC2) explained
together 98.67% of the variance; this means that the loss of information due to the projection
of the plots was insignificant. Moreover, the variable atp6 contributed to 99.26% of the inertia
(variance) of the CP1 while the construction of the CP2 was attributed to 12S (31.18%),
sod(Mn) (30.87%), mt (30.16%) and cox1 (7.67%). The coordinates of the plot representing
Cd-contaminated gills sampled at T30 was strongly correlated to the variable atp6 while the
correlation of Cd-hepatopancreas at T30 with the variables was difficult to assess visually.
However the coordinates of this last plot were obtained by R program and demonstrated that
they were closest to the variables mt, 12s and atp6. Cd-contaminated organs sampled at T60
were also closest to the variable mt, 12s and also to atp6. The U-contaminated gills sampled at
T30 were significantly negatively correlated to the variable atp6 while all other U
contaminated organs were correlated to the variables atp6, cox1 and sod(Mn).
mt
12S
Hp-Cd-T60
G-Cd-T60
Hp-Cd-T30
G-U-T30
atp6 Hp-U-T60 G-Cd-T30
Hp-U-T30
G-U-T60
cox1
sod.Mn
Figure 78: Principal components analysis (PCA) ordination of hepatopancreas and gills
of crayfish P. clarkii exposed to 0.1 µM of U or Cd at T30 and T60 characterized by the
expression factors of 12s, atp6, cox1, sod(Mn) and mt compared to the basal level of
controls (n=5). Note: clusters were manually added for better visualisation.
246
4. Discussion
4.1. Comparison of the mortality rates
The survival rate of the crayfish P. clarkii was lower in groups contaminated to 40µM of
Cd than in groups exposed to the same concentration of DU. Studies comparing the effects of
DU and Cd on the survival rates of aquatic invertebrates are scarce. A study on the resistance
of freshwater benthic macroinvertebrate Tubifex tubifex to U via an exposure to contaminated
sediments showed that the LC50-12 days for this species is equal to 2910 mgUg-1 dry wt
(Lagauzère et al., 2009). Authors compared the sensitivity of this worm to other heavy metals
already reported in literature and stated that the toxicity of U to T. tubifex seemed lower than
copper, Cd, and nickel (Milani et al., 2003). Martins et al. (2007) summarized in their review
the Cd LC 50-48h values of the microcrustacean Daphnia magna found in literature. The
lowest concentration reported was equal to 0.009 mg Cd.L-1(Lewis and Horning Ii, 1991)
whereas the highest was of 0.065 mg Cd/L (Toussaint et al., 1995). On the other hand, the
lowest U LC50-48h for Daphnia magna reported by Zeeman et al. (2008) was equal to 0.39
mg U/L while the highest was of 7.8 mg U/L. These findings show that Daphnia magna
seemed more tolerant to U toxicity than Cd. Moreover, the Cd LC 50-96h of the fish Danio
rerio is around 2.2 mg Cd/L (Martins et al., 2007), where the U LC 50-96h for the same
species is almost of the same range and equal to 3.05 mg U/L (Labrot et al., 1999). However,
the different conditions under which the assays on the fish were performed (pH, water
hardness, temperature…) make it difficult to draw any relevant comparison. Moreover, the
crayfish mortality rates in the present study were low demonstrating the resistance capacities
of P. clarkii. This crayfish also resisted long term exposure (60 days) to 0.1µM of Cd and U.
Wigginton and Birge (2007) demonstrated in the same study that P. clarkii was more resistant
to Cd exposure when compared with other crayfish species (Orconectes sp. and Procambarus
sp.). In addition, this species tolerates high concentrations of metals of greatest toxicological
significance such as lead (Pb) and mercury (Hg) (Del Ramo et al., 1987; Torreblanca et al.,
1989; Naqvi and Howell, 1993). In fact P. clarkii has been used as a bioindicator of heavy
metal toxicity in numerous field studies (Finerty et al. 1990; Sánchez López et al.
2004;Higueras et al. 2006; Hothem et al. 2007; Richert and Sneddon 2008; Faria et al. 2010;
Moss et al. 2010;Suárez-Serrano et al. 2010). Therefore, the tolerance of this species toward
U and Cd make these organisms good candidates to be used as alert systems in case of acute
water contamination such as accidental spills, industrial wastewater discharge and accidental
or intended water poisoning.
247
4.2. Comparison of the bioaccumulation and detoxification
This species seemed to be more tolerant to U despite of its high levels of concentrations in
organs after the acute exposure. The crayfish bioaccumulated 23 to 27 times more U in the
gills than Cd. A possible explanation could be differences in the detoxification mechanisms
between both metals. The electron probe Xray microanalysis detected Cd in flocculent forms
which were localized in the epithelium and cuticle of gills exposed to 40µM of Cd at T10.
Deposits of Cd were observed by Tayal et al. (2000) in fish Colisa fasciatus cells, where they
were visualized as dense clouds. They demonstrated that Cd in presence of Na2S is converted
into insoluble metal sulfides. In our experiment, Cd was co-localized mainly with phosphorus,
chlorine and calcium. A similar description was reported in cells of Azolla filiculoides shoots.
The analysis of Cd content in the shoot demonstrated the appearance of dark grains about 0.3
µm, the Cd in these grains was accompanied by phosphorus and calcium (Sela et al., 1988).
Indeed, heavy metal containing granules found in epithelial cells of invertebrates may contain
either calcium or heavy metals such as zinc, copper, iron… complexed with sulfur or
phosphorus (Ahearn et al., 2004). As a result of these complexation events with anions, the
heavy-metal ion is removed from the cytoplasm by sequestration within a vacuolar membrane
in an insoluble, detoxified form. Subsequent cellular exocytotic events may extrude the
concretions from the cell followed by excretory mechanisms (Ahearn et al., 2004; Marigómez
et al., 2002). Moreover, TEM analysis led to the detection of piles of flake shaped U inside
the gills epithelium after 10 days of exposure to 40µM of DU (Chapter IV-A). This form of U
was mainly co-localized with phosphorus which is insoluble and non-toxic. Similar results
were also observed in the bivalve Corbicula fluminea (Simon et al., 2011). It should be noted
that Cd was harder to localize by TEM than U, Cd could have strongly bound to organic
ligands such as proteins (e.g. metallothioneins (MT)), lipids, and nucleic acids in which case,
it may not have been complexed with sulfur or phosphorus and therefore remained
histochemically invisible. Thus once the metals are absorbed, it is possible that Cd binds to
organic ligands quicker than U. Another explanation to the higher levels of U detected in gills
when compared to Cd could be related to differences in the adsorption capacities of the metals
on the tissues. Choi et al. (2009) demonstrated that the adsorption capacity of Cd, U and Pb
on starfish and bacterial cells followed the order: U(VI)>Pb>Cd. It seems that cells
preferentially sorb U, followed by Pb, and exhibit the least preference for Cd. It was
suggested that the mechanisms for metal uptake process are mainly both organism- and metal-
dependent because of specific surface properties of the organisms, cell physiology, and
solution chemistry. In the chronic experiment gills also accumulated more U than Cd possibly
248
for the same reasons stated above. Interestingly, when comparing the bioaccumulation levels
between organs different results were obtained for the acute and chronic experiments in the
case of Cd. In fact, Cd concentrations were lower in gills than in hepatopancreas when
contaminated chronically, while the opposite was observed in the acute exposure conditions.
This could be related to the differences in the adsorption rates on tissues of the different
waterborne Cd concentrations (40µM vs 0.1µM) (Chapter III). In U exposure conditions, gills
always bioaccumulated more U when compared to the hepatopancreas no matter the type of
exposure (acute/chronic). These results also demonstrate that Cd and U have different transfer
capacities to organs. Indeed, in the acute exposure experiment crayfish accumulated up to 263
times more U in gills than in hepatopancreas whereas this factor was maximum equal to 6 for
Cd. This shows that Cd is more easily transferred to organs than U. This hypothesis is also
verified in the chronic exposure experiment since the hepatopancreas bioaccumulated more
Cd than gills and the contrary was observed for U. Examination of the storage and distribution
of Cd and U in roots and shoots of the plant Azolla filiculoides showed thatCd relative content
in the shoot was similar to its content in the root, hence its mobility was relatively high.
Authors also showed that the absence of significant U quantities in the shoot despite of the
relatively high content in the root suggest a lesser mobility of U than Cd from Azolla root
(Sela et al., 1988). These findings are in concordance with our results. A tendency of
increasing metal bioaccumulation with time was observed in organs sampled from the acute
exposure experiment even though statistically it was only significant in hepatopancreas. Then
again, the chronic Cd and U bioaccumulation in gills seamed to have reached a steady state at
T30 and T60 on the opposite to the accumulation in the hepatopancreas. At last, crayfish were
able to bioconcentrate rapidly both contaminants in their tissues after exposition to 40µM of
the contaminants (high AF at T4: e.g. AFgills-40µM Cd~ 65 and AF gills-40µMU~ 942). P.
clarkii was found to be also capable of concentrating U after 4 days in gills and
hepatopancreas even after a low level of waterborne exposure (0.1 µM U) (Chapter IV-A).
Diaz-Mayans et al. (1986), also demonstrated that P. clarkii can bioaccumulate Cd in these
tissues after 4 days when exposed to 0.1µM via a direct route of exposure. This capacity of
the crayfish to bioaccumulate the studied metals early can be useful in field studies, caging
experiments and biomonitoring programs.
249
4.3. Comparison of histopathological effects between Cd and U
A previous study has shown that U induces histological damages to the hepatopancreas of
P. clarkii after 10 days of exposure to 40 µM of U (Chapter IV-A). In the present study we
demonstrated that this metal provoked similar damage after a long term exposure (60 days) to
a low concentration of waterborne U (0.1 µM). In fact, the symptoms were identical; both
experiments had demonstrated that U causes vacuolisation, lumen dilatation and thinning of
the epithelium of the hepatopancreas. However, in the U acute exposure experiment we have
additionally examined a disorganisation of the epithelium and evidenced the presence of
degenerated tubules. This shows that the extent of histopathological damage was in line with
the bioaccumulation of U determined in the soft tissues in both experiments. The
concentration of U recorded in the hepatopancreas after 10 days of exposure to 40 µM (78.8 ±
31.2 µg U/ g DW) was higher than the concentration found after 60 days of exposure to 0.1
µM (39.91 ± 8.07 µg U/ g DW). In a previous study, we have demonstrated that the
epithelium of the hepatopancreas of P. clarkii showed vacuolisation after 60 days of exposure
to 0.1µM of Cd (Chapter III). This demonstrates that vacuolisation is a similar symptom of
both Cd and U toxicity. Moreover, vacuolisation in hepatopancreatic cells of the green mussel
Perna viridis exposed to various concentrations of copper and mercury were observed in
various degrees (Pillai and Menon, 1998). Additionally, one of the prominent effects of
platinum on the liver of the fish Danio rerio and on the hepatopancreas of the ramshorn snail
Marisa cornuarietis is increased vacuolisation in cells (Osterauer et al., 2010). Exposure of
the crayfish P. clarkii to high levels of Cd concentrations also revealed structural damage in
the hepatopancreas. For example, when exposed to 40 µM Cd for 10 days vacuolisation,
lumen dilatation, thinning of the epithelium and cellular shrinkage were observed in this
organ (Chapter III). It should be highlighted that these symptoms were identical to those
observed in the hepatopancreas of P. clarkii exposed to 40 µM of DU. Moreover degenerated
tubules were seen in these organs which indicates that DU can lead to cell death. In fact
studies have already reported that U can induce apoptosis and necrosis in cells (Thiébault et
al. 2007; Periyakaruppan et al. 2009). It is also known that cellular shrinkage is the first sign
of programmed cell death (Rost-Roszkowska et al., 2010), thus we suspect that 40 µM of Cd
led to apoptosis of hepatopancreatic tubules of crayfish. In fact, it has already been confirmed
that apoptosis is one of the hepatopancreas cell death pathways of the crab Sinopotamon
yangtsekiense upon Cd administration (Li et al., 2010). Cd is also capable of provoking
necrosis in cells, in effect histopathological examination showed tissue injuries consistent
with inflammation and necrosis in the digestive gland of the common mussel Mytilus edulis
250
during Cd exposure (11 days at 20 and 50 µg/L) (Sheir and Handy, 2010). At this level of
comparison it is difficult to draw conclusions on the classification of the cytotoxic effects of
U and Cd because no statistical analyses were conducted to quantify these impacts. However,
a comparative study between the cytotoxicity of U and other metals on the osteoblastic bone
cells of rats was conducted and permitted to classify Cd, Zn, Se IV and Cu as the most toxic
and Ni, SeVI, Mn and U as the least toxic. The toxicity of metals was determined from the
quantification of cell viability by comparison to controls(Milgram et al., 2007).
4.4. Comparison of the antioxidant responses

The exposed gills of P. clarkii sampled after the chronic experiment were clearly
separated into related clusters by PCA using the enzymatic responses of SOD, CAT, GPX and
GST (Figure 76). The enzymatic responses in contaminated gills of P. clarkii were influenced
by the time of exposure since the organs at T30 were separated from those at T60. The
oxidative stress seemed more important at T60 than T30 since the distance between
contaminated organs and control of the corresponding sampling time were more marked and
elongated at T60 than T30. At T30 the contaminated gills (especially to U) were close to the
corresponding control organs and formed a cluster demonstrating that the activities of the
enzymes were not significantly different in these conditions. Nevertheless, Cd and U
contaminated organs at T30 seamed negatively correlated to CAT and GST. This
demonstrates that the activities of these enzymes were tending to decrease in presence of the
contaminants. Two other distinctive clusters were also formed, the first contained the organs
contaminated to U during 60 days and the second consisted of the contaminated gills with Cd
at T60. This ordination of the plots demonstrated the differences between the effects of Cd
and U on this level of biological organisation. The contaminated organs with Cd and U at T60
were oppositely detached from their corresponding control group and thus were all negatively
correlated to CAT and GST. However, contaminated gills with U at T60 were more isolated
from the control groups and from all the other conditions and were negatively correlated to all
the enzymes. This result indicated that the enzymatic responses of all the studied antioxidants
tended to decrease at the end of the experiment in presence of U. The decrease in antioxidants
responses in presence of Cd or U could be linked to a decrease in substrates, expressions
levels of the corresponding genes, oxidative alteration of the enzymes, and/or direct binding
of the contaminants to the proteins (Chapter III and IV-B). In fact, Bem and Bou-Rabee
(2004) stated that the chemical toxicity of uranium is similar to that for other heavy metals,
e.g. cadmium or mercury and is due to its chemical affinity to proteins and formation of stable
251
complexes with biological ligands of low molecular mass. GPX (P=0.0054) and SOD
(P=0.037) activities were significantly more depleted in U contaminated organs than in those
exposed to Cd at T60. Therefore it seamed that the oxidative stress was more important in the
U exposed organs which is in concordance with the bioaccumulation levels. Even though U
concentration in gills was 22 times higher than that of Cd, the observed decrease in enzyme
activities was low when compared to the Cd contaminated condition (GPX: -33.15 % ± 3.24,
GST: -6.3 % ± 6.5, CAT: -24 % ± 20, and SOD: -18.6% ± 7.06). It should be reminded that
the bioaccumulation levels result from adsorption, internalisation of the metal, and the
detoxification mechanisms. Thus it is possible that a part of U was precipitated in a detoxified
form and/or adsorbed on the cuticle and remained biologically unavailable. Consequently it is
not possible to indicate whether or not Cd is capable to generate more oxidative stress than U,
nor to classify the toxicity of the metals at this level of biological organisation. Moreover, the
mechanisms by which U and Cd generate oxidative stress are different which complicate the
comparison between the toxicity of both metals. Indeed, it is well known that Cd promotes
indirectly oxidative stress in cells (Wang et al. 2004; Shi et al. 2005) because it is a redox-
inactive metal that cannot induce fenton-like reactions (Ercal et al., 2001). U on the other
hand, is able to chemically activate oxygen species in the course of redox reactions via the
redox chemistry of transition metals (Miller et al., 2002; Yazzie et al., 2003). Furthermore, U
can enhance the production of free radicals via the ionization phenomenon induced by alpha
particle emissions (Jones et al., 2003).
4.5. Comparison of the variations in transcriptional responses

It has already been proven that both Cd and U impact the mitochondria (Pulido and
Parrish, 2003; Valko et al., 2005; Pourahmad et al., 2006;Cannino et al.,2009;Lerebours et al.,
2009;Lerebours et al., 2010) (Chapter III, IV-A, and IV-B) and generate oxidative stress
(Stohs et al. 2001; Gonzalez et al. 2006; Barillet et al. 2007; Jia et al. 2010;Wang et al.
2010;Barillet et al. 2011)(Chapter III and IV-B). In previous studies we evidenced alterations
in the expression levels of mitochondrial genes (cox1, atp6, and 12S) and genes involved in
the oxidative stress responses (sod(Mn) and mt) in gills and hepatopancreas of P. clarkii
exposed to 40µM or 0.1µM of either Cd or U. In the present study, we observed that the gills
and hepatopancreas of crayfish sampled from the different conditions of exposure of the acute
experiment (metals-time) were separated into groups by PCA using the expression factors of
cox1, atp6, 12S, sod(Mn), and mt. All U contaminated organs constituted a tight cluster that
was distinctive from the two other groups formed by Cd contaminated organs. In addition, the
252
organs sampled at T4 from the Cd exposure conditions were clearly separated from those
sampled at T10. The expression levels of atp6 in the studied organs conditioned the most this
organisation. Indeed, the most variability in the expression factors was observed for the atp6
gene. In fact, the Cd contaminated organs at T4 were associated the most to the variable atp6
which discriminated this group from all others. Toxic metals can have two types of effects:
(1) indirect, due to the additional metabolic cost of accumulating, transporting, storing, and
excreting the contaminant; and (2) direct, on cellular membranes and/or specific biochemical
pathways (Labrot et al., 1999). Without a doubt, the ATP synthase is responsible for both
ATP synthesis and hydrolysis (Li and Neufeld, 2001),thus high variations in atp6 gene
expression levels are expected when cells are facing a stress caused by metals. Cells could
produce more ATP for maintaining the viability of crayfish and provide additional energy to
the defence mechanisms (e.g: transporting, storing, excreting, detoxification…), or in certain
pathologies the ATP synthase can hydrolyse the ATP as a response to a mitochondrial stress
in order to maintain the H+ gradient(Nevière, 2008; Wang and Oster, 1998). Either way, the
solicitation of the ATP synthase was clearly elevated in contaminated organs. Moreover,
Muhlia-Almazan et al., (2008) stated that the level of expression of this gene can change in
response to environmental changes and to endogenous physiological conditions, which makes
the expression of this gene predisposed to be highly altered. At T10 the Cd contaminated
organs were associated the most to the vectors mt and 12s which means that the expression
levels of these two genes distinguished the most this group from the others. In fact, mt gene
was always up-regulated in Cd contaminated organs and was the most expressed in gills at
T10 (gills: 39-fold; hepatopancreas: 11-fold) (Chapter III), while it was only over-expressed
in gills contaminated to U at T10 (5-fold up) (Chapter IV-A). Indeed, Cd (Duncan et al.,
2006) and U (Michon et al., 2010) can bind to MT. It is also known that the concentration of
metals ions required for the induction of MT and the time required for response varies
according to the metal (Freedman et al., 1993; Haq et al., 2003). The mt gene can also be up-
regulated because of an increase in oxidative stress (Iszard et al., 1995;Andrews, 2000; Haq et
al., 2003).The amount of mitochondria seemed to increase over time in presence of high
levels of Cd (Chapter III), whereas 12S was down-regulated in U contaminated organs at the
end of the experiment indicating a decrease in the number of the organelles (Chapter IV-A).
This shows the difference in cellular response facing Cd or U stress. The variables cox1 and
sod(Mn) seemed to be most strongly associated with the group formed by the organs of
crayfish exposed to U. This association demonstrates that all the U contaminated organs had
similar expression levels of cox1 and sod(Mn) genes. The hepatopancreas contaminated with
253
Cd and sampled at T10 were close to the U contaminated gills of the same sampling time.
This distribution is due mostly to similar gene expression levels of cox1 andatp6 in both
conditions. It should be mentioned that overall the cox1 gene was repressed in all
contaminated organs during the experiment whereas the atp6 gene was mainly over-expressed
(Chapter III and IV-A). It was obvious that both metals impaired the mitochondrial chain
reaction, it also appeared that the pattern of expression of these two genes were similar when
organs are exposed to high levels of Cd or U.
In the chronic exposure experiment, distinctive groups were also formed between Cd and U
exposed organs (Figure 78). In fact, Cd contaminated gills and hepatopancreas sampled at
T30 were separated from those sampled at T60, while U contaminated organs formed a
distinct cluster except for gills sampled at T30 which were clearly separated from all others.
The separation of the groups contaminated with Cd from those contaminated with U was
especially due to the variations in the expression levels of the genes atp6, mt, and 12S as it
was observed in the acute exposure experiment. Cd contaminated organs sampled at T60 are
better correlated to these variables than those sampled from the Cd exposure condition at T30,
which demonstrates higher values in the expression factors of these genes at T60. The gills
exposed to U and sampled at T30 showed the highest variation in the expression factor of the
atp6 gene since they were significantly negatively correlated to this variable. The other U
contaminated organs seemed to have a similar pattern of gene expression especially for atp6,
cox1 and sod(Mn). However a negative correlation to the variables cox1 and sod(Mn) was
observed for the Cd contaminated organs which demonstrates a difference in the pattern of
these gene expressions in organs exposed to low levels of Cd or U. The current PCA results
demonstrated that even though both studied metals impact the mitochondria and alter the
expression of genes involved in oxidative stress responses the mechanisms by which they
induces such toxicity seams different. Nevertheless, it is easier to classify metals according to
their toxicity by comparing the effects on higher biological levels while a “Top-down”
approach (population to molecular levels) has a more mechanistic value (Snape et al., 2004).
Acknowledgments
The authors would like to thank Dr F. Coppin for J-CHESS simulations, N. Gauthier for
providing the crayfish, B. Geffroy for his assistance in dissecting P. clarkii, S. Pierrisnard for
ionic chromatography measurements, C. Della-Vedova and L. Février for helping in statistical
analysis, and R. Al kaddissi for his proofreading support. This study was supported by the
254
ENVIRHOM research program funded by the institute of Radioprotection and Nuclear Safety
and co-financed by the CNRS.
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261
Chapitre VI
Synthèse générale et perspectives.
262
1. Rappel du contexte, des objectifs et de la démarche expérimentale
Les états membres européens sont ou seront confrontés dans un avenir proche à la
mise en place de nouvelles installations, à l’expansion ou au maintien des programmes du
nucléaire incluant le démantèlement, la mise en œuvre de sites de stockage de déchets ou
encore la gestion d’anciens sites miniers d’uranium après leur exploitation (cf. figure 23). A
titre d’exemple, la France est actuellement en train de développer de nouvelles installations en
Basse-Normandie (construction de l’EPR sur le site de Flamanville). La gestion du nucléaire
civil renforce l’enjeu sociétal et scientifique de la radioprotection de l’environnement. Les
connaissances disponibles dans la bibliographie concernant les études d’impact de l’U sur la
composante biotique sont rares. Bien que quelques études mettent en évidence les capacités
de ce métal à induire des changements au niveau de grandes fonctions biologiques (telles que
la reproduction, la physiologie et le comportement), nous sommes encore loin d’avoir
découvert l’ensemble des impacts induits et les mécanismes associés. Il est donc nécessaire
d’acquérir de nouvelles données afin de pouvoir prédire l’impact de l’uranium dans
l’environnement et de participer à la mise en place d’un système de radioprotection de
l’environnement. Démarré en 2001 au sein de l’IRSN, le programme ENVIRHOM a pour
objectifs de permettre une meilleure évaluation des risques liés à l’exposition des
radionucléides à la fois sur l’environnement et sur la santé de l’homme. Ce programme a
souligné l’insuffisance de données expérimentales dans un domaine spécifique de la
radioprotection, celui de la contamination chronique à faible dose des organismes par les
radionucléides et leur incorporation chez l’homme par ingestion. C‘est dans ce contexte
spécifique que s'inscrit la problématique de cette thèse dont les travaux avaient pour objectif
d'appréhender les dysfonctionnements physiologiques induits par l’U sur l’écrevisse P.
clarkii. Cette approche a été réalisée à travers le développement et l’utilisation de plusieurs
marqueurs faisant appel à différents niveaux d'intégration biologique (moléculaire, protéique,
cellulaire, individuel) et à différents champs disciplinaires. Ainsi, les processus de
bioaccumulation et de détoxication métallique (MET-EDX et le suivi de l’expression du gène
mt) ou encore, la modification de la balance oxydative (activité enzymatique de la GST, SOD,
CAT, GPX, expression du gène sod(Mn)), l’impact sur les mitochondries (atp6, cox1, 12S),
l’histopathologie et la survie des individus ont été appréhendés. En effet, en l’absence
d’études sur la toxicité de l’U chez l’écrevisse P. clarkii dans la bibliographie, le choix des
paramètres biologiques est fondé sur les effets toxiques identifiés pour le Cd et ceux identifiés
chez le poisson zèbre après exposition à l’U (Barillet et al. 2007; Barillet et al. 2010;Barillet
et al. 2011; Bourrachot et al. 2008; Lerebours et al. 2009 ; Lerebours et al. 2010a; Lerebours
263
et al. 2010b). Cette démarche utilise a priori les connaissances acquises sur un métal
fortement étudié, le Cd, et sur l’U, passées au crible des premiers résultats obtenus sur le
modèle poisson. Cette démarche de « screening », présente plusieurs avantages en
écotoxicologie. Elle permet de tester et de sélectionner des biomarqueurs utilisables in fine sur
le terrain, de dégager un lien entre les différents niveaux de l’organisation biologique ou
encore d’orienter la recherche afin d’approfondir les connaissances sur les mécanismes de
toxicité du métal. En plus, nous avons essayé de caractériser et de mieux comprendre la
toxicité de l’U en la comparant à celle du Cd et de l’233U à des concentrations équivalentes.
Nous allons tenter, au cours de cette synthèse générale, de dégager les résultats les plus
marquants suite à l’exposition au Cd et à l’U et de mettre en évidence le niveau atteint pour
chaque objectif (cf. Chapitre I-A).
2. Niveau atteint des objectifs

2.1. Le modèle biologique (cf. Chapitre I-A objectif ii)
La majorité des informations concernant les effets biologiques de l’U sur les
organismes aquatiques a été acquise à partir d’expériences effectuées sur le poisson zèbre
Danio rerio (Labrot et al. 1999; Barillet et al. 2007; Bourrachot et al. 2008; Lerebours et al.
2009; Barillet et al. 2010; Lerebours et al. 2010a; Lerebours et al. 2010b; Barillet et al. 2011;
Gagnaire et al. 2011; Simon et al. 2011). Cet organisme modèle vit dans les régions tropicales
et possède donc une répartition géographique limitée contrairement à P. clarkii (cf. figure 1 et
2). Ainsi, l’utilisation de cette espèce de poisson comme bioindicatrice de contamination dans
l’environnement apparait restreinte. Il est donc évident que le développement des
biomarqueurs utilisables dans des programmes de biosurveillance doit se focaliser sur des
organismes sentinelles largement répandus dans l’environnement. Ces organismes sentinelles
naturellement présents dans le milieu intègrent les modifications spatio-temporelles des
stresseurs. Abondants dans le milieu récepteur, ils doivent être résistants à la contamination
chronique (et accidentelle) mais aussi être capables de marquer la pollution. De plus, ce
poisson de petite taille, n’est pas consommé par les populations humaines, contrairement à
l’écrevisse. La distribution géographique actuelle, la vitesse d’expansion et les densités de
populations atteintes de cette espèce invasive conduit à sa consommation (50 000 tonnes/an,
Arignon, 2004) dans de nombreux endroits du globe. La contamination de P. clarkii peut alors
constituer, dans certains cas, un risque sanitaire. Rappelons que la plupart des réponses
264
biologiques face à un contaminant dépendent de l’espèce considérée et de sa résistance
(Ballestros et al., 2009). Il est donc évident que le développement de biomarqueurs utilisables
dans des programmes de biosurveillance doit se faire sur des organismes sentinelles largement
répandus dans l’environnement.
Notre travail a mis en évidence la forte capacité de résistance de l’écrevisse P. clarkii
à l’U et au Cd. Ceci a été illustré par les faibles pourcentages de mortalité obtenus après les
expositions à de fortes concentrations en métaux. En effet, suite à une contamination aigüe
des écrevisses, nous n’avons observé respectivement que 10% et 30% de mortalité après
exposition à 40 µM d’U ou de Cd, respectivement. Compte tenu de ces pourcentages, cette
espèce paraît être plus résistante à l’U qu’au Cd. Ce point sera discuté plus en détail dans la
suite de cette partie. De même, aucune mortalité des écrevisses n’a été observée après
exposition chronique à de faibles doses de Cd (10 µg/L) et d’U (30 µg/L) et ceci même après
60 jours d’exposition au laboratoire. Cette espèce résiste donc à une large gamme de
concentrations et de durées d’exposition. A cette caractéristique s’ajoute le fait qu’elle est
capable de bioaccumuler les deux métaux étudiés. Les concentrations de Cd et d’U observées
dans les organes étaient élevées et significativement différentes de celles des témoins (cf.
Chapitre VI 2.2) dans toutes les conditions d’exposition (à tous les temps et toutes les
concentrations). De plus, nous avons noté des effets moléculaires à fortes et faibles
concentrations (0.1 µM de Cd et d’U) et sur des temps courts (4 et 10 jrs). Ces marqueurs
mesurés chez l’écrevisse s’avèrent être sensibles. En effet, il est possible de suivre les
réponses de biomarqueurs moléculaires chez l’écrevisse après une exposition à des
concentrations environnementales rencontrées à proximité de zones faiblement et fortement
impactées par les activités minières. En raison de l’ensemble de ces résultats, cette espèce
semble être un bon organisme sentinelle pour le suivi de contamination dans l’environnement.
2.2. La bioaccumulation et la détoxication (cf. Chapitre I-A objectif i)

La quantification des deux métaux dans les différents tissus étudiés confirme les capacités
d’accumulation de l’écrevisse. En effet, la bioaccumulation était rapide (dès 4 jours) et élevée
(Facteur d’Accumulation élevé). Les concentrations accumulées en U dans les branchies
étaient supérieures à celles du Cd suite à une contamination à des concentrations molaires
équivalentes (40 µM). Malgré ces résultats, le taux de mortalité des écrevisses était moindre
dans la condition d’exposition à l’U. En parallèle des propriétés physiques et chimiques de ces
deux éléments responsables d’un effet direct sur les organismes, nous avons émis l’hypothèse
que des différences dans les mécanismes de détoxication puissent être à l’origine de tels
265
résultats. Les observations de microlocalisation des métaux réalisées via le microscope à
transmission électronique couplées aux analyses chimiques réalisées grâce à la sonde multi-
élémentaire (EDX) ont révélé des différences entre les mécanismes de détoxication des deux
métaux. Ces mécanismes, déterminant le pool toxique, peuvent être à l’origine de la résistance
des écrevisses. Cette approche développée au LRE se consacre à l’identification d’amas
subcelluaires denses aux électrons. Notons que ces granules insolubles (Metal Rich Granules)
ne sont représentatives que d’une partie des mécanismes de détoxication mobilisables par la
cellule ; la formation de complexes avec des molécules dédiées (exemple des MT) et la
séquestration dans les lysosomes n’étant pas identifiées par cette technique (Viarengo et al.,
1989). En effet, des précipités d’U en forme de paillettes ont été co-localisés avec du
phosphore dans l’épithélium branchial, alors que le Cd a été localisé dans des formes
« floconneuses » avec principalement du phosphore, du chlore et du calcium. Ces formes
floconneuses semblent être des granules qui ressemblent à ceux retrouvés chez les crustacés
durant les phénomènes de détoxication (Ahearn et al., 2004). En effet, les métaux sont
normalement complexés avec du phosphore ou du souffre et piégés dans des vacuoles qui
seront ensuite excrétées par les cellules (Chassard-Bouchaud, 1982; Fjeld et al., 1988;
Marigómez et al., 2002; Ahearn et al., 2004; Simon et al., 2011). Quantitativement les formes
floconneuses du Cd étaient plus difficiles à localiser que les granules insolubles d’U; ceci
nous a amené à proposer comme hypothèse que le Cd internalisé dans la cellule n’était pas
présent majoritairement sous cette forme mais était capable de se lier rapidement aux ligands
organiques (ex : MT ou autres macromolécules), dans une forme toxique non détectée par
cette technique. Malheureusement, la technique de microscopie employée seule ne permet pas
la quantification des fractions détoxiquées. Elle doit s’accompagner d’une caractérisation
chimique après séparation par centrifugations différentielles successives des différentes
fractions subcellulaires (cytosol et ses sous fractions protéiques, organites cellulaires, granules
insolubles, noyau, débris cellulaires (Wallace et Luoma, 2003)). Les moyens analytiques
disponibles actuellement tels que l’ICP MS, permettent de mesurer de faibles quantités de
métaux dans des fractions biologiques de plus en plus précises (mitochondrie, lysosomes, …).
La distribution à l’échelle subcellulaire dans ces différents compartiments permet in fine
d’identifier la fraction toxique responsable des effets (voir la revue sur le zinc réalisée par
Rainbow et Luoma, 2011). Le travail réalisé dans cette thèse confirme que les concentrations
totales accumulées à l’échelle de l’organe ne renseignent pas sur les niveaux de toxicité
rencontrés et nous amène à identifier les fractions toxiques à l’échelle subcellulaire, seules
responsables des effets observés. De plus, Il faut aussi mentionner que les résultats de la
266
quantification des concentrations des métaux dans les tissus résultent à la fois de l’adsorption
et de l’internalisation. En conséquence, les valeurs élevées de la bioaccumulation de l’U
mesurées dans l’organe entier (ici les branchies) peuvent être aussi liées à des différences de
capacités d’adsorption des deux métaux étudiés. Afin de mieux caractériser les impacts du Cd
et de l’U, il faudra essayer d’établir un lien entre les effets et les fractions internalisées des
métaux. Cette approche définie comme le Critical Body Residues (CBR) est une alternative
dans l’établissement des relations dose/réponse. Elle identifie une valeur seuil d’accumulation
au-delà de laquelle un effet toxique est attendu (Vijver et al., 2004). Cette approche intègre le
concept de biodisponibilité et des différentes voies d’exposition rencontrées par les
organismes. Elle bénéficie des développements récents distinguant au sein de cette valeur
seuil, une fraction bioaccumulée dite active/toxique et une fraction non active.
La distribution des métaux dans les organes montre que le Cd et l’U ne possèdent pas
les mêmes capacités de transfert des branchies vers l’hépatopancréas. En effet, l’efficacité des
transferts peut être évaluée par la prise en compte de la gamme de variation des niveaux
d’accumulation (Tableau 24).
Tableau 24 : Gamme de variation des concentrations accumulées dans la branchie et

l’hépatopancréas (HP) après exposition aigüe au Cd et à l’U.
[Cd, U] µg/g, ps Cadmium Uranium

Min Max Max/Min Min Max Max/Min
branchies 12.13 460 37 129 12346 95
hepatopancreas 1.78 200 112 1.11 78 70
HP/branchies 0.14 0.43 0.008 0.006
La gamme d’accumulation dans les branchies est plus étendue après exposition à l’U
qu’après exposition au Cd. Le ratio entre les niveaux accumulés dans l’hépatopancréas et dans
la branchie montre une efficacité de transfert plus importante pour le Cd. Ce résultat est bien
entendu à relativiser car il prend en compte uniquement les concentrations totales accumulées
dans l’organe. Il faudra mesurer la contribution de l’adsorption pour évaluer les quantités
réellement mobilisables.
Mentionnons qu’après une exposition par voie directe à une faible concentration d’U
(30 µg/L), le radionucléide s’est accumulé dans divers organes (branchies, glandes vertes,
estomac, hépatopancréas, intestin, muscles et carapace) dès 4 jours d’exposition, mettant ainsi
267
en évidence sa mobilité à l’intérieur de l’écrevisse. Les branchies, l’intestin, l’estomac et la
carapace présentaient les plus forts niveaux d’accumulation probablement à cause de la
contribution de l’adsorption de l’U sur la cuticule et le mucus des organes. L’ICP MS utilisé
ici pour la mesure de l’U et la spectrophotométrie d’absorption (four) pour la mesure du Cd
fournissent des limites de détection faibles, permettant de mesurer les niveaux d’accumulation
dans les différents tissus des témoins et dans ceux obtenus après exposition aux deux métaux.
La contribution de chaque organe, en particulier, ceux présentant une masse faible (glande
verte) peut donc être réellement quantifiée.
La figure 79 représente le ratio entre l’écart-type à la moyenne et la moyenne afin
d’évaluer les variations inter-individuelles de la bioaccumulation de la branchie et de
l’hépatopancréas. Pour l’uranium, l’augmentation de la variabilité inter-individuelle semble
être liée à l’augmentation de la concentration d’exposition. Peu de données d’accumulation
sont disponibles pour l’U. Toutefois, d’importantes variations ont été précédemment
observées chez le modèle bivalve Corbicula fluminea et chez l’écrevisse Orconectes limosus
(Simon et Garnier-Laplace, 2005; Simon et al., 2011). Chez le poisson Danio rerio, la
variabilité inter-individuelle mesurée dans la branchie semble moins élevée, respectivement
12 et 18% après exposition à faible et forte concentrations (20 et 250 µg/L) (Bourrachot,
2009). Pour le Cd, l’interprétation de cette variabilité est plus complexe. Chez une espèce de
poisson Paralichthys alivaceus (Seong-Gil et al., 2011), ce ratio calculé pour le Cd est plus
faible que celui de l’U ; il diminue de 13 à 7 % pour la branchie et de 20% à 14% pour le foie
après deux conditions d’exposition (50 et 100 µg/L). Les facteurs physiologiques sont les plus
souvent à l’origine des variations des concentrations tissulaires des métaux d’un individu à
l’autre en milieu contrôlé. Ces facteurs physiologiques (ventilation/respiration, animaux
homéothermes ou hétérothermes, capacités de détoxication) peuvent fortement influencer les
processus de bioaccumulation (Luoma et Rainbow, 2005). En conséquence, nous avons
corrélé les réponses des biomarqueurs à la bioaccumulation à l’échelle de chaque individu
afin de prendre en compte la plasticité interindividuelle (cf. chapitre VI 2.4).
268
50
RSD EC/Moyenne*100
40
Br U
30 Br Cd
20 HP U
HP Cd
10
0
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
Concentration d'exposition (µg/L)
Figure 79 : Présentation du ratio (RSD) entre l’écart-type à la moyenne et la moyenne

des concentrations de Cd ou d’U accumulées dans les branchies ou l’hépatopancréas (en
pourcentage) en fonction des concentrations d’exposition. (Hp) hépatopancréas. (Br)
branchies. (U) organe exposé à l'uranium. (Cd) organe exposé au Cd.
2.3. Les effets histopathologiques (cf. Chapitre I-A objectifs ii et iii)

Les symptômes histologiques observés dans les hépatopancréas présentant des
concentrations de Cd et d’U équivalentes (absence de différence significative) suite à
l’exposition à 0.1 µM (~ 10 µg/L Cd ; ~ 30 µg/L U) et 40 µM (~ 5000 µg/L Cd ; ~ 8000 µg/L
U) des deux métaux, sont similaires. En effet, les observations microscopiques mettent en
évidence la capacité des deux métaux à induire une désorganisation épithéliale, une dilatation
du lumen et une vacuolisation. En cas de forte contamination (ex : 40 µM), le Cd et l’U
peuvent aussi conduire à l’amincissement des parois épithéliales et la dégénérescence des
tubules par apoptose et/ou nécrose. En effet, des études ont montré que l’U est capable
d’induire une mort cellulaire (Periyakaruppan et al. 2009; Thiébault et al. 2007). Une nécrose
des hépatocytes du poisson Coregonus clupeaformis a été observée suite à une contamination
trophique de l’U (Cooley et Klaverkamp, 2000). Il a été également mis en évidence que le Cd
induit une apoptose des glandes digestives chez le crabe Sinopotamon yangtsekiense (7.25
mg/L ; 96h) et leur nécrose chez la moule Mytilus edulis (20 et 50 µg/L ; 11 jours) (Li et al.
2010; Sheir et Handy 2010). Une vacuolisation des cellules hépatiques du poisson Esox lucius
a été reportée comme symptôme de toxicité à l’U (Kelly et Janz, 2009). Ce symptôme semble
être couramment observé suite à une exposition métallique (Pillai et Menon, 1998 ; Osterauer
et al., 2010), voire même à une exposition aux HAPs et aux molécules organiques(Hagger et
al.,(2006). Chez la moule, Pillai et Menon (1998) montrent que le degré de vacuolisation des
cellules hépatopancréatiques dépend des concentrations d’exposition au mercure et au cuivre.
De la même façon, la sévérité des dommages histologiques et la fréquence de leur apparition
se sont avérées être dose-dépendants dans nos études. En effet, le suivi des atteintes
269
histologiques au niveau de l’hépatopancréas après exposition à 30, 600, 4000 et 8000 µg/L
d’U durant 10 jours a montré que la vacuolisation, la dégénérescence des tubules et la
désintégration de l’épithélium augmentaient en fonction de la contamination. Notons que les
tubules étaient encore intacts après 10 jours de contamination à 30 µg/L d’U. Cependant après
60 jours d’exposition à cette dernière concentration, les hépatopancréas présentaient des
symptômes similaires à ceux observés à fortes concentrations d’exposition telle une
vacuolisation, une dilatation du lumen et un amincissement de l’épithélium ce qui est en
concordance avec les niveaux de bioaccumulation (la gamme de variation s’échelonnant entre
20 et 70 µg/g). Dans le cas du Cd, la vacuolisation et la désintégration des tubules étaient
aussi dose-dépendante (de 50 µg/L à 5000µg/L) et l’exposition chronique de l’hépatopancréas
à 10 µg/L pendant 60 jours conduit elle aussi à l’apparition du phénomène de vacuolisation.
Ce symptôme a aussi été reporté par Martin-Diaz (2006) suite à l’exposition de P. clarkii à la
même concentration d’exposition obtenue après 21 jours.
L’histopathologie est déjà utilisée comme marqueur de pollutions pouvant être intégré
dans l’évaluation des effets de perturbations environnementales sur des populations de
poissons (Schwaiger et al., 1997; Stentiford et al., 2003; Hagger et al., 2006; Pinto et al.,
2010). Aussi, ce critère d’effet apparaitrait comme un des indicateurs les plus fiables pour la
mise en évidence de la détérioration de la santé des animaux aquatiques par des activités
anthropogéniques (Stentiford et al., 2003). Ainsi, l’histopathologie appliquée à
l’hépatopancréas de l’écrevisse pourra servir de biomarqueur sensible et aspécifique d’une
pollution métallique.
2.4. Les effets moléculaires (cf. Chapitre I-A objectif ii et iii)

Les travaux réalisés durant cette thèse soulignent que les deux métaux altèrent
l’expression de plusieurs gènes mitochondriaux (12S, atp6 et cox1) et que le pattern
d’expression de ces gènes est différent suivant les modalités d’exposition (aigüe versus
chronique) indiquant des mécanismes d’action différents. Les résultats d’une étude de
l’impact du Cd sur l’expression génique dans le foie de carpes confirment ces propos
(Reynders et al. 2006). En effet, ces auteurs ont utilisé une puce à ADN pour déterminer des
changements de l’expression de 643 gènes après expositions par voie directe (9-480 µg/L) et
indirecte (9.5- 144 µg/g) simultanément. Leur étude montre que l’expression des gènes est
très variable en présence du Cd. La variation du nombre de gènes affectés par le Cd et celle du
profil de l’expression des gènes pris individuellement mettent en évidence la complexité de la
270
toxicité du Cd à faibles et fortes doses au niveau moléculaire. Une puce à ADN a aussi été
réalisée pour évaluer la toxicité de l’U chez le poisson zèbre Danio rerio après 10 jours
d’exposition à de faibles concentrations (15 et 100 µg/L) (Lerebours et al., 2010). Les
résultats de cette étude ont révélé que les réponses géniques étaient inversement corrélées aux
concentrations d’U testées : le nombre de gènes dont la réponse était altérée était plus
important chez les poissons soumis à 15 µg/L qu’à 100 µg/L. Les auteurs ont conclu qu’à
faibles doses d’exposition, différents profils de réponses géniques sont attendus. De plus,
d’après Lerebours et al, 2010b, il ne faut pas toujours s’attendre à ce que l’intensité de la
réponse génique augmente entre une exposition chronique et aigüe, mais c’est plutôt la nature
qualitative de la réponse génique qui peut changer entre les deux modes d’expositions. Ainsi,
le concept selon lequel plus les concentrations d’exposition sont fortes, plus l’intensité de la
réponse des gènes doit être élevée est à nuancer lors d’exposition à faibles doses. Il faut plutôt
admettre que la nature des réponses varie selon le type de stress appliqué (aigüe ou
chronique).
Cependant, le dogme liant l’intensité de la réponse aux doses de toxiques
(dose/réponse) reste vrai aux doses élevées. En effet, nous avons pu corréler les expressions
des gènes avec les concentrations accumulées de Cd ou d’U dans les organes de P. clarkii
suite à l’exposition à fortes doses (aigüe) (Figure 80). Lors de l’exposition chronique, ce type
de corrélation n’était significatif que pour le gène mt dans le cas du Cd. Dans le cas de l’U, le
gène cox1 était surexprimé chez P. clarkii après une longue durée d’exposition à 30 µg/L,
alors que ce même gène était réprimé après une courte durée d’exposition à fortes doses. Nous
avons retenu au cours de ce travail de recherche que les altérations géniques acquièrent une
meilleure significativité biologique en comparant les réponses dans leur ensemble.
Effectivement, nous avons observé une augmentation de l’expression du gène atp6suite à une
exposition aigüe (ex : T10j après exposition à 8 mg U/L) et chronique (T60j après exposition
à 30 µg U/L). Néanmoins, lorsque nous comparons ensemble les réponses de l’expression de
ces deux gènes, le fonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale semble être
différent suivant les conditions d’exposition (aigüe et chronique). Dans le cas d’une forte
contamination, la répression de cox1et la surexpression de atp6 peuvent témoigner d’une
inhibition du complexe IV et d’une augmentation de l’activité du complexe V (réponse de
l’atp6). Dans certaines pathologies, un tel fonctionnement de la chaîne respiratoire peut
témoigner d’une diminution du potentiel membranaire et de la mise en place de l’hydrolyse de
l’ATP au niveau du complexe V (ATP synthase) au lieu de sa synthèse (Kurochkin et al.,
2010 ; Nevière et al., 2008 ; Wang et Oster, 1998). Lors d’une faible contamination, la
271
surexpression des deux gènes peut témoigner d’une augmentation de l’activité de la chaîne
respiratoire mitochondriale afin de produire assez d’énergie pour les besoins de la cellule
(défense, détoxication…).
Ces résultats mettent en évidence la nécessité de mener une approche multi-marqueurs
pour la compréhension des mécanismes d’action des métaux. L’étape de screening des
mécanismes toxiques doit être complétée par une seconde étape, dirigée vers l’étude
approfondie d’un mécanisme spécifique préalablement identifié. Cette seconde étape doit
s’enrichir de l’approche multi-marqueurs pour appréhender la complexité (rétro-contrôle,
mécanismes de compensation) de ces mécanismes.
Figure 80 : Corrélation de Spearman (r) entre la bioaccumulation des métaux dans les
branchies et l’hépatopancréas et l’expression des 5 gènes étudiés suite à l’exposition
aigüe (0, 0.05, 0.5 et 5 mg Cd/L ; 0, 0.6, 4 et 8 mg U/L ; à 4 et 10 jours). (*) P < 0.05. (**)
P <0.005.
Dans le cas du Cd, l’hépatopancréas exposé à 10 µg/L à T30 (contamination

chronique) présentait une concentration tissulaire équivalente à celle retrouvée dans le même
organe exposé à 0.5 mg/L à T10 (contamination aigüe). Cependant les expressions des gènes
ne présentaient pas un même pattern (cf. Chapitre III). Ceci montre que le niveau mais aussi
la cinétique d’exposition doivent être pris en compte dans l’interprétation de la réponse de ces
marqueurs moléculaires. En effet, les organismes peuvent s’acclimater à une exposition
chronique à faible dose en mettant en place des mécanismes de détoxication et de
compensation efficaces. D’après Luoma et Rainbow (2005), la compréhension de la toxicité
des métaux nécessite plus que la seule considération des concentrations totales accumulées
dans les tissus. Ces auteurs conseillent de prendre en compte la dynamique biologique telle
que les taux d’internalisation et d’excrétion des métaux pour expliquer les effets adverses. De
plus, des variations de l’expression des gènes mitochondriaux et des gènes impliqués dans la
réponse face au stress oxydant ont été observées au cours du temps (4,10, 30 et 60jrs) après
exposition des écrevisses à une faible concentration d’U (30 µg/L) (Figure 81).
272
Evolution of genes expression levels with time
0,8 **
**
Spearman coefficient (r)

0,6
0,4
0,2
0
-0,2
-0,4
co
x 1
at
p6 12
S
Mn
) mt
d(
-0,6 So
-0,8 **
Figure 81 : Corrélation de l’expression des 5 gènes étudiés dans les branchies et les
hépatopancréas contaminés en fonction du temps (4, 10, 30 et 60 jrs) suite à une
exposition de 30 µg/L d’U.(*) P < 0.05. (**) P <0.005.
L’expression des gènes cox1 et sod(Mn) dans l’hépatopancréas et les branchies

contaminés à l'U est positivement corrélée avec les temps d’exposition contrairement au gène
12S. Cette relation montre que l’expression de ces gènes dépend du temps. Notons que la
corrélation de l’expression des gènes mt et atp6 avec le temps n’est pas significative. En effet,
l’expression du gène mt ne suit pas un pattern spécifique, sa surexpression ponctuelle est
probablement liée au stress oxydant. Une forte fluctuation de l’expression du gène atp6 a été
observée au cours du temps (Figure 82).
100
Expression de atp6 par
rapport au témoin
50
Branchies
0
Hepatopancreas
4 10 30 60
-50
-100
Durée d'exposition (jours)
Figure 82 : Cinétique d’expression du gène atp6 normalisée par rapport au témoin après
exposition chronique (4 ; 10 ; 30 ; 60 jours) à faible dose d’U (30 µg/L).
Des pics séquentiels et ponctuels de transcription en relation avec la demande du

métabolisme doivent être responsables de cette forte variabilité. Ainsi, l’expression ponctuelle
de ce gène semble être modulée par les interactions entre les besoins énergétiques de la cellule
273
et l’U. Les métaux peuvent avoir un effet indirect sur la demande énergétique en relation avec
les processus d’accumulation, de transport, de stockage et d’excrétion des contaminants
(Labrot et al., 1999 ; Goertzen et al., 2011). Ils peuvent aussi avoir un effet direct en affectant
des mécanismes biochimiques (ex : protéines membranaires des mitochondries et enzymes
antioxydantes) (Labrot et al., 1999 ; Ivanina et al., 2008 ; Cannino et al., 2009 ; Kurochkin et
al., 2010 ; Miccadei et Floridi, 1993 ; Wang et al., 2004; Wroñska-Nofer et al., 1999 ;
Salazar-Medina et al., 2010). Ceci peut expliquer la grande variabilité de l’expression du gène
de l’atp6 dans le cas d’une contamination métallique. En effet, il se peut que les cellules
produisent plus d’ATP pour assurer la viabilité cellulaire et fournir de l’énergie pour la mise
en place des mécanismes de défense. Ce gène peut aussi être surexprimé comme réponse au
dysfonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale.
Vu la sensibilité des gènes et la possibilité d’avoir différents patterns en relation avec
des variations physiologiques (ex : atp6), des concentrations (aigüe et chronique) et des temps
d’exposition, nous conseillons d’avoir une approche multi-gènes pour l’évaluation de la
toxicité.
Toutefois, il faut mentionner que malgré la fluctuation des réponses géniques (Figure
83), ces biomarqueurs ont pu témoigner d’un stress métallique car les expressions étaient
significativement différentes des témoins. Ainsi, l’utilisation de ces expressions peut aisément
être utilisée comme marqueurs de toxicité de l’U. Effectivement, malgré des différences entre
les réponses géniques des écrevisses à deux stades différents de mues (cf. Chapitre IV-A et
IV-C) et exposées à 30 µg/L pendant 4 et 10 jours, cet outil a toujours réussi à mettre en
évidence un effet de l’U (différences avec les témoins) même si les patterns ou les niveaux
d’expression des gènes n’étaient pas semblables. Rappelons que la variation de l’expression
du gène atp6 était la plus remarquable parmi les gènes étudiés suite à la contamination à l’U
des écrevisses en prémue. En effet, les crustacés peuvent avoir de grandes demandes
énergétiques durant la mue, ce qui peut expliquer la grande variabilité de l’expression du gène
atp6. De même, Muhlia-Almazan et al. (2008) ont démontré que l’expression de ce gène chez
la crevette Litopenaeus vannamei variait en fonction des stades de mue.
Nous avons pu aussi observer qu’une corrélation positive existe entre l’expression des
gènes cox1 et sod(Mn). En effet, une augmentation du métabolisme mitochondrial (cox1
surexprimé) entraine une augmentation des ERO endogènes entrainant une induction du
système antioxydant (sod(Mn)surexprimé). En l’absence de surexpression de cox1, le système
de défense n’est pas plus sollicité (sod(Mn) réprimé) et le pool basal semble être suffisant.
274
Ainsi, l’expression de sod(Mn) semble être modulée par celle de cox1. Une étude récente a
aussi montré que l’expression du gène codant pour le complexe IV est fortement et
positivement corrélée à l’expression du gène codant pour la superoxyde dismutase cytosolique
chez le poisson Perca flavescens exposés à des concentrations environnementales de Cd
(Pierron et al., 2009).
Enfin, les réponses géniques prennent en compte les besoins cellulaires en protéines
fonctionnelles présentant elles-mêmes des durées de vie différentes. Ainsi, la durée de vie de
ces protéines peut agir directement sur les niveaux d’expression de gènes et conduire à des
variations d’expression.
Les analyses en composantes principales (cf. Chapitre V) des réponses géniques ont
montré que dans les expositions à fortes doses d’U et de Cd (40 µM), le gène atp6 présentait
la plus grande variabilité d’expression parmi les gènes étudiés (ex : jusqu’à 183 fois
surexprimé dans le cas du Cd et 3 fois dans le cas de l’U), confirmant un impact significatif
des xénobiotiques sur la demande énergétique cellulaire. L’expression des gènes mt et 12S
était différente entre les deux conditions d’exposition. En effet, Le gène mt était surexprimé
uniquement dans les tissus fortement contaminés à l’U alors qu’il était surexprimé dans toutes
nos conditions d’exposition au Cd. Jusqu’à ce jour, le rôle des MT dans la prise en charge de
l’U et dans sa détoxication n’est pas clair. Toutefois, il est confirmé que ces protéines peuvent
piéger les ERO et participer à la gestion de la balance anti-oxydante (Fang et al., 2010 ;
Viarengo et al., 2000). Il est donc fort probable que l’U a généré un stress oxydant à fortes
doses, conduisant à la surexpression du gène mt.
Le gène mt semble être un biomarqueur idéal de toxicité du Cd puisqu’il suit le même
pattern d’expression quels que soient les organes, le temps et les concentrations d’exposition.
Le nombre des mitochondries (suivi par l’expression du gène 12S) semble augmenter dans le
cas d’une exposition aigüe au Cd contrairement à l’U. Ces résultats soulignent une différence
dans les réponses cellulaires face à une contamination au Cd et à l’U. Il s’avère que le nombre
de mitochondries augmente pour palier au dysfonctionnement de la chaîne respiratoire dans le
cas d’une contamination au Cd mais pas à l’U. Il faut noter que les altérations des expressions
des gènes cox1 et atp6sont moins importantes dans le cas de l’U que dans le cas du Cd
indiquant une différence dans le degré de dysfonctionnement.
275
Uranium
Forte Faible
dose dose
Mitochondries
cox1 atp6 12S

Chaîne
Densité
Hydrolyse
respiratoire de l’ATP
Synthèse ATP
Sod(Mn) mt
Stress oxydant Stress oxydant

Homéostasie
Figure 83 : Synthèse de la tendance de l’expression des gènes étudiés suite à une forte
(0.6, 4 et 8 mg/L) ou faible (30 µg/L) exposition à l’U. (↑) surexpression. (↓) répression.
Il est aussi intéressant de noter qu’après une exposition aigüe (40 µM), l’impact du Cd et de
l’U sur le fonctionnement de la chaîne respiratoire mitochondriale semble être similaire. En
effet, le pattern de l’expression de cox1 et de l’atp6 semble être le même. Comme nous avons
pu le voir précédemment (cf. Chapitre VI 2.3), le Cd et l’U peuvent conduire à l’apoptose. Il
semblerait qu’à fortes doses, le Cd et l’U puissent conduire à la mort cellulaire programmée
par la voie intrinsèque mitochondriale. Nous pouvons supposer que les deux métaux ont
provoqué une diminution du potentiel membranaire (cox1 réprimé) qui a été suivie par le
déclenchement de la voie apoptotique (Pinot et al., 2000)(ouverture des pores de transition de
perméabilité mitochondriale, puis relargage du cytochrome C, suivi de l’activation des
caspases conduisant à la fragmentation du noyau, et la mort cellulaire). De plus, dans les deux
conditions, les tubules des hépatopancréas étaient en dégénérescence (mort cellulaire).
Les mécanismes d’action des deux métaux étaient différents suite à une exposition
chronique (0.1 µM de Cd ou d’U). Le métabolisme mitochondrial semble plus élevé en
présence de l’U (cox1 surexprimé) qu’en présence du Cd (faible impact sur cox1). De plus, le
gène mt était toujours surexprimé en présence du Cd, mais que ponctuellement en présence de
l’U confirmant une meilleur prise en charge du Cd que l’U par cette protéine de séquestration.
Ce résultat peut aussi être expliqué par les variations de la quantité des mitochondries suite à
276
la contamination. En effet, la diminution de l’expression du gène 12S observée dans le cas de
l’U a pu conduire à l’augmentation du métabolisme pour compenser la perte des organites,
contrairement à ce qui a pu être observé dans le cas du Cd.
Les réponses moléculaires des antioxydants (activités enzymatiques et expressions des

gènes) ont montré que l’U est capable de générer un stress oxydant chez l’écrevisse et ceci
dès 4 jours d’exposition à une faible concentration environnementale (30 µg/L). Un stress
oxydant généré par l’U chez Danio rerio a aussi été observé après 3 jours d’exposition
(Barillet et al., 2007). Dans notre étude, le stress oxydant semblait être plus important dans les
branchies que dans l’hépatopancréas de P. clarkii via la mesure de l’activité des enzymes.
Ceci peut être dû au fait que les branchies constituent d’une part la première barrière
biologique à entrer en contact avec le radionucléide (Borkovi et al., 2008), et présentent
d’autre part des forts taux d’accumulation. Il est aussi possible que le niveau basal des
antioxydants soit plus important dans l’hépatopancréas que dans les branchies (Atli et al.,
2006; Borkovi et al., 2008; Pandey et al., 2008). Cette différence de sensibilité des organes
face au stress oxydant a aussi été observée dans le cas du Cd. Les résultats de l’analyse en
composantes principales ont montré que le stress oxydant après 60 jours d’exposition au Cd
ou à l’U était plus important qu’après 30 jours. Les activités des enzymes avaient tendance à
diminuer en fonction du stress. En effet, les activités de la CAT et de la GST ont été affectées
par la présence des deux métaux. De plus, l’activité de la SOD et de la GPX étaient
significativement plus faibles dans les branchies contaminées à l’U que dans celles
contaminées au Cd. Sur la base de ces résultats, il semblerait que l’U génère un stress oxydant
plus important que le Cd. Cependant, les branchies ont bioaccumulé 22 fois plus d’U que de
Cd alors que les différences des activités des enzymes entre les deux conditions n’étaient pas
très élevées (ex : GPX : -33%, SOD : -18%). Comme nous avons déjà mentionné, une partie
de l’U a pu précipiter et/ou s’adsorber aux parois biologiques contribuant à réduire la fraction
toxique. Nous sommes alors incapables de savoir à ce niveau d’analyse lequel des deux
éléments est capable de générer le plus de stress oxydant chez ce modèle biologique.
L’ensemble des résultats acquis durant ce travail de recherche souligne la complexité

des mécanismes d’action de ces deux métaux. Malgré cette complexité, nous avons tenté de
lier les réponses des différents paramètres biologiques étudiés entre eux. L’un des
mécanismes de toxicité de l’U que nous proposons, est fondé sur les travaux effectués par
Pourahmad et al. (2006) (Figure 84). Ces auteurs ont rapporté que dans les cellules, l’U
277
pourrait être réduit en présence du glutathion, passant ainsi de la valence VI à V puis IV.
Cette réaction semble consommer beaucoup de dioxygène et conduit à la formation de
quantités considérables d’ions superoxydes (O2.-). De plus, elle conduit à la transformation du
glutathion réduit (GSH) en glutathion oxydé (GSSG). Les ERO engendrées par cette réaction
peuvent oxyder les enzymes et les rendre ainsi inactives (Blum et Fridovich, 1985; Davies,
2005). Ceci peut expliquer la diminution des activités enzymatiques observées au cours de
nos expériences. L’hypothèse de la complexation directe de l’U sur les enzymes doit être
aussi prise en compte (Labrot et al., 1996). En effet, l’effet toxique des métaux comme le Cd,
l’arsenic et le plomb est expliqué par leur fixation sur les groupes sulphydryles des
antioxidants conduisant ainsi à leur inactivation (Jomova et Valko, 2011). Une étude récente a
montré que l’U est capable de se lier à certaines protéines comme la MT, la ferritine, la
transferrine et l’albumine, cependant la fixation de ce radionucléide sur les enzymes
impliquées dans la défense contre le stress oxydant n’a pas encore été étudiée (Michon et al.,
2010). Une diminution de l’activité d’une enzyme peut aussi être le résultat d’une répression
de la transcription du gène correspondant (Lerebours et al., 2009). Ceci montre la nécessité de
coupler l’approche enzymatique et génétique dans le but d’éclaircir les mécanismes d’action
des toxiques. Dans le cas de la GST et de la GPx, la diminution du substrat (GSH) peut aussi
expliquer une telle diminution. Une diminution de l’activité de la SOD va conduire à la
diminution des concentrations de H2O2 dans les cellules et par conséquent, contribuer à
réduire l’activité de la CAT et de la GPX. Le dysfonctionnement du système de défense va
conduire à l’augmentation des niveaux de ERO dans la cellule. Le stress oxydant va alors
modifier l’expression génique (ex : surexpression de gènes pour compenser les dommages, de
gènes impliqués dans la défense et la détoxication) et les ERO vont cibler les mitochondries
(ex : membrane, complexes) ce qui va engendrer des perturbations au niveau de la chaîne
respiratoire (fonctionnement des complexes, expression des gènes mitochondriaux). Ceci va
être suivi par une diminution du potentiel membranaire et l’enclenchement de l’apoptose. La
mort cellulaire va potentiellement conduire à des dommages histologiques qui peuvent avoir
des conséquences physiologiques graves telles une perturbation du fonctionnement de
l’organe qui peut mener à la mort de l’individu. Dans le cas du Cd, nous pouvons imaginer
qu’un mécanisme similaire puisse survenir suite à une diminution des activités enzymatiques.
278
Figure 84 : Proposition d’un mécanisme de cytotoxicité induit par la présence de l’U.
(GSH) glutathion réduit, (GSSG) glutathion oxydé, (O2) dioxygène, (O2.-) anion
superoxyde, U (VI) uranium de valence VI, U (V) uranium de valence V, U (IV)
uranium de valence IV, (SOD) superoxyde dismutase, (H2O2) peroxyde d’hydrogène,
(CAT) catalase, (GPX) glutathion peroxydase, (GST) glutathion S transférase, mt: gène
codant pour la métallothionéine, (gst) gène codant pour la GST, (gpx) gène codant pour
la GPX, (cat) gène codant pour la CAT, sod(Cu) gène codant pour la SOD cytosolique,
sod(Mn) gène codant pour la SOD mitochondriale, (12S) gène codant pour l’ RNA
ribosomale 12S, (atp6) gène codant pour sous-unité 6 de l’ATP synthase, (cox1) gène
codant pour la sous-unité 1 de la cytochrome c oxydase, (-) indique une diminution du
substrat, (+) indique une augmentation d’un produit, une flèche avec un trait indique
une inhibition, une flèche normale indique un impact (ex: sur les mitochondries et les
expressions des gènes).
2.5. Chimiotoxicité vs radiotoxicité (cf. Chapitre I-A objectif iv)

Nous nous sommes intéressés dans une approche préliminaire à discriminer la radio- et
la chimiotoxicité de l’U en utilisant comme marqueurs d’effets, les expressions de gènes
mitochondriaux (cox1, atp6, 12S), de gènes codant pour des antioxydants (mt, sod(Mn)) et les
activités des enzymes (SOD, CAT, GPx, GST) impliquées dans la défense contre le stress
oxydant. Lors de cette approche, nous avons exercé une chimio-toxicité équivalente entre les
deux formes de l’U (UA, 233U) et une radiotoxicité élevée dans le cas de l’exposition au 233U.
Les niveaux de bioaccumulation entre l’UA et l’233Usont différents pour un seul
279
compartiment biologique, la carapace (cf. Chapitre IV-C). Barillet et al. , 2007 met en
évidence une différence transitoire d’accumulation entre ces deux formes d’U dans la
branchie du Danio rerio. Les auteurs proposent comme hypothèse un impact de la
radiotoxicité sur la structure branchiale conduisant à des modifications du taux
d’accumulation. Une telle hypothèse ne peut être proposée dans le cas de la carapace, puisque
une grande part de l’U accumulée est en fait adsorbée sur sa surface.
L’analyse des marqueurs géniques montre une augmentation de l’expression du gène
atp6 dans les deux organes étudiés après 10 jours d’exposition dans les deux conditions.
Notons toutefois que cette augmentation est plus élevée après exposition des branchies à
l’233U qu'à l'UA. Il semble que la lutte contre le stress induit par la radiotoxicité nécessite plus
d’énergie. Une différence de l’activité de la GST dans les branchies a été observée après 10
jours d’exposition à l’233U. En effet, la GST a été induite lorsque la radiotoxicité a augmenté.
Ceci semble être dû à une augmentation des ERO suite à la radioactivité. Les autres
paramètres biologiques étudiés n’ont pas pu discriminer la radio- de la chimiotoxicité de l’U.
En parallèle, nous avons calculé le débit de dose dans l’hépatopancréas suite à
l’exposition à l’UA (0.86 µGh/h) etàl’233U (12900µGh/h). Les calculs ont montré que la dose
interne était 15000 fois supérieure dans les organes contaminés à l’233U qu’à l’UA. Malgré
cette grande différence, l’impact de la radioactivité sur les paramètres biologiques testés
n’était significatif que sur l’activité de la GST et l’expression du gène atp6. Ainsi, cette
approche nous a permis de conclure que dans la gamme des concentrations massiques
utilisées, représentatives de concentrations environnementales, la toxicité de l’U est plus liée à
ses propriétés chimiques qu’à sa radioactivité mais que cette dernière augmentait la toxicité.
Durant cette expérience, nous avons aussi comparé la sensibilité des biomarqueurs
étudiés. Au niveau enzymatique, seules les activités de la CAT (inhibé à T4) et de la GST
étaient différentes de celles des témoins, alors que l’expression des 5 gènes étudiés était
altérée significativement en présence des deux formes d’U. Nous pouvons ainsi conclure qu’à
faible dose (30 µg/L) et à courte durée (4- 10 jrs) d’exposition, les biomarqueurs géniques
sont plus sensibles que les biomarqueurs enzymatiques. Ceci a été confirmé lors de
l’expérience chronique (30 µg/L 30-60 jrs).
280
2.6. Classification de la toxicité des métaux (cf. Chapitre I-A objectif v)
Suite à l’ensemble des résultats mentionnés, il est évident que la comparaison des
impacts du Cd et de l’U peut être utilisée dans le but de classifier la toxicité des métaux. La
classification est plus simple lorsque nous prenons en compte les effets à des niveaux élevés
de l’organisation biologique. La comparaison des taux de mortalité des écrevisses a montré
clairement que le Cd est plus toxique que l’U pour P. clarkii. Cependant, plus nous affinons
l’étude, plus la comparaison des effets devient compliquée. Ainsi dans un but d’évaluation
comparative de la toxicité des métaux il est préférable de se contenter des réponses
biologiques à des échelles élevées de l’intégration biologique. Néanmoins, l’étude d’impact
sur les niveaux moléculaires a un grand intérêt mécanistique et constitue un outil sensible à la
contamination.
3. Perspectives de recherche
Ces travaux ouvrent plusieurs perspectives de recherche comme approfondir les
connaissances sur les mécanismes d’action de l’U sur les mitochondries et sur la balance
oxydative, établir un lien entre l’expression d’un gène et sa traduction au niveau protéique,
essayer de lier les impacts étudiés à la distribution de l’U dans différentes fractions cellulaires,
vérifier la réponse des biomarqueurs retenus chez P. clarkii à différents stades de mues et
chez d’autres organismes aquatiques sentinelles présentant des résistances différentes face au
contaminant, et étudier des effets in situ.
3.1. Eclaircir les mécanismes de toxicité de l’U sur les mitochondries

Nos résultats de l’expression des gènescox1, atp6 et 12S ont mis en évidence un
impact de l’U sur les mitochondries. Cependant, le mécanisme d’action s’est avéré très
complexe et l’étude de l’expression de ces quelques gènes seule n’est pas suffisante pour
établir un diagnostique complet de la situation. Ainsi, nous proposons d’essayer de séquencer
des gènes codant pour des sous unités du complexe I, II et III de la mitochondrie et de gènes
impliqués dans l’apoptose. Comme nous avons pu le voir, les atteintes mitochondriales
peuvent déclencher une apoptose. L'identifiction du déclenchement de ce phénomène est aussi
possible grâce à des techniques histologiques de marquage. En effet, la méthode « tunel »
(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labelling) permet d’identifier les
cellules apoptotiques. Cette méthode se base sur le fait que les cellules apoptotiques voient
leur ADN clivé par des nucléases. Cette dégradation génère des 3' OH libres qui sont
reconnus par la transférase qui va leur ajouter un dUTP biotinylé ou marqué avec un
281
fluorochrome. Il suffit ensuite de visualiser le marquage. Il est possible de distinguer
facilement les cellules vivantes des cellules mortes en cytométrie en flux et de distinguer les
cellules nécrotiques des cellules apoptotiques en réalisant un double marquage. Le dosage de
la cytochrome C est aussi envisageable puisqu’elle est relâchée de la mitochondrie vers le
milieu intracellulaire lorsque la voie apoptotique mitochondriale est activée. Le dosage du
potentiel membranaire mitochondrial et du taux d’ATP peut aussi clarifier le mécanisme par
lequel l’U impacte la mitochondrie.
3.2. Eclaircir les mécanismes de toxicité de l’U sur la balance oxydative

L’observation d’une baisse ou d’une augmentation d’activité enzymatique peut avoir
de nombreuses origines (sous-surexpression génétique, altérations directes de la protéine,
etc…). Dans un but de compréhension des mécanismes par lesquels l’U génère un stress
oxydant, nous proposons d’essayer de séquencer les gènes codant pour la CAT, GPX, SOD
(cytosolique) et la GST chez P. clarkii. Ceci permettra de vérifier si l’origine des réponses
enzymatiques est liée à un impact au niveau génique. De plus, le dosage des substrats des
enzymes pourrait éclaircir les variations des activités enzymatiques. Notre équipe a
récemment développé une méthode analytique (transposition de la méthode classique de
quenching de fluorescence à une technique “haut débit”, utilisant un spectrofluorimètre
lecteur de microplaques) afin de déterminer les constantes de complexation de l’U aux
protéines. Comme nous avons émis l’hypothèse qu’une diminution de l’activité d’une enzyme
peut être liée à la fixation directe de l’U à la protéine, ceci mérite d’être vérifié chez les
enzymes participant à la défense contre le stress oxydant (la CAT, la SOD, la GPX et la
GST). Cette étude pourrait être réalisée à partir de protéines pures ou de protéines extraites de
cytosol de P. clarkii et séparées par chromatographie basse pression. Il s’agira de déterminer
in vitro par fluorimétrie les constantes de complexation de l’uranium avec chacune des
enzymes d’intérêt. Les concentrations d’U à tester dans cette expérience seront en relation
avec les niveaux d’accumulation de l’U dans la fraction cytosolique obtenue à partir de
l’hépatopancréas et les branchies des écrevisses exposés pendant 4 et 10 jours à 30, 600 et
4000 µg/L d’U (analyses en cours). Une fois validé pour chacune des enzymes, nous pourrons
contaminer une fraction cytosolique d’une écrevisse avec de l’U et suivre la décroissance de
l’activité de l’enzyme concernée en fonction de l’augmentation des concentrations. Cette
étape est nécessaire afin de déterminer une relation entre l’activité de l’enzyme et les
concentrations d’U dans un milieu intracellulaire. En effet, il se peut que l’U en présence d’un
282
pool protéique présente des constantes d’affinités plus élevées pour les protéines présentes
dans le milieu que pour l’enzyme testée.
3.3. Lien entre le niveau génique et enzymatique

Une absence de différence entre les mesures des activités enzymatiques effectuées
chez les organismes exposés à l’U et celles réalisées chez les témoins peut aussi bien être
interprétée comme une absence totale d’effet ou au contraire comme un indicateur d’un stress
trop important. En effet, certaines enzymes ont des réponses qui suivent une courbe en cloche
(Dagnino et al., 2007) en fonction de l’augmentation du stress ce qui peut mener à une
confusion lors de l’interprétation. Afin de remédier à ce problème, il est nécessaire d’avoir
une approche multimarqueurs pour obtenir une image plus précise de la toxicité de l’U. Le
couplage de l’étude de l’expression du gène codant pour l’enzyme étudiée et le suivi de son
activité présente plusieurs avantages. Cette approche peut aussi bien aider à mieux interpréter
les résultats que permettre de comparer la sensibilité des deux outils utilisés afin de choisir les
biomarqueurs les plus pertinents.
3.4. Distribution de l’U dans différentes fractions cellulaires

Actuellement au sein du LRE, l’accent est porté sur la détermination du comportement
de l’U dans le milieu biologique. En effet, la caractérisation des biomolécules interagissant
avec un élément est un point clé pour élucider la toxicité de cet élément. Cependant, la
détermination de la « spéciation biologique » nécessite avant tout une connaissance précise de
la distribution de l’élément dans le milieu d’intérêt. Pour cela, nous avons envisagé de mettre
en évidence la distribution de l’U dans les différentes fractions cellulaires provenant des
branchies et de l’hépatopancréas des écrevisses exposés à 30, 600 et 4000 µg/L d’U. Cette
étude nous permettra de connaitre les fractions les plus contaminées et pourra nous guider
dans le choix de tester d’autres mécanismes susceptibles d’être impactés par l’U et ainsi
identifier de nouveaux biomarqueurs. De plus, compte tenu de la biodisponibilité des
polluants et de la diversité des mécanismes d’entrée, certains auteurs proposent d’exprimer les
effets toxiques chroniques en fonction d’une « dose de polluant » accumulée dans les organes.
L’approche «Critical Body Residue (CBR)» tente de relier les effets toxiques observés aux
capacités de bioaccumulation des polluants plutôt qu’aux concentrations dans la colonne
d’eau. Le dosage de l’U dans les différentes fractions de la cellule permettra de relier les
effets que nous avons observés au niveau génique à la bioaccumulation subcellulaire et ainsi
répondre à l’approche CBR.
283
3.5. Etude d’impact de la mue sur les biomarqueurs retenus
La physiologie d’un organisme influence la réponse d’un biomarqueur. Il est possible
de distinguer notamment des facteurs intrinsèques, tels que l’âge, le sexe, le statut
reproducteur ou les stades de mues dans le cas où l’espèce sentinelle est un crustacé. Durant
nos études, nous avons choisi de travailler avec des écrevisses males au stade adulte afin de
limiter ces variations physiologiques. Cependant, nous n’avons pas pu empêcher le
déclenchement naturel du phénomène de mue. Ainsi dans l’une de nos expériences, les
écrevisses étaient au stade de prémue (chapitre IV-C) et en conséquent nous avons remarqué
des variations de l’expression des gènes étudiés (surtout de l’atp6) en les comparant avec
celles des écrevisses au stade d’intermue (Chapitre IV-A). Il est donc nécessaire d’étudier les
réponses des biomarqueurs d’U à différents stades de mue de l’écrevisse (intermue, prémue,
mue et post-mue). L’une des expériences envisageables consiste à contaminer des écrevisses
adultes à l’U puis à déclencher artificiellement la mue (ex : par injection d’écdysone).
3.6. Etude des effets chez des organismes présentant différentes résistances à l’U
Afin de permettre l’application des biomarqueurs dans un grand nombre de situations,
il semble également intéressant de valider l’utilisation de ces outils chez différents taxa. En
effet, une approche plurispécifique fournit des indicateurs de stress chez des espèces qui
diffèrent à la fois par leur sensibilité à la pollution, par leur physiologie, le groupe fonctionnel
auquel elles appartiennent au sein d’une communauté, ainsi que par le compartiment de
l’écosystème auquel elles sont principalement exposées, à savoir la colonne d’eau, le
sédiment ou leur interface. Afin de préserver un certain réalisme écologique, les biomarqueurs
doivent être validés chez différentes espèces sentinelles susceptibles d’être présentes sur le
terrain. Idéalement, les biomarqueurs, étudiés au niveau individuel, devraient permettre de
prédire les effets à l’échelle supérieure de la population ou de la communauté. A ce jour, cet
objectif n’est pas atteint avec notre modèle biologique P. clarkii car cette espèce s’est révélée
très résistante à l’U et nécessite des efforts supplémentaires afin d’approcher une évaluation
du risque écotoxicologique. Ceci nécessite soit une étude de l’impact de l’U sur d’autres
mécanismes biologiques (ex : reproduction, croissance…) chez P. clarkii qui sont plus
susceptibles de traduire une conséquence écologique, soit d’évaluer la réponse des
biomarqueurs étudiés durant cette thèse chez des organismes plus sensibles.
284
3.7. Etude des effets in situ
Si l’influence de facteurs confondants (intrinsèques : physiologiques, extrinsèques :
abiotique ex : température, spéciation…) peut être en partie limitée en conditions contrôlées,
l’interprétation de la réponse des biomarqueurs devient extrêmement plus délicate en milieu
naturel. Le biomarqueur parfait et universel n’existe pas. Un biomarqueur peut s’avérer très
pertinent dans certaines conditions, mais ne pas répondre dans d’autres, voire induire un
diagnostique erroné. La nécessité d’étudier les réponses des biomarqueurs in situ semble
évidente. En effet, les mélanges de substances et les contaminations multiples impliquent des
synergies et des antagonismes qui peuvent influencer grandement les réponses biologiques.
Nous pouvons envisager de prélever de l’eau polluée à l’U du terrain (ex : Limousin) et
exposer des écrevisses au laboratoire. Cette approche présente l’avantage de limiter les
impacts des facteurs extrinsèques tels que la variation de température et d’autres paramètres
abiotiques qui peuvent influencer la physiologie de l’écrevisse et la réponse des
biomarqueurs.
285
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329
Annexes
330
331
332
333
Résumé
L’étude des effets des radionucléides et des métaux sur les organismes vivants est nécessaire pour
évaluer leur toxicité et leur risque écologique. Notre approche a visé dans un premier temps à
étudier les impacts du cadmium (Cd) et de l’Uranium (U) sur différents niveaux biologiques de
l’écrevisse Procambarus clarkii après exposition aigue et chronique. Nous avons évalué leurs
impacts sur les mitochondries, les réponses face à un stress oxydant, les structures histologiques et
la survie. Nous avons tenté de lier ces effets entre eux et à la bioaccumulation dans les branchies et
l’hépatopancréas. Nous avons aussi essayé de différencier la chimio- et la radiotoxicité de l’U en
exposant des écrevisses soit à l’U appauvri soit au 233U (présentant une activité spécifique plus
élevée) au travers des mêmes critères d’effets. Nous avons démontré que le gène mt codant pour la
métallothionéine était toujours surexprimé en présence du Cd. De ce fait, il semble être un bon
biomarqueur de toxicité du Cd chez P. clarkii. Nous avons mis en évidence que les deux métaux
affectent les mitochondries grâce au suivi des niveaux d’expressions des gènes mitochondriaux (12s,
atp6 et cox1), et que leur mécanismes d’action ne semblent pas être toujours les mêmes. Nous
avons aussi prouvé que l’U génère plus de stress oxydant que le Cd grâce à la comparaison des
niveaux d’expressions de gènes qui codent pour des antioxidants (sod(Mn) et mt) et des réponses
enzymatiques de la superoxyde dismutase, la catalase, la glutathion peroxydase et la glutathion S
transférase. Toutefois, les symptômes des atteintes histo-pathologiques semblent être les mêmes
pour les deux métaux. En comparant leurs effets sur la survie des écrevisses, nous avons conclu que
le Cd était plus toxique que le radioélément. D’autre part, nous avons démontré que les effets
toxiques de l’U aux concentrations rencontrées dans l’environnement, sont plus liés à la
chimiotoxicité qu’à la radiotoxicité de cet élément. Nous avons démontré que, les réponses
moléculaires varient en fonction de l’intensité et la durée du stress chimique imposé aux
organismes. Nous avons proposé d’utiliser les expressions de l’ensemble des gènes étudiés en tant
que biomarqueurs de toxicité de l’U plutôt que les activités enzymatiques à cause de leur
sensibilité. Ce travail de thèse propose des mécanismes d’actions de l’U basé surtout sur les
réponses moléculaires et confirme la nécessité d’approfondir l’étude du profil écotoxicologique de
ce radioélément.
Mots clés : écrevisses P. clarkii, uranium, cadmium, expressions géniques, activités
enzymatiques, histologie, mitochondries, antioxydants.
Abstract
The study of the effects of radionuclides and metals on organisms is necessary for the evaluation of
their toxicity and their ecological threats. We first aimed to study the impacts of cadmium (Cd) and
Uranium (U) on different biological levels of the crayfish Procambarus clarkii after acute and
chronic exposures. We evaluated their impacts on mitochondria, oxidative stress responses, on
histological structures, and the survival rates. We tried to connect these effects between them and
to the bioaccumulation in the gills and the hepatopancreas. We also tried to discriminate the chemo
and the radiotoxicity of U by exposing crayfish to either depleted or enriched U (233U: presenting a
higher specific activity) using the same criteria of effects. We demonstrated that the gene mt
encoding for the metallothionein was always over-expressed in the presence of Cd. Therefore, it
seems to be a good biomarker of Cd toxicity in P. clarkii. The follow up of mitochondrial genes
expressions (12s, atp6 and cox1), showed that both metals affect mitochondria and that their
mechanisms of action do not seem to be always the same. We also observed that U generates more
oxidative stress than Cd when comparing the expression levels of genes encoding for antioxidants
(sod (Mn) and mt) and the enzymatic activities of superoxide dismutase, the catalase, the
glutathione peroxidase and the glutathione S transferase. However, the symptoms of histo-
pathological damages after Cd and U contamination were similar in both conditions. After
comparing the survival rates of the crayfish, we concluded that Cd was more toxic than the
radioelement. Moreover, we demonstrated that the toxic effect of U on P. clarkii exposed to a low
environmental concentration is mainly due to its chemotoxicity rather than to its radiotoxicity. We
established that, the molecular answers vary according to the intensity and the duration of the
chemical stress applied to the organisms. We suggested the use of the expressions of all the studied
genes as biomarkers of toxicity of U rather than the enzymatic activities because of their
sensitivity. This work proposes mechanisms of actions of U based especially on the molecular
responses and confirms the necessity of studying the ecotoxicological profile of this radioelement.
Keywords: crayfish P. clarkii, uranium, cadmium, gene expression levels, enzymatic
activities, histology, mitochondria, antioxidants.

2012 These Al Kaddissi

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THESE

Par Mlle AL KADDISSI Simone

Comparaison de la réponse (en termes

M. COUTURE Patrice, Professeur titulaire/ INRS ETA Quebec (rapporteur)

Devant la commission d’examen formée de :

M. DÖRR Martin, Chercheur, Université de Pérouse (examinateur)

«Incertitude, ô mes délices

D’abord je tiens à remercier l’Institut de Radioprotection et de Sureté Nucléaire

Cette étude a été réalisée dans le cadre du programme de recherche ENVIRHOM de

Effects of uranium uptake on transcriptional responses, histological structures

Effects of uranium on crayfish Procambarus clarkii mitochondria and antioxidant

Mitochondrial gene expression, antioxidant responses, and histopathology after

An attempt to descriminate the radio and chemo-toxicity of uranium

How toxic is depleted uranium to crayfish Procambarus clarkii? A comparative

The use of Procambarus clarkii as a bioindicator of cadmium and uranium

Comparaison de la réponse (en termes d'accumulation, d'impacts cellulaires et

Etude comparative de la bioaccumulation et des effets (à différentes échelles de

The use of molecular responses of crayfish Procambarus clarkii as biomarkers of

A comparative study of molecular responses during acute exposures to uranium

Etude comparative de l'impact de l'uranium et du cadmium chez l'écrevisse

Comparaison des réponses de l’écrevisse Procambarus clarkii après

Liste des tableaux ....................................................................................................................... 1

Chapitre I-C :Choix stratégiques et démarche expérimentale .................................................. 79

Chapitre II : Matériels et méthodes .......................................................................................... 92

Acknowledgments .................................................................................................................. 152

Chapitre IV : Etude de l’impact de l’uranium sur la survie, l’histologie, les mitochondries et

Chapitre IV-A: Effet de la bioaccumulation de l’uranium sur les réponses transcriptomiques,

Références .............................................................................................................................. 286

Tableau 1 : Position systématique de Procambarus clarkii. .................................................... 18

Tableau 2 : Bruit de fond du cadmium dans l’environnement ................................................. 40

Tableau 3 : Emissions de Cd en Europe. .................................................................................. 41

Tableau 6 : Composition isotopique en masse et en activité de l’uranium naturel et de

Tableau 8 : Bilan de la démarche expérimentale retenue. ........................................................ 82

Tableau 9 : Comparaison de la similarité des séquences nucléotidiques et des acides

Tableau 10 : Concentration des solutions mères de sels nécessaires pour la préparation de

Tableau 24 : Gamme de variation des concentrations accumulées dans la branchie et

Liste des figures

Figure 1 : Distribution mondiale de P. clarkii. ........................................................................ 19

Figure 2 : Evolution de la répartition de Procambarus clarkii. ............................................... 20

Figure 3 : Aspect d’une écrevisse Procambarus clarkii. ......................................................... 21

Figure 4 : Morphologieexterne d’une écrevisse. ...................................................................... 22

Figure 5 : Critères de détermination de P. clarkii. ................................................................... 23

Figure 7 : Anatomie interne d'une écrevisse ............................................................................ 26

Figure 8 : Cycle de la mue des écrevisses ................................................................................ 28

Figure 10 : représentation des différents niveaux de l’organisation biologique pouvant être

Figure 11 : Représentation des méthodologies permettant d’évaluer les risques

Figure 12 : Progression de l’état de santé d’un individu à l’exposition d’une augmentation de

Figure 13 : Illustration des différentes voies de contamination d’une écrevisse et de

Figure 17 : Schéma de la balance anti-oxydants/pro-oxydants représentant un stress oxydant

Figure 18 : Mécanismes possibles expliquant la génération de stress oxydant par le cadmium

Figure 19 : Schéma de la chaîne respiratoire mitochondriale .................................................. 56

Figure 20 : Effets du cadmium sur les mitochondries. ............................................................. 58

Figure 22 : Chaîne de désintégration de l’234U, 235U et de l’238U............................................. 63

Figure 27 : Effets biologiques des rayonnements ionisants. Evolutions possibles au niveau

Figure 29 : Représentation schématique d’un feuillet branchial d’une écrevisse. ................... 86

Figure 30 : Représentation schématique des différents types de cellules de l’hépatopancréas

Figure 33 : Carte du lieu de prélèvement des écrevisses. ......................................................... 94

Figure 34 : Dispositif expérimental .......................................................................................... 95

Figure 36 : Système de filtration de l’eau contaminée au Cd ou à l’U par la calcite pour

Figure 39 : Photo illustrant une écrevisse disséquée .............................................................. 100