Cycle cellulaire et polarisation du zygote Fucus

régulations et interactions
Florence Corellou

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Florence Corellou. Cycle cellulaire et polarisation du zygote Fucus régulations et interactions. Biologie
cellulaire. Rennes 1, 2000. Français. �NNT : �. �tel-01115123�

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2/07/1992)
 THESE
Présentée
DEVANT L’UNIVERSITE DE RENNES 1
Pour obtenir
le grade de : DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE RENNES 1
Mention : BIOLOGIE
PAR

Florence CORELLOU

Cycle cellulaire et polarisation du zygote de Fucus : régulations et

interactions

Soutenue le 6 avril 2000 devant la commission d’Examen

Mme Nicole CHAUBET-GIGOT Directeur de Recherche au CNRS, Rapporteur

M. Dirk INZE Directeur de Recherche à l’INRA,
Rapporteur
Mme Eva KONDOROSI Directeur de Recherche au CNRS
M. Michel PHILIPPE Professeur à l’Université de Rennes 1
Mme Katherine LE GUELLEC Professeur à l’Université de Rennes 1
M. Bernard KLOAREG Directeur de Recherche au CNRS
M. Hervé MOREAU Chargé de Recherche au CNRS
N° Ordre : 2328
de la thèse

THESE

Présentée
DEVANT L’UNIVERSITE DE RENNES 1

Pour obtenir
le grade de : DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE RENNES 1
Mention : BIOLOGIE

PAR

Florence CORELLOU

Equipe d’accueil : UMR 1931, ROSCOFF

Ecole Doctorale : Vie et Santé
Composante universitaire : Observatoire Océanologique de Roscoff

TITRE DE LA THESE :

Cycle cellulaire et polarisation du zygote de Fucus : régulations et

interactions

SOUTENUE LE 6 avril 2000 devant la commission d’Examen

COMPOSITION DU JURY :

Mme Nicole CHAUBET-GIGOT Directeur de Recherche au CNRS, Rapporteur

M. Dirk INZE Directeur de Recherche à l’INRA, Rapporteur
Mme Eva KONDOROSI Directeur de Recherche au CNRS
M. Michel PHILIPPE Professeur à l’Université de Rennes 1
Mme Katherine LE GUELLEC Professeur à l’Université de Rennes 1
M. Bernard KLOAREG Directeur de Recherche au CNRS
M. Hervé MOREAU Chargé de Recherche au CNRS
Résumé
L’orchestration correcte de la différenciation et du cycle cellulaire est nécessaire au développement de tout organisme.
Chez les végétaux, il n’existe que peu de données sur les mécanismes moléculaires mis en jeu pour coordonner ces deux
événements. Le zygote de l’algue brune Fucus est un modèle de l’embryogenèse précoce des végétaux. La polarisation du
zygote de Fucus s’effectue après la fécondation et coïncide avec le premier cycle cellulaire mitotique. Des acteurs
moléculaires impliqués dans la polarisation zygotique ont été identifiés mais les voies de transduction contrôlant
l’établissement de la polarité restent à préciser. Par ailleurs les connaissances sur le cycle cellulaire du Fucus sont très
réduites. Dans ce contexte, nous avons voulu savoir comment la polarisation et le cycle cellulaire sont régulés et s’il existe
des interactions entre ces deux événements.
Nous avons montré que le cycle cellulaire présente quatre phases G 1, S, G2 et M bien définies, possède les mécanismes de
surveillance usuels, qui rendent la mitose dépendante de la réplication et de l’assemblage correct du fuseau, et que sa
progression (transitions G1/S, G2/M, sortie de mitose, cytodiérèse) dépend étroitement de l’activité de protéines de type
kinases dépendantes des cylines (CDK). Deux CDK à motif PSTAIRE, p32 et p34, sont traduites à partir ARNm maternels,
après la fécondation, et leur synthèse progressive correspond à l’augmentation de l’activité kinase des CDK, dont le pic
mitotique requiert la transcription d’un régulateur positif. Ces deux CDK sont négativement régulées par phosphorylation sur
tyrosine, lors de la progression normale et lors de l’activation du point de contrôle de la réplication de l’ADN. P34 est
spécifiquement liée par l’inhibiteur de CDK, purvalanol, et jouerait un rôle majeur dans le contrôle du cycle cellulaire. Nous
avons montré que, à la transition G1/S, la CDK p34 contrôle également la formation de l’axe de polarité embryonnaire, qui
s’effectue durant la phase S.
D’autre part nous avons mis en évidence que la formation de l’axe est essentielle au modelage de l’embryon et qu’elle est
régulée par des protéines de type tyrosine-kinases. Ces kinases ne sont pas nécessaires à la division. Aussi, si la formation de
l’axe de polarité est sous le contrôle du cycle cellulaire, la réciproque reste à démontrer.

Abstract
The correct orchestration of cell cycle and differentiation is required for the development of all organisms. In plants, there
is little data on the molecular mechanisms involved in the coordination of both of these processes. The zygote of the brown
alga Fucus is a model to study plant early embryogenesis. Polarization of the Fucus zygote occurs after fertilization and is
concomitant with the first mitotic cell cycle. Little is known about cell cycle, and although molecular actors involved in
polarisation have been identified, transduction pathways controlling the establishment of polarity remain to be determined. In
this context, we are interested in the regulation of cell cycle and polarisation, as well as, in interconnection between these two
processes.
We have demonstrated, that the first cell cycle of Fucus zygotes encompasses four well-defined phases G1, G 2, S and M,
and is under the tight control of cell-cycle dependent kinase-related proteins (CDK). Usual functional checkpoints are found,
ensuring that mitosis will not occur in the presence of incomplete DNA replication or of mitotic spindle defects. Two CDKs
containing the hallmark PSTAIRE, p32 and p34, are translated from maternal mRNAs, after fertilization, and their
progressive synthesis correlates with an increase in CDK activity until G2 phase, where the transcription of a positive
regulator is further required to achieve CDK activation before mitosis. Both of these CDKs appear to be negatively regulated
by tyrosine phosphorylation, during normal cell cycle progression and following activation of the DNA replication
checkpoint. Since p34 is the major target of the CDK inhibitor purvalanol, it appears to play a major role in cell cycle control.
We have also demonstrated that, at the G1/S transition, p34 controls the formation of the embryonic axis, which is achieved
during S phase.
On the other hand, we have shown that axis formation is essential for embryo patterning and is under the control of
tyrosine-kinases-related proteins, whose inactivation delayed but do not hampered cell division. Thus, whereas axis
formation is cell-cycle dependent, a putative control of the cell-cycle control by polarisation events remains to be shown.
SOMMAIRE
 INTRODUCTION

I EMBRYOGENESE PRECOCE DU FUCUS.......................................................................................

• A. PRESENTATION DU MATERIEL BIOLOGIQUE................................................................................

A.1. Cycle de vie.........................................................................................................................

A.1.1. Généralités .......................................................................................................................
A.1.2. La Fécondation.................................................................................................................
A.1.3. Du zygote à l’algue adulte................................................................................................

A.2. Avantages et inconvénients du système biologique pour l’étude du

développement embryonnaire .................................................................................................

A.3. Le zygote de Fucus un modèle historique en biologie du développement................

• B. POLARISATION ET DEVELOPPEMENT PRECOCE DU ZYGOTE DE FUCUS .......................................

• B.1. LA POLARISATION CELLULAIRE, EST UN PREREQUIS POUR LA MORPHOGENESEERREUR! SIGNET NON DÉFI

B.2. Photopolarisation du zygote de Fucus spiralis..............................................................

B.3. Acquisition de la polarité ..................................................................................................

B.3.1. La fécondation ..................................................................................................................
B.3.2. Sélection d’un axe de polarité ..........................................................................................
Les différents inducteurs de la polarité.....................................................................................
Perception du signal lumineux..................................................................................................
B.3.3. La formation de l’axe de polarité......................................................................................
B.3.4. Le cytosquelette ...............................................................................................................
B.3.5. Les interactions plasmalemme-paroi ...............................................................................
B.3.6. Le calcium libre.................................................................................................................

B.4. La fixation de l’axe de polarité .........................................................................................

B.4.1. Le cytosquelette ...............................................................................................................
B.4.2. La paroi.............................................................................................................................
B.4.3. Les sécrétions polarisées et l’asymétrie pariétale ...........................................................
B.4.4. Les acteurs du continuum paroi-membrane-cytosquelette .............................................

B.5. Modèle de la polarisation zygotique................................................................................

B.6. La germination....................................................................................................................

B.7. La division...........................................................................................................................
B.7.1. La mitose ..........................................................................................................................
Séparation des centrosomes et rotation nucléaire...................................................................
Division nucléaire ......................................................................................................................
 B.7.2. La cytodiérèse ..................................................................................................................

II LE CYCLE CELLULAIRE..................................................................................................................

• A. LES PHASES DU CYCLE CELLULAIRE .........................................................................................

• B. LES KINASES DEPENDANTES DES CYCLINES ASSURENT LA PROGRESSION DANS LE CYCLE

CELLULAIRE .......................................................................................................................................

B.1. Identification .......................................................................................................................

B.2. Différents complexes CDK/cyclines interviennent au cours des phases du cycle

cellulaire......................................................................................................................................
B.2.1. Contrôle de la phase S.....................................................................................................
B.2.2. Contrôle de la mitose .......................................................................................................

B.3. Régulation des CDK...........................................................................................................

B.3.1. Structure tridimensionnelle...............................................................................................
B.3.2. Régulation par les cyclines ..............................................................................................
B.3.3. Régulation par phosphorylation .......................................................................................
Phosphorylations activatrices ...................................................................................................
Phosphorylations inhibitrices ....................................................................................................
B.3.4. Régulation par les CKI .....................................................................................................
B.3.5. Interactions avec les sous-unités p9................................................................................
B.3.6. Régulation par synthèse ..................................................................................................

• C. LES MECANISMES DE SURVEILLANCE DU CYCLE CELLULAIRE ....................................................

C.1. Intégrité de l’information génétique ................................................................................

C.1.1. L’endommagement de l’ADN et l’inhibition de la réplication arrêtent la cellule à
différents stades du cycle cellulaire............................................................................................
C.1.2. Voie de transduction ........................................................................................................
C.1.3. Les cibles moléculaires des points de contrôle dépendants de l’ADN ...........................

C.2. Assemblage du fuseau mitotique ....................................................................................

• D. PARTICULARITES DU CYCLE CELLULAIRE DANS LES EMBRYONS PRECOCES D’ANIMAUX ............

D.1. Rôle et régulation du MPF.................................................................................................

D.2. Rôle du complexe cdk2/cycline E ....................................................................................

D.3. Les points de contrôle du cycle cellulaire embryonnaire.............................................

• E. LE CYCLE CELLULAIRE CHEZ LES VEGETAUX .............................................................................

E.1. Diversité des CDK et des cyclines ...................................................................................

E.2. rôle des CDK et des cyclines............................................................................................

E.3. Régulation des CDK...........................................................................................................

 E.3.1. Interactions avec les molécules régulatrices du cycle.....................................................
E.3.2. Phosphorylations..............................................................................................................

E.4. Les mécanismes de surveillance du cycle cellulaire chez les végétaux ....................

III DEVELOPPEMENT ET VOIES DE SIGNALISATION PAR PHOSPHORYLATION......................

• A. GENERALITES ...........................................................................................................................

• B. IMPORTANCE DES KINASES .......................................................................................................

• C. LES CASCADES DE PHOSPHORYLATION .....................................................................................

C.1. Dans la polarisation cellulaire ..........................................................................................

C.1.1. Polarisation chez Saccharomyces cerevisiae .................................................................
C.1.2. Les adhésions focales......................................................................................................

C.2. Dans l’établissement de la polarité embryonnaire ........................................................

C.3. Dans l’embryogenèse végétale ........................................................................................

• D. COORDINATION CYCLE CELLULAIRE ET DEVELOPPEMENT ..........................................................

D.1. Cycle cellulaire et morphogenèse chez les animaux ....................................................

D.2. Cycle cellulaire et morphogenèse chez les végétaux ...................................................

D.3. Cycle cellulaire et morphogenèse chez les ascomycètes ............................................

IV OBJECTIFS DE LA THESE.............................................................................................................

• A. CARACTERISATION DU PREMIER CYCLE CELLULAIRE DE FUCUS SPIRALIS..................................

• B. LE CYCLE CELLULAIRE REGULE-T-IL LA POLARISATION ZYGOTIQUE?.........................................

• C. EXISTE-T-IL UN CONTROLE DE LA POLARISATION PAR LES KINASES? ........................................

RESULTATS

ARTICLE 1 :

Un point de contrôle S/M inhibe les événements nucléaires et cytoplasmiques de la

division cellulaire, incluant l’alignement de l’axe des centrosomes avec l’axe de
polarité, et inhibe l’activation des kinases dépendantes des cycliens dans les
embryons de Fucales ....................................................................................................................
ARTICLE II :

Le cycle cellulaire du zygote de Fucus présente des parallèles avec le cycle cellulaire des
cellules somatiques .......................................................................................................................

ARTICLE III :

Le contrôle du développment précoce du zygote de Fucus est dépendant du cycle

cellulaire par l’intermédiaire d’une protéine de type CDK ........................................................

ARTICLE IV :

L’inhibition de l’établissement de la polarité zygotique par des inhibiteurs de tyrosine-

kinases perturbe le modelage de l’embryon chez Fucus ..........................................................

CONCLUSION-PERSPECTIVES

CONCLUSION ET PERSPECTIVES....................................................................................................

• A. LES CDK CONTROLENT DE NOMBREUX EVENEMENTS DU CYCLE CELLULAIRE ET

CONSTITUENT UNE CIBLE MAJEURE DES MECANISMES DE SURVEILLANCE ...........................................

A.1. Identité des CDK responsables de la progression au cours du cycle cellulaire .......

A.2. Le clonage des ADNc de CDK de Fucus ouvrirait de nombreuses perspectives.......

A.3. Intervention des CDK dans les événements nucléaires et cytoplasmiques de la

division........................................................................................................................................
A.3.1. Intervention des CDK à la transition G1/S........................................................................
A.3.2. L’assemblage du fuseau est régulé par les CDK mitotiques...........................................
A.3.3. Sortie de mitose et cytodiérèse........................................................................................

• B. MECANISMES DE REGULATION DES CDK...................................................................................

B.1. Régulation traductionnelle................................................................................................

B.2. Régulation transcriptionnelle de l’activité mitotique.....................................................

B.3. Régulations par phosphorylation ....................................................................................

• C. RELATIONS CYCLE CELLULAIRE ET DEVELOPPEMENT .................. ERREUR! SIGNET NON DÉFINI.

C.1. Importance de la division cellulaire pour la polarisation et la morphogenèse ..........

 C.2. La CDK PSTAIRE de 34 kDa contrôle la polarisation précoce du zygote ...................

C.3. Importance de la polarisation pour l’embryogenèse.....................................................

• D. EXISTE-T-IL UN CONTROLE DU CYCLE CELLULAIRE PAR LES ACTEURS DE LA POLARISATION? ...

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
INTRODUCTION
 EMBRYOGENESE PRECOCE DU FUCUS

A. P RESENTATION DU MATERIEL BIOLOGIQUE

A.1. CYCLE DE VIE

A.1.1. Généralités

Les Fucales sont des algues brunes macrobenthiques qui occupent l’étage médio-littoral

supérieur des côtes rocheuses des zones tempérées. Elles se caractérisent par un cycle de vie

monogénétique diplophasique, où la phase gamétophytique se résume aux gamètes, et par un

mode de reproduction oogamique. La fécondation et le développement externes autorisent la

manipulation des gamètes et des zygotes. Les espèces dioïques (Fucus vesiculosus, Fucus

serratus) permettent un bon contrôle temporel de la fécondation car les gamètes, obtenus

séparément, peuvent être réunis au moment choisi par l’expérimentateur. Cependant, chez les

espèces monoïques (Fucus spiralis, Fucus distichus, Pelvetia compressa, Pelvetia canniculata),

la maturation des gamètes est simultanée et l’émission des anthérozoïdes et des oosphères

s’effectue dans des proportions idéales, ce qui conduit à l’obtention rapide d’un taux élevé de

zygotes viables et de populations homogènes. Les périodes de reproduction, souvent

hivernales, varient dans le temps et sont plus ou moins longues selon les espèces. Fucus

spiralis est une espèce monoïque dont la période de reproduction est relativement longue,

puisqu’elle s’étend généralement d’octobre à juin. Aussi, nous avons choisi d’utiliser

principalement cette espèce pour mener nos travaux.

Les parties reproductrices des Fucales correpondent à des sacs renflés appelés

réceptacles, situés à l’extrémité des frondes chez les genres Fucus et Pelvetia (figure 1). Sous

la surface des réceptacles, de nombreuses chambres (conceptacles), où se développent les

gamètes, s’ouvrent sur l’extérieur par un petit orifice. A maturité, les réceptacles présentent une

1
-
 Figure 1 : Cycle de vie de Fucus vesiculosus

réceptacle
gamète (oosphère)

poil

sporophyte
oogone

Méiose

conceptacle
paraphyse
Méiose
anthérocyste
anthérocyste

sporophyte

gamète
conceptacle (anthérozoïde)
plantule zygote
pronucleus
pronucleus

Fécondation

D’après Gayral, 1975

Description dans le texte principal.

surface externe d’aspect granuleux; l’observation de leur surface interne, à l’oeil nu et à la

lumière, permet de distinguer les oogones bien individualisés. Un oogone contient, suivant les

genres, 2 à 8 oosphères dont le diamètre est d’environ 100 µm. Les anthérozoïdes, contenus

dans des anthéridies, possèdent un chloroplaste pourvu d’un stigma (à l’exception de chez F.

spiralis) qui leur confère une couleur orangée. Cette couleur permet une distinction aisée des

sexes chez les espèces dioïques. A marée basse, sous l’effet de la dessiccation, les gamètes

perlent à l’extérieur du conceptacle. L’immersion provoque la rupture des enveloppes

protectrices des gamètes, leur dispersion et l’activation des anthérozoïdes. Les oosphères

sédimentent en milieu calme et émettent une substance chimiotactrice, le fucoserratène, qui attire

les anthérozoïdes (Müller et Jaenicke, 1973). Le stigma dirige la nage des anthérozoïdes par

phototaxisme négatif, ce qui favorise la rencontre des gamètes sur le fond.

A.1.2. La Fécondation

En laboratoire, le relargage des gamètes peut être obtenu après quelques jours de

conditionnement des réceptacles à 4°C et à l’obscurité. Les réceptacles sont soumis à un choc

osmotique et lumineux (rinçage à l’eau douce, illumination puis immersion en eau de mer) qui

provoque l’émission plus ou moins rapide des gamètes, suivie en moyenne trente minutes plus

tard, par la fécondation. Le contact des gamètes déclenche immédiatement un potentiel de

fécondation qui est initié par l’ouverture des canaux Na+ , puis des canaux Ca2+, ce qui permet

l’influx de ces ions, et s’achève par un efflux de K+ , qui rétablit le potentiel membranaire de base

(Brawley, 1991; Roberts et al., 1993; Taylor et Brownlee, 1993; Roberts et Brownlee, 1995).

La dépolarisation membranaire, de -60 mV à -20 mV, constitue une barrière électrique immédiate

et efficace à la polyspermie (Brawley, 1991), qui est renforcée par la mise en place rapide

(quelques minutes AF) de la paroi cellulaire. Cependant, l’influx de calcium observé à la

fécondation est limité en comparaison de la vague calcique intervenant lors de l’activation des

oeufs animaux (Roberts et al., 1993). L’augmentation de calcium observée chez Fucus est

diffuse et subcorticale. L’activation métabolique de l’oosphère est marquée par un doublement

de l’activité respiratoire (Whitaker, 1931; Levring, 1952) et la reprise de la synthèse d’ARNm et

de protéines (Koehler et Linskens, 1967).

2
-
 A.1.3. Du zygote à l’algue adulte

Les zygotes sédimentent, et adhèrent au substrat cinq à six heures après fécondation

(AF). Ces zygotes ont l’originalité de ne posséder initialement aucune asymétrie et de se

polariser en réponse à des gradients environnementaux, tels que la lumière. L’expression

morphologique de cette polarité se traduit par l’émergence d’une protubérance au pôle opposé à

la lumière incidente (germination). Ce phénomène se prolonge par la croissance polarisée du

rhizoïde. La première division asymétrique s’effectue perpendiculairement à l’axe de polarité et

sépare la cellule “rhizoïde” de la cellule “thalle” (figure 2). Dans nos conditions de culture (lumière

continue, 14°C), la germination et le premier clivage du zygote ont lieu, respectivement de 14 à

16 heures et de 22 à 24 heures AF. Les divisions suivantes se succèdent beaucoup plus

rapidement : le rhizoïde s’allonge par croissance apicale tandis que des divisions orientées de la

cellule “thalle” s’effectuent initialement sans accroissement du volume cellulaire. A terme, le

crampon et la fronde de l’algue adulte, qui ont respectivement pour origine les deux premières

cellules, rhizoïde et thalle, se forment. Il faut cependant souligner la plasticité du développement

de l’embryon de Fucus illustrée par la formation tardive d’embryons adventifs à partir de cellules

rhizoïdiennes (McLachlan et Chen, 1972; Bouget et al., 1998) (figure 2).

L’embryon âgé de deux à trois semaines mesure environ 1 mm de long et possède

plusieurs rhizoïdes, qui sont issus de la cellule apicale rhizoïdienne et forment le crampon

embryonnaire. Au pôle apical du thalle se forme une dépression, à la base de laquelle est initiée

la croissance de poils apicaux qui atteignent des longueur de l’ordre de 2 cm et cassent au bout

de quelques jours. A la base de ces poils, se met en place une zone méristématique (Oltmanns,

1922). De ce fait, ces poils apicaux sont considérés comme des marqueurs morphologiques du

méristème apical embryonnaire. Il est difficile de garder les jeunes Fucus en culture au delà de ce

stade. En effet, leur croissance se ralentit et ils finissent par se nécroser. De nombreux essais

de culture en laboratoire furent réalisés et ne donnèrent, dans le meilleur des cas, que des

algues de taille réduite, mais permirent d’observer l’évolution morphologique du thalle

(McLachlan et al., 1971; Fries, 1977; Fries, 1982). Le thalle cylindrique de l’embryon âgé s’aplatit

et entame une croissance dichotomique de part et d’autre des cellules basales à l’origine des

poils. Dans la nature, le passage de la plantule à l’algue adulte semble se faire en quelques

3
-
 Figure 2 : Embryogenèse précoce de Fucus spiralis

Les zygotes restent sphériques durant toute leur polarisation (14-15 h AF) (A).
L’expression morphologique de la polarité s’effectue par l’émergence du rhizoïde (du
côté opposé à la lumière) (15-16 h AF B) et la première division asymétrique,
perpendiculaire à l’axe de polarité, sépare la cellule thalle de la cellule rhizoïdienne
(24 h AF C). Ces deux cellules donnent naissance, respectivement, à la fronde et au
crampon de l ’algue (H et I). Les divisions suivantes sont également très conservées.
Dans le rhizoïde, la deuxième division s’effectue transversalement comme la plupart
des divisions rhizoïdiennes qui suivront (32 h AF D et 48 h AF E). Dans le thalle, les
divisions se succèdent et sont alternativement parrallèles et perpendiculaires à l’axe
de polarité (E). AT, cellules apicale du thalle; BT, cellules basales du thalle; AR,
cellules apicales du rhizoïde, BR1 et BR2, cellules basales du rhizoïde. Après deux à
trois semaines, une région méristématique est mise en place à l’apex du thalle et
précède l ’émergence de poils apicaux (pa) (F). Chez certains embryons se
développent des embryons adventifs (tête de flèche) à partir de la partie rhizoïdienne
de l’algue (G). Après deux mois, la jeune algue s’est développée (H) et donnera, par
croissance, l’algue adulte (I). L’échelle représente en A-C 30 µm, en E 40 µm en F et
G 100 µm, en H 400 µm et en I 20 cm. D’après Bouget et al., 1998.
mois (2 à 4 mois environ), soit beaucoup plus rapidement que la durée de deux ans rapportée

par Knight et Parke (1950).

A.2. A VANTAGES ET INCONVENIENTS DU SYSTEME BIOLOGIQUE POUR

L ’ ETUDE DU DEVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE

Les difficultés techniques inhérentes aux végétaux supérieurs compliquent l’avancée de

la recherche sur l’embryogenèse végétale. L’embryon, de petite taille, est prisonnier des tissus

maternels, ce qui rend toute approche pharmacologique et cellulaire extrêmement difficile.

L’approche génétique, principalement réalisée chez Arabidopsis thaliana, est la seule

envisageable, mais n’est néanmoins pas suffisante. L’étude de l’embryogenèse somatique

constitue une alternative, cependant les premiers stades de développement ne reflètent pas

ceux de l’embryogenèse zygotique.

Les zygotes de Fucus sont libres et se développent de manière synchrone. La culture

des zygotes se réalise facilement en eau de mer et leur adhérence naturelle en permet la

manipulation aisée. De plus, leur taille relativement importante (80-100 µm) et l’absence de

vacuole cellulaire permettent l’utilisation des techniques de microinjection et d’imagerie cellulaire,

par ailleurs difficiles chez les végétaux supérieurs. L’abondance de matériel disponible rend

possible des approches biochimiques et moléculaires au cours du développement. Enfin, les

premiers événements du développement (polarisation et cycle cellulaire) se déroulent

suffisamment lentement pour pouvoir les étudier avec précision. Le zygote de Fucus est donc

l’unique système cellulaire végétal permettant une approche expérimentale de l’embryogenèse

dans des conditions physiologiques.

Cependant, la présence de nombreux pigments (chlorophylle, carotène,

fucoxanthènes), d’abondants polyphénols et d’une épaisse paroi (cellulose, alginates)

nécessite la mise au point de techniques adéquates de biochimie (extraction de protéines et

d’ARN) et de biologie cellulaire (problèmes d’autofluorescence, de bruit de fond et d’effet d’écran

en imagerie). Outre l’incompatibilité de l’environnement salin avec les techniques classiques de

transformation génétique, le maintien laborieux des embryons en culture au delà de quatre

4
-
semaines permet difficilement d’envisager la mise en place d’approches génétiques du

développement par mutagenèse.

A.3. LE ZYGOTE DE FUCUS UN MODELE HISTORIQUE EN BIOLOGIE DU

DEVELOPPEMENT

De par son accessibilité, le zygote de Fucus constitue, depuis longtemps, un matériel de

choix en biologie du développement. Ainsi, dès 1854, Gustave Thuret put observer et décrire la

formation des gamètes, la fécondation ainsi que le développement précoce de l'embryon de

Fucus. Il remarqua notamment que le premier clivage de l’embryon s’effectue toujours

perpendiculairement à l’axe du rhizoïde. Strasburger (1897), Farmer et Williams (1896, 1898) et

Yamanouchi (1909) poursuivirent les études cytologiques de Thuret sur la gamétogenèse chez

le Fucus, ce qui les conduisit à étudier la mitose. Dans ce cadre, la mise en place et l’organisation

du fuseau mitotique ainsi que la condensation des chromosomes, dans le jeune zygote, fut

minutieusement décrite. Yamanouchi remarqua que l’oosphère de Fucus ne présentait aucune

asymétrie cytologique. A la même époque, Rosenvinge(1889) observa que la polarité du

zygote pouvait être imposée par un gradient lumineux : la germination du rhizoïde s'effectue

toujours au pôle opposé à la source lumineuse. Il nota qu’à l’obscurité les zygotes en culture

dense ont tendance à germer les uns vers les autres. Ce phénomène sera qualifié plus tard

d’effet de groupe (Hurd, 1920). La propriété du zygote à orienter sa germination en fonction de

facteurs extérieurs suscita l’intérêt de nombreux biologistes. Des études descriptives sur

l’embryon mirent en évidence la remarquable conservation des divisions embryonnaires et

révélèrent le fonctionnement d’une cellule initiale tétraédrique à la base de la croissance

dichotomique du thalle (Oltmanns, 1922; Nienburg 1931).

Parallèlement, le zygote fit l’objet d’études fonctionnelles, qui marquent le début de

l’embryologie expérimentale chez les plantes. Au début du siècle (1907), Hans Kniep

s’interrogea sur le mode d’action des signaux cellulaires impliqués dans la formation du rhizoïde.

Il rechercha notamment, quel pouvait être l'effet de la lumière sur ces signaux et en discuta le

mode d'action putatif. Ses expériences constituent l’ébauche de nombreux travaux ultérieurs.

Deux conclusions majeures s’en dégagent :

5
-
 - la polarité zygotique peut être orientée à volonté par un vecteur lumineux pendant une

période définie, puis le zygote, toujours sphérique, devient réfractaire à l’orientation lumineuse et

germe selon la dernière orientation lumineuse qui lui a été imposée lors de sa période de

photosensibilité. Ces deux périodes seront ultérieurement dénommées formation et fixation de

l’axe de polarité (Quatrano, 1973).

- chez l’embryon de deux cellules ou plus, à la suite de l’ablation sélective de la (ou des)

cellule(s) rhizoïdienne(s), la cellule thalle a la capacité de régénérer la partie rhizoïdienne

manquante, indépendamment de l’orientation du vecteur lumineux imposée. Quatre vingt dix ans

plus tard, des expériences similaires réalisées par microchirurgie laser démontrèrent l’existence

d’une information de position au sein de l’embryon (Berger et al., 1994; Bouget et al., 1998).

De nombreuses autres investigations portèrent sur les facteurs influençant la polarité :

Hurd, en 1920, mit en évidence l’action prépondérante de la lumière bleue sur la polarisation des

zygotes et Lund (1923) découvrit qu’ils répondaient également à des champs électriques. Par la

suite, Whitaker et Lowrance identifièrent de nombreux facteurs capables d’influencer la

polarisation des zygotes, tels que la température (Lowrance, 1937), la force gravitationnelle

(Whitaker, 1937), le pH (Whitaker, 1938) et les rayonnements ultraviolets (Whitaker, 1941).

Ces auteurs définirent les différentes étapes de la photopolarisation : l’acquisition de la

photosensibilité est suivie de la formation d’un axe polaire dont l’expression morphologique

différée est la germination (Whitaker et Lowrance, 1936). En 1931, Knapp publia des résultats

suggérant que le point d’entrée de l’anthérozoïde influence la polarisation du zygote de

Cystoseira barbata. Ces résultats seront extrapolés pendant de nombreuses années au

zygote de Fucus avant d’être confirmés très récemment, chez Pelvetia (Hable et Kropf, 2000).

A partir des années 60, deux auteurs émergent et ont une influence considérable sur

l’orientation des recherches sur les mécanismes de polarisation du zygote de Fucus : L. F. Jaffe

et R. S. Quatrano. Le premier s’attache à connaître et à modéliser l’action de la lumière sur la

polarité et met en évidence l’existence d’un courant transcellulaire associé à des transport de K+

et de Ca 2+ au cours de l’établissement précoce de la polarité. Quatrano s’intéresse aux

processus biochimiques et moléculaires mis en jeu lors de la polarisation. Ceci le conduit à définir

6
-
plusieurs phases dans la polarisation et à élaborer un modèle de travail que nous détaillerons

ultérieurement. Au cours des dernières années, des efforts croissants ont été réalisés afin de

préciser les acteurs moléculaires et les voies de signalisation impliqués dans la polarisation. La

dynamique du cytosquelette (D. L. Kropf) et les variations de calcium intracellulaire (K. R.

Robinson, C. Brownlee) reçurent une attention particulière.

B. P OLARISATION ET DEVELOPPEMENT PRECOCE DU ZYGOTE DE FUCUS

B.1. LA POLARISATION CELLULAIRE , EST UN PREREQUIS POUR LA

MORPHOGENESE

Le mécanisme universellement utilisé pour initier la différenciation cellulaire est la

localisation polarisée de déterminants cytoplasmiques, qui est le plus souvent suivie par une

division asymétrique de la cellule. Chacune des cellules filles hérite ainsi d’un patrimoine

particulier, qui reflète et/ou spécifie son destin cellulaire (développement autonome). Le jeu des

interactions cellulaires affine l’information propre à chaque cellule (développement non-

autonome) (Horvitz et Herskowitz, 1992; Drubin et Nelson, 1996).

Chez le zygote de Fucus, l’importance de la polarisation zygotique pour l’embryogenèse

tardive n’a pas été clairement établie car seuls les effets précoces de l’inhibition de la

polarisation ont été observés, et les répercussions sur le modelage tardif de l’embryon ne sont

généralement pas rapportées. Néanmoins, l’inhibition des sécrétions polarisées et/ou de la

polymérisation de l’actine au pôle rhizoïdien empêche la polarisation et entrave la germination du

jeune embryon. Ceci suggère que la localisation de déterminants morphogénétiques joue un rôle

important pour la différenciation des deux premières cellules de l’embryon (Quatrano, 1973;

Shaw et Quatrano, 1996a). Cependant, chacune des deux cellules de l’embryon est capable,

lorsqu’elle est libérée du contexte embryonnaire et pariétal, de ré-enclencher un programme de

développement, et de générer un petit zygote puis un embryon (Berger et Brownlee, 1995). De

plus, au sein de l’embryon de trois cellules, la cellule apicale rhizoïdienne est capable, après

division, de compenser aussi bien l’ablation de la cellule thalle que celle de la cellule basale

7
-
rhizoïdienne (figure 2) (Bouget et al., 1998). Ces résultats indiquent que le développement non-

autonome intervient majoritairement dans l’embryogenèse de Fucus : le contexte embryonnaire

dicte et maintien la différenciation des cellules.

B.2. P HOTOPOLARISATION DU ZYGOTE DE FUCUS SPIRALIS

La polarisation du zygote de Fucus en réponse à des gradients environnementaux

conduit à la formation de deux pôles morphologiquement et cytologiquement différents : le pôle

rhizoïdien et le pôle thalle. Le zygote présente des fenêtres temporelles de sensibilité

différentes aux vecteurs environnementaux (revue par Quatrano, 1974). Le stimulus lumineux a

été de loin le plus étudié. Le zygote de F. spiralis est sensible à la lumière de 4/6 h à 10 h AF.

Placé à l’obscurité après un stimulus lumineux, de durée et d’intensité adéquates, il germera

selon l’orientation de la lumière qui lui a été imposée. Durant cette période, l’expérimentateur peut

imposer une nouvelle orientation à l’axe de polarité en changeant l’orientation du vecteur

lumineux. Cette période pendant laquelle la polarité est dite labile, est appelée formation de

l’axe. Elle est suivie d’une période pré-germinatoire (10 à 14 heures), pendant laquelle le zygote

est réfractaire aux changements d’orientation de la lumière : c’est la période de fixation de l’axe.

En l’absence de marqueurs cytologiques de la formation, la réponse au vecteur lumineux est

évaluée au moment de la germination, dont l’orientation correspond ou non à la direction du

vecteur imposé. Ce protocole expérimental a été largement utilisé pour définir les événements

cellulaires et moléculaires correspondant à chacune de ces périodes et pour déterminer les

acteurs essentiels de la polarisation (figure 3).

B.3. A CQUISITION DE LA POLARITE

B.3.1. La fécondation

Chez Pelvetia, après la plasmogamie, la migration du pronucleus mâle s’effectue, par un

mécanisme qui implique les microtubules, à une vitesse moyenne de 0,11 à 0,29 µm/mn

(Swope et Kropf, 1993). Chez Fucus et Pelvetia, la caryogamie a lieu entre 2 et 4 h AF, tandis

que chez Ascophyllum, les noyaux fusionneraient 10 mn AF (Farmer et Williams, 1896).

8
-
 Figure 3 : Protocole expérimental de détermination des
périodes de formation et de fixation de l’axe de polarité

Formation Fixation Germination Cytodiérèse

4 8 10 14 16 22

orientation de la germination:
1
A aléatoire

1 selon le vecteur
B
lumineux 1

1 2 selon le vecteur
C
lumineux 2

1 1 2 selon le vecteur
D
lumineux 1

Ce protocole expérimental est actuellement le seul moyen de connaître avec certitude

le stade de développement dans lequel se trouvent des zygotes sphériques. Il a
largement été utilisé pour associer les événements physiologiques aux périodes de
formation ou de fixation de l ’axe.
Les zygotes sont soumis à un vecteur lumineux 1 et placés, à différents temps, à
l’obscurité ou soumis à un vecteur lumineux opposé 2. Au moment de la manipulation,
si les zygotes ne sont pas encore en période de formation (pas photosensibles) ils
germeront, à l ’obscurité, selon une orientation aléatoire (A). S’ils ont perçu le signal
lumineux ils germeront, à l’obscurité, selon le vecteur lumineux 1 (B). S’ils ont perçu le
signal mais n’ont pas fixé leur axe de polarité ils percevront et répondront au deuxième
vecteur lumineux qui leur est imposé, en germant à l’opposé du vecteur lumineux 2
(C). S’ils ont perçu et intégré définitivement le signal lumineux (fixé leur axe), ils ne
répondront plus au deuxième vecteur lumineux (D).
 A ce jour aucune asymétrie cytologique et/ou pariétale n’a pu être détectée dans

l’oosphère (Brawley et al., 1976). Le pronucleus femelle est maintenu en position centrale par le

cytosquelette de microfilaments et de microtubules. Cependant, les zygotes mis en culture dans

un milieu homogène (à faible densité et à l’obscurité), où ils ne sont soumis à aucun stimulus

suffisant pour les polariser, germent selon une orientation aléatoire et sont donc capables de se

polariser. Au début du siècle dernier, des études réalisées sur le zygote de Cystoseira barbata

indiquent que le point d’entrée de l’anthérozoïde détermine la polarité zygotique. En 1909,

Yamanouchi observe la présence de matériel fibreux au point d’entrée de l’anthérozoïde chez

les Fucales, mais ce n’est que très récemment qu’une localisation transitoire de l’actine corticale a

été mise en évidence au point d’entrée de l’anthérozoïde juste après la fécondation. La

polarisation puis la germination s’effectuent au point d’entrée de l’anthérozoïde. De plus, il existe

une étroite corrélation entre le taux de polyspermie et la formation d’embryons possédant deux

rhizoïdes diamétralement opposés (bipolaires) (Hable et Kropf, 2000). L’entrée de

l’anthérozoïde provoque donc une asymétrie initiale, matérialisée par la localisation transitoire du

cytosquelette d’actine, qui serait suffisante pour induire et orienter la polarisation. Par la suite,

cette première orientation de la polarité est annulée par d’autres stimuli environnementaux plus

efficaces.

B.3.2. Sélection d’un axe de polarité

Les différents inducteurs de la polarité

La période pendant laquelle aucune asymétrie n’est détectée, s’étend chez Fucus

spiralis jusqu’à 6 h AF et peut être conçue comme une période de potentialisation de la cellule à

répondre à son environnement. Les composants pariétaux (cellulose, alginates, fucanes peu

sulfatés et polyphénols) sont mis en place de façon uniforme et permettent au zygote d’adhérer

au substrat (Novotny et Forman, 1974; Vreeland et al., 1993). Simultanément, les synthèses

d’ARNm et de protéines nécessaires à la polarisation s’opèrent (Quatrano, 1968; Kropf et al.,

1989). La sensibilité du zygote aux nombreux facteurs environnementaux évolue dans le

temps (Jaffe, 1968). La sensibilité au “voisin” (effet de groupe) interviendrait très tôt après la

fécondation, tandis que la photosensibilité n’apparaît que plus tard (vers 5 h AF pour F. spiralis)

9
-
(Berger et Brownlee, 1994). De plus, parmi ces facteurs, certains prédominent sur les autres.

Ainsi, l’attraction mutuelle des zygotes prévaut sur l’orientation par la lumière (Bentrup et Jaffe,

1968). La qualité d’un facteur donné est également très importante (par exemple, la lumière

bleue prédomine sur la lumière blanche). Dans la nature, tous ces facteurs agiraient en synergie

pour orienter la croissance rhizoïdienne vers le substrat rocheux.

L’idée que ces facteurs n’agissent pas en réorientant un axe préformé mais sont à

l’origine même de sa formation, a reposé, pendant longtemps, sur l’observation suivante : en

lumière polarisée, les zygotes développent deux rhizoïdes diamétralement opposés

perpendiculairement au plan de vibration de la lumière (Jaffe, 1956; Jaffe, 1958). Comme il

semblait difficilement concevable que ces zygotes bipolaires résultent du dédoublement d’un

axe préformé, il était généralement accepté que l’axe de polarité du zygote est formé de novo.

Cette conception est remise en cause par le fait que l’anthérozoïde constitue un stimulus

suffisant pour induire la polarité (Hable et Kropf, 2000). De plus, quel que soit l’inducteur de la

polarité (l’anthérozoïde ou la lumière), les premières asymétries cellulaires apparaissent au

même moment pour une espèce donnée (Hable et Kropf, 1998). Enfin, la réorientation de la

polarité par un repositionnement du vecteur lumineux ne retarde pas sensiblement la

germination (observation personnelle). Il faut donc concevoir que l’établissement initial de la

polarité, à la suite de la fécondation, requiert la mise en place de facteurs qui lui sont propres et

qui, plus tard, pourraient être utilisés rapidement lors d’un repositionnement de la polarité.

Perception du signal lumineux

L’influence de la lumière a été beaucoup étudiée. Les zygotes se photopolarisent

exclusivement en réponse à la lumière bleue et ultraviolette, après un temps d’exposition qui

est fonction de l’intensité lumineuse (Hurd, 1920). Cependant, seules deux études nous

renseignent sur les mécanismes de perception du signal lumineux. Elles sont en profond

désaccord sur un point fondamental : la localisation des récepteurs à la lumière. La première

étude suggère que le zygote aurait la capacité de focaliser la lumière incidente au pôle rhizoïdien

au travers de son cytoplasme, qui servirait en quelque sorte de lentille convergente. Les

auteurs de cetravaux observent que la photopolarisation est inhibée par le ferricyanure qui est

préférentiellement réduit au pôle rhizoïdien. Ceci a conduit à l’hypothèse qu’une chaîne rédox

10
-
membranaire interviendrait en aval d’un photorécepteur localisé au pôle rhizoïdien (Berger et

Brownlee, 1994). La seconde étude démontre que les zygotes absorbent la lumière au pôle

thalle et soutient que la lumière ne peut pas être focalisée au pôle rhizoïdien (Robinson, 1996a).

Le fait que, chez les embryons âgés, les rhizoïdes s’orientent toujours en réponse à la lumière

malgré l’évolution des propriétés optiques due aux multiples cellules, est en faveur de la

dernière hypothèse. Des travaux plus récents indiquent qu’un gradient de GMPc est nécessaire

à la photopolarisation (Robinson et Miller, 1997). La découverte de fortes concentrations en

rétinal dans les zygotes a conduit Robinson à proposer un modèle faisant intervenir la

rhodopsine (11-cis-rétinal et opsine), similaire à celui de la transduction de la lumière dans les

systèmes visuels de vertébrés (Robinson et al., 1998). Une des faiblesses de ce modèle

réside dans la lenteur de l’élévation du GMPc en réponse à la lumière (2 h). En effet, l’essence

même du mécanisme de transduction de la lumière par la rhodopsine est l’amplification ultra

rapide du signal lumineux grâce à une forte production de GMPc (1 photon déclenche la

synthèse de 200 molécules de GMPc) (Lamb et Pugh, 1992).

B.3.3. La formation de l’axe de polarité

Les premières asymétries observées dans le zygote sont peu marquées, ce qui rend

leur détection difficile. Elles ont principalement été observées en réponse au vecteur lumineux et

peuvent être repositionnées par un changement d’orientation de ce vecteur (figure 4). Aussi, je

considérerai dans ce chapitre que les travaux concernant la photopolarisation intéressent

directement la formation de l’axe de polarité. Jusqu’à ce jour, aucun phénomène physiologique

propre à la formation n’a été identifié et les asymétries détectées sont amplifiées au cours de la

période de fixation (figure 4). Elles correspondent principalement à :

- l’apparition de courants transcellulaires de faible intensité entrant, au pôle rhizoïdien et

sortant au pôle thalle.

- une localisation au pôle rhizoïdien des microfilaments d’actine corticale.

- une modification des interactions plasmalemme-paroi au pôle rhizoïdien présomptif, qui

peut être mis en évidence par une plasmolyse marquée en milieu hypertonique.

- la localisation de molécules affines pour la dihydropyridine à ce même pôle, suggérant

une redistribution de canaux calciques en réponse à la lumière.

11
-
Figure 4 : Changements physiologiques et structuraux au
cours de la polarisation des zygotes de fucales

Lumière

Pronucleus mâle Actine F Récepteurs à la DHP

Nuclei de l’oosphère Courants électriques
et du zygote Gradient ionique
cytosolique
Centrioles Paroi
MtOC Gelée Fucanes sulfatés; protéine
apparentée à la vitronectine
Microtubule Vésicules sécrétoires ARNm d’actine

A. 1 h AF : Le pronucleus mâle migre vers le pronucleus femelle. Le zygote ne présente pas

d’asymétrie structurale. B. Formation de l’axe : 4-6 h à 8-10 h AF. Les courants
transcellulaires s’établissent, les recépteurs à la DHP et l’actine corticale se redistribuent au
futur pôle rhizoïdien, les centrosomes commencent à se séparer. Chez Pelvetia, de la gelée
se dépose au futur site rhizoïdien. C. Fixation de l’axe : 8-10 h à 14-16 h AF. Les
phénomènes de polarisation s’amplifient. Le gradient de Ca2+ est détecté. Les sécrétions
polarisées permettent l’ancrage de la polarité. Chez Fucus, des composés sulfatés sont mis
en place dans la paroi du pôle rhizoïdien. D. Germination : 16-18 h AF. Les sécrétions
polarisées s’accroîssent, et le remaniement pariétal au pôle rhizoïdien permet l’émergence
du rhizoïde. Les centrosomes sont les sites majeurs de nucléation des microtubules qui
s’allongent vers le pôle rhizoïdien et permettent la rotation nucléaire. E. Mitose : 16-20 h AF.
La rotation nucléaire s’achève, permettant l’alignement des centrosomes avec l’axe de
polarité. Les chromosomes se séparent. F. Cytodiérèse : 20-24 h AF. La membrane et la
paroi de division se forment transversalement à l’axe de polarité. L’actine et les ARNm
d’actine sont localisés au plan de division. MtOC, centre organisateur des microtubules.
DHP, dihydropyridine. D’après Kropf, 1997.
 B.3.4. Le cytosquelette

L’intégrité du cytosquelette d’actine, mais non celle des microtubules, est indispensable

à la formation de l’axe (Nelson et Jaffe, 1973; Quatrano, 1973; Brawley et Quatrano, 1979).

Chez Pelvetia, les inhibiteurs de la polymérisation de l’actine (cytochalasine D ou B, latrunculine

B) abolissent les sécrétions polarisées de matériel gélatineux amorphe (gelée) qui sont à

l’origine de la formation d’une zone claire située au pôle rhizoïdien (figure 4) (Hable et Kropf,

1998). La cytochalasine D diminue les courants électriques dans l’embryon germé et les

inhiberait totalement lors de la polarisation précoce (Brawley et Robinson, 1985).

Malheureusement cette dernière observation ne porte que sur trois zygotes et nécessiterait une

confirmation expérimentale.

B.3.5. Les interactions plasmalemme-paroi

Chez Pelvetia, le site de déposition de la gelée coïncide avec le site de plasmolyse

préférentielle chez le zygote et, de ce fait, les modifications des contacts plasmalemme-paroi au

pôle rhizoïdien présomptif apparaissent comme une conséquence du flux dirigé d’exocytose

(Hable et Kropf, 1998). De nouvelles molécules, dont la nature reste à préciser, seraient

insérées dans la membrane au pôle rhizoïdien et permettraient la modification des interactions

plasmalemme-paroi. Chez Fucus, des modifications similaires semblent avoir lieu lors de la

formation de l’axe, car la plasmolyse a lieu au site présomptif de la germination (Whitaker 1941;

Reed et Whitaker, 1941). Cependant, le flux dirigé de vésicules d’exocytose n’interviendrait que

plus tard, au moment de la fixation de l’axe (Shaw et Quatrano, 1996a). Chez Fucus,

l’interruption des phénomènes sécrétoires par la bréféldine A (BFA) ne gêne pas la

photopolarisation mais inhibe la fixation de l’axe (Shaw et Quatrano, 1996a), alors qu’un

traitement similaire chez Pelvetia, empêche également la photopolarisation (Hable et Kropf,

1998). Il faut cependant remarquer que la durée d’incubation des zygotes de Fucus en BFA est

seulement d’une heure pour les expériences de photopolarisation contre 6 heures pour les

expériences de fixation, et il serait judicieux de vérifier qu’un traitement plus précoce et plus long

n’a pas d’effet sur la photopolarisation.

12
-
 B.3.6. Le calcium libre

Historiquement, les courants transcellulaires entrant au pôle rhizoïdien et sortant au pôle

thalle ont été détectés avant toutes les autres asymétries. L’étude de ces courants dans des

milieux de différentes compositions ioniques, suggère qu’ils sont, en partie, attribuables aux ions

calcium (Nuccitelli, 1978). L’utilisation de 45Ca 2+ permit de mettre en évidence un influx de calcium

plus important au pôle rhizoïdien qu’au pôle thalle, 2 h après la stimulation des zygotes de

Pelvetia par la lumière, c’est à dire 6 h AF (Robinson et Jaffe, 1974). A ce stade, le calcium serait

majoritairement responsable du courant transcellulaire. Cet influx décroît par la suite mais se

stabilise en situation asymétrique au pôle rhizoïdien (revue par Robinson et al., 1999). Ces

expériences constituent le début d’une série de recherches visant à déterminer l’importance du

calcium dans le processus de photopolarisation.

Le rôle du calcium dans la croissance apicale du rhizoïde est actuellement bien établi et

un gradient de calcium a été visualisé dans le rhizoïde en croissance (Brownlee et Wood, 1986).

Il s’étend entre les valeurs extrêmes de 400 nM à la pointe rhizoïdienne et 100 nM, 20 à 30 µm

en deçà de cette région. Un plus faible gradient a pu être détecté par une sonde fluorescente

tétracycline au moment de la fixation de l’axe (Kropf et Quatrano, 1987). En revanche,

l’intervention des ions calcium lors de la formation de l’axe reste discutée. Les zygotes se

polarisent dans un gradient d’ionophores spécifiques du calcium et forment leur rhizoïde vers la

concentration d’ionophore la plus élevée (Robinson et Cone, 1980). De plus, Robinson

observe que les zygotes de Pelvetia ne peuvent se photopolariser lorsqu’ils sont en eau de

mer artificielle sans calcium, suggérant le rôle non négligeable du calcium extracellulaire pour

l’établissement de la polarité (Robinson, 1996b). Plusieurs auteurs rapportent, cependant, que

les zygotes de Fucus gardent la capacité à se photopolariser dans un milieu déplété en calcium

(Kropf et Quatrano, 1987; Love et al., 1997). Il apparaît même que le potassium seul suffit à

leur photopolarisation (Hurst et Kropf, 1991). Néanmoins, Love démontre que plusieurs agents

bloquants de canaux calciques (nifédipine, TMB 8, bépridil, vérapamil) inhibent la

photopolarisation, ce qui renforce les résultats similaires obtenus par Robinson avec les agents

bloquants D600 et le Gd3+ (Love et al., 1997; Robinson, 1996). Love propose que le calcium

intracellulaire libre aurait un rôle majeur par rapport au calcium extracellulaire pour la

13
-
photopolarisation. Les différences observées entre Pelvetia et Fucus pourraient être dues à des

variations dans leurs capacités pariétales à chélater le calcium, ce qui rendrait la déplétion de

calcium plus difficile chez Fucus. En effet, la paroi des algues brunes contient des polymères

d’acide guluronique, qui chélatent le calcium, et constitue de ce fait un stock non négligeable de

calcium (Kloareg et Quatrano, 1988).

Les expériences citées ci-dessus, font état de la réponse calcique à la suite de

l’illumination des zygotes mais ne permettent pas de déterminer si le calcium est nécessaire

précocement au cours de la photopolarisation, c’est à dire lors de la formation de l’axe. Deux

récents travaux viennent combler cette lacune. En réponse à la lumière, un agent bloquant

fluorescent spécifique des canaux calciques, la dihydropyridine (DHP), se localise au pôle non

éclairé des zygotes, et peut être repositionné lorsque l’orientation lumineuse est inversée, ce qui

suggère que des canaux calciques sont relocalisés au pôle rhizoïdien durant la période de

formation de l’axe (Shaw et Quatrano, 1996b). Néanmoins, des mesures électrophysiologiques

de l’activité de canaux isolés ne révèlent aucune asymétrie dans la distribution des canaux

calciques dans l’embryon de deux cellules et la DHP n’inhibe l’activité d’aucun de ces canaux

(Taylor et al., 1996; Taylor communication personnelle). Au moment de la formation de l’axe (1 h

après application du vecteur lumineux) une élévation de calcium aurait lieu au site présomptif

rhizoïdien (Pu et Robinson, 1998). Cependant, la méthode de quantification du calcium utilisée

est indirecte (ratio-imaging à partir de deux sondes différentes) et d’autres expériences seraient

nécessaires pour affirmer avec certitude qu’il existe un gradient de calcium lors de la formation de

l’axe.

Quoiqu’il en soit, l’ensemble de ces résultats suggère que la calcium intra ou/et

extracellulaire intervient dans le phénomène de photopolarisation. Toutefois, face à

l’hétérogénéité des résultats et à l’absence de gradient calcique détectable pendant la formation,

les auteurs s’accordent pour attribuer au calcium un rôle d’amplificateur plutôt que d’initiateur de

la polarisation.

Une protéine apparentée à la calmoduline a été isolée chez Pelvetia et Fucus (Brawley

et Roberts, 1989). Elle semble constituer un médiateur important du calcium lors de la

polarisation mais son rôle dans la formation proprement dite reste controversé. Selon les

14
-
travaux de Love, la microinjection de calmoduline accentue la photopolarisation des zygotes

Fucus tandis que les antagonistes de la calmoduline inhibent la photopolarisation (Love et al.,

1997). Pu rapporte, à l’inverse, qu’un antagoniste de la calmoduline différent favorise la

photopolarisation mais inhibe la germination (Pu et Robinson, 1998). Il est donc trop tôt pour

affirmer que le calcium agit via la calmoduline lors de la photopolarisation.

B.4. LA FIXATION DE L ’ AXE DE POLARITE

La fixation de l’axe a été initialement définie comme la période pré-germinatoire pendant

laquelle le zygote ne répond plus aux changements d’orientation du vecteur lumineux et au

cours de laquelle les phénomènes initiés lors de la formation (les courants transcellulaires,

gradient de calcium et les sécrétions polarisé) s’amplifient (figure 4). Lors de la fixation, le site

d’émergence du rhizoïde est déterminé, même si, plus tard, le rhizoïde en croissance continuera

de s’orienter selon un phototropisme négatif. Ceci laisse présumer que la fixation de l’axe résulte

du renforcement des interactions physiques au pôle rhizoïdien plutôt que d’une

photodésensibilisation.

B.4.1. Le cytosquelette

Le cytosquelette d’actine a longtemps été considéré comme un acteur principal de la

fixation de l’axe du fait que sa localisation au futur pôle rhizoïdien a été détectée initialement

durant cette période (Brawley et Robinson, 1985). La cytochalasine B empêche la fixation de

l’axe chez des zygotes dont l’axe est déjà formé, de sorte que les zygotes continuent de

répondre à l’orientation du vecteur lumineux après le retrait de l’inhibiteur (Quatrano, 1973).

Love rapporte, d’ailleurs, que seule la fixation de l’axe serait empêchée par les inhibiteurs de la

polymérisation de l’actine. Cependant, il utilise des périodes d’incubation en cytochalasine bien

plus longues lors des tests de fixation (7h) que lors des tests de formation (3h) (Love et al.,

1997). L’ensemble de ces résultats indique que le rôle essentiel des microfilaments d’actine pour

la photopolarisation est maintenu au cours de la fixation de l’axe de polarité. Les microtubules,

quant à eux, ne semblent pas intervenir au cours de la fixation de l’axe de polarité, puisque leur

dépolymérisation n’a pas d’effet sur la germination (Brawley et Quatrano, 1979).

15
-
 B.4.2. La paroi

La digestion enzymatique de la paroi de jeunes zygotes de Fucus inhibe spécifiquement

la fixation de l’axe. Les protoplastes sont capables d’enregistrer le signal lumineux et d’y

répondre une fois qu’ils ont régénéré une paroi, mais, tant que la paroi est absente la

réorientation de l’axe reste possible (Kropf et al., 1988). Des pseudoprotoplastes de cellule

thalle ou rhizoïdienne peuvent être obtenus par microchirurgie laser, à partir d’un embryon de

deux cellules. Ces pseudoprotoplastes se développent en de nouveaux zygotes

photopolarisables, ce qui démontre également le rôle primordial de la paroi dans l’ancrage et le

maintien de la polarité, essentielle à la différenciation cellulaire (Berger et Brownlee, 1995). A

l’inverse, une cellule isolée dans sa paroi ne perd pas sa polarité, ce qui confirme le rôle de la

paroi dans le maintien de la polarité cellulaire (Bouget et al., 1998)

B.4.3. Les sécrétions polarisées et l’asymétrie pariétale

Quelles sont les molécules impliquées dans les interactions membrane-paroi et quels

sont leurs rôles? Ces questions firent l’objet de nombreuses investigations, qui conduisirent à

l’élaboration d’un modèle de travail. Ce modèle propose qu’un complexe de stabilisation de l’axe

servirait de relais structural et informationnel entre la paroi et le milieu intracellulaire (Quatrano,

1990) (figure 5). Ce modèle est inspiré des adhésions focales dans les cellules animales et du

complexe mis en place dans les levures lors des phénomènes de bourgeonnement et de

conjugaison (Craig et Jonhson, 1996; Cid et al., 1995). En effet, ces deux situations sont

phénoménologiquement proches de la polarisation du zygote de Fucus et impliquent, elles

aussi, la localisation du cytosquelette d’actine, l’exocytose dirigée de vésicules au site de

polarisation et l’intervention de la matrice extracellulaire.

Chez le zygote de Fucus, des fucanes très sulfatés sont incorporés dans la paroi

rhizoïdienne lors de fixation de l’axe de polarité (environ 2 h avant la germination). De ce fait,

ces molécules furent considérées comme de bons candidats pour assumer le rôle d’ancrage de

la polarité (Goodner et Quatrano, 1993). En effet, lorsque la fixation de l’axe est inhibée par la

cytochalasine B ou par un inhibiteur de la synthèse protéique, le cycloheximide, ces composés

sulfatés ne se localisent pas alors que la seule inhibition de la germination en milieu

hypertonique permet leur localisation (Novotny et Forman, 1974). De plus, des zygotes cultivés

16
-
 Figure 5 : Modèle de l’établissement de la polarité zygotique :
le complexe de stabilisation de l’axe
Lumière
Perception
et transduction
du signal Vésicules contenant
des canaux ioniques
Photorécepteur
Vésicules contenant
Paroi cellulaire
du matériel pariétal

Formation
de l’axe de polarité Protéines apparentées
aux intégrines

Microfilaments
d’actine

Déterminants
Fixation du site rhizoïdien
de l’axe de polarité
Composés pariétaux d’ancrage
du cytosquelette d’actine :
Protéine apparentée
à la vitronectine
Fucanes sulfatés

Croissance polarisée
(germination)

Sécrétions polarisées

Division cellulaire
Protéines impliquées
asymétrique dans la fusion des vésicules à la membrane

A gauche : Processus global de polarisation. A droite : Détail des événements

moléculaires se produisant au pôle rhizoïdien. Durant la formation de l’axe, le site
rhizoïdien est sélectionné. La polarisation du cytosquelette d’actine à ce site permet le
transport polarisé de vésicules contenant des canaux ioniques, dont les canaux
calciques responsables de l’augmentation de calcium du pôle rhizoïdien. Le Ca2+
favorise la polymérisation de l’actine. D’autres molécules, comme les intégrines, la
vitronectine et les fucanes sulfatés, sont mises en place par exocytose dans la
membrane et la paroi du pôle rhizoïdien. Elles permettent l’amplification de la
polarisation et l’ancrage du cytosquelette au pôle rhizoïdien (Fixation de l’axe). D’après
Goodner et Quatrano, 1993.
en eau de mer sans sulfate, qui ne présentent pas de localisation de molécules sulfatées,

gardent un aspect sphérique mais se divisent. Cependant, ces zygotes adhèrent mal au

substrat, et de ce fait après retour en eau de mer normale, l’orientation de leur germination ne

renseigne pas sur leur capacité à se polariser durant le traitement. Shaw et Quatrano (1996a)

ont montré que, chez Fucus, l’inhibition des sécrétions par la BFA empêche la localisation des

composés sulfatés et également la fixation de l’axe, et soutiennent l’hypothèse selon laquelle

des molécules sécrétées, dont les composés sulfatés, auraient un rôle important pour la fixation

de l’axe de polarité. L’ensemble de ces résultats a tout naturellement conduit à l’hypothèse que

les fucanes sulfatés localisés au pôle rhizoïdien, par une exocytose dirigée dépendante des

filaments d’actine, seraient des acteurs essentiels de la fixation de l’axe. Les composés sulfatés

sont de ce fait couramment utilisés comme marqueurs de la fixation de l’axe (figure 5).

Toutefois, Crayton et colaborateurs montrèrent, dans une étude isolée, que les zygotes

cultivés en eau de mer sans sulfate mais supplémentée en méthionine, manquent d’adhérence

mais peuvent se photopolariser et germer bien qu’ils ne contiennent pas de fucanes sulfatés

dans leur paroi (Crayton et al., 1974). Ces embryons ne “produisent pas de rhizoïde allongé

d’embryons typiques, mais se développent en embryons globulaires non adhérents” (Wagner

et al., 1992). Des expériences, que nous avons réalisées en collaboration avec C. Brownlee,

nuancent également le rôle essentiel attribué aux fucanes sulfatés lors de la fixation de l’axe

(résultats non publiés). Nous avons pu constater que des zygotes cultivés en eau de mer

sans sulfate, mais dont l’adhésion est favorisée par la polylysine, ne germent pas mais forment

et fixent un axe de polarité. La polarisation, bien que retardée, s’effectue donc en l’absence de

localisation de composés sulfatés au pôle rhizoïdien. Nous avons obtenu des résultats

similaires en inhibant la sulfatation avec des inhibiteurs de la sulfatation des polyphénols

(dichloronitrophénol et le pentachlorophénol). De plus, nous avons observé que la localisation

pariétale des polyphénols, au cours du développement normal, est identique à celle des

composés sulfatés lors des différents traitements. Quelle que soit la nature des composés

sulfatés, il apparaît donc qu’ils joueraient un rôle dans la morphogenèse rhizoïdienne et non

dans la fixation de l’axe de polarité. L’inhibition de la fixation de l’axe par la BFA empêcherait

donc la mise en place d’autres molécules clé pour l’ancrage de la polarité, qui restent à identifier.

17
-
 B.4.4. Les acteurs du continuum paroi-membrane-cytosquelette

D’autres tentatives pour isoler des molécules faisant partie du complexe-relais entre le

cytosquelette d’actine et la paroi ont été réalisées. Ainsi, des protéines reconnues par des

anticorps anti-vitronectine, anti-vinculine et anti-ß-intégrine ont été mises en évidence dans les

extraits d’embryons de deux cellules (figure 5) (Quatrano et al., 1991). L’anticorps anti-

vitronectine directement ajouté aux cultures de zygotes aurait un effet inhibiteur sur leur capacité

d’adhésion et sur le maintien de la polarité mais non sur son établissement. L’immuno-détection

in situ suggère que la protéine reconnue par cet anticorps serait localisée dans la paroi

rhizoïdienne de l’embryon de deux cellules (Wagner et al., 1992). Les tentatives d’identification

d’un gène codant la vitronectine ont échoué. Par la suite, Henry et collaborateurs (1996) mirent

en évidence que l’actine est localisée aux sites de fortes interactions entre le plasmalemme et la

paroi dans la pointe rhizoïdienne. Le nombre de ces interactions apparaît plus faible lorsque les

zygotes sont incubés en présence de peptides RGDS qui correspondent à la séquence

consensus de liaison des molécules, telle que la vitronectine, aux intégrines (Henry et al., 1996).

Ces résultats, quoiqu’encourageants, concernent l’embryon germé et il n’est pas possible

d’affirmer avec certitude que ce type d’interaction plasmalemme-paroi est essentiel à la fixation

de l’axe de polarité et de conclure quant à la nature exacte des molécules impliquées.

B.5. MODELE DE LA POLARISATION ZYGOTIQUE

Si de nombreux acteurs de la polarisation ont été identifiés, le mécanisme initial par

lequel l’asymétrie environnementale est traduite en une asymétrie cytologique et physiologique

reste mal comprise. Néanmoins, la localisation de l’actine apparaît être prépondérante (figure 4

et 5). Le cytosquelette d’actine, essentiel tout au long de la polarisation, servirait, notamment, à

orienter les sécrétions polarisées. Lors de la formation de l’axe, l’exocytose de vésicules au pôle

rhizoïdien pourrait être responsable de la mise en place localisée de canaux calcium. Il est

également envisageable qu’une activation précoce et localisée de canaux calciques s’opère au

pôle rhizoïdien et participe à la création d’un courant transcellulaire entrant au pôle rhizoïdien et

sortant au pôle thalle. L’élévation de calcium favoriserait la polymérisation de l’actine ainsi que

l’exocytose au pôle rhizoïdien et agirait donc en boucle d’amplification positive. L’exocytose de

18
-
protéines d’adhésion et de pontage, et de polyphénols sulfatés, permettrait d’ancrer les

interactions cytosquelette-paroi. Simultanément, la mise en place de composés sulfatés au pôle

rhizoïdien, serait à l’origine d’une modification des propriétés pariétales permettant l’émergence

ultérieure du rhizoïde.

Les synthèses d’ARNm et protéiques ont lieu avant la période photosensible ce qui

suggère que les phénomènes impliqués dans la polarisation sont régulés par voie post-

traductionnelle (Quatrano 1968; Kropf et al., 1989). Les ARNm sont localisés au pôle thalle dès

la fixation de l’axe mais la signification biologique de cette localisation, qui est dépendante des

microfilaments d’actine, n’est pas connue (Bouget et al., 1995).

B.6. LA GERMINATION

L’affaiblissement mécanique de la paroi et l’exocytose accrue de vésicules au pôle

rhizoïde permettent l’émergence d’une protubérance qui correspond à la naissance du rhizoïde.

A son apex, les microfilaments d’actine et le gradient de calcium intracellulaire sont aisément

détectés (Brownlee et Wood, 1986; Kropf et Quatrano, 1987). Le gradient de calcium est

nécessaire à la croissance apicale du rhizoïde. Les concentrations calcique atteignent 1µM à la

pointe rhizoïdienne. L’injection de chélateurs de type BAPTA et la réduction des concentrations

extracellulaires de calcium inhibent la croissance rhizoïdienne (Speksnijder et al., 1989). Des

phénomènes calciques similaires et d’égale importance se retrouvent dans l’élongation du tube

pollinique (Rathore et al., 1991; Miller et al., 1992). Le calcium stabilise la polymérisation des

microfilaments d’actine et favorise l’exocytose de vésicules à l’apex.

Les courants transcellulaires s’accentuent lors de la germination, atteignant environ 100

pA (Nuccitelli et Jaffe, 1974). Ils résultent d’un influx de Ca2+, K + , Na + et d’un efflux de Cl - au

pôle rhizoïde ainsi que d’un efflux des même ions au pôle thalle (Jaffe et Nuccitelli, 1974;

Robinson et Jaffe, 1974). Dans l’embryon germé, ces courants sont dépendants de l’intégrité du

cytosquelette d’actine. Il a été proposé que l’augmentation du courant transcellulaire résulte de la

mise en place de nouveaux canaux ioniques par exocytose (Brawley et Robinson, 1985).

Dans les heures qui suivent, la polarisation cytologique de l’embryon se prononce : le

rhizoïde se charge en mitochondries et possède une machinerie sécrétoire très développée

19
-
(Golgi et vésicules abondantes) alors que le pôle thalle présente de nombreux chloroplastes

(Quatrano, 1972; Brawley et al., 1977). La ségrégation artificielle des organites par

centrifugation avant la germination, montre que le pôle thalle se développe du côté où les

chloroplastes se sont accumulés (Beams, 1937; Whitaker, 1940). Néanmoins, la violence d’un

tel traitement implique la perturbation de nombreux phénomènes et ne permet pas de conclure

sur le rôle de la répartition des organites dans l’établissement de la polarisation. La localisation

des organites au sein du zygotes, refléterait plutôt la spécification de deux pôles qui, à la suite

de la première division cellulaire, sont isolés l’un de l’autre. Chacune des cellules filles adopte un

mode de croissance et une physiologie propre aux fonctions des tissus auxquels elle donnera

naissance.

B.7. LA DIVISION

La division asymétrique est non seulement l’aboutissement de la polarisation mais

surtout celle du premier cycle cellulaire sur lequel il n’existe que très peu de données. Les

oosphères se trouvent en phase G 1 du cycle cellulaire et contiendraient 32 chromosomes

(Evans, 1962). Motomura soupçonne la nécessité d’un facteur localisé dans le pronucleus

femelle pour la réplication de l’ADN, et d’un facteur cytoplasmique de type MPF (M-phase

Promoting Factor), dont l’activité maximale en milieu de métaphase permettrait la réalisation de la

mitose (Motomura, 1995). La situation temporelle des événements pré-mitotiques du cycle

cellulaire n’était jusqu’à ce jour pas connue (article I, II,III).

La mitose a lieu juste après la germination (16-20 h AF) alors que la cytodiérèse

s’effectue entre 20-24 h AF (revue par Kropf, 1992). Le moment de la première division est bien

mieux conservé, au sein d’une même espèce, entre des lots de zygotes dans des états

physiologiques différents et même entre les genres Fucus et Pelvetia, que ne le sont les

phénomènes de polarisation, ce qui suggère l’existence d’une horloge interne.

B.7.1. La mitose

Séparation des centrosomes et rotation nucléaire

20
-
 Les centrioles des centrosomes proviennent des corpuscules basaux des flagelles de

l’anthérozoïde (Motomura, 1994; Bisgrove et al., 1997). A la suite de la caryogamie, les

centrosomes viennent s’accoler à l’enveloppe nucléaire en un même site (Nagasato et al.,

1999). Les microtubules émanent à partir de la périphérie nucléaire et présentent une distribution

radiale homogène. Leur nombre s’accroît au fur et à mesure du développement (Kropf et al.,

1990). En début de mitose, les microtubules interphasiques disparaissent et les centrosomes

deviennent les centres de nucléation des microtubules (centre organisateurs des microtubules

MtOC) (Allen et Kropf, 1992). Ils migrent lentement et de manière asynchrone pour se placer en

position diamétralement opposée autour du noyau selon une orientation aléatoire par rapport à

l’axe de polarité (figure 4) (Nagasato et al., 1999; Motomura, 1994). Les MtOC s’alignent alors

avec l’axe de polarité, par un mécanisme dépendant des microtubules et de l’actine, provoquant

une rotation du noyau (Kropf et al., 1990; Allen et Kropf, 1992; Bisgrove et Kropf, 1998). De ces

MtOC émanent des microtubules qui s’allongent vers le pôle rhizoïdien et fourniraient la force

motrice principale nécessaire à la rotation nucléaire (Allen et Kropf, 1992). L’actine corticale ne

servirait que de point d’ancrage des microtubules. La rotation nucléaire permet d’orienter le plan

de la première division asymétrique perpendiculairement à l’axe de polarité. Les agents

dépolymérisants des microtubules, les inhibiteurs de la polymérisation de l’actine et les

inhibiteurs des sécrétions polarisées conduisent à l’altération de l’orientation du plan de division

(Allen et Kropf, 1992; revue par Quatrano et Shaw, 1997). Ceci suggère que l’organisation

polaire des microtubules au moment de la germination, qui est retrouvée à la pointe rhizoïdienne

lors de la croissance apicale, dépendrait du continuum actine-membrane-paroi établi au moment

de la fixation de l’axe (Bisgrove et Kropf, 1998).

Division nucléaire

Motomura (1994) décrit de manière très détaillée les événements de mitose observés en

microscopie électronique. Il complète, confirme ou rectifie les observations précédentes (Farmer

et Williams, 1896; Yamanouchi 1909; Brawley et al., 1977). La mitose est semblable à celle des

autres algues brunes (Markey et Wilce, 1975; La Claire, 1982; Ktsaros et Galatis 1992). La

prophase est initiée par la condensation du matériel nucléaire et la nucléation des asters à

chaque pôle du futur fuseau. Une discontinuité dans la membrane nucléaire apparaît

21
-
tardivement, principalement aux pôles du fuseau et s’accentuera jusqu’en fin de métaphase.

Lors de la métaphase, les chromosomes s’alignent sur le plan équatorial du fuseau qui s’est

formé progressivement par polymérisation des microtubules. Des microtubules interconnectent

les deux pôles, (microtubules polaires) et d’autres se terminent sur des structures

kinétochoriennes des chromosomes (microtubules kinétochoriens). Les microtubules émanant

vers le cytoplasme se raccourcissent (microtubules astraux). L’anaphase correspond à la

séparation des chromatides soeurs vers chacun des pôles de la cellule, phénomène qui

s’accompagne de la réapparition de microtubules irradiant des MtOC vers le cytoplasme. En

télophase, la membrane nucléaire se reforme autour des nuclei dans lesquels la chromatine se

décondense et le nucléole apparaît. Ces nuclei sont pourvus chacun d’une paire de centrioles.

B.7.2. La cytodiérèse

La cytodiérèse s’effectue par un mécanisme faisant probablement intervenir d’avantage

l’actine que les microtubules. En effet, l’actine est localisée au plan de division alors que les

microtubules n’y sont pas détectés (Brawley et al., 1977). Cependant, le clivage n’est pas

inhibé mais simplement retardé par de faibles concentrations de cytochalasine (Quatrano,

1973). L’actine est supposée être responsable de l’accumulation de chloroplastes au plan de

division où s’accumulent également de nombreuses vésicules golgiennes (Brawley et al.,

1977). L’initiation du clivage centripète n’est pas bien comprise, mais la fusion de vésicules

participerait à la formation des membranes et de la paroi intermédiaire. Le réticulum

endoplasmique rugueux et l’appareil de Golgi se développent entre les deux noyaux. L’actine,

sous forme de collier au plan de clivage, ne se contracte pas et persiste très longtemps après la

division. Les transcrits d’actine sont également localisés au niveau de ce collier et contribuent

très probablement à la localisation de l’actine à ce site (Bouget et al., 1996). Le rôle de l’actine

dans le clivage cellulaire reste à préciser. La cytodiérèse de Fucus diffère donc de la cytodiérèse

végétale où, avant l’achèvement de la mitose, les microtubules et microfilaments forment

transitoirement un réseau dense (la bande préprophasique) qui marque le futur site de division

tandis que, les microtubules organisent le phragmoplaste au centre de la cellule et permettent un

clivage centrifuge (Staehelin et Hepler, 1996).

22
-
 II. LE CYCLE CELLULAIRE

Le cycle de division cellulaire est le moyen fondamental par lequel les êtres vivants se

propagent : chez les espèces unicellulaires, chaque division produit un nouvel organisme,

tandis que chez les espèces pluricellulaires, des profils complexes de divisions permettent de

créer et de maintenir un nouvel organisme.

A. L ES PHASES DU CYCLE CELLULAIRE

La transmission fidèle de l’information génétique de la cellule mère aux cellules filles

requiert le déroulement séquentiel et le contrôle strict des événements de réplication de l’ADN

(phase de synthèse ou S) et de ségrégation des chromosomes (phase de mitose ou M). Ces

phases sont généralement précédées de phases préparatrices appelées “Gap” (G) pour

espace (figure 6). En G1, les facteurs environnementaux et physiologiques, qui sont intégrés

par la cellule, permettent ou non l’entrée en phase S (disponibilité en nutriments, mitogènes,

hormones, augmentation de masse cellulaire, lumière pour les cellules végétales). Ces facteurs

n’influencent la cellule que pendant une période définie de la phase G 1, de telle sorte que

lorsque les conditions sont favorables, la cellule s’engage irréversiblement dans le cycle de

division. Ainsi, au delà de cette transition appelé START (pour les levures) ou point de

restriction (R) chez les eucaryotes supérieurs, la cellule achève son cycle cellulaire

indépendamment des facteurs exogènes (revue par Planas-Silva et Weinberg, 1997). En

revanche, lorsque les conditions ne sont pas favorables à la division, les cellules somatiques

peuvent entrer réversiblement dans un état quiescent qui définit la phase G0. Durant la phase

S, les chromatides soeurs sont néo-synthétisées. Pendant la phase G2, la masse cellulaire peut

continuer de s’accroître et les acteurs nécessaires à la mitose sont élaborés. La mitose

correspond à un remaniement extrême du noyau, menant à la séparation des chromatides

soeurs qui constitueront le support de l’information génétique des cellules filles. La mitose se

déroule en cinq grandes étapes, la prophase, la prométaphase, la métaphase, l’anaphase et la

23
-
 Figure 6 : Les différents complexes CDK/cyclines
intervenant lors de la progression
dans le cycle cellulaire

CDC28
Levure (S. Cerevisiae)

CLB1-2
Eucaryotes
CDC28 cdc2
Cycline B supérieurs
cdc2
CLN3
M Cycline D
CDC28
Cycline A Cdk4/6
cdc2 G2 G1
START
Cycline E CLN1-2
cdk2 CDC28
S
Cycline A
cdk2

CLB5-6
CDC28

Description dans le texte principal

télophase, comme nous l’avons précédemment décrit chez Fucus (I-B.7.1). L’enveloppe

nucléaire se désagrège, les chromosomes se condensent et le fuseau mitotique se met en place.

Après la séparation des chromatides soeurs, les noyaux fils s’individualisent et la cytodiérèse a

lieu. La durée d’un cycle est très variable selon le type de cellule et l’organisme. Les variations

les plus importantes concernent la phase G1. La durée d’un cycle est de 8 minutes pour une

cellule embryonnaire de drosophile et de 24 h pour une cellule somatique de mammifère (Murray

et Hunt, 1993).

B. L ES KI N A S E S D E P E N D A N T E S D E S C Y C L I N E S A S S U R E N T L A P R O G R E S S I O N

DANS LE CYCLE CELLULAIRE

B.1. I DENTIFICATION

L’identification des premières kinase dépendantes des cyclines (CDK) et de leur fonction

est le résultat d’approches biochimiques et génétiques complémentaires, effectuées

respectivement sur l’oeuf de xénope et la levure. Des études cellulaires démontrèrent l’existence

d’un facteur capable de déclencher la maturation ovocytaire chez le xénope (Rao et Johnson,

1970; Masui et Markert, 1971). Ce facteur fut ultérieurement identifié comme étant responsable

de la phase M (méiose et mitose) dans toutes les cellules eucaryotes et baptisé "M phase

promoting factor" (MPF) (revue par Kishimoto, 1988). Parallèlement, l’approche génétique permit

d’isoler des mutants de levure cdc (pour “cell cycle division”) (Hartwell, 1974; Nurse et al., 1976;

Nasmyth et Nurse, 1981; Beach et al., 1982) et conduisit à l’identification du gène cdc2 chez

Schizosaccharomyces pombe et de son homologue CDC28 chez Saccharomyces cerevisiae.

Les mutants cdc2- et CDC28 - sont arrêtés en G1 et en phase M, ce qui suggère que les CDK

sont impliquées tant dans l’entrée en phase S que dans la progression mitotique (Nurse et

Bisset, 1981; Beach et al., 1982).

La caractérisation biochimique du MPF conduisit à identifier un hétérodimère constitué

d’une sous-unité catalytique de 34 kDa, qui est codée par le gène homologue cdc2 et possède

une activité kinasique spécifique des résidus serine et thréonine (S/T kinase) (Dunphy et al.,

24
-
1988; Gautier et al., 1988) et d’une protéine, dont la concentration fluctue au cours du cycle

(Evans et al., 1983; Murray, 1989; Gautier et al., 1990). Cette protéine, qui reçut le nom de

cycline, s’accumule en interphase pour atteindre un niveau maximum en mitose, puis décroît

rapidement en fin de mitose (revue par Hunt, 1989). L’activité du MPF est directement corrélée à

l’abondance de cette cycline qui représente donc une sous-unité régulatrice positive. Le MPF

est un des représentants d’une famille hétérodimérique de S/T kinases appelées Kinases

Cyclines-Dépendantes (CDK pour Cyclin-Dependent Kinase).

De nombreux gènes homologues de cdc2 furent identifiés par la suite chez les

eucaryotes supérieurs (Lehner et O’Farrell, 1990; Paris et al., 1991; Meyerson et al., 1992). Les

protéines codées par ces gènes sont des S/T kinases qui possèdent une masse moléculaire de

l’ordre de 34 à 40 kDa. Elles présentent, entre elles, 36 à 65% d’identité de séquence

(Meyerson et al., 1992; Pines, 1995). Le site catalytique, de 300 acides aminés, contient un

motif conservé de liaison à la cycline “PSTAIRE” (cdk1, cdk2, cdk3) ou divergent (cdk4 :

PSTVRE, cdk 5 : PSSALRE). L’association à une cycline n’a pas été démontrée pour d’autres

protéines apparentées à cdc2, qui possèdent un motif PSTAIRE ou divergent, mais ces

protéines sont tout de même dénommées CDK.

B.2. D IFFERENTS COMPLEXES CDK/CYCLINES INTERVIENNENT AU COURS

DES PHASES DU CYCLE CELLULAIRE

Chez les levures, il n’existe qu’une seule sous-unité catalytique (cdc2/CDC28) à

laquelle s’associent des cyclines spécifiques, selon la phase du cycle, conférant ainsi à la

kinase sa spécificité (Stern et Nurse, 1996; Mendenhall et Hodge, 1998) (figure 6). On distingue

classiquement les cyclines de G1 (CLN) et les cyclines mitotiques (CLB). Chez les eucaryotes

superieurs, la multiplicité des cyclines s’ajoute à celle des kinases, mais les possibilités de

combinaison restent réduites car il existe une spécificité entre les sous-unités catalytiques et les

cyclines, et la majorité des cyclines n’apparaissent que transitoirement au cours de certaines

phases (Pines, 1995). Ainsi, les cyclines D et E interviennent exclusivement en phase G 1 et en

phase S précoce et ne peuvent s’associer avec cdk1 (homologue de cdc2) qui intervient en fin

de phase G 2 et en mitose. En activant des substrats spécifiques, via des cascades de

25
-
phosphorylation, les différents complexes CDK/cyclines permettent la progression de la cellule

à travers les différentes étapes du cycle cellulaire (figure 6).

B.2.1. Contrôle de la phase S

L’inhibition des CDK de G 1 empêche la réplication de l’ADN dans la plupart des

systèmes biologiques. Les CDK contrôlent au moins deux événements essentiels à la transition

G 1/S : elles activent la transcription de gènes nécessaires à la phase S ainsi que celle des

gènes codant les protéines nécessaires à l’empaquetage de l’ADN, et régulent directement la

mise en place des complexes d’initiation de la réplication (revue par Heichman et Roberts, 1994;

Sherr, 1994; Chevalier et Blow, 1996).

Les CDK de phase G 1 phosphorylent la protéine du rétinoblastome (Rb) et les

protéines apparentées p107 et p130, ce qui permet la libération des facteurs de transcription

(E2F/ DP1) liés à ces protéines, facteurs qui contrôlent l’expression de protéines requises pour

la phase S (figure 8) (Müller, 1995). Les complexes cdk4-6/cyclines D et le complexe cdk2/

cycline E interviennent dans la phosphorylation de Rb (Sauer et Lehner, 1995). Les complexes

cdk2/cycline A sont responsables de la phosphorylation inactivatrice des facteurs de

transcription E2F/DP1, et contrôlent ainsi la durée de la phase S (Krek et al. 1994; Xu et al.,

1994).

Les CDK de phase S sont colocalisées aux sites de réplication avec les protéines de la

réplication comme RP-A (Cardoso et al., 1993). Elles activeraient le désenroulement de l’ADN

(Adachi et Laemmli, 1994) et favoriseraient, ainsi, l’association des complexes d’initiation de la

réplication aux origines de réplication contenant de l’ADN désenroulé (Roberts, 1993). En effet,

des expériences utilisant le virus oncogène SV40 montrent que les CDK activent la fonction

topoisomérase de l’antigène T. L’étude de la réplication, chez S. cerevisiae, a conduit à

l’identification de complexes macromoléculaires (ORC pour Origin of Recognition Complexes),

qui reconnaissent les origines de réplication (ARS pour Autonomous Replicative Sequence),

dont l’importance est fondamentale pour le déroulement correct de la phase S (revue par

Heichman et Roberts, 1994). Certaines sous-unités des ORC, ainsi que de nombreux produits

de gènes impliqués dans la régulation des ORC (dont CDC6) possèdent des sites de

phosphorylation potentiels pour CDC28. Cependant, les mécanismes de régulation de ces

26
-
protéines par les CDK ne sont toujours pas clairement établis. Récemment, il a été montré que

la localisation intracellulaire de CDC6, composant essentiel à la réplication, dépend de sa

phosphorylation par le complexe cdk2/cycline A (Petersen et al., 1999).

Les CDK assurent également que la réplication n’ait lieu qu’une seule fois par cycle.

Ainsi, chez Schizosaccharomyces pombe, certaines mutations de cdc2 ou cdc13 (qui code la

cycline mitotique), conduisent à une re-réplication de l’ADN sans qu’il n’y ait eu de mitose (Broek

et al., 1991; Hayles et al., 1994). L’ensemble des données actuelles indiquent que les CDK

mitotiques empêcheraient l’accumulation ou l’activation nucléaire de facteurs requis pour le

réétalissement des complexes de préréplication en phase G2 (revue par Chevalier et Blow,

1996).

B.2.2. Contrôle de la mitose

L’activité des CDK mitotiques est essentielle à l’entrée en mitose. Elle est responsable

de la rupture de l’enveloppe nucléaire, de la condensation des chromosomes et de la mise en

place du fuseau mitotique (revue par Kishimoto, 1994). Bien que de nombreux substrats de

cdc2 soient identifiés in vitro (Nigg, 1991), la complexité des événements et des inter-

régulations survenant in vivo rend la compréhension de la fonction directe des CDK dans les

événements mitotiques difficile. Je me cantonnerai donc à illustrer le rôle des CDK par des

exemples simples.

L’hyperphosphorylation des lamines nucléaires, substrats de cdc2 in vitro, favoriserait

la désagrégation de l’enveloppe nucléaire (Peter et al., 1990). La condensation des

chromosomes résulte, en partie, de la modification des interactions de l’ADN et des protéines de

liaison à l’ADN, telles que l’histone H1 et les protéines HMG (High Mobility Group) (Roth et

Allis, 1992; Schwanbeck et Wisniewski, 1997), qui sont substrats de cdc2 en mitose (Arion et

al., 1988; Labbé et al., 1989; Meijer et al., 1991). In vivo, la phosphorylation de l’histone H1

permettrait l’accès à la chromatine des facteurs directement impliqués dans la condensation des

chromosomes (revue par Kishimoto, 1994). La topoisomérase II, qui est phosphorylée

directement par cdc2 et/ou par la caséine kinase II (CKII), elle-même substrat de cdc2, agit

positivement sur la condensation des chromosomes (Mulner-Lorillon et al., 1990; Cardenas et

al., 1992; Wells et Hickson, 1995).

27
-
 La nucléation du fuseau mitotique au niveau des centrosomes et la réorganisation des

microtubules sont également régulées par cdc2 (Verde et al., 1990). La dynamique des

microtubules fait intervenir des phosphorylations inhibitrices des protéines associées aux

microtubules (MAP), auxquelles cdc2 participe. Les MAP sont des protéines qui stabilisent la

polymérisation des microtubules interphasiques et leur inhibition favorise la mise en place du

fuseau mitotique (Kishimoto, 1994). D’autre part, le complexe cdc2/cycline B régule, par lui-

même, son inactivation, nécessaire à la sortie de mitose, en activant la dégradation de sa sous-

unité régulatrice positive, la cycline B (revue par Morgan, 1999). La nécessité de cette

inactivation est illustrée par le fait que cdc2/cycline B régule négativement la protéine CENP-E,

apparentée à la kinésine, qui permet l’association des kinétochores aux microtubules et, par là-

même, la séparation des chromosomes en anaphase (Liao et al., 1994). Tant que cdc2/cycline

B est actif, la transition métaphase-anaphase ne peut donc pas avoir lieu. La diminution de

l’activité kinase du complexe permettrait également, la décondensation des chromosomes et la

formation des nouvelles enveloppes nucléaires (King et al., 1996). Lors de la cytodiérèse des

cellules animales, la contraction du cytoplasme se fait par un mécanisme dépendant de la

myosine et des microfilaments d’actine. La phosphorylation de la myosine par cdc2 constituerait

un des mécanismes par lesquels la cytodiérèse serait retardée jusqu’à l’inactivation du MPF

(Satterwhite et al., 1995).

B.3. R EGULATION DES CDK

La régulation de la synthèse des CDK constitue un moyen sûr, mais néanmoins lent,

pour contrôler l’activité CDK au cours d’événements rapides du cycle. Aussi, les CDK sont-elles

majoritairement soumises à des mécanismes de régulation post-traductionnelle. L’association

des CDK aux cyclines, constitue la base de la régulation des CDK, à laquelle s’ajoute une

régulation par phosphorylation (revue par Morgan, 1995). Ces phosphorylations, activatrices

et inhibitrices, s’inscrivent généralement dans le cadre de boucles de rétrocontrôle positif qui

permettent une amplification rapide des phénomènes. Enfin, l’intervention d’inhibiteurs de CDK

(CKI pour Cyclin-dependent Kinase Inhibitor) qui agissent principalement sur les CDK de G1,

affine encore le contrôle de l’activité CDK (figure 7).

28
-
Figure 7 : Régulation des complexes CDK/cycline

Synthèse Dégradation Synthèse Dégradation

Cip/Kip Cycline

cdk p9

Ink4
T14 - Y15 T161

Phosphatase Kinase Phosphatase Kinase

cdc25 wee1 KAP CAK

mik1 PP2A

myt1

Description dans le texte principal.

 B.3.1. Structure tridimensionnelle

Les CDK possèdent une structure tridimensionnelle très conservée qui permet de mieux

appréhender leur régulation. La poche catalytique de la kinase se situe entre deux lobes et

comprend le site de fixation de l’ATP et de liaison au substrat. Lorsque la CDK est sous forme

monomérique, l’orientation du site de fixation de l’ATP est défavorable au transfert de

phosphate. L’accès de ce site est bloqué par une large boucle (T loop) (De Bondt et al., 1993;

Jeffrey et al., 1995). Les CDK possèdent des résidus très conservés qui peuvent constituer la

cible de phosphatases et de kinases régulatrices de l’activité des CDK. Les phosphorylations

activatrices ont lieu, en fonction des CDK, sur des résidus thréonine ou serine placés dans la

boucle T, et les phosphorylations inhibitrices sur les résidus tyrosine et/ou thréonine, en

position N-terminale, qui se situent dans la poche catalytique (figure 8).

B.3.2. Régulation par les cyclines

L’interaction de la cycline avec la sous-unité catalytique au niveau de l’hélice PSTAIRE

(ou équivalent dans les CDK non-PSTAIRE) entraîne un changement de configuration favorable

au transfert d’ATP et déplace la boucle T. Le déplacement de la boucle T rend le site catalytique

accessible et permet aux phosphorylations activatrices sur les résidus T-161 (ou équivalents) et

inhibitrices sur les résidus T-14 et Y-15 (ou équivalents) de certaines CDK, de s’effectuer

(Jeffrey et al., 1995).

Des expériences in vitro suggèrent que les cyclines seraient impliquées dans la

spécificité de substrat. Ainsi les complexes cdk2/cycline A et cdc2/cycline A phosphorylent dix

fois plus efficacement la protéine p107 (apparentée à Rb) que les mêmes CDK associées à la

cycline B1. En revanche, l’activité du complexe cdc2/ cycline B sur la sous-unité p34 du facteur

de réplication et de réparation de l’ADN, RP-A, est cinq fois supérieure à celle du complexe

cdc2/cyclineA (Pan et al., 1993; Peeper et al., 1993). Les cyclines dirigeraient également la

localisation intracellulaire des complexes, ce qui limiterait l’accès spatial et temporel à leur

substrat. Par exemple, les cyclines de type B, au contraire de la cycline A, possède un domaine

CRS (Cytoplasmic Retention Signal) qui, en interphase, permet le maintien du complexe dans

le compartiment cytoplasmique avant que ce domaine ne soit clivée en fin de phase G2 (Pines

et Hunter, 1994).

29
-
 Figure 8 : Régulations majeures des complexes
CDK/cycline lors de l’entrée en phase S et en phase M

Ink4
A
Cycline B cdc2
cdc25 cdc2 P
Cycline D

CAK
Cycline B M Rb Cdk 4-6
E2F
P cdc2 P

wee1 Cycline B
G2 G1 CIP/KIP
P
P
P cdc2 START Rb P

S E2F Cycline E
cdk2 P

Transcription
des gènes
de la phase S

Augmentation
B du taux
cdc25/wee1

Cycline B Cycline B Cycline B

cdc25 wee1
cdc2 P cdc2 cdc2

cdc25 wee1

A. Schéma représentant les régulations des complexes CDK/cyclines G1 et cdc2/cycline B,

respectivement nécessaires à l’entrée en phase S et à l’entrée en mitose. Le complexe
Cdk4-6/cyline D intervient avant le point de restriction, où il promeut la phosphorylation de la
protéine du rétinoblastome (Rb), permettant ainsi, la libération des facteurs de transcription
E2F et la transcription des gènes nécessaires à la phase S. La cycline E, ainsi transcrite,
s’associe à cdk2 et le complexe phosphoryle différents substrats (dont Rb ferait partie ce qui
permettrait une amplification du processus) et déclenche la réplication de l’ADN.
Cdc2/cycline B est activée par phosphorylation sur T-161 mais inhibée par les
phosphorylations T-14 et Y-15 jusqu’à l’entrée en mitose, où la déphosphorylation de ces
résidus permet une activation rapide du complexe et l’entrée en mitose. B. Deux modèles de
régulation de cdc2/cycline B par les enzymes régulatrices cdc25 et wee1 à l’entrée en
mitose. A gauche : Mécanisme de retrocontrôle positif. L’activation d’une faible quantité de
cdc2/cycline B permet la l’hyperphosphorylation activatrice de cdc25 et inhibitrice de wee1,
conduisant à un accroissement de l’activation du complexe. A droite : L’activité interphasique
de cdc25 est suffisante à activer complétement cdc2/cycline. L’hyperphosphorylation de
cdc25 et wee1 s’effectue en aval, et ne sert qu’à verrouiller l’état déphosphorylé actif du
complexe. D’après Lew et Kornbluth, 1996.
 Le niveau de toutes les cyclines, à l’exception de la cycline D, fluctue au cours du cycle

et est régulé par une dégradation périodique, rapide et programmée des cylines, qui est, dans

certains cas, accompagné d’une régulation transcriptionnelle. La formation des complexes actifs

dépend, en premier lieu, de l’accumulation périodique des cyclines qui s’effectue, le plus

souvent, pendant la phase dans laquelle les cyclines sont impliquées. Chez les animaux, la

transcription des cyclines E et A, en phase S, est assurée par le facteur E2F qui est régulé

positivement par les cyclines D de phase G1 (revue par Pines, 1995; Morgan, 1997). Chez S.

cerevisiae, les cyclines de G2 sont impliquées dans la dégradation des cyclines de G1 (Blondel

et Mann, 1996). D’une manière générale, les cyclines favorisent l’expression des cyclines de la

phase suivante et répriment ou favorisent la dégradation des cyclines de la phase précédente.

La transcription de la cycline D en phase G1 dépend, quant à elle, de facteurs extracellulaires

(Sherr et al., 1994). De plus, il existe également un rétrocontrôle des complexes cdk/cyclines qui

favorisent aussi bien leur activation que leur inactivation. Ainsi, chez la levure les cyclines de

G2 activent leur propre transcription (Amon et al., 1993) et chez les animaux il a été montré que

les complexes cdk2/cycline E et cdc2/cycline B activent la dégradation de leur cycline (Won et

Reed, 1996; Hershko et al., 1994). La dégradation des cyclines s’opère par un phénomène

d’ubiquitination faisant intervenir un complexe ligase E3, qui permet la fixation des dernières

molécules d’ubiquitine à la cycline. Cette fixation est nécessaire à la reconnaissance de la

cycline par le complexe de dégradation proprement dit : le protéasome 26S. Le complexe ligase

E3 est spécifique du substrat à dégrader, et correpond au complexe promoteur de l’anaphase

(APC) dans le cas des cyclines mitotiques (revue par Hershko, 1997). Le système de

protéolyse par ubiquitination, qui assure la dégradation des cyclines mais également celles des

CKI, constitue un élément essentiel pour le contrôle du cycle cellulaire (Morgan, 1999).

B.3.3. Régulation par phosphorylation

Phosphorylations activatrices

La phosphorylation sur thréonine T-161 (ou équivalent) serait absolument essentielle à

l’activité des CDK chez l’humain et dans de nombreux autres organismes. Ainsi, la mutation du

résidu T-167 de cdc2 de levure inhibe l’activation du complexe mitotique (Gould et al., 1991).

Chez les animaux, la phosphorylation de cdk2 et cdc2 est essentielle à l’entrée et à la

30
-
progression en phase S, G2 et M (Gu et al., 1992; Gould et al., 1991). Cdk4 semble également

être activée par phosphorylation (Matsuoka et al., 1994). Du fait de la situation du résidu cible

dans la boucle T qui peut bloquer l’accès au site catalytique, il a été suggéré que la

phosphorylation stabilise la conformation active de l’enzyme. Cette phosphorylation favorise

l’interaction cycline-CDK dans certains complexes et pourrait constituer une stratégie plus

générale de contrôle de l’activité CDK (Ducommun et al., 1991; Desai et al., 1995). Inversement,

la liaison de la cycline à la kinase favorise la phosphorylation de cette dernière.

La kinase activatrice des CDK (CAK pour CDK Activating Kinase) a été identifiée chez

de multiples organismes, ce qui souligne l’importance de la phosphorylation sur T-161 (ou

équivalent), dont la place dans les régulations des CDK reste cependant à préciser. Au cours

du cycle, l’activité de la CAK ne fluctue pas (Kaldis, 1999) et les changements de

phosphorylation sur T 161 (ou équivalent) pourraient être régulés par la liaison de la cycline à la

CDK (revue par Morgan, 1995; Krek et Nigg, 1991a; Gu et al., 1992). L’activité CAK ne semble

donc pas limitante au cours de la progression normale, mais il n’est pas exclu que sa régulation

puisse intervenir dans des conditions particulières de croissance.

La déphosphorylation du résidu activateur de cdc2 a lieu, in vivo, en sortie de mitose et

peut être réalisée, in vitro, par la S/T phosphatase 2-A (Gould et al., 1991; Lee et al., 1991). In

vivo, la phosphatase 2-A agirait indirectement sur la CAK ou sur les phosphatases

déphosphorylant les résidus activateurs, ce qui conduirait à une inactivation de cdc2, due à

l’absence de résidu T-161 phosphorylé (ou équivalent) (Lee et al., 1994). La KAP (CDK

Associated Phosphatase), identifiée par la technique du double hybride comme associée à cdc2

et cdk2, est un bon candidat pour assumer le rôle de phosphatase des CDK (Hannon et al.,

1994; Poon et Hunter, 1995). En sortie de mitose, la dégradation de la cycline B semble jouer le

rôle principal dans l’inactivation de cdc2 par rapport à sa déphosphorylation (revue par Morgan,

1995) mais la déphosphorylation inhibitrice du résidu T-161 pourrait permettre une inactivation

complète des CDK. Le rôle exact de cette déphosphorylation reste à préciser pour chacune des

CDK.

Phosphorylations inhibitrices

Le mécanisme par lequel les phosphorylations des résidus T-14 et/ou Y-15, situés dans

31
-
le site catalytique des CDK, inhibe l’activité kinase, reste discuté. Jeffrey (1995), en désaccord

avec De Bondt (1993), rapporte que la phosphorylation de la Y-15 interfère avec la fixation de

l’ATP.

Les CDK mitotiques sont inhibées par phosphorylation durant les phases S et G2 et

leur déphosphorylation, à l’entrée en mitose, correspond à leur activation (figure 8). La mutation

des sites inhibiteurs de cdc2 en résidus non phosphorylables, provoque l’entrée prématurée de

la cellule en mitose (Gould et Nurse, 1989; Krek et Nigg, 1991b). Dans les cellules humaines,

des expériences de mutations montrent que le résidu Y aurait un rôle fondamental dans la

régulation alors que le résidu T servirait de verrou supplémentaire, empêchant une activation

accidentelle de cdc2 par des tyrosines kinases non-spécifiques, au cours du cycle. En effet, la

mutation du résidu T-14 de cdc2 n’est pas suffisante pour induire des perturbations de la

progression du cycle mais augmente les effets de la mutation Y-15 (revue par Lew et Kornbluth,

1996; Krek et Nigg, 1991b).

La phosphatase cdc25, à double spécificité T/Y, est responsable de l’activation de

cdc2. Chez S. pombe, la tyrosine-kinase pyp3 semble assister cdc25. L’approche génétique,

chez S. Pombe, a également permis d’identifier les kinases wee1 et myk1, qui inactivent cdc2 en

phosphorylant coopérativement le résidu Y-15. Chez S. pombe, le résidu T-14 ne semble pas

être phosphorylé au cours du cycle normal mais wee1 a la capacité de phosphoryler cdc2 sur

T-14 chez certains mutants (Den Haese et al., 1995). Chez les vertébrés, wee1 phosphoryle

uniquement la tyrosine-15 (McGowan et Russell, 1993). La kinase myt1, identifiée dans la

membrane d’ovocytes de xénope, possède, quant à elle, une double spécificité T/Y pour cdc2

(Kornbluth et al., 1994; Mueller et al., 1995). Chez l’humain, cette kinase serait spécifique de

cdc2 (Booher et al., 1997). Cdc25 et wee1 sont les régulateurs principaux de l’activation de

cdc2 par phosphorylation, et engagent la cellule en mitose de manière irréversible tandis que les

autres enzymes (pyp3, myk1, myt1) n’interviendraient que lorsque l’activité des premières est

compromise (revue par Lew et Kornbluth, 1996).

L’activité de cdc25 oscille durant le cycle. Chez S. pombe, son accumulation en

interphase est supposée déclencher l’entrée en mitose, après laquelle on observe une chute

importante du messager et de la protéine (revue par Coleman et Dunphy, 1994). Cdc25 est

32
-
activée par phosphorylation et est substrat de cdc2 in vitro, ce qui a conduit à proposer un

mécanisme d’amplification en boucle, par rétrocontrôle positif, dans l’activation de cdc2 à l’entrée

en mitose (figure 8). De manière similaire, l’activité de wee1, qui décroît en mitose, est inhibée

par phosphorylation. Wee1, comme cdc25, est substrat de cdc2 in vitro et pourrait également

participer à l’activation autocatalytique de cdc2 (figure 8). Ce phénomène d’autoamplification a

été appréhendé lors des expériences de microinjection de cdc2 hétérologue dans des oeufs de

xénope, où d’infimes quantités d’enzyme suffisent à induire la maturation méiotique (Masui et

Markert, 1971; Masui, 1972; Wassermann et Masui, 1975; Wassermann et Masui, 1976).

Cependant cdc2 n’est pas le seul responsable de sa propre activation, et d’autres enzymes

interviennent dans la régulation de cdc25 et wee1, entraînant leur hyperphosphorylation en

mitose et conduisant respectivement à l’activation de cdc25 et l’inhibition de wee1 (Izumi et

Maller, 1995; Tang et al., 1993). Nim1 est une kinase inhibitrice de wee1 bien caractérisée chez

la levure fissipare, et les kinases de type polo sont également de bons candidats pour réguler

cdc25 et wee1 (Coleman et al., 1993; Kumagai et Dunphy, 1996). D’autre part, les complexes

CDK/cycline de G1/S apparaissent réguler l’activité mitotique de cdc2 via cdc25. Ainsi, chez le

xénope, il a été démontré que cdk2 est nécessaire à l’hyperphosphorylation de cdc25 et est

directement impliquée dans l’activation de cdc2 (Guadano et Newport, 1996).

Les phosphorylations inhibitrices sont clairement impliquées dans le contrôle de l’entrée

en mitose chez la plupart des organismes. Cependant, chez Saccharomyces cerevisiae, bien

que la phosphorylation de CDC28 fluctue au cours du cycle, les doubles mutants de CDC28,

chez qui les résidus T et Y ont été remplacés par des résidus non phosphorylables, possèdent

une activité CDK normale et présentent des cycles identiques à ceux des levures sauvages.

Ces résultats suggèrent, que les phosphorylations inhibitrices ne constituent pas un

mécanisme de régulation prépondérant de l’activité mitotique de CDC28 au cours de la

progression normale dans le cycle chez la levure bourgeonnante (Amon et al., 1992).

Le rôle des phosphorylations inhibitrices sur les complexes non mitotiques reste à

préciser (revue par Lew et Kornbluth, 1996). Chez les vértébrés, il existe trois types de cdc25.

Cdc25C est impliquée lors de la mitose, tandis que cdc25A présente un pic d’activité en G1 et

pourrait intervenir dans la transition G1/S (Jinno et al., 1994). Cependant, dans le cas de cdk2,

33
-
une corrélation directe entre la phosphorylation sur Y-15 et une inhibition de l’activité n’a pas été

établie in vivo (Gu et al., 1992).

B.3.4. Régulation par les CKI

Les CKI agissent principalement en phase G1. Ces inhibiteurs sont induits par des

facteurs extracellulaires et assurent l’arrêt du cycle, nécessaire à l’accomplissement d’autres

grandes fonctions cellulaires telles que la différenciation ou la conjugaison des levures

bourgeonnantes. Ils permettent aussi l’arrêt du cycle lorsque les conditions ne sont pas

favorables à la division (inhibition de contact, manque de nutriments) (Mendenhall, 1993; Zavitz

et Zipursky, 1997; Peter et Herkowitz, 1994). Ils sont également impliqués dans la régulation

intrinsèque du cycle et lors de la surveillance du cycle.

Trois CKI ont été identifiées chez S. cerevisiae. FAR1 est activée en réponse aux

phéromones et inhibe le complexe CDC28/CLN, provoquant l’arrêt du cycle en G1 (revue par

Peter et Herskowitz, 1994). PHO81 stoppe le cycle en réponse à un manque de phosphate

(revue par Lenburg et O’Shea, 1996). P40SIC1 est un inhibiteur dont l’activité ne dépend pas

des conditions extérieures mais est fonction du cycle. P40SIC1, activé en G1, se lie spécifiquement

à CDC28-CLB5-6 et l’inhibe. En fin de phase G 1, sa phosphorylation par CDC28/CLN

entraîne sa dégradation par la voie d’ubiquitination et permet l’initiation de la réplication (Schwob

et al., 1994). Chez S. pombe, rum1 empêche l’entrée prématurée de la cellule en mitose en

inhibant cdc2/cdc13 pendant la phase G1 (Correa-Bordes et Nurse, 1995).

Chez les eucaryotes supérieurs, les CKI sont répartis en deux groupes : la famille Ink4

(“Inhibitors of cdk4”) et la famille Cip/Kip représentée par p21Cip, p27 Cip et p57 Kip2 qui lient et

inhibent un large éventail de CDK.

Les inhibiteurs Ink4 auraient deux modes d’actions. Des études in vitro démontrent que

p19 Ink4d peut interagir avec le complexe hétérodimérique CDK/cycline et l’inhiber (Hirai et al.,

1995), tandis que p16Ink4 se lie à cdk4 monomérique et empêche ainsi la fixation de la cycline D

in vivo (Serrano et al., 1993; Serrano, 1997). Les complexes cdk4-6/cyclines D activent les

facteurs de transcription des gènes de la phase S en phosphorylant la protéine Rb (inhibiteur

des facteurs E2F/DP1) (figure 8). Or, p16 n’est associé à cdk4 que dans des cellules mutantes

34
-
n’exprimant pas Rb, ce qui suggère que la transcription de p16 est inhibée par Rb. Ceci a

conduit à l’hypothèse qu’in vivo l’accumulation de p16 durant la phase S permettrait un

rétrocontrôle négatif sur les complexes cdk4/cycline D (revue par Peter et Herskowitz, 1994).

Le gène codant la protéine p21 a été cloné indépendamment par différents groupes et

est donc connu sous divers noms : waf1, cip1, sdi1, cap20 ou encore mda. Alors que les

CDK/cycline contenant une seule molécule de p21 peuvent être actifs, l’addition d’une molécule

de p21 au complexe ternaire l’inactive (Harper et al., 1995). Bien que la saturation des

complexes par des molécules de p21 bloque leur activation par la CAK, p21 inhibe également

l’activité des CDK/cycline phosphorylées (Aprelikova et al., 1995). P21 inhibe les complexes

cdk/cycline D et, par là-même, la transcription des gènes nécessaires à la phase S, dont le gène

de la cycline E, mais également le complexe cdk2/cycline E empêchant ainsi le fonctionnement

correct des complexes de réplication (Zhang et al., 1994). P21 intervient donc à deux niveaux

dans l’inhibition de l’entrée en phase S. De plus, p21 se lie directement à l’antigène nucléaire de

prolifération cellulaire (PCNA), une sous-unité de l’ADN polymérase δ, et inhibe ainsi, la

transcription selon un mécanisme indépendant des CDK (Luo et al., 1995). La transcription de

p21 est sous le contrôle de facteurs de différenciation et également sous celui du suppresseur

de tumeur p53, qui est activé en réponse à l’endommagement de l’ADN (voir ci-dessous) .

Le mécanisme d’inhibition des CDK par p27 est similaire à celui de p21. Cependant, p27

est induit par d’autres facteurs que p21 et agirait plus précocement dans le cycle. Le niveau de

p27 est notamment plus élevé dans les cellules à l’état quiescent. Sous l’action de facteurs

mitogènes, la transcription de cdk4 est favorisée alors que celle de p27 est réprimée, ce qui

conduit à la titration de p27 par cdk4 et permet à la cellule d’entrer dans le cycle de division

(revue par Sherr, 1994).

B.3.5. Interactions avec les sous-unités p9

Des protéines de faible poids moléculaire, p13suc1, p18 CKS (chez les levures) et p9 cks

(chez les eucaryotes supérieurs) interagissent avec les sous-unités catalytiques des CDK, en

particulier cdc2 et cdk2. Des études génétique ont montré que suc1 est essentiel à la sortie de la

phase M (Moreno et al., 1989) et que CKS1 (S. cerevisiae) intervient en G1/S et en G 2/M (Tang

et Reed, 1993). Par ailleurs, les extraits acellulaires d’ovocytes de xénope en interphase ou en

35
-
mitose cessent leur progression lorsqu’ils sont immuno-déplétés en p9 (Patra et Dunphy, 1996).

L’analyse de cdc2/cycline B dans ces extraits, montre que lorsqu’ils sont bloqués en interphase

la phosphorylation du résidu Y-15 subsiste et que lorsqu’ils sont bloqués en mitose la

dégradation de la cycline B n’a pas lieu. Il semblerait que les protéines p9 favorisent l’interaction

des CDK avec leurs substrats et régulateurs, à savoir, cdc25 et les molécules responsables de

la dégradation des cyclines (Patra et Dunphy, 1996). Les protéines p9 peuvent se dimériser et,

en formant des hexamères, sont capables de lier six molécules de CDK, suggérant que la p9

aurait également un rôle stabilisateur des complexes multimériques de CDK (Parge et al., 1993).

B.3.6. Régulation par synthèse

La synthèse et la dégradation coordonnées des cyclines, spécifiques de chaque phase,

est un élément essentiel à la régulation de l’activité des CDK et donc à la progression du cycle

cellulaire. Chez les levures et les animaux, les régulations transcriptionnelles durant le cycle

cellulaire s’adressent uniquement aux cyclines (Durkacz et al., 1986; Mendenhall et Hodge,

1998). En revanche, il existe également une régulation transcriptionnelle des CDK dans les

cellules de mammifères. L’exemple le plus évident est le contrôle de la synthèse des CDK à la

sortie et à l’entrée des cellules somatiques dans le cycle cellulaire. Lorsque les cellules entrent

dans un état quiescent, l’expression des gènes du cycle cellulaire, dont ceux des CDK, est

réprimée et le niveau des protéines correspondantes diminue (Zwicker et al., 1995). Nous

avons précédemment mentionné que la stimulation des cellules par des mitogènes conduit à la

synthèse de cdk4 et qu’inversement, la synthèse de cdk4 est réprimée par des facteurs qui

stoppent le cycle cellulaire, tels que TGF-ß (Ewen et al., 1995). Dans les lymphocytes ré-

entrant dans le cycle cellulaire, la transcription de cdk4 précède celle de cdk2 selon un

mécanisme indépendant de l’interleukine 2, mais le rôle de cdk4 dans l’activation du gène cdk2

n’a pas été déterminé (Modiano et al., 1994). La stimulation des lymphocytes T par l’interleukine

2 active l’expression de cdk2 qui précède celle de cdc2 (Elledge et al., 1992). Cependant, à ma

connaissance, la rôle de cdk2 dans la régulation transcriptionnelle de cdc2 n’a pas été étudiée.

Dans les cellules humaines, l’expression du gène cdc2 est activée à la transition G 1/S et

réprimée à l’entrée en mitose (Furukawa et al., 1990; Dalton, 1992), mais le niveau de la protéine

reste constant en raison de la synthèse et de la dégradation coordonnées du produit de gène

36
-
(Welch et Wang, 1992). Seules les protéines nouvellement synthétisées contrôlent l’entrée en

mitose. La transcription de cdc2 dépend de plusieurs séquences consensus dans la région

promotrice dont une constitue un site de fixation à E2F. Ceci laisse supposer que les CDK de

G 1 pourraient jouer un rôle dans la régulation transcriptionnelle de cdc2 (via la phosphorylation

de Rb). Le rôle biologique de la régulation transcriptionnelle de cdc2 dans les cellules en

prolifération n’est pas compris. Cependant, les dérégulations de l’expression de cdc2 sont

associées à une cancérisation, suggérant l’importance fondamentale du contrôle transcriptionnel

(Furukawa et al., 1995; Tanimoto et al., 1998). Enfin, dans l’oeuf de xénope la traduction du

messager de cdk2 est contrôlée, entre la maturation et la fécondation, par un changement de

polyadénylation de l’ARNm, ce qui témoigne de l’existence d’un contrôle traductionnel de

certaines CDK (Seydoux, 1996).

C. L ES MECANISMES DE SURVEILLANCE DU CYCLE CELLULAIRE

La progression de la cellule dans le cycle est soumise à des contrôle stricts qui

permettent de vérifier que tous les événements d’une étape sont réalisés avant le déroulement

de l’étape suivante (Russell, 1998; Rudner et Murray, 1996). Si tel n’est pas le cas, ces

contrôles empêchent ou retardent le passage à l’étape suivante en agissant sur l’activité des

CDK aux transitions G1/S et G 2/M. Ces deux points majeurs de contrôle, ou “checkpoints”, sont

activés lorsque l’ADN est endommagé, la réplication incorrecte ou l’attachement des

chromosomes au fuseau défectueux (revue par Murray, 1994). Le terme de “checkpoint” est

également utilisé par certains auteurs pour désigner les contrôles qui empêchent la progression

de la cellule au delà du point de restriction R (ou START).

C.1.I NTEGRITE DE L ’ INFORMATION GENETIQUE

C.1.1.L’endommagement de l’ADN et l’inhibition de la réplication arrêtent la

cellule à différents stades du cycle cellulaire

La condition sine qua non à la transmission correcte de l’information génétique de la

cellule mère aux cellules filles, réside dans la conservation de cette information. Ainsi, les

37
-
modifications de l’ADN (modification des bases ou du squelette carboné), dont les causes sont

aussi bien extrinsinsèques (radiations γ ou UV, agents mutagènes) qu’intrinsèques (réactivité

propre de l’ADN, métabolisme), doivent-elles être corrigées avant la réplication ou la mitose.

L’existence des mécanismes de surveillance permet que l’endommagement de l’ADN, en

G 1, G 2 ou au cours de la phase S, stoppe les cellules, respectivement avant la phase de

réplication, la mitose ou ralentisse la progression en phase S, ce qui autorise la réparation de

l’ADN (revue par Paulovich et al., 1997). Il existe, cependant, quelques différences selon les

organismes étudiés. Ainsi, le blocage de la mitose s’effectue en phase G 2 tardive chez S.

pombe et à la transition métaphase-anaphase chez S. cerevisiae (figure 9) (revue par Rhind et

Russell, 1998). Ces blocages mitotiques s’opèrent également lorsque la réplication de l’ADN est

empêchée par des inhibiteurs d’ADN polymérase, tel que l’aphidicoline, ou du métabolisme des

acides nucléiques, comme l’hydroxyurée (Ikegami et al., 1978). Dans ce dernier cas, le point de

contrôle est appelé S/M en opposition avec le point de contrôle G 2/M, activé lors de

l’endommagement de l’ADN après le début de sa réplication.

C.1.2.Voie de transduction

Selon que l’on considère l’inhibition de la réplication ou l’endommagement de l’ADN,

certains éléments de la voie de transduction diffèrent, bien que beaucoup d’entre eux soient

communs aux deux voies. Dans le premier cas, le signal émanerait directement des ADN

polymérases et/ou des fourches de réplication (Navas et al., 1995; D’Urso et al., 1995; D’Urso

et Nurse, 1997). Dans le second cas, les lésions de l’ADN (cassures simple ou double brin(s))

ou des variations biochimiques corrélées à ces lésions provoquent des arrêts spécifiques du

cycle (Garvick et al., 1995; Hannun, 1996).

Les éléments des voies de transduction qui conduisent à l’arrêt du cycle sont

relativement bien conservés quelles que soient les phases du cycle concernées et les

organismes étudiés. Ces voies ont été bien caractérisées dans les levures, par approches

génétiques (Rhind et Russell, 1998) (figure 9). Les mutants de S. pombe rad1, rad3, rad9,

rad17, rad26 et hus1 ne possèdent plus de points de contrôle fonctionnels de la réplication et de

la réparation de l’ADN. Ces gènes, dont les homologues ont été identifiés chez l’humain, servent

de médiateurs entre les signaux initiaux et la machinerie cellulaire, et pourraient être directement

38
-
Figure 9 : Mécanismes de surveillance de l’état de l’ADN

S. pombe

Chk1

-Y15

S. cerevisiae

Description dans le texte principal. D’après Rhind et Russel, 1998.

impliqués dans la reconnaissance des lésions de l’ADN car plusieurs d’entre eux possèdent des

similarités de séquence avec des exonucléases et des facteurs de réplication. Un acteur central

des deux voies de transduction (réplication/réparation) est la protéine rad3 de S. pombe

(homologue MEC1 chez S. cerevisiae). Elle est similaire aux “DNA-protein kinases” (DNA-PK),

protéines qui se lient aux cassures simple et double brin de l’ADN et seraient donc directement

impliquées dans la reconnaissance des lésions de l’ADN in vivo. La protéine ATM de

mammifère, une “DNA-PK-like”, est également impliquée dans la reconnaissance de l’ADN

endommagé (Hoekstra, 1997).

En réponse à un endommagement de l’ADN, un des rôle des protéines rad est d’activer

par phosphorylation chk1, une S/T kinase spécifiquement impliquée dans le point de contrôle

G 2/M (Walworth et Bernards, 1996). La protéine kinase cds1 joue un rôle analogue à chk1 lors

de l’activation du point de contrôle S/M. Chez S. cerevisiae, lorsque l’ADN est endommagé, la

protéine PDS1 est spécifiquement phosphorylée selon un mécanisme dépendant de MEC1. Le

contrôle S/M pourrait également faire intervenir la protéine PDS1. Cependant ce contrôle reste

fonctionnel lorsque PDS1 est muté.

C.1.3.Les cibles moléculaires des points de contrôle dépendants de l’ADN

Les voies de transduction impliquées dans les points de contrôle ont été étudiées

principalement lors de blocages en mitose et il n’existe que peu de données sur le mode d’action

de ces points de contrôle sur les CDK de G1 et de phase S. Dans les cellules de mammifères,

l’endommagement de l’ADN en G1 conduit à une augmentation du produit suppresseur de tumeur

p53, par stabilisation cette protéine qui active la transcription de la CKI, p21, et, par là-même,

inhibe les CDK de G 1 (Maltzman et Czyzyk, 1984; Lu and Lane, 1993; El-Deiry et al., 1993).

Chez S. pombe, la phosphorylation inhibitrice du résidu Y-15 de cdc2 semble avoir un

rôle majeur dans la régulation du cycle à l’entrée de mitose, lors de l’activation des points de

contrôle de la réplication ou de l’endommagement de l’ADN (revue par Russell, 1998), mais

l’importance de cette phosphorylation est quelque peu nuancée en fonction des organismes

(figures 9 et 10). En effet, si la mutation du résidu Y en résidu non phosphorylable rend ces

points de contrôle non fonctionnels chez S. pombe (Rhind et al., 1997) en revanche, chez

Aspergillus nidulans et Homo sapiens, elle ne provoque d’altération du point de contrôle que

39
-
 Figure 10 : Modèles de fonctionnement du point de contrôle
de réplication de l’ADN chez différentes espèces

A S. pombe A. nidulans S. cerevisiae

X. laevis
H. sapiens

Point de contrôle Point de contrôle Point de contrôle

de réplication de l ’ADN de réplication de l ’ADN de réplication de l ’ADN

Cdc2 Y-15 Cdc2 Y-15 Mécanisme Mécanisme

phosphorylation phosphorylation indépendant de Y-15 indépendant de Y-15

Mitose Mitose Mitose

B S. pombe A. nidulans S. cerevisiae

X. laevis
H. sapiens

Point de contrôle Point de contrôle Point de contrôle

de réplication de l ’ADN de réplication de l ’ADN de réplication de l ’ADN

Mécanisme Mécanisme Mécanisme

indépendant de Y-15 indépendant de Y-15 indépendant de Y-15

Mitose Mitose Mitose

Cdc2 Y-15 Cdc2 Y-15 Cdc2 Y-15

phosphorylation phosphorylation phosphorylation

A. Le point de contrôle fonctionne par deux mécanismes différents. Le premier module

l’activité des enzymes qui régulent la phosphorylation inhibitrice de cdc2 sur le résidu Y
(équivalent de Y-15 chez S. pombe) et le second agit selon un mécanisme différent. S.
pombe utilise exclusivement le premier mécanisme tandis que S. cerevisiae utilise
uniquement le second. Les autres organismes possèdent un mécanisme mixte qui utilise les
deux voies. B. Toutes les cellules répondent à une réplication incomplète de l’ADN par une
voie ne faisant pas intervenir les enzymes régulant la phosphorylation inhibitrice de cdc2. La
phosphorylation inhibitrice de cdc2, intervenant durant la progression normale de la cellule
dans le cycle, assiste ce mécanisme indépendant de Y-15 en empêchant l’entrée en mitose.
L’importance de la phosphorylation sur Y-15 varie selon les espèces (indiquée par
l ’épaisseur des traits) et fournit, de ce fait, une assistance plus ou moins marquée au
fonctionnement du point de contrôle. D’après Lew et Kornbluth, 1996.
lorsque la réplication est ralentie (et non lorsqu’elle est bloquée) (revue par Lew et Kornbluth,

1996; Ye et al., 1996). Dans les cellules humaines, le retard en mitose à la suite d’un

endommagement de l’ADN dépend également en partie de cette phosphorylation. Chez S.

cerevisiae, pour qui la phosphorylation sur Y-19 de CDC28 fluctue au cours de la progression

normale dans le cycle, l’activation des points de contrôle de l’état de l’ADN ne dépendrait pas de

la phosphorylation de Y-19 (Amon et al., 1992; Sorger et Murray, 1992). En effet, si la

phosphorylation sur Y-19 augmente lorsque les cellules sont irradiées ou traitées par

l’hydroxyurée, les cellules surexprimant une forme de CDC28 non phosphorylable sur tyrosine

répondent comme les cellules sauvages lorsque l’état de l’ADN est modifié. CDC28 est

néanmoins une cible de ce point de contrôle, dont l’activation conduirait à la stabilisation du

complexe mitotique CDC28/CLB actif, empêchant ainsi la transition métaphase-anaphase

(Mendenhall et Hodge, 1998).

Chez S. pombe, l’activation des points de contrôle dépendant de l’ADN inhibe la

déphosphorylation sur Y-15 de cdc2 (Rhind et al., 1997; Rhind et Russell, 1998) et, en

conséquence, l’entrée en mitose. La tyrosine-kinase de cdc2, wee1, est substrat de chk1 et

cds1 in vitro. De plus, chez les doubles mutants wee1/myk1, la déphosphorylation de cdc2 est

amoindrie en réponse à l’endommagement de l’ADN, suggérant que cdc25 est aussi une cible de

ce contrôle in vivo. Cdc25, est également phosphorylée par chk1 et cds1 in vitro, ce qui la

désigne comme une cible potentielle de ces deux régulateurs in vivo (figure 9) (Furnari et al.,

1999). Des études récentes sur les extraits d’oeufs de xénope et sur des cellules de

mammifères, montrent que chk1 régulerait l’activité de cdc25 en contrôlant sa localisation

intracellulaire. Les formes de cdc25 phosphorylée sur des résidus S-16 seraient maintenues

dans le cytoplasme par leur liaison aux protéines 14-3-3 et ne pourraient agir sur cdc2, localisé

dans le noyau au moment de la mitose. En effet, les mutants chez lesquels cdc25C est

incapable de lier les protéines 14-3-3, possèdent des points de contrôle défectueux (Kumagai

et Dunphy, 1999). Pourtant, les levures fissipares ne possédant ni wee1 ni cdc25, maintiennent

leur capacité à stopper le cycle lorsque l’ADN est répliqué de manière incomplète, suggérant que

ces deux régulateurs majeurs de la phosphorylation de cdc2 sur Y, ne sont pas les cibles

exclusives du point de contrôle (Enoch et al., 1992; Boddy et al., 1998). Les cellules traitées par

40
-
l’hydroxyurée présentent un niveau élevé de la kinase mik1, dont l’accumulation dépend des

protéines rad3 et cds1, ce qui suggère que l’activation de mik1 pourrait être suffisante au

fonctionnement du point de contrôle S/M chez les doubles mutants wee1/cdc25.

En résumé, chez la plupart des organismes, les points de contrôle G2/M et S/M agissent

sur l’activité de cdc2 en régulant les phosphorylations inhibitrices sur cette enzyme. Chez S.

pombe, la régulation des kinases, wee1 et myk1, et des phosphatases cdc25 et pyp3, dont

cdc2 est le substrat direct, serait réalisée par les effecteurs aval des voies de contrôle tels chk1

et cds1. Cependant, chez les cellules d’animaux, l’étude est d’autant plus complexe qu’il existe

d’autres types de régulations, ne faisant pas intervenir la phosphorylation de cdc2.

C.2.A SSEMBLAGE DU FUSEAU MITOTIQUE

L’attachement correct des chromosomes au fuseau est également une condition sine qua

non pour assurer une égale répartition de l’information génétique entre les cellules filles. Aussi,

des mécanismes de surveillance ont été développés pour permettre l’arrêt de la mitose, avant

l’anaphase, en réponse à des défauts, qui, s’ils n’étaient pas corrigés, aboutiraient à une

répartition anormale des chromosomes. Ainsi, la dépolymérisation des microtubules par des

drogues telles que le nocodazole, la colchicine ou le benomyl, la présence de multiples

minichromosomes, de chromosomes dicentriques, ainsi que les défectuosités dans les corps

polaires du fuseau (équivalent des centrosomes chez les levures), des protéines des

kinétochores ou de l’ADN centromérique sont autant de signaux capables d’activer ce

mécanisme de contrôle (Rudner et Murray, 1996).

Les kinétochores, qui sont des structures protéiques permettant l’attachement des

chromosomes aux microtubules, paraissent jouer un rôle primordial dans la détection des

anomalies du fuseau (figure 11) (Nicklas, 1997). En effet, ces structures sont capables de

percevoir la tension entre le microtubule et le chromosome, de telle sorte que si l’attachement est

défectueux ou si le nombre de microtubules du fuseau est réduit (ce qui abaisse la tension au

point d’ancrage), la mitose est inhibée. Les protéines MAD2 (Mitotic arrest defective) et BUB1

(Budding uninhibited by benomyl), initialement identifiées chez les mutants de levures, sont

associées aux kinétochores non attachés, ce qui suggère leur implication dans la régulation de la

41
-
 Figure 11 : Point de contrôle de l’assemblage du fuseau
mitotique

MPS1 BUB1 BUB3

P
MAD1 MAD2
P
P

APC cdc2
Cycline B
cdc2

ASE1

PDS1

La polymérisation rapide des microtubules polaires et kinétochoriens, permet la formation

du fuseau mitotique et l’alignement des chromosomes sur la plaque métaphasique. La
séparation des chromatides soeurs s’opère grâce au raccourcissement des microtubules et
à des protéines motrices. Cette dynamique génère une tension sur les structures
kinétochoriennes des chromosomes, qui est altérée lorsque l ’assemblage du fuseau est
défecteux. Le point de contrôle est alors activé et fait intervenir les kinases MPS1 et BUB1
(en interaction avec BUB3). MPS1 hyperphosphoryle MAD1 lorsqu’elle interagit avec
MAD2, qui est localisée sur les kinétochores non attachés. La cible ultime de la voie est
l’APC, dont l’inhibition empêche la dégradation des cyclines mitotiques et de protéines
impliquées dans la cohésion des microtubules ou des chromatides soeurs (PDS1, ASE1).
La transition métaphase-anaphase ne peut donc pas s’effectuer. Dessin supérieur d’après Sorger et
al., 1997.
liaison kinétochore-microtubule et, notamment, dans la signalisation de défectuosités de ces

interactions (figure 11). Chez S. cerevisiae, l’hyperphosphorylation de la protéine MAD1 en

réponse à l’activation du point de contrôle dépend de plusieurs autres protéines, dont MAD2

avec laquelle MAD1 interagit. In vivo, la kinase de MAD1 pourrait être MPS1, (Monopolar

spindle), dont la surexpression induit une hyperphosphorylation de MAD1 et l’arrêt mitotique

(Hardwick et al., 1996; Lauze et al., 1995). Chez les vertébrés, l’homologue du gène MAD2 est

également requis pour le point de contrôle. Chez le xénope et l’humain, MAD2 est localisée sur

les kinétochores en prophase et prométaphase et lorsque les kinétochores ne sont pas

attachés aux microtubules. Les protéines kinétochoriennes contenant des phosphoépitopes

3F3/2 se comportent de la même manière : ces protéines sont phosphorylées lorsque les

kinétochores ne sont pas attachés aux microtubules et l’application d’une tension sur les

kinétochores à l’aide d’une microaiguille, qui suffit à diminuer leur phosphorylation, permet l’entrée

en anaphase (Li et Nicklas, 1995). L’ensemble de ces résultats suggère qu’un complexe

multiprotéique, localisé au niveau du kinétochore, interviendrait dans la signalisation des

défectuosités du fuseau chez les levures comme chez les vertébrés (figure 11). Le mécanisme

dépend essentiellement de la tension appliquée par les microtubules au kinétochore, et ferait

intervenir des cascades de phosphorylations lors de l’activation du point de contrôle.

Une cible majeure de ce point de contrôle serait le complexe de dégradation

APC/cyclosome (revue par Hardwick, 1998). L’inhibition de son activité résulte en un retard ou

en une inhibition de la progression à travers la phase M. En effet, à l’anaphase, l’APC permet la

dégradation de nombreuses protéines impliquées dans la cohésion des chromatides soeurs

(PDS1/cut2) et dans le pontage des microtubules (ASE1) (figure 11) (Funabiki et al., 1996;

Cohen-Fix et al., 1996; Juang et al., 1997; Yamamoto et al., 1996a; Yamamoto et al., 1996b). De

surcroît, nous avons vu précédemment que l’APC est impliqué dans la dégradation de la cycline

B et donc dans l’inactivation du complexe cdc2/cycline B, également nécessaire à la sortie de

mitose (figure 11). Le maintien d’une activité CDK élevée dans les cellules traitées par des

drogues des microtubules, illustre l’inhibition de l’APC par ce point de contrôle (Irniger et al.,

1995). Le fait que chez certains mutants de levure, la séparation des chromatides soeurs

s’effectue en l’absence de dégradation de la cycline B suggère que l’accessibilité de l’APC à

42
-
certains de ses substrats serait régulée durant la mitose. Les protéines impliquées dans la

reconnaissance ou l’accessibilité des substrats de l’APC représentent donc des cibles

potentielles du point de contrôle de l’assemblage du fuseau.

D. P ARTICULARITES DU CYCLE CELLULAIRE DANS LES EMBRYONS PRECOCES

D ’ ANIMAUX

Chez les embryons animaux, les premières divisions, qui s’effectuent rapidement, de

manière synchrone et sans croissance cellulaire, conduisent au clivage de l’oeuf en de multiples

petites cellules appelées blastomères (car elles constituent la blastula). L’ovocyte contient les

ARN messagers nécessaires au cycle cellulaire en quantité suffisante pour assurer les cycles

de divisions jusqu’au stade mid-blastula, où la transcription zygotique prend le relais. Les

premiers cycles cellulaires sont caractérisés par l’alternance de phases S et de phases M (sans

phases G séparatrices), qui sont corrélées à l’oscillation de l’activité du complexe cdc2/cycline B

ou MPF (figure 12). Ces cycles rapides ne sont pas soumis à toutes les régulations habituelles

et certains point de contrôle peuvent être absents. De plus, selon l’organisme considéré, les

complexes CDK/cycline n’auraient pas exactement les mêmes fonctions que celles qu’elles

assurent dans le cycle somatique. Nous illustrerons ces particularités par les connaissances

acquises chez les embryons de mouche, de batracien et d’oursin.

D.1. R OLE ET REGULATION DU MPF

Chez l’oursin et le xénope, durant les premiers cycles embryonnaires, l’activité

oscillatoire du MPF (haute en mitose et basse en phase S) suggère que ce complexe est

essentiel à la mitose. En effet, la déplétion en ARNm totaux d’extraits acellulaires d’oeufs de

xénope résulte en un arrêt de la progression du cycle, qui peut être anihilé par addition d’ARNm

de cycline B (Murray et Kirschner, 1989). L’équilibre synthèse-dégradation de la cycline B

constitue la régulation principale du MPF chez le xénope, alors que la phosphorylation inhibitrice

sur tyrosine de cdc2 ne jouerait un rôle que lors du premier cycle (Ferrel et al., 1991; Hartley et

al., 1996). La stabilité de la cycline B dépendrait des cyclines de G 1, dont l’expression

43
-
 Figure 12 : Modèle de régulation de l’activité MPF dans les
embryons et dans les cellules somatiques

L’activité du MPF dépend étroitement de l’équilibre synthèse/dégradation de la cycline B.

Chez les jeunes embryons, où les régulations de cdc2 par phosphorylation ne sont pas
toujours présentes, la protéolyse de la cycline B serait la régulation principale de l’activité du
MPF. La stabilité de la cycline B dépend des cyclines de G1. A. Chez les embryons en
mitose le MPF active le système de dégradation de la cycline B, et le niveau constant de
cyclines de G1 permet une réaccumulation rapide de cycline B en sortie de mitose, ce qui
entraîne une activation du MPF, qui permet à nouveau la mitose. Ces régulation produisent
de très brèves périodes d’instabilité de la cycline B, et permettent l’alternance rapide des
phases S et M. B. Dans les cellules somatiques, le niveau de cyclines de G1 est régulé. La
cycline E s’accumule en fin de phase G1. De ce fait, la cycline B reste instable durant la plus
grande partie de la phase G1. D’après King et al., 1994.
constitutive contrecarrerait rapidement l’action de l’APC à la sortie de mitose permettant la

réactivation du MPF pour un nouveau cycle (figure 12) (revue par King et al., 1994). Le

mécanisme de contrôle par phosphorylation sur tyrosine réapparaît à la transition mid-blastula,

tout comme chez la drosophile, où la dégradation des phosphatases cdc25 d’origine maternelle

(codées par string) permettrait la phosphorylation inhibitrice de cdk1 (Edgar, 1995). En

revanche, chez l’oursin les deux types de régulation (phosphorylation sur tyrosine et

dégradation de la cycline B) sont conservés au moins pendant les deux premiers cycles

(Edgecombe et al., 1991; Meijer et al., 1991). Chez la drosophile, aucune oscillation de l’activité

du MPF ni aucune variation de la quantité de cyclines A ou B n’ont été détectées durant les sept

premiers cycles, et le mécanisme de contrôle de ces premiers cycles est mal compris.

Cependant, l’induction de cyclines A ou B non dégradables stoppe le cycle cellulaire, suggérant

que la dégradation d’un pool spécifique de cyclines jouerait un rôle essentiel dans la régulation

du cycle, par le biais de la ségrégation intracellulaire des complexes MPF-substrat, plus que par

le contrôle biochimique de l’activité enzymatique (Edgar et al., 1994; Edgar, 1995).

D.2. R OLE DU COMPLEXE CDK 2/CYCLINE E

Le rôle du complexe cdk2/cycline E est moins bien défini chez les embryons que dans

les cellules somatiques. Des expériences de déplétion de la cycline E, dans des extraits

acellulaires d’oeufs de xénope et chez l’embryon de drosophile, suggèrent que le complexe

cdk2/cycline E est nécessaire à la phase S (Knoblich et al., 1994; Rempel et al., 1995). De plus,

le suivi de l’activité du complexe cdk2/cycline E, in vivo, révèle une oscillation biphasique au

cours de chaque cycle, ce qui suggère un rôle pour ce complexe en phase S mais aussi en

mitose (Hartley et al., 1996). Au contraire, lors du premier cycle mitotique de l’oursin, ce

complexe ne semble pas être nécessaire à la réplication de l’ADN mais pourrait jouer un rôle

dans l’inhibition de la re-réplication de l’ADN (Moreau et al., 1998).

44
-
 D.3. LES POINTS DE CONTROLE DU CYCLE CELLULAIRE EMBRYONNAIRE

Au cours de la progression normale dans le cycle, la re-réplication de l’ADN est inhibée

dans la plupart des cellules embryonnaires, ce qui assure le maintien du niveau de ploïdie (pour

revue Heichman et Roberts, 1994; Harland et Laskey, 1980). En revanche, le couplage de la

mitose à la réplication de l’ADN est limité voire fait défaut. Ainsi, Genevière-Garrigues (1995)

montre que, chez l’oursin, la mitose dépend en partie de la réplication de l’ADN mais les cibles

du checkpoint ne semblent pas être des CDK. En effet, chez des embryons traités par

l’aphidicoline, la rupture de l’enveloppe nucléaire et la formation correcte du fuseau mitotique sont

inhibées mais l’activité CDK, mesurée par la capacité des extraits à phosphoryler l’histone H1

(extrait brut et immunoprecipités, par un anticorps anti-cycline B) s’élève jusqu’à un niveau

équivalent, voire supérieur, à l’activité mitotique (Sluder et al., 1995; Genevière-Garrigues et al.,

1995). Les centrosomes se positionnent normalement autour du noyau, les microtubules astraux

se forment, et les asters adoptent une dynamique similaire à celle observée en anaphase et

télophase. Dans certains cas, le clivage a lieu et conduit à une répartition aberrante de l’ADN

(Genevière-Garrigues et al., 1995).

Chez les embryon de xénope et de drosophile, les divisions cellulaires continuent

lorsque la synthèse de l’ADN est inhibée avant le stade mid-blastula (Raff et Glover, 1988;

Dasso et Newport, 1990). De même, l’endommagement de l’ADN par irradiation n’altère pas les

divisions chez la drosophile et le xénope (revue par Hartwell et Weinert, 1989; Anderson et al.,

1997). Le point de contrôle de l’assemblage du fuseau fait également défaut chez l’embryon

précoce de xénope, où la dépolymérisation des microtubules ne stoppe pas le cycle cellulaire

(Clute et Masui, 1992). Chez l’oursin, l’anaphase se produit en dépit d’une absence

d’attachement ou d’une orientation aberrante des chromosomes (Sluder et al., 1994).

Il a été proposé que le fonctionnement des mécanismes de surveillance dépende de la

densité en noyaux dans l’embryon. Ainsi, tant que le rapport nucléoplasme/cytoplasme est

faible, ces points de contrôle seraient inopérants (Masui et Wang, 1998; Edgar et al., 1986).

Cependant, des études récentes suggèrent que c’est l’âge de l’embryon qui joue un rôle

prépondérant (Clute et Masui, 1997). L’absence de certains points de contrôle, avant le stade

mid-blastula, permet des divisions synchrones car la progression d’une cellule présentant une

45
-
anomalie (au niveau réplicatif par exemple) n’est pas retardée par rapport aux cellules

normales. Cependant, ceci comporte l’inconvénient de générer des erreurs pendant les

premières divisions, qui, si aucun système de correction n’était mis en place, conduiraient au

développement d’embryons anormaux. Chez la drosophile, dont le développement initial est

syncitial, un mécanisme de contrôle particulier assure que les noyaux anormaux soient

regroupés au centre du syncitium, puis éliminés (revue par Edgar, 1995). Cette élimination a lieu

à la transition blastula-gastrula et il est raisonnable de penser que chez les autres embryons

des mécanismes de surveillance similaires, qui permettent l’élimination des cellules anormales

soient également enclenchés durant cette période, c’est à dire avant la morphogenèse.

E. L E CYCLE CELLULAIRE CHEZ LES VEGETAUX

La remarquable conservation des mécanismes régulateurs du cycle cellulaire chez les

eucaryotes, s’étend au règne végétal. En 1989, John et collaborateurs mirent en évidence

qu’une protéine homologue de p34 cdc2 participait à la mitose chez l’algue unicellulaire

Chlamydomonas. Par la suite, de nombreux gènes potentiellement impliqués dans le cycle

cellulaire, notamment des gènes homologues de CDK et de cyclines, furent identifiés mais les

efforts pour préciser leur rôle in planta n’ont été déployés que récemment et les données

fonctionnelles sont assez lacunaires.

E.1. D IVERSITE DES CDK ET DES CYCLINES

Les CDK se répartissent en deux grands groupes : les CDK à motif PSTAIRE

définissent la classe A et les CDK non PSTAIRE appartiennent majoritairement à la classe B.

Quelques CDK non PSTAIRE n’ont pas d’affiliation particulière et semblent être spécifiques de

certaines espèces (revue par Mironov et al., 1999). Les gènes de cyclines, quant à eux, ont été

classés et dénommés sur la base d’homologies avec les cyclines animales (conservation dans

la “cycline-box”) et leur dénomination ne reflète pas forcément leurs propriétés fonctionnelles.

Les neuf groupes qui ont été définis se répartissent en trois super-groupes A, B et D

(tableau 1).

46
-
 E.2. ROLE DES CDK ET DES CYCLINES

De nombreuses approches expérimentales démontrent que les CDK interviennent dans

le contrôle du cycle cellulaire végétal. L’utilisation d’inhibiteurs spécifiques de CDK chez

plusieurs espèces suggère que les CDK seraient impliquées dans la transition G1/S et G 2/M

(Binarová et al., 1998; Glab et al., 1994). En particulier, chez Arabidopsis, l’expression de

cdc2aAt et cdc2bAt est limitée aux cellules en prolifération, ou ayant la capacité à proliférer, et

l’activité de ces enzymes correspond à des phases spécifiques du cycle (figure 13) (Martinez

et al., 1992; Hemerly et al., 1993; Segers et al., 1996). L’activité de cdc2aAt s’accroît lors des

deux transitions G1/S et G 2/M et son inhibition conduit à une diminution des divisions chez la

plante, sans que les durées relatives des phases G1 et G 2 ne soient affectées (Hemerly et al.,

1995). Ces résultats suggèrent que cdc2a interviendrait dans le contrôle des transitions G1/S et

G 2/M. La plupart des CDK de classe A, au contraire des CDK de classe B, peuvent

complémenter des mutants de levures CDC28-/cdc2- (tableau 1) (revue par Mironov et al.,

1999). Durant la mitose, les CDK de classe A sont associées à de nombreuses structures du

cytosquelette microtubulaire comme le fuseau, la bande préprophasique et le phragmoplaste

(Stals et al., 1997). De plus, l’inhibition des CDK empêche l’assemblage correct du fuseau

mitotique chez Vicia faba (Binarová et al., 1998). Il est donc raisonnable de supposer que les

CDK auraient une fonction régulatrice dans la réorganisation du cytosquelette lors de la mitose et

de la cytodiérèse.

Les cyclines B1 constituent de bons candidats pour remplir la fonction de cyclines

mitotiques. En effet, leur niveau d’expression est maximal en mitose et l’expression ectopique

de cycline B1;1 favorise la prolifération cellulaire dans les racines d’Arabidopsis (figure 13)

(Doerner et al., 1996; Mironov et al., 1999) La localisation intracellulaire spécifique des cyclines

durant le cycle suggère qu’elles rempliraient des fonctions particulières et pourraient diriger les

CDK vers leurs substrats. Notamment, la cycline B1;2 est relocalisée dans le noyau lors de la

mitose, à l’image de la cycline B1 animale. Toutefois, les CDK partenaires de ces cyclines ne

sont pas identifiées avec certitude.

La cycline A1, qui est localisée au niveau du fuseau mitotique et des microtubules

interphasiques, pourrait intervenir dans le contrôle de la dynamique des microtubules. La cycline

47
-
 Figure 13 : Expression et activité des CDK et expression des
cyclines au cours du cycle cellulaire
chez Arabidopsis thaliana

Activité
Protéine

ARNm

Activité

Protéine
ARNm

ARNm

Description dans le texte principal. D’après Mironov et al., 1999.

A2;1 de luzerne, quant à elle, aurait un rôle dans la transition G0/G 1 (Meskiene, 1995). Chez les

cellules de luzerne en phase S précoce, une kinase phosphorylant l’histone H1 et n’ayant pas

d’affinité pour p13 est immunoprécipitée par l’anticorps anti-cycline A, ce qui suggère que les

CDK des phases précoces pourraient s’associer à cette classe de cycline (Magyar et al.,

1993). Néanmoins, les kinases associées aux cyclines A ne sont actuellement pas identifiées.

L’utilisation du système double-hybride a permis de mettre en évidence que les cyclines

D1;1 et D4;1 interagissent avec cdc2a (De Veylder et al., 1997; De Veylder et al., 1999). La

première interaction fonctionnelle cycline CDK n’a été que très récemment mise en évidence

chez le tabac, où le complexe cdc2/cycline D phosphoryle la protéine homologue du

rétinoblastome (Nakagami et al., 1999). Les cyclines D ont été identifiées par complémentation

de mutants de levures et leur expression, quasi-constante dans les cellules en prolifération,

peut être induite par des hormones ou les nutriments (figure 13) (Soni et al., 1995; Riou-

Khamlichi et al., 1999). Aussi, comme leurs homologues animales, les cyclines D de plantes sont

soupçonnées jouer le rôle de médiateur entre les signaux extracellulaire et le contrôle du cycle.

De nombreuses expériences suggèrent que les complexes CDK/cyclines permettraient la

libération du facteur de transcription EF-2 via la phosphorylation de Rb. Chez le maïs, la

phosphorylation de Rb est corrélée au phénomène d’endoréplication des cellules de

l’endosperme. La protéine Rb de plante inhibe la réplication des geminivirus et des cellules

animales en interagissant avec EF-2 (revue par Gutierrez, 1998). La capacité du complexe

cdc2/cycline D de tabac à phosphoryler Rb en système homologue, et la mise en évidence des

interactions Rb-EF2 en système végétal, suggèrent la fonctionnalité de la voie du

rétinoblastome chez les végétaux (Nakagami et al., 1999; Inzé et al., 1999).

E.3. R EGULATION DES CDK

E.3.1.Interactions avec les molécules régulatrices du cycle

La multiplicité des cyclines de plantes et leur localisation intracellulaire particulière au

cours du cycle suggèrent que ces molécules constituent des régulateurs fondamentaux des

CDK. De plus, les CDK monomériques n’ont qu’une très faible activité kinasique, alors que les

48
-
complexes immunoprécipités par des anticorps anti-cycline (A et B) possèdent une activité

conséquente (Bögre et al., 1997; Magyar et al., 1993; Magyar et al., 1997).

D’autres molécules régulatrices ont été isolées chez les plantes. L’utilisation du système

double-hybride a permis l’identification de trois protéines interagissant avec cdc2aAt et qui

présentent des similarités de séquences réduites avec les CKI humaines, p21 et p27 (Wang et

al., 1997; Wang et al., 1998). Ces similitudes sont localisées dans la partie C-terminale de la

molécule qui est cruciale pour l’interaction d’ICK1 (apparenté à p27Kip1) avec cdc2aAt/cycline

D3;1. Des concentrations de ICK1 de l’ordre du namolaire sont suffisantes pour inhiber de 80%

l’activité H1 kinase chez Arabidopsis. La transcription de ICK1 peut être induite par l’acide

abcissique, ce qui suggère que ICK1 serait le médiateur de l’effet cytostatique de cette hormone.

L’ensemble de ces résultats indique que les CKI existent chez les plantes et jouent, à l’image de

leurs homologues animaux, un rôle dans l’intégration des signaux environnementaux pour la

régulation du cycle cellulaire.

L’équilibre synthèse/dégradation des molécules régulatrices du cycle, telles que les

cyclines et les CKI, constitue une clé de voûte de la régulation du cycle et est assuré par une

régulation transcriptionnelle ainsi que probablement par le fonctionnement du système de

dégradation protéolytique dépendant de l’ubiquitine qui est conservé chez les plantes (Plesse

et al., 1998).

Enfin, chez Arabidopsis, la transcription de l’homologue de CKS, CKS1At, dont le

produit correspondant se lie aux CDK de classe A et B, est élevée dans les cellules en division

et dans les tissus polyploïdes. Néanmoins, s’il est probable que CKS1At soit nécessaire au

fonctionnement des CDK, son rôle est actuellement mal défini (De Veylder et al., 1997).

E.3.2.Phosphorylations

Les CDK de plantes possèdent les résidus conservés, qui sont les cibles des

phosphorylations régulatrices chez les autres eucaryotes (Dudits et al., 1998). Deux kinases,

présentant des homologies réduites avec la CAK humaine, ont été identifiées chez Arabidopsis

et le riz (tableau 1). Ces kinases peuvent phosphoryler la protéine humaine cdk2 mais leur rôle

n’a pas été démontré in planta (Umeda et al., 1998, Yamanuchi et al., 1998). De même, un

49
-
homologue de wee1 a été isolé chez le maïs et le produit de ce gène inhibe l’activité CDK de

maïs in vitro (Sun et al., 1999). Enfin, une lignée transgénique de tabac surexprimant cdc25 de

levure, possèdent des cellules de petite taille suggérant que l’expression de cdc25 favorise la

mitose avant que la cellule n’ait atteint la taille requise pour la division (Bell et al., 1993;

McKibbin et al., 1998). De plus, l’expression de cdc25 permet de compenser l’absence de

cytokinine, hormone de croissance, du milieu de culture (John, 1998). Cependant, il n’existe que

peu d’évidences directes du contrôle des CDK par phosphorylation. A ma connaissance, seul

Zhang et collaborateurs (1996) ont montré que, chez le tabac, la protéine reconnue par

l’anticorps anti-PSTAIRE est phosphorylée sur tyrosine lorsque les cellules BY-2, cultivées

dans un milieu dépourvu de cytokinine, sont arrêtés en G2. Les CDK purifiées à partir de ces

extraits sont activées par cdc25a de levure et, de plus, l’ajout de cytokinine au milieu diminue la

phosphorylation sur tyrosine de la CDK PSTAIRE, et permet l’activation des CDK. Ces

résultats suggèrent l’importance de la phosphorylation sur tyrosine dans la régulation des CDK

végétales. Cependant, les plantes transgéniques de tabac et d’Arabidopsis, qui expriment

l’allèle doublement muté de cdc2aAt T14A/Y15F (supposé être constitutivement actif), se

développent apparemment normalement. Il apparaît donc probable, qu’à l’instar de ce qui est

observé chez S. cerevisiae, un autre mécanisme de régulation indépendant des ces

phosphorylations existe et soit suffisant au fonctionnement correct des CDK chez les plantes

mutantes.

La figure 14 présente un schéma récapitulatif des connaissances acquises sur la

régulation des CDK au cours du cycle cellulaire des végétaux.

E.4. LE S M E C A N I S M E S D E S U R V E I L L A N C E D U C Y C L E C E L L U L A I R E C H E Z L E S

VEGETAUX

La littérature sur le cycle cellulaire végétal ne fait pas directement état des mécanismes

de surveillance existant chez les plantes, à l’exception d’une étude récente qui montre que le

stress oxydatif diminue l’activité H1 kinase et stoppe le cycle cellulaire (Reichheld et al., 1999).

Cependant, l’utilisation d’inhibiteurs de la réplication de l’ADN ou de la polymérisation des

microtubules pour synchroniser les populations, indique implicitement que des mécanismes de

50
-
 Figure 14 : Modèle du contrôle du cycle cellulaire végétal

CKI

Cks1 CycA/B Mitogènes

B-CDK
CycA/B
Cks1 A-CDK

Y-Phosphatase P
(Cytokinine-dépendante)
M A-CDK
G2 CycD

CycB
G1

S P
Rb
P

Y-Kinase CycA CycD

A-CDK
A-CDK Rb

RIP

CycA
CKI CKI RIP

Ce modèle prend en considération les différentes connaissances acquises sur les gènes et
les protéines intervenant dans le cycle cellulaire végétal et s’appuit sur les fonctions qu’ont
ces protéines dans des systèmes hétérologues. La stimulation mitogénique entraîne la
synthèse des cyclines D, qui s’associent aux CDK de type A. Ces complexes phosphorylent
la protéines du rétinoblastome (Rb), ce qui conduit au relargage de protéines avec
lesquelles Rb interagit (RIP) et, en conséquence, à l’entrée en phase S. La synthèse des
cyclines A, lors de la phase S, permet la formation des complexes actifs CDK de type
A/cycline A. A la fin de la phase S, les complexes CDK/cycline sont inhibés par
phosphorylation. Les cyclines B sont synthétisées en G2. Les deux types de CDK A et B
sont actives à la transition G2/M et s’associeraient toutes deux, aux cyclines B. Leur
activation serait permise par la déphosphorylation du résidu inhibiteur tyrosine. Ce
processus a été montré être dépendant des cytokinines. La présence du facteur Cks1 serait
également nécessaire à la mitose. Les séquences spécifiques trouvées chez les cyclines A
et B, suggèrent qu’elles sont dégradées durant la phase M. L’arrêt du cycle serait provoqué
par association de CKI avec les cyclines de types A. D’après Mironov et al., 1999.
contrôle empêchant la mitose, lorsque la réplication est incomplète ou l’assemblage du fuseau

défectueux, sont présents (Planchais et al., 1997; Binarová et al., 1998). Les cibles et les

acteurs de ces mécanismes de contrôle ne sont, à ce jour, pas caractérisés. En ce qui concerne

le point de restriction R (START), chez les levures et les animaux, qui peut être considéré

comme un mécanisme de surveillance du cycle par rapport aux conditions extérieures, il est

important de remarquer que les cellules végétales peuvent sortir et ré-entrer dans le cycle en

phase G2. Ce phénomène, illustré par le blocage des cellules de tabac en G2 en l’absence de

cytokinine (Zhang et al., 1996) est spécifique des cellules végétales et sous-entend que des

mécanismes de régulation supplémentaires existent chez les végétaux.

51
-
 III. DEVELOPPEMENT ET VOIES DE SIGNALISATION PAR
PHOSPHORYLATION

A. G ENERALITES

Le développement d’un nouvel organisme requiert la différenciation et la croissance

coordonnées de ses cellules. Pour ce faire, chaque cellule doit avoir la capacité d’intégrer

spécifiquement de nombreux signaux provenant de l’environnement (endosperme chez les

plantes à fleurs, utérus chez les mammifères) et des cellules embryonnaires voisines. La

réponse cellulaire consiste, le plus souvent, en l’activation de gènes spécifiques, mais réside

également dans la régulation post-traductionnelle de protéines qui permettent des changements

métaboliques et/ou une réorganisation du cytosquelette. La transduction du signal utilise des

mécanismes universels et ubiquitaires qui sont retrouvés aussi lors de l’embryogenèse. Ainsi,

dans l’activation des lymphocytes T, la chaîne principale de transduction du signal est analogue

à celle intervenant lors de l’établissement de l’axe dorso-ventral chez l’embryon de drosophile

(revue par Hoffman et al., 1999).

B. I MPORTANCE DES KINASES

La perception d’un signal extracellulaire se fait généralement à la surface de la cellule via

un récepteur protéique qui enclenche la phosphorylation en cascade de protéines en aval, et

régule, ainsi, leur activité. Les cascades de phosphorylation reposent principalement sur

l’activité de deux types de kinases : les serine/thréonine-kinases (S/T-kinases) et les tyrosine-

kinases (Y-kinase). Certaines MAP kinases (Mitogene Activated Protein) peuvent phosphoryler

les trois résidus (Hanks et Hunter, 1995, Schenk et Snaar-Jagalska, 1999). Plus rarement, les

résidus aspartyl, glutamyl ou histidyl peuvent également être phosphorylés par des kinases

particulières. Les gènes de kinases représentent entre 1 et 3% du génome eucaryote (Hunter,

52
-
1991; Hunter et Plowman, 1997) et une même cellule de mammifère peut contenir une centaine

de kinases différentes, dont la plupart sont des S/T-kinases. Chez les animaux, bien que les

protéines phosphorylées sur tyrosine représentent moins de 0,1% des phosphoprotéines, les

protéines tyrosine-kinases (PTK) jouent un rôle prépondérant dans la signalisation faisant

intervenir des récepteurs catalytiques (fonctionnant comme des enzymes ou associés à des

enzymes) (Posada et Cooper, 1992) et régulent un large éventail de réponses cellulaires

(Parsons et Parsons, 1997). Ainsi, les récepteurs aux facteurs de croissance (EGF, PDGF,

NGF pour Epidermal-, Platelet-Derived- et Nerve- Growth Factor) possèdent une activité

tyrosine-kinase intrinsèque. Les intégrines, protéines transmembranaires d’adhésion cellulaire,

sont couplées à des PTK particulières, les FAK (pour Focal Adhesion Kinase), qui enclenchent

les réponses nécessaires à l’adhésion cellulaire. Les réponses sécrétoires font également

intervenir des PTK.

Chez les végétaux, aucun gène de PTK n’a pu être isolé, bien que des activités

tyrosine-kinases aient été caractérisées (Torruela et al., 1985; Duerr et al., 1993; Islas-Flores et

al., 1998). Parmi les quelques 650 séquences de kinases végétales répertoriées à ce jour (sur

3700 séquences de protéines kinases eucaryotes), des kinases typiquement végétales se

distinguent des kinases eucaryotes classiques (Stone et Walker, 1995) : les CDPK, pour

“Calcium Dependent Protein Kinases”, sont directement dépendantes du calcium et ne

requièrent aucun intermédiaire (calmoduline, phospholipides ou diacylglycérol) pour être

activées. Elles différent, en cela, des kinases dépendantes des complexes calcium/calmoduline

(CaMK) et des protéines kinases C (PKC). Les RLK (Receptor Like Kinase) sont des

récepteurs transmembranaires catalytiques à activité S/T kinase mais ont une structure

analogue aux récepteurs tyrosine-kinase des animaux (revue par Becraft, 1998; Stone et

Walker, 1995).

53
-
 C. L ES CASCADES DE PHOSPHORYLATION

C.1.D ANS LA POLARISATION CELLULAIRE

L’établissement de la polarité cellulaire réside dans la création et le maintien de domaines

subcellulaires particuliers, dont la localisation spécifique oriente des phénomènes cellulaires tels

que la croissance, ou encore la différenciation. La polarisation est donc d’une importance capitale

pour le contrôle de processus fondamentaux qui interviennent largement dans la morphogenèse.

La levure bourgeonnante est soumise à de multiples événements de polarisation au

cours de sa vie (bourgeonnement, conjugaison, croissance pseudohyphale) et représente un

modèle classique d’étude de la polarisation (revue par Cid et al., 1995). Chez les animaux

pluricellulaires, l’adhésion (inter)cellulaire à l’origine de la polarisation cellulaire, joue un rôle

fondamental dans les processus de différenciation, de prolifération et de migration cellulaire

(Gumbiner, 1996; Drubin et Nelson, 1996). Dans ces systèmes, biologiquement et

phylogénétiquement très éloignés, des mécanismes analogues sont utilisés lors de la

polarisation cellulaire. La perception du signal conduit au recrutement, en un site défini, de

molécules qui vont former un complexe informationnel servant à la réorganisation du

cytosquelette d’actine et à l’activation des gènes, dont les produits amplifient le phénomène de

polarisation et/ou modifient la physiologie de la cellule (figure 16). La transduction de l’information

fait intervenir des cascades de phosphorylation.

C.1.1.Polarisation chez Saccharomyces cerevisiae

La levure bourgeonnante réalise sa croissance et sa division cellulaire de manière

polarisée. Son cycle de vie et sa morphogenèse sont définis par les conditions nutritionnelles

du milieu (figure 15) (Cid et al., 1995). Dans des conditions favorables, les organismes

diploïdes se multiplient par bourgeonnement d’une cellule fille suivie d’une division asymétrique

(croissance végétative). En conditions limitantes, les levures peuvent soit entrer dans une

phase stationnaire, soit entamer une croissance pseudohyphale, où des chaînes de cellules

sont formées (ce qui facilite l’accès aux nutriments), ou encore sporuler pour donner des levures

haploïdes. Ces levures haploïdes se multiplient également de manière végétative et peuvent,

54
-
 Figure 15 : Cycle de vie et morphogenèse
de la levure bourgeonnante, Saccharomyces cerevisiae
A
Haploïde Diploïde
Conjugaison
Phase stationnaire Phase stationnaire
1n->2n
Croissance végétative Croissance végétative
(bourgeonnement axial) Sporulation (bourgeonnement bipolaire)

2n->1n
Croissance invasive Croissance pseudohyphale

Bourgeonnement

Conjugaison

Description dans le texte principal. D’après Kron et Gow, 1995 et d’après Chant, 1996.
lorsque les conditions redeviennent favorables, conjuguer pour générer un organisme diploïde

(figure 15). La croissance polarisée, qui intervient pour chacun de ces événements

morphogénétiques, implique la sélection du site de croissance et son orientation, puis la

reconnaissance de ce site par la cellule. La réorganisation du cytosquelette, en conséquence,

oriente les sécrétions polarisées et permet l’émergence du bourgeon (figure 15 B). Seuls les

microfilaments d’actine (et non les microtubules) sont nécessaires à la croissance polarisée

(Roemer et al., 1996). Trois protéines principales sont essentielles à l’organisation du

cytosquelette d’actine (figure 16 A) : CDC42, CDC24 et BEM1 (respectivement GTPase,

protéine échangeuse GDP-GTP sur CDC42, et protéine à motif SH3 du cytosquelette) servent

de relais membranaire pour l’activation de S/T-kinases de la famille PAK (STE20, SKM1 et

CLA4) qui régulent la dynamique et l’ancrage du cytosquelette d’actine. Lors de la croissance

pseudohyphale ou de la conjugaison, STE20 active des voies de MAP kinases (STE11, STE7,

FUS3 ou KSS1) qui activent, à leur tour, la transcription de gènes nécessaires aux événements

morphogénétiques (Roemer et al., 1996; Johnson, 1999) (figure 16 A).

C.1.2.Les adhésions focales

Chez les animaux, le contact des cellules avec la matrice extracellulaire (via les

intégrines) résulte en l’organisation d’un complexe supramoléculaire, dénommé adhésion focale,

qui comprend des molécules signalisatrices et des molécules du cytosquelette (figure 16 B). A la

taline et aux filaments d’actine qui se localisent précocement, s’ajoutent les molécules de

vinculine et d’autres protéines du cytosquelette. Un module GTPase, similaire à celui que nous

avons décrit chez la levure, active l’expression de gènes spécifiques par l’intermédiaire de la

kinase PAK et de la voie des MAP kinases. En revanche, à la différence de ce qui se passe

chez les levures, les adhésions focales contiennent de nombreuses tyrosine-kinases qui sont

nécessaires à la signalisation par le complexe. Les deux kinases principales, la FAK (Focale

Adhesion Kinase) et la protéine p60 c-Src, sont localisées aux adhésions et travaillent de concert

pour intégrer les signaux d’adhésion et de division cellulaire (Craig et Johnson, 1996).

55
-
 Figure 16 : Exemples de cascades de phosphorylation
contrôlant la polarisation cellulaire

A B
Récepteur aux phéromones Ste2
ECM

P
P Protéines
de signalisation
Src
Rho (CDC42)
P PI3Kinase
P etc...
P
A
ct

P
in
e

Polarisation
du cytosquelette

A. Modèle d’établissement de la croissance polarisée en réponse aux phéromones, lors de

la conjugaison chez S. cerevisiae. La liaison de la phéromone au récepteur Ste2 conduit à
l’activation de gènes spécifiques, à l’arrêt du cycle cellulaire et à la polarisation du
cytosquelette ainsi qu’à la croissance au site où la concentration en phéromone est la plus
élevée. Ces réponses sont le résultats de l’activation de protéines G et de la voie des MAP
kinases (voir texte principal). D’après Roemer et al., 1996.
B. Complexe de l’adhésion focale dans les fibroblastes. La liaison des intégrines à la
matrice extracellulaire (ECM) provoque leur regroupement au site d’adhésion, et le
recrutement de protéines du cytosquelette, telles que la tensine (T), la vinculine (V) et
l’alpha-actinine (α-A) et de la protéine kinase FAK ainsi que d ’autres molécules
signalisatrices. La tensine et la FAK sont phosphorylées sur tyrosine, une fois qu’elles sont
recrutées. La combinaison de ces événements induit la colocalisation de l’actine et de la
paxilline phosphorylée au site d’adhésion.D’après Craig et Johnson, 1996.
 C.2.D ANS L ’ ETABLISSEMENT DE LA POLARITE EMBRYONNAIRE

Du fait de leur rôle dans l’adhésion et la migration cellulaire, les récepteurs tyrosine-

kinases (RTK) interviennent pour beaucoup dans l’embryogenèse animale, où ces deux

fonctions sont essentielles à l’embryogenèse (Tanaka et al., 1998; Partanen et al., 1998). Chez

la drosophile, le récepteur Toll, dont la structure extracellulaire est très similaire à celle des

récepteurs tyrosine-kinases, est couplé à une S/T kinase, Pelle, et se situe en amont de la voie

de transduction conduisant à l’établissement de l’axe dorso-ventral (Galindo et al., 1995).

L’établissement de l’axe dorso-ventral chez le xénope, dépend également d’une voie de

signalisation (Wnt) dont les acteurs sont bien caractérisés et qui semble intervenir

universellement dans les phénomènes de polarisation embryonnaire, tels que le modelage

antéro-postérieur des segments de l’embryon de drosophile ou la formation des appendices

embryonnaires chez la souris (figure 17) (Miller et Moon, 1996; Moon et al., 1997; Brown et

Moon, 1998). Wnt-1 code une glycoprotéine sécrétée, qui permet par sa liaison au récepteur

Frizzeld, la phosphorylation de la protéine Dishevelled. Dihevelled inhibe alors la kinase 3 de la

glycogène synthase (GSK-3) et permet ainsi la libération de la ß-caténine liée à GSK-3. La ß-

caténine libre active alors l’expression de morphogènes. Les protéines de la famille Wnt sont

capables d’induire, à elles seules, la formation ectopique d’un axe dorso-ventral lorsqu’elles sont

injectées dans les embryons de xénope, ce qui démontre le rôle primordial de cette voie dans la

polarisation des vertébrés (McMahon et Moon, 1989).

C.3.D ANS L ’ EMBRYOGENESE VEGETALE

La recherche sur l’embryogenèse n’a malheureusement pas connu le même engouement

dans le domaine végétal que dans le domaine animal et il n’existe que très peu de données sur

la signalisation au cours de l’embryogenèse végétale. Chez Arabidopsis thaliana, si la

caractérisation de mutants de l’embryogenèse, déficients pour la mise en place de l’axe apico-

basal et de l’axe radial, a permis de mieux comprendre les mécanismes du modelage de

l’embryon (Mayer et al., 1991; Meinke, 1995), les produits des gènes mutés restent souvent à

identifier et les régulations auxquelles ils prennent part restent mal comprises. Ainsi, la mutation

monopteros concerne un gène codant un facteur de transcription impliqué dans la différenciation

56
-
 Figure 17 : Voie de signalisation par Wnt-1 lors de
l’établissement de la polarité embryonnaire

P
P
P
C
AP

P
P P
P

Voie classique de signalisation par Wnt-1. En l’absence de signal, GSK-3β (Glycogene

Synthase Kinase) et l ’APC (Adenomatous Polyposis Coli tumor suppressor) sont en
complexe avec la β-caténine et provoquent sa dégradation par ubiquitination. Dans le
noyau, la transcription du morphogène siamois est réprimée par le facteur Lef/Tcf. La
liaison de Wnt à son récepteur membranaire Frizzled, conduit à l’hyperphosphorylation
de Dishevelled (Dsh), en partie par l’intermédiaire de la caséine kinase CKII. Dsh
hyperphosphorylée est active et inhibe par phosphorylation, GSK-3β par un mécanisme
qui impliquerait la protéine kinase C (PKC). Le niveau de β-caténine augmente en
conséquence et cette protéine est transloquée dans le noyau. Elle interagit avec le
répresseur Lef/Tcf, levant l’inhibition de la transcription du morphogène siamois, qu’elle
active également, en interagissant avec l’ADN. D’après Brown et Moon, 1998.
du tissu vasculaire qui a lieu dans la région centrale de l’embryon. Cette mutation affecte

pourtant, les embryons dans leur région basale et centrale et, à un moindre degré, dans leur

région apicale, selon un mécanisme inconnu (Berleth et Jürgens, 1993; Hardtke et Berleth,

1995). La protéine gnom, récemment identifiée comme un facteur échangeur de GDP/GTP,

intervient dans le transport polarisé de l’auxine et est importante pour le modelage de l’embryon

car les mutants gnom ne présentent ni région centrale ni région basale (Mayer et al., 1991;

Steinmann et al., 1999).

Inversement, des activités kinases ont été identifiées chez les embryons, mais

généralement les gènes et/ou les fonctions correspondants restent à préciser. En particulier,

bien qu’aucun gène de tyrosine-kinase classique n’ait été identifié, des activités tyrosine-

kinases ont été caractérisées dans l’embryon de noix de coco et fluctuent au cours du

développement (Islas-Flores et al., 1998). Des changements dans les profils de protéines

phosphorylées sur tyrosine s’opèrent également durant le développement, suggérant que les

tyrosine-kinases pourraient jouer un rôle régulateur au cours de l’embryogenèse de la noix de

coco. Une étude approfondie sur l’embryogenèse somatique de carotte, visant à identifier des

marqueurs de compétence embryonnaire des cellules hypocotylaires, indique que l’initiation de

l’embryogenèse est corrélée à l’expression d’un gène codant un récepteur de type kinase

(RLK), plutôt qu’à la morphologie des cellules (Schmidt et al., 1997). Ce gène est exprimé

transitoirement et exclusivement jusqu’au stade globulaire, aussi bien chez les embryons

somatiques que chez les embryons zygotiques. De ce fait, il a été dénommé SERK pour

“Somatic Embryogenesis Receptor-like Kinase”. Le domaine extracellulaire de liaison au ligand

de la protéine SERK présente des homologies de structure avec celui de la protéine Toll, car il

possède des régions de répétition de leucine (LRR), tandis que le domaine catalytique est

analogue à celui de la S/T kinase Pelle. Ces homologies structurales avec des protéines

impliquées dans l’établissement de l’axe dorso-ventral de la drosophile, ne permettent

cependant pas de statuer sur la fonction de SERK au cours de l’embryogenèse végétale.

L’existence de molécules-signal diffusibles et promotrices de l’embryogenèse, tel le facteur Nod,

qui est capable de restaurer l’embryogenèse chez des mutants de carotte thermosensibles ts11

(revue par Schmidt et al., 1994), laisse supposer la présence de récepteurs à ces molécules.

57
-
Les protéines de type SERK constituent de bons candidats pour assumer ce rôle. L’expression

de gènes de RLK, clavata1 et clavata3 (qui serait le ligand de clavata1) débute plus

tardivement dans l’embryogenèse et se maintient dans les régions méristématiques. Cette

expression est essentielle à la mise en place des régions méristématiques (Clark et al., 1993;

Clark et al., 1995; Clark et al., 1997; Lenhard et Laux, 1999). De manière générale, les RLK,

dont l’identification est en plein essor, semblent être primordiales lors du développement des

végétaux mais les acteurs intervenant dans les voies de phosphorylations qu’elles enclenchent

restent à identifier (revue par Becraft, 1998).

D. C OORDINATION CYCLE CELLULAIRE ET DEVELOPPEMENT

L’orchestration de la croissance et de la différenciation cellulaire est essentielle à la

morphogenèse correcte de tout organisme. Chaque cellule doit ajuster son rythme de division à

son état physiologique et inversement, afin de maintenir une taille et des interactions avec les

cellules voisines adaptées à son intégration dans l’organisme. Les données qui suivent

illustrent, en partie, les connaissances acquises sur les interactions qu’il existe entre les trois

grandes fonctions que sont la division, la croissance et la différenciation cellulaire chez les

animaux, les végétaux et les levures.

D.1. CYCLE CELLULAIRE ET MORPHOGENESE CHEZ LES ANIMAUX

L’augmentation de masse impressionnante, à laquelle sont soumis la plupart des

organismes au cours du développement, est accompagnée d’une augmentation coordonnée et

précise du nombre de cellules. La coordination de la division et de la croissance cellulaire confère

à chaque organe une densité cellulaire appropriée et assure ainsi, en partie, sa morphologie.

Conceptuellement, cette coordination peut s’effectuer de trois manières différentes mais non

exclusives : la progression au cours du cycle peut contrôler la croissance, la croissance peut

contrôler la progression au cours du cycle, ou ces deux événements peuvent être régulés, à un

niveau supérieur, par une voie de signalisation commune (revue par Neufeld et Edgar, 1998).

La différenciation cellulaire, quant à elle, est couplée, chez les animaux, à une sortie du cycle

58
-
cellulaire, ce qui implique une régulation du cycle par les facteurs de différenciation. Les

molécules contrôlant la progression en G 1, telles que les cyclines D et certaines CKI,

précédemment évoquées, jouent le rôle de médiateurs de ces facteurs.

Peu de données de la littérature supportent l’existence d’un contrôle de la croissance et

de la différenciation par le cycle cellulaire. La surexpression des cyclines de G1 (D1 et E) dans

les cellules animales provoque la division précoce des cellules, ce qui conduit à la réduction du

volume cellulaire (Ohtsubo et Roberts, 1993; Quelle et al., 1993; Resnitzky et al., 1994). De

manière similaire, l’expression ectopique de E2F ou de son antagoniste RBF (apparentée à la

protéine du rétinoblastome), dans l’aile de drosophile, mènent respectivement à une

augmentation ou à une diminution des taux de divisions mais la taille des territoires occupés par

ces petites ou grosses cellules reste similaire. De plus, la surexpression du gène délété de

cdc2, dans les ailes de drosophiles, conduit à la formation d’ailes de forme et de taille normales

mais qui sont constituées de grosses cellules, dont le nombre est réduit par rapport à la normale

(Weigmann et al., 1997). Ce résultat met en évidence un découplage total entre la

morphogenèse et la division. Enfin, chez Caenorhabditis elegans, la mutation du gène cul-1,

probablement impliqué dans la dégradation programmée de cyclines de G 1, conduit à la

formation d’un animal avec plus de cellules, mais chez qui la plupart des aspects de la

détermination et de la différenciation cellulaire s’effectuent normalement (Kipreos et al., 1996).

Ces données suggèrent donc que la croissance et la morphogenèse sont indépendantes du

cycle cellulaire.

Il faut néanmoins noter que le ralentissement ou l’arrêt du cycle cellulaire lors du

développement précoce de l’aile de drosophile supprime la croissance, ce qui suggère qu’avant

que la croissance devienne autonome par rapport au cycle cellulaire, une taille minimale viable

doit être atteinte, ou que la croissance est limitée par le nombre de molécules d’ADN matriciel

(Weigmann et al., 1997; Neufeld et al., 1998). De plus, chez l’embryon de drosophile, la

mutation délétère du gène dacapo, qui code une CIP/KIP spécifique du complexe cdk2/cycline

E, est létale (Lane et al., 1996). L’importance de la CKI, p27, dans le développement de la

souris, vient également nuancer l’idée d’une autonomie totale de la morphogenèse vis à vis du

cycle cellulaire. En effet, la mutation p27-/- cause, en plus de multiples anomalies mineures, de

59
-
graves désordres dont une absence de différenciation des cellules lutéales, en partie

responsable de la stérilité des femelles, et une différenciation anormale des cellules

photoréceptrices (Nakayama et al., 1996). Ces anomalies ne peuvent être attribuées à une

incapacité des cellules à sortir du cycle cellulaire car les cellules de souris p27-/- répondent de la

même manière que les cellules normales, au facteur antiprolifératif TGF-ß et conservent leurs

propriétés d’inhibition de contact. P27 aurait donc un rôle spécifique dans le contrôle de la

différenciation.

Le contrôle du développement de l’oeil de drosophile par la protéine roughex, illustre,

quant à lui, la nécessité d’une régulation du cycle cellulaire pour la différenciation correcte des

cellules de la rétine. La protéine roughex régulerait le niveau de cycline A, ce qui permettrait le

maintien des cellules en phase G1. La mutation du gène roughex conduit les cellules à entrer

prématurément en phase S, et mène, à terme, à une différenciation anormale et à une mort

cellulaire, probablement en raison de la rupture des interactions cellulaires nécessaires au

développement (Thomas et al., 1994). Il apparaît donc, que si dans la majorité des cas, le cycle

cellulaire ne contrôle pas directement la croissance cellulaire, les régulateurs du cycle cellulaire

peuvent être essentiels à la différenciation de cellules particulières.

La croissance cellulaire pourrait, quant à elle, contrôler le cycle cellulaire, notamment en

régulant la synthèse de cdk4, des cyclines D et de p27 par un mécanisme similaire à celui

opérant sur la synthèse de la cycline CLN 3 de levure (voir ci-dessous). Chez les mammifères,

les hormones et les interactions cellulaires pourraient jouer un rôle de médiateur entre la

croissance et le cycle cellulaire, en régulant la synthèse des protéines du cycle cellulaire en

fonction de l’état physiologique de la cellule, mais ceci reste à démontrer.

Il apparaît probable que la coordination du cycle et de la croissance et/ou de la

morphogenèse cellulaire s’effectue par l’intermédiaire de facteurs agissant à des

embranchements en aval d’une voie de signalisation commune. La voie de signalisation “ras”

activée en réponse à des facteurs mitogènes et lors de nombreux phénomènes de

différenciation cellulaire, pourrait coordonner ces trois processus. Ras régule le facteur de

traduction eIF4, responsable de l’augmentation de la synthèse protéique globale qui est

nécessaire à la croissance, et ras régule également la transition G 1/S via la protéine du

60
-
rétinoblastome. En effet, l’expression de dominants négatifs de ras, dans des cellules

quiescentes, abolit l’induction des cyclines D1, la dégradation de p27 ainsi que l’activation des

gènes sous le contrôle de E2F et, en conséquence, bloque l’entrée des cellules stimulées en

phase S (Aktas et al., 1997). La protéine du rétinoblastome apparaît être une cible clé de ras,

pour la réalisation de ces événements, puisqu’en son absence l’expression de dominants

négatifs de ras ne bloque pas l’entrée en phase S (Peeper et al., 1997). Plus généralement, la

protéine du rétinoblastome semble être un bon candidat pour intégrer les différents signaux

cellulaires et coordonner le cycle, la croissance et la différenciation cellulaire. En effet, Rb régule

les ARN polymérases I et III, qui assurent la synthèse des ribosomes et des ARN de transfert,

et exerce de ce fait un contrôle global sur la synthèse protéique nécessaire à la croissance

cellulaire (Bartek et al., 1996). De plus, l’interaction entre Rb et le facteur de transcription Myo-D,

qui contrôle l’expression de gènes requis pour la différenciation musculaire, est nécessaire à

l’activité de Myo-D (Gu et al., 1993).

Nous avons précédemment exposé le cas particulier des embryons précoces animaux,

chez lesquels la plupart des contrôles et des mécanismes de surveillance du cycle cellulaire

sont absents. Dans les embryons plus âgés, chez qui la différenciation s’opère, la coordination

cycle cellulaire-morphogenèse ne semble pas être aussi étroite que dans les cellules

somatiques. Ainsi, chez les embryons de xénope au stade neurula, le blocage de la réplication

par des inhibiteurs d’ADN polymérases inhibe la division, mais n’affecte pas le développement

pendant les 40 heures suivante (Rollins et Andrews, 1991). De manière analogue, l’embryon

d’oursin traité par l’aphidicoline au stade “vegetal-plate”, se développe jusqu’au stade pluteus

(Stephens et al., 1986). Chez la drosophile, les premiers cycles syncitials rapides sont

indépendants de la croissance, puis, après la cellularisation, une régulation plus affinée du cycle

cellulaire s’instaure progressivement sous l’influence de voies de différenciation (revue par

Edgar, 1995). La dégradation des phosphatases cdc25 maternelles serait responsable de

l’apparition de la phase G2 dans le quatorzième cycle (transition mid-blastula). Les cycles

cellulaires sont alors contrôlés en G2/M grâce à la régulation transcriptionnelle zygotique de

cdc25 (string) (Edgar et Lehner, 1996). Ces cycles ne présentent pas de phase G 1, phase

habituellement utilisée pour la coordination des contrôles cycle cellulaire-

61
-
croissance/morphogenèse, et conduisent à la formation de cellules de plus en plus petites. Par

la suite (cycle 17) la déplétion de la cycline E maternelle et l’expression d’une CKI (dacapo)

agissent de concert pour stopper le cycle en phase G 1 dans la plupart des cellules. Il est

intéressant de noter que lors de la morphogenèse l’expression zygotique de string, de la cycline

E et de dacapo (CIP/KIP) est contrôlée par des facteurs de différenciation (Duronio et O’Farrel,

1994; Penton et al., 1997; Johnston et Edgar, 1998).

D.2. CYCLE CELLULAIRE ET MORPHOGENESE CHEZ LES VEGETAUX

L’absence de migration cellulaire chez les végétaux a longtemps laissé présumer que la

morphogenèse végétale était directement dépendante de l’orientation des plans et du taux de

division cellulaire. Cependant, les connaissances actuelles tendent à montrer que l’orientation et

la fréquence des divisions ne sont pas tant des déterminants de la morphogenèse végétal que

des outils utilisés, parmi d’autres, pour façonner l’organisme.

L’orientation transversale des plans de division par rapport à l’axe de croissance semble

être, plus souvent, la conséquence que la cause de la croissance polarisée (Green, 1976). En

effet, en l’absence de divisions cellulaires, les germes de blé effectuent correctement l’initiation

des primordia racinaires latéraux et la morphologie des jeunes feuilles est normale (revue par

Hemerly et al., 1999; Foard et al., 1965). L’indépendance entre la morphogenèse et l’orientation

des plans de division, est également illustrée par les mutants fass d’Arabidopsis et tangled de

maïs. Chez ces mutants, dans lesquels les divisions ne sont pas correctement orientées, la

formation de l’axe de polarité apical-basal, la structuration de la plante (fass) et la morphologie

des feuilles (tangled) sont apparemment normales (Torres-Ruiz et Jürgens, 1994; Smith et al.,

1996).

L’approche génétique, consistant à manipuler des effecteurs du cycle cellulaire, conforte

l’idée selon laquelle la morphogenèse végétale ne dépend pas du cycle cellulaire. En effet,

l’expression d’un allèle dominant négatif de cdc2a d’Arabidopsis (cdc2aAt) dans le tabac conduit

à la formation de plantes possédant un nombre restreint de cellules mais présentant une

morphologie normale (Hemerly et al., 1995). A l’inverse, chez Arabidopsis, l’expression du gène

de cycline A (cyc1aAt), sous le contrôle du promoteur de cdc2aAt, résulte en la formation de

62
-
longues racines, qui contiennent un nombre accru de cellules, mais dont la morphologie globale

n’est pas affectée (Doerner et al., 1996). Les mutants de l’embryogenèse titan1, chez lesquels

la mitose est affectée, sont constitués de cellules géantes, mais possèdent une forme voisine

de celle des embryons normaux, ce qui suggère que la croissance et la morphogenèse seraient

également découplées du cycle cellulaire chez les embryons (Liu et Meinke, 1998).

Il faut cependant noter que les jeunes plantules de tabac exprimant le gène cdc2a muté

non fonctionnel présentent initialement des anomalies prononcées de développement (Hemerly

et al., 1995). Des résultats préliminaires indiquent que les embryons d’Arabidopsis qui

expriment ce même gène muté sous le contrôle d’un promoteur spécifique de l’embryogenèse ne

germent pas ou se développent en de jeunes plantules anormales. L’interprétation de ces

résultats reste difficile en l’absence d’une analyse détaillée de la morphologie des embryons

précoces (De Veylder et al., 1998). Une étude récente démontre le rôle de cdc2bAt dans la

morphogenèse de la plantule d’Arabidopsis à l’obscurité (Yoshizumi et al., 1999). L’expression

de cdc2b est corrélée à l’élongation de l’hypocotyle et l’inhibition de cdc2b par des ARNm

antisens conduit, à l’obscurité, à la formation d’une plantule à hypocotyle court et cotylédons

ouverts. Ce phénotype correspond à celui que les plantules adoptent normalement en lumière

et résulte d’une élongation restreinte de l’hypocotyle plutôt que de la diminution du nombre de

cellules. Cdc2b interviendrait également dans la différenciation des plastes. L’expression de

cdc2b est cantonnée aux cellules en prolifération et fluctue au cours du cycle (Segers et al.,

1996), ce qui suggère que cdc2b pourrait assurer un rôle de coordinateur entre la régulation du

cycle cellulaire et le développement. Néanmoins, le rôle de cdc2b dans la progression au cours

du cycle cellulaire n’a, à ce jour, pas été clairement défini. Il reste donc à déterminer si cette

protéine, apparentée aux CDK, joue un rôle exclusivement lors du développement, à l’image de

cdk5 dans le développement neuronal animal, ou si elle intervient également dans la régulation

du cycle cellulaire. L’intervention d’inhibiteurs du cycle dans le contrôle de la différenciation a été

récemment illustré chez Medicago sativa. L’inhibiteur mitotique ccs52 est nécessaire à la

commutation du programme de division au programme de différenciation des nodules rhizoïdien,

lors de la symbiose entre Rhizobium meliloti et Medicago sativa (Cebolla et al., 1999). Aussi, si

la plupart des résultats obtenus à ce jour indique que la morphogenèse serait indépendante du

63
-
cycle cellulaire, ces récentes découvertes incitent à la prudence quant à une conclusion

définitive.

La coordination entre le cycle cellulaire et le développement pourrait être assurée par

des voies de signalisation en amont de la régulation du cycle cellulaire, capables d’intégrer les

multiples signaux extérieurs, auxquels les plantes répondent. En effet, le nombre anormalement

élevé de cellules dans les méristèmes floraux et apicaux des mutants clavata, chez lesquels

des désordres morphologiques sont également observés, laisse supposer l’existence de

mécanismes de coordination entre cycle cellulaire et développement (Clark et al., 1993). Les

mutants shootmeristem-less présentent, quant à eux, un nombre réduit de cellules et une

réduction des organes floraux et foliaires (Clark et al., 1996). Au sein de l’organisme, les

interactions cellulaires et l’information de position, qui apparaissent prépondérantes pour la

détermination de la forme cellulaire et le contrôle du cycle cellulaire, pourraient orchestrer cette

coordination. Ainsi, l’ablation de cellules spécifiques par faisceau laser, réalisée chez

Arabidopsis et dans l’embryon de Fucus, démontre que les cellules avoisinantes sont capables

d’enclencher un nouveau programme de division et de différenciation pour remplacer les cellules

manquantes, avec une efficacité variable selon leur position dans la plante ou l’embryon (Van

den Berg et al., 1995; Bouget et al., 1998).

D.3. CYCLE CELLULAIRE ET MORPHOGENESE CHEZ LES ASCOMYCETES

Les levures bourgeonnantes sont des organismes chez lesquels une étroite coordination

entre le cycle cellulaire et les événements morphogénétiques a été mise en évidence. Lors de la

conjugaison, l’arrêt du cycle cellulaire est rendu possible par l’activation transcriptionnelle de la

CKI FAR1, qui est directement enclenchée par la voie des MAP kinases, en réponse aux

phéromones (Kron et Gow, 1995) (figure 16). De même, la régulation de la synthèse de la

cycline CLN3, en fonction de la qualité du milieu nutritionnel, permet l’arrêt du cycle et du

bourgeonnement et l’entrée des levures en phase stationnaire. La qualité du milieu nutritif

intervient sur le niveau d’expression de la cycline CLN3, tandis que la croissance cellulaire

contrôle le niveau de traduction des ARNm de CLN3 (Polymenis et Schmidt, 1997; Parviz et

Heideman, 1998). Le cycle cellulaire et le bourgeonnement sont deux événements très

64
-
synchronisés chez la levure (figure 18 A) (revue par Cid et al., 1995). La sélection du site de

bourgeonnement a lieu en phase G1 tardive, l’émergence du bourgeon, qui est précédé par la

localisation de l’actine et des autres composants marquant le site de bourgeonnement, s’effectue

juste après le point de restriction “START”. La croissance du bourgeon s’étend sur les phases

G 1 tardive, S, et G2 et implique une commutation de la croissance apicale en une croissance

isotrope du bourgeon. La mutation de CDC42 ou CDC24 provoque un retard important à

l’entrée en phase G2, bien qu’elle autorise le déroulement des événements de division nucléaire.

Ce retard constitue un mécanisme de surveillance supplémentaire du cycle cellulaire par la

morphogenèse et fonctionne principalement par la phosphorylation inhibitrice de CDC28, par la

kinase SWE1, sur le résidu tyrosine 19 (Lew et Reed, 1995). Une étude récente suggère que

les défauts dans l’organisation de l’actine sont à l’origine de l’activation de ce point de contrôle

(McMillan et al., 1998).

De plus, il existe chez la levure, un contrôle réciproque de la morphogenèse par les

événements du cycle cellulaire (figure 18 B). La polymérisation de l’actine au site de

bourgeonnement nécessite l’activité des complexes CDC28/CLN à la transition G1/S (Lew et

Reed, 1993). L’activation de CDC28/CLN déclenche la polymérisation de l’actine et

l’accumulation prématurée de CLN conduit au bourgeonnement précoce en G 1, et ceci en

l’absence de traduction, ce qui suggère que CDC28/CLN régule directement la mise en place du

site de pré-bourgeonnement (figure 18 B). Chez les levures en phase G2, l’activation de CDC28

par les cyclines mitotiques causent la dépolymérisation de l’actine à l’apex du bourgeon.

L’absence de cette activation conduit à l’hyperpolarisation et à la formation de bourgeons très

allongés. CDC28/CLB, semble donc jouer un rôle dans la commutation de la croissance apicale à

la croissance isotrope du bourgeon. L’inactivation des complexes mitotiques serait, quant à elle,

responsable de la redistribution des structures d’actine du site de bourgeonnement au site de

cytodiérèse (sous forme de collier). Ces résultats démontrent le rôle essentiel de CDC28 dans la

régulation du bourgeonnement. Les substrats de CDC28 intervenant dans la réalisation de ces

événements morphogénétiques ne sont pas connus. Il faut cependant noter que la kinase

STE20 est phosphorylée par CDC28/CLN1-2 au site de bourgeonnement bien que cette

phosphorylation ne semble pas influer sur son activité. Cette phosphorylation est, cependant,

65
-
Figure 18 : Cycle cellulaire et morphogenèse chez S. cerevisiae

Croissance pseudohyphale
A

Conjugaison

D’après Johnson, 1999.

Distribution de l’actine corticale

Sécrétions D’après Lew et Reed, 1993.

A. Représentation schématique des événements morphogénétiques en corrélation avec le

cycle cellulaire (voir texte principal). B. Modèle du rôle des complexes CDC28/cycline dans le
contrôle des transitions morphogénétiques au cours du cycle cellulaire. L’activation de
CDC28/CLN au point "START " déclenche la polarisation de l’actine corticale au site de pré-
bourgeonnement (a, a ’). L’activation de CLB1,2 en G2 déclenche la dépolarisation de l’actine
corticale et des sécrétions (c). L’inactivation de CDC28 en fin de mitose déclenche la
redistribution de l’actine corticale et des sécrétions dans la région du collier, ce qui permet la
cytokinèse (e). Deux autres transitions, à savoir, (b) la redistribution de l’actine corticale au
sein du bourgeon, et (d) dans la cellule mère pourraient être également sous le contrôle de
CDC28.
corrélée à la répression de la voie de la signalisation par les phéromones et pourrait jouer le rôle

de commutateur entre les réponses cellulaires mitotiques et celles de la conjugaison (Wu et al.,

1998).

Chez Aspergillus nidulans, la formation de conidies à partir du mycélium implique des

commutations de croissance apicale vers une croissance par bourgeonnement ainsi qu’un

découplage entre la mitose et la septation dans certaines parties du conidiophore. Une étude

récente, démontre que NIMXcdc2, l’homologue de cdc2, joue un rôle primordial dans la formation des

conidiophores et des conidies. L’activité de NIMX cdc2 est requise pour la formation de conidies et

dépend spécifiquement de la régulation transcriptionnelle de NIMXcdc2. De plus, la régulation de

NIMXcdc2 par phosphorylation sur tyrosine est essentielle à la structuration correcte des

conidiophores et à la formation des conidies. Cette régulation par phosphorylation n’est pas

essentielle pour la progression au cours du cycle cellulaire mais intervient, en partie, lors de

l’activation des points de contrôle. Comme chez la levure bourgeonnante, la régulation de

NIMXcdc2 par phosphorylation pourrait constituer un moyen de coordonner le cycle cellulaire et la

morphogenèse (Ye et al., 1999).

66
-
 IV. OBJECTIFS DE LA THESE

Chez le zygote de Fucus, la mise en place de l’axe de polarité et son expression

morphogénétique (la germination) se produisent au cours du premier cycle cellulaire (0-24 h). De

plus, la majorité des traitements inhibant la germination induisent un retard de la division. Ces

observations amènent naturellement à se poser la question quant aux liens potentiels existants

entre les événements du cycle cellulaire et ceux de la polarisation.

D’autre part, l’ensemble des résultats obtenus sur l’étude de la polarisation donnent une

image fragmentaire du phénomène, où le calcium intracellulaire est la seule molécule signalisatrice

potentiellement impliquée dans la polarisation. Enfin, l’importance même de la polarisation du

zygote pour le modelage de l’embryon, bien qu’implicitement reconnue par les chercheurs

travaillant sur ce modèle, reste à préciser. Nous avons donc voulu savoir si des protéines

kinases intervenaient dans la polarisation et/ou dans le développement de l’embryon de Fucus.

A. C ARACTERISATION DU PREMIER CYCLE CELLULAIRE DE F UCUS SPIRALIS

Nous nous sommes attachés dans un premier temps à caractériser les phases du cycle

cellulaire par l’utilisation conjointe d’outils pharmacologiques, cellulaires et biochimiques. Nous

avons évalué le rôle des CDK dans la progression du premier cycle cellulaire et les mécanismes

de surveillance intervenant dans ce cycle. Les deux premiers articles répondent donc à des

questions s’adressant directement au cycle cellulaire à savoir :

Quelle est la localisation temporelle des phases S et M ? (Chapitre I et II)

Quelles sont les dépendances entre la phase S et M ? (Chapitre I)

Quels événements du cycle cellulaire sont contrôlés par les CDK? (Chapitre I et II)

Comment ces CDK sont-elles régulées? (Chapitre I et II)

67
-
 B. LE CYCLE CELLULAIRE REGULE - T - IL LA POLARISATION ZYGOTIQUE ?

Nous nous sommes intéressés aux liens entre le cycle cellulaire et le développement et

avons voulu savoir s’il existe un contrôle de la polarité par le cycle cellulaire. Pour ce faire, nous

avons défini la corrélation temporelle entre les phases du cycle cellulaire et les événements de

polarisation et avons plus particulièrement étudié l’influence de l’activité des CDK sur la

polarisation (Chapitre III).

C. E XISTE - T - IL UN CONTROLE DE LA POLARISATION PAR LES KINASES ?

Le dernier chapitre relate une étude qui précise le rôle des kinases dans la polarisation

précoce du zygote. Les résultats obtenus permettent de déterminer l’importance de

l’établissement d’un axe zygotique pour le modelage de l’embryon. Ces travaux, réalisés au

cours des premières années de ma thèse, précèdent dans le temps les études concernant la

coordination cycle cellulaire et développement. La question de l’existence d’éventuelles

interactions entre la polarisation et le cycle cellulaire y apparaît donc peu mais est plus

amplement discuté dans la conclusion.

68
-
RESULTATS et DISCUSSIONS
ARTICLE 1 :

UN POINT CONTROLE S/M INHIBE LES EVENEMENTS NUCLEAIRES ET

CYTOPLASMIQUES DE LA DIVISION CELLULAIRE, INCLUANT L’ALIGNEMENT DE

L’AXE DES CENTROSOMES AVEC L’AXE DE POLARITE, ET INHIBE L’ACTIVATION

DES KINASES DEPENDANTES DES CYCLINES DANS LES EMBRYONS

PRECOCES DE FUCALES

Cet article met en évidence les relations entre la réplication de l’ADN et la mitose dans les

zygotes de Fucales. Alors que dans les cellules somatiques et chez les levures, ces événements

sont étroitement dépendants, chez les embryons animaux, le couplage réplication/mitose fait

souvent défaut. Nous avons analysé les répercutions de l’inhibition de la réplication sur les

événements cellulaires et biochimiques de la mitose. En absence de réplication, la rupture de

l’enveloppe nucléaire ainsi que la condensation des chromosomes n’ont pas lieu et la formation

du fuseau mitotique est inhibée. Nous avons voulu connaître les cibles moléculaires de ce point

de contrôle. Nous avons établi qu’il existe une corrélation entre l’état de phosphorylation sur

tyrosine des deux CDK à motif PSTAIRE de 32 et 34 kDa, qui sont liées par la protéine p9 CKS, et

l’activité CDK au cours de la progression normale dans le cycle. Les événements mitotiques, tels

que la rupture de l’enveloppe nucléaire et la formation du fuseau, sont dépendants de

l’augmentation de l’activité CDK qui coïncide avec la déphosphorylation sur tyrosine des deux

CDK. L’activation du point de contrôle de la réplication empêche la déphosphorylation des deux

CDK mitotiques et en conséquence, la mitose. In vitro, la déphosphorylation par cdc25 des CDK

d’extraits de zygotes dont la réplication est bloquée, résulte en une augmentation de l’activité

kinasique jusqu’à un niveau mitotique, ce qui suggère, que la régulation de l’activité des CDK par

le point de contrôle de réplication de l’ADN s’opère principalement par un mécanisme faisant

intervenir la phosphorylation inhibitrice sur résidu tyrosine. La réplication de l’ADN contrôle, de

69
-
surcroît, l’alignement correct du fuseau mitotique avec l’axe de polarité du zygote selon un

mécanisme indépendant des CDK.

Cet article est sous presse dans la revue “Development”.

RESUME

Le point de contrôle de la réplication de l’ADN, S/M, empêche différents événements de la

division cellulaire lorsque l’ADN n’est pas répliqué. Ce point de contrôle est particulièrement

efficace chez les levures et dans les cellules somatiques animales mais fait souvent, partiellement

ou totalement défaut aux embryons animaux. Du fait du peu de données sur le point de contrôle

S/M chez les cellules et les embryons végétaux, nous avons étudié l’effet de l’aphidicoline, un

inhibiteur spécifique des ADN polymérases α et δ, sur la division cellulaire et la morphogenèse

des zygotes de Fucus et Pelvetia. La réplication et la division cellulaire sont, toutes deux

inhibées par l’aphidicoline, ce qui indique l’existence du point de contrôle S/M chez les zygotes

de fucales. Ce point de contrôle empêche la condensation des chromosomes, la formation du

fuseau mitotique, l’alignement des centrosomes avec l’axe de croissance du zygote et la

cytodiérèse mais n’a pas d’effet sur la germination et l’élongation du rhizoïde. Ce point de contrôle

empêche également, la déphosphorylation de résidus tyrosine de kinases apparentées aux

kinases dépendantes des cyclines (CDK) lors de l’entrée en mitose. L’activité mitotique des

kinases de zygotes traités par l’aphidicoline, est restaurée par un traitement par la phosphatase

cdc25. Lorsque l’olomoucine, un inhibiteur spécifique des CDK, est ajouté aux zygotes en phase

S, il produit les mêmes effets que l’aphidicoline sur la division cellulaire mais l’axe des

centrosomes peut s’aligner avec l’axe de polarité. Nous proposons un modèle de fonctionnement

du point de contrôle S/M dans les zygotes et les embryons de Fucales, qui fait intervenir

l’inactivation des CDK.

70
-
ARTICLE II :

LE CYCLE CELLULAIRE DU ZYGOTE DE FUCUS PRESENTE DES PARALLELES

AVEC LE CYCLE DES CELLULES SOMATIQUES

Dans cet article, nous avons étudié l’importance des CDK pour la réalisation des

événements du premier cycle cellulaire de Fucus et appréhendé les mécanismes de régulation de

l’activité des CDK. Des études similaires ont été réalisées chez les embryons animaux comme

l’oursin ou le xénope, en revanche il n’existe que peu de données biochimiques sur les

régulations des CDK dans les systèmes végétaux, et aucune en ce qui concerne les embryons

végétaux. Aussi, ce travail, apporte-t-il de précieuses informations fonctionnelles sur la régulation

du cycle cellulaire embryonnaire chez les végétaux et vient compléter l’étude précédente

(chapitre I). Au contraire du cycle cellulaire embryonnaire des animaux, le cycle cellulaire du

zygote de Fucus présente les caractéristiques d’un cycle cellulaire de cellule somatique, à cette

particularité près, que les CDK sont synthétisées progressivement après la fécondation à partir

d’ARNm maternels. Au cours du cycle cellulaire, la régulation de l’activité CDK par

phosphorylation sur tyrosine, semble occuper une place prépondérante.

Cet article a été soumis au journal “Plant Cell”.

RESUME

Lors de la progression dans le cycle cellulaire des cellules eucaryotiques, beaucoup

d’événements cellulaires sont contrôlés par les kinases dépendantes des cyclines qui constituent

souvent les cibles moléculaires des points de contrôle. Nous avons précédemment caractérisé un

point de contrôle de la réplication de l’ADN, S/M, qui, par opposition à ce qui existe dans les

embryons animaux, est drastique dans les zygotes de Fucales. Dans cette étude, nous

déterminons, plus précisemment, l’implication des protéines kinases dépendantes des cyclines

71
-
(CDK) dans le contrôle du cycle cellulaire zygotique et leur régulation chez Fucus. La synthèse

des deux CDK à motif PSTAIRE, p32 et p34, ainsi que l’activité de phosphorylation de l’histone

H1, sont toutes deux enclenchées à la suite de la fécondation mais indépendamment de la

caryogamie et sont régulées au niveau traductionnel. En revanche, l’activité mitotique des CDK

dépend de la transcription d’un régulateur positif. Un dérivé de purine, l’olomoucine, inhibe

l’activité des protéines apparentées aux CDK, in vivo comme in vitro, induit des arrêts du cycle

cellulaire aux deux transitions, G1/S et G 2/M ainsi qu’en mitose et provoque la décondensation de

la chromatine chez des zygotes bloqués en mitose. Enfin, quels que soient les arrêts du cycle

cellulaire provoqués par l’olomoucine, la synthèse des CDK s’effectue normalement alors que la

déphosphorylation activatrice sur tyrosine des CDK est inhibée. In vitro, la déphosphorylation

par cdc25, des CDK provenant de zygotes bloqués à différents stades par l’olomoucine, conduit

à une activation des CDK jusqu’à un niveau comparable au niveau mitotique. L’ensemble des

ces résultats suggère, que, chez Fucus, le cycle cellulaire zygotique ressemble au cycle cellulaire

somatique, c’est à dire, que des CDK, elles-mêmes régulées au niveau de leur synthèse et par

phosphorylation, contrôlent étroitement le cycle cellulaire.

72
-
ARTICLE III :

LE CONTROLE DU DEVELOPPEMENT PRECOCE DU ZYGOTE DE FUCUS EST

DEPENDANT DU CYCLE CELLULAIRE PAR L’INTERMEDIAIRE D’UNE PROTEINE

DE TYPE CDK.

Savoir comment la morphogenèse et le cycle cellulaire sont coordonnés au cours du

développement des organismes est une question cruciale en biologie du développement. Les

connaissances actuelles acquises chez les animaux et les végétaux, indiquent que la régulation

de ces deux événements fondamentaux, que sont la morphogenèse et le cycle cellulaire,

s’effectuerait en amont des acteurs spécifiquement impliqués dans chacun de ces phénomènes et

que les interactions directes entre ces acteurs seraient réduites. En revanche, chez les levures,

les acteurs principaux du cycle cellulaire tels que CDC28 ou NIMXcdc2 interviennent directement

dans le contrôle des événements morphogénétiques, à savoir la formation des bourgeons ou des

conidies. Il n’existe que très peu de données sur les relations entre le cycle cellulaire et

l’embryogenèse des végétaux. Nous avons voulu connaître l’implication du cycle cellulaire dans

la polarisation et la morphogenèse précoce du zygote de Fucus. Il ressort de cette étude que la

formation de l’axe de polarité et la phase S sont concomitantes et vraissemblablement

dépendantes de l’activité de la CDK p34.

Cet article sera très prochainement soumis à la revue “Development”.

RESUME

Bien que le développement itératif puisse être découplé de la morphogenèse dans les

organes de plantes, la relation entre le cycle cellulaire et les événements du développement n’est

pas clairement établi chez les embryons. Les zygotes libres des algues de la classe des

Fucales, qui comportent les genres Fucus et Pelvetia, se prêtent bien à l’étude des interactions

73
-
entre la progression dans le cycle cellulaire et la morphogenèse précoce, car l’établissement de la

polarité embryonnaire, ainsi que son expression morphogénétique, la germination, et le premier

cycle cellulaire sont concomitants. Nous avons, récemment démontré que la progression au cours

du cycle cellulaire était sous le contrôle étroit de protéines de type CDK, dont deux CDK à motif

PSTAIRE, p34 et p32, qui sont synthétisées à la suite de la fécondation. Dans la présente

étude, nous montrons que l’inhibition spécifique des protéines de type CDK, soit par des

composés dérivés de purine tels que l’olomoucine et le purvalanol, soit par l’inhibiteur p21 Cip1

microinjecté, empêche la germination et la division cellulaire. L’olomoucine inhibe spécifiquement la

formation de l’axe de polarité et l’entrée en phase S, deux événements qui sont concomitants.

L’anticorps monoclonal anti-PSTAIRE empêche également la germination et la division cellulaire

lorsqu’il est injecté précocement lors du cycle cellulaire et seule p34 présente une affinité pour le

purvalanol, ce qui suggère que cette protéine contrôle la polarisation et la morphogenèse. Nous

proposons différents modèles pour rendre compte du contrôle simultané de la progression

précoce dans le cycle cellulaire et de la polarisation.

74
-
ARTICLE IV :

L’INHIBITION DE L’ETABLISSEMENT DE LA POLARITE ZYGOTIQUE PAR DES

INHIBITEURS DE PROTEINES TYROSINE-KINASES PERTURBE LE MODELAGE DE

L’EMBRYON CHEZ FUCUS

L’étude exposée ci-dessous, a été réalisée précédemment aux travaux sur le cycle

cellulaire. J’ai jugé opportun de l’insérer dans ce manuscrit pour plusieurs raisons. Tout d’abord

elle démontre l’importance de la polarisation précoce pour le modelage de l’embryon et peut être

mise en relation avec les résultats du troisième chapitre, qui montrent que la CDK p34 contrôle la

formation de l’axe de polarité. De plus, elle met en évidence que des kinases, différentes des

CDK, sont impliquées dans le contrôle de la formation de l’axe. En effet, l’inhibition de ces kinases

n’empêche pas la division cellulaire. En revanche, il faut souligner ici que l’inhibition de ces

kinases et, en conséquence, celle de la formation de l’axe de polarité, retarde significativement la

division. Chez S. cerevisiae, les défauts de la polarisation du cytosquelette d’actine retardent le

cycle cellulaire en agissant sur l’activité de CDC28. A la lumière des données exposées

précédemment et des connaissances acquises sur S. cerevisiae, le retard de division observé

chez les zygotes de Fucus dont la polarisation est inhibée, soulève la question d’une régulation

du cycle cellulaire par les événements de polarisation. Cette question est discutée dans la

conclusion générale de ce manuscrit.

Ce travail fait l’objet d’un article sous presse dans la revue “Developmental Biology”.

RESUME

Les algues de la classe des Fucales, qui comprennent les genres Fucus et Pelvetia, sont

des modèles biologiques reconnus pour l’étude de l’embryogenèse végétale. En particulier, les

zygotes de Fucales sont très bien adaptés pour étudier l’établissement de la polarité ainsi que

75
-
l’importance de la polarisation pour l’embryogenèse. Cependant, les voies de transduction

impliquées dans le processus précoce de polarisation sont encore mal définies, et le lien entre la

polarisation précoce et le modelage de l’embryon à long terme n’a jamais été démontré de manière

expérimentale. En conséquence, nous avons voulu déterminer le rôle potentiel de la

phosphorylation des protéines dans la régulation de l’embryogenèse précoce, par l’utilisation

combinée d’approches pharmacologiques et biochimiques. Parmi les différents inhibiteurs de

protéine kinases que nous avons testés, un sous groupe d’inhibiteurs de protéines tyrosine-

kinases (PTK), incluant la génistéine, empêche la germination mais n’a aucun effet sur la

croissance rhizoïdienne chez des embryons germés. L’inhibition de la germination apparaît être

une conséquence directe de l’inhibition de la polarisation, car la génistéine ainsi que d’autres

inhibiteurs de PTK, inhibent spécifiquement la formation de l’axe de polarité, selon un mécanisme

indépendant de la lumière. La génistéine inhibe des événements cellulaires associés à la

polarisation, tels que la sécrétion polarisée de composés pariétaux sulfatés. L’ancrage du

cytosquelette d’actine au pôle rhizoïdien est également inhibé et les microfilaments d’actine se

redistribuent en réponse à un nouveau vecteur lumineux. Les zygotes, dont le processus de

polarisation est inhibé sur une période couvrant la formation de l’axe, récupèrent du traitement et

présentent des structures différenciées quelques jours après le traitement. Toutefois,

l’organisation spatiale de ces structures est profondément affectée, ce qui suggère que le

processus précoce de polarisation est essentiel au modelage normal de l’embryon. L’analyse en

immuno-blot de la phosphorylation des protéines met en évidence que le profil de

phosphorylation change au cours du développement et est perturbé chez des zygotes traités

par la génistéine. In vitro, la génistéine inhibe également l’autophosphorylation des protéines. A

la lumière de ces résultats, nous discutons de la nature des kinases sensibles à la génistéine, qui

sont requises pour la polarisation et le modelage de l’embryon à long terme.

76
-
CONCLUSION et PERSPECTIVES
 CONCLUSION ET PERSPECTIVES

A.1. LES CDK CONTROLENT DE NOMBREUX EVENEMENTS DU CYCLE

CELLULAIRE ET CONSTITUENT UNE CIBLE MAJEURE DES MECANISMES DE

SURVEILLANCE

La progression de l’embryon de Fucus dans le premier cycle cellulaire est sous le contrôle

strict des CDK, dont l’activité est nécessaire à la réplication de l’ADN, la rupture de l’enveloppe

nucléaire, la formation du fuseau mitotique, la condensation des chromosomes (et leur

décondensation) et la cytodiérèse (articles I et II). L’inhibition de la réplication de l’ADN et de

l’assemblage du fuseau mitotique, respectivement par l’aphidicoline et le nocodazole, conduit à un

arrêt du cycle cellulaire en phase S et M, et témoigne de l’existence de mécanismes de

surveillance usuels chez le zygote de Fucus.

La figure 19 récapitule les différents arrêts du cycle cellulaire provoqués par les principaux

inhibiteurs pharmacologiques utilisés.

A.2. I DENTITE DES CDK RESPONSABLES DE LA PROGRESSION AU COURS DU

CYCLE CELLULAIRE

L’utilisation de la protéine p9CKS humaine pour la purification des CDK de Fucus, et de

l’histone H1 comme substrat de ces CDK, est susceptible d’introduire un double biais. En effet,

certaines CDK, intervenant essentiellement en G1 et S, ne possèdent pas d’affinité pour p9CKS

et/ou phosphorylent mal l’histone H1 (Magyar et al., 1993; Azzi et al., 1994; Pines, 1996).

L’utilisation de l’actinomycine D, inhibiteur transcriptionnel, nous a permis de découpler une

activité H1 kinase précoce, qui est indépendante de la transcription, de l’activité mitotique, qui est,

pour sa part, dépendante de la transcription d’un régulateur positif (chapitre II). La faible activité

H1 kinase, qui ne dépend pas de la transcription, augmente progressivement au cours des

phases précoces G1 et S, ce qui suggère que la protéine p9CKS lie certaines CDK de phases

77
-
 Figure 19 : Schéma récapitulatif des différents
outils pharmacologiques et cellulaires utilisés pour
situer et déterminer les événements du cycle
cellulaire du zygote de Fucus spiralis.

22-24 h Oh

M
G1
Olomoucine 35 M

CDK - Anticorps anti-PSTAIRE

(à 1 h AF)
- P21cip1
Nocodazole - Olomoucine 100 M
Formation du fuseau

Rupture de l’enveloppe
nucléaire et condensation
CDK
des chromosomes CDK
Transcription des gènes
16-18 h d’histones
5-6 h
Olomoucine 100 M

Aphidicoline
G2
S

10-12h

La coloration des noyaux à la mithramycine A permet de suivre les événements

nucléaires et de déterminer par quantification au microscope confocal, l’état 2C
ou 4C de l’ADN, à la suite des traitements par les inhibiteurs pharmacologiques.
Conjointement, l’analyse biochimique des protéines liées à la p9Cks et l’analyse
moléculaire de la transcription de l’histone H3 permettent d’appréhender la
progression du zygote dans le cycle cellulaire ainsi que le rôle des CDK pour
cette progression. Les résultats sont décrits et discutés dans le texte principal.
précoces. Il serait intéressant d’étudier la capacité des CDK liées à la protéine p9 CKS à

phosphoryler la protéine du rétinoblastome, qui est un substrat préférentiel des complexes

CDK/cycline de phase G1 et S (Guttierez, 1998). Ces expériences pourraient nous renseigner

sur la fonction des CDK précoces liées à p9CKS et permettre de dissocier les activités des phases

G 1/S et M. D’ores et déjà, plusieurs résultats plaident en faveur de l’implication majeure de la

CDK à motif PSTAIRE de 34 kDa dans la transition G1/S. Le purvalanol, inhibiteur de la même

famille que l’olomoucine qui bloque la transition G1/S, lie la CDK PSTAIRE de 34 kDa, p34, et non

celle de 32 kDa, tout au long du développement, y compris en phase G1 et S, ce qui désigne p34

PSTAIRE comme une cible majoritaire de ce type d’inhibiteur. De plus, la microinjection précoce

d’anticorps anti-PSTAIRE inhibe la germination et la division, de la même manière que l’application

précoce de purvalanol ou d’olomoucine (chapitre III). Il est donc probable que ces zygotes soient

stoppés en G 1, ce qui signifierait que la CDK PSTAIRE est essentielle à la transition G 1/S.

L’analyse du contenu en ADN des zygotes inhibés par l’anticorps anti-PSTAIRE, qui serait

nécessaire à la confirmation de cette hypothèse, est malheureusement difficile.

Les questions énoncées ci-dessus concernent, dans une moindre mesure, les CDK

mitotiques. En effet, l’affinité de la protéine p9CKS pour les CDK mitotiques est connue dans la

plupart des systèmes biologiques (Brizuela et al., 1987; Hadwiger et al., 1989; Richardson et al.,

1990; Patra et Dunphy, 1996; De Veylder et al., 1997). Chez les végétaux, la liaison aux CDK

de l’homologue de la p9 CKS, CKS1, serait nécessaire au cycle mitotique et lors des cycles

d’endoréplication (Jacqmard et al., 1999). Chez Fucus, l’activité H1 kinase, liée à p9CKS, présente

une activité mitotique importante. D’autre part, l’affinité du purvalanol pour p34 dans les extraits

mitotiques (chapitre III), et la similitude de profil d’activité H1 kinase entre les extraits dépourvus

de p32 et les extraits témoins au moment de la mitose (chapitre II), laisse supposer que p34

remplirait un rôle majeur, également en mitose. Cette protéine, à l’image de CDC28 de levure et

de cdc2a d’Arabidopsis thaliana, serait donc essentielle aux deux transitions G1/S et G 2/M. Son

association avec des cyclines spécifiques de chaque phase lui confèrerait sa spécificité. La

fonction de la CDK PSTAIRE de 32 kDa, qui n’est pas liée in vitro par le purvalanol, reste à

élucider.

78
-
 Il est possible que d’autres CDK non PSTAIRE puissent également participer à la

phosphorylation de l’histone H1. En effet, d’autres protéines sont liées par les billes de p9CKS.

Notamment, une bande à 31 kDa est visible sur le profil de protéines éluées à partir de billes de

p9 CKS et à partir de billes de purvalanol. Cependant, les changements majeurs de

phosphorylation sur tyrosine, qui sont étroitement corrélés aux variations de l’activité CDK

globale, sont observés sur les seules CDK PSTAIRE, pour des poids moléculaires compris entre

30 et 45 kDa (articles I et II). Ces données confortent l’idée que p34 serait la principale protéine

liée à p9 Cks impliquée dans le contrôle du cycle cellulaire. Néanmoins, nous ne pouvons pas

exclure l’existence éventuelle d’autres CDK non-PSTAIRE, sur lesquelles il n’y aurait pas de

phosphorylation sur tyrosine, et/ou de CDK PSTAIRE n’ayant d’affinité ni pour p9CKS ni pour le

purvalanol. Dans les deux cas, ces éventuelles CDK pourraient avoir un rôle dans la

progression dans le cycle.

A.3. LE CLONAGE DES ADN C DE CDK DE FUCUS OUVRIRAIT DE NOMBREUSES

PERSPECTIVES

Chez Fucus, les deux bandes reconnues par l’anticorps anti-PSTAIRE ne sont

malheureusement pas identifiées avec certitude. Plusieurs essais de microséquençage de ces

protéines sont restés infructueux du fait de la faible quantité de matériel disponible et de la pureté

insuffisante des extraits protéiques élués à partir des billes de p9 CKS. Une analyse en gel

d’électrophorèse bidimensionnelle pourrait permettre, dans un premier temps, de savoir s’il

n’existe réellement que deux CDK PSTAIRE, mais à terme le clonage d’ADNc de Fucus serait

primordial pour l’identification des CDK PSTAIRE ainsi que d’éventuelles autres CDK. Le clonage

d’ADNc de CDK ouvrirait des champs d’investigation variés, dont l’un des plus intéressants

serait d’étudier les potentialités des ADNc des deux CDK PSTAIRE à complémenter les mutants

CDC28 -/cdc2- de levures en G1/S et G 2/M. Le suivi de la transcription des gènes de CDK, au

cours du développement, pourrait également nous renseigner sur l’implication des CDK au cours

des différentes phases. En effet, chez plusieurs espèces de végétaux (Arabidopsis,

Anthirrhinum, Zea), l’activation transcriptionnelle de certaines CDK précède les phases du cycle

cellulaire dans lesquelles elles sont impliquées (Segers et al., 1996; Fobert et al., 1996; Magyar

79
-
et al., 1997). Toutefois, les transcrits des CDK PSTAIRE de Fucus semblent être présents dans

l’oosphère et la nécessité d’une transcription pour la mitose paraît plutôt concerner un régulateur

de l’activité CDK (chapitre II).

Enfin, le développement d’anticorps spécifiques pourrait permettre d’analyser l’activité et

l’expression propre de chaque CDK au cours du cycle et offrirait de nombreuses autres

possibilités d’investigations au niveau cellulaire (microinjection, localisation intracellulaire).

A.4. I NTERVENTION DES CDK DANS LES E V E N E M E N T S NUCLEAIRES E T

CYTOPLASMIQUES DE LA DIVISION

A.4.1. Intervention des CDK à la transition G1/S

La réplication est inhibée par de fortes concentration d’olomoucine (chapitre II). De plus,

p21 Cip, une CKI connue pour intervenir dans l’inhibition des complexes CDK/cycline en G1 et à

l’entrée en phase S, inhibe in vitro, l’activité des extraits bloqués en G1/S et in vivo la germination

qui dépend de cette transition (chapitre III). Ces résultats suggèrent fortement l’implication des

CDK dans la transition G1/S (figure 20). Dans la plupart des systèmes eucaryotes, le rôle majeur

des CDK à cette transition, consiste à phosphoryler la protéine du rétinoblastome pour permettre

la transcription des gènes nécessaires à la phase S. Chez le zygote de Fucus spiralis, la

transcription précoce (jusqu’à 10 h AF) est nécessaire à la division (observation personnelle)

mais non à l’activité précoce de CDK liés à p9CKS (chapitre II). L’oosphère contiendrait donc tous

les ARNm nécessaires à l’activité CDK au cours des phases précoces, tout comme la plupart

des embryons animaux, chez qui les ARNm de cyclines de G1 (cycline E) sont stockés dans

l’oeuf (revue par King et al., 1994). Par analogie à ce qui est observé dans d’autres systèmes,

l’initiation de la phase de réplication pourrait dépendre de la transcription de gènes sous le

contrôle de facteur de transcription liés à une protéine apparentée à la protéine Rb. Nous avons

d’ores et déjà montré que la transcription de l’histone H3 dépend de l’activité des kinases à cette

transition (chapitre II). Pour tester cette hypothèse plus en avant, il serait nécessaire de

déterminer l’état de l’ADN (2C ou 4C) d’embryons dont la transcription est inhibée en G 1, et

d’autre part, de connaître la capacité des CDK à phosphoryler la Rb et à libérer des facteurs de

transcription qui y sont liés. La quantification de l’ADN n’est réalisable que sur des embryons de

80
-
 Figure 20 : Rôle et régulations des CDK au cours
du cycle cellulaire et fonctionnement des points
de contrôle

Y
CDK

? CDK
Y
CDK G1
M
CDK
Point de contrôle de
l’assemblage du fuseau
CDK
Cdc25
P Y Y

CDK CDK
Y
CDK
Transcription
Rotation des gènes
nucléaire d’histone H3

G2 S
Point de
P Y CDK contrôle de
réplication de
P Y Y
l’ADN
CDK CDK
Kinase

Après la fécondation, la synthèse des CDK est activée par régulation

traductionnelle. L’accumulation des CDK pourrait participer à l’augmentation de
l’activité CDK au dessus d ’un niveau seuil requis pour la transition G 1/S : la
transcription de gènes nécessaires à la phase S (histone H3) s’opère et l ’ADN
se réplique. La transcription d’un régulateur positif de CDK a lieu avant la fin de
cette phase (non représenté). Les CDK sont inactivées par phosphorylation sur
tyrosine en phase G2. En fin de phase G 2, leur activation par déphosphorylation
provoque l’entrée en mitose. L’inactivation des CDK nucléaires serait nécessaire
à la sortie de mitose, alors que l ’activité d’autres CDK serait maintenue ou
activée pour assurer la cytodiérèse. Le point de contrôle de réplication de l ’ADN
inhibe les CDK mitotiques et empêche, indépendamment des CDK, l’alignement
du fuseau mitotique avec l’axe de polarité. L’activation du point de contrôle du
fuseau, empêche l’inactivation des CDK et la sortie de mitose.
deux cellules. Il faudrait donc préalablement synchroniser les cellules en mitose en utilisant, par

exemple, le nocodazole.

A.4.2. L’assemblage du fuseau est régulé par les CDK mitotiques

L’activation du point de contrôle S/M conduit à l’inhibition des CDK mitotiques qui

semblent réguler l’assemblage correct du fuseau (figure 20) (chapitre I). En effet, l’inhibition des

CDK mitotiques par l’olomoucine, tout comme l’inhibition directe de la réplication, empêche la

formation du fuseau. Il est probable que chez Fucus, comme c’est le cas dans d’autres systèmes,

certaines protéines moteurs, qui sont nécessaires aux pontages des microtubules polaires,

soient régulées par les CDK mitotiques (Sorger et al., 1997). L’absence de rupture de

l’enveloppe nucléaire, résultant de l’inhibition des CDK mitotiques par de fortes concentrations

d’olomoucine, pourrait également empêcher physiquement les interactions microtubules-

kinétochores. Cependant, en présence de faibles concentrations d’olomoucine, bien que la

rupture de l’enveloppe nucléaire et la condensation des chromosomes aient lieu, la formation du

fuseau mitotique porrait être défectueuse car l’organisation des chromosomes est altérée. Il n’est

pas exclu que le fuseau mitotique se forme à de faibles concentrations d’olomoucine, et dans tous

les cas le blocage provoqué par les faibles concentrations d’olomoucine est différent de celui

observé avec le nocodazole. En effet, une certaine dynamique est observée. Les asters se

séparent normalement et les chromosomes condensés peuvent, au début du blocage,

s’organiser en plaque de métaphase, bien que certains d’entre eux puissent être dispersés. Par

la suite, ces chromosomes se dispersent ou sont disposés “en cercle” comme s’il existait une

tentative de ségrégation. Ces observations amènent à s’interroger sur l’efficacité du point de

contrôle de l’assemblage du fuseau et le rôle précis des CDK dans les interactions entre les

chromosomes et le fuseau. Il serait important de tester l’effet des traitements par de faibles doses

d’olomoucine sur la dynamique des microtubules. De plus, la localisation cellulaire des CDK de

Fucus apporterait des informations précieuses sur le rôle des CDK dans la dynamique du fuseau

mitotique.

La rotation du fuseau dépend, quant à elle, exclusivement des événements de réplication

et non des CDK mitotiques (chapitre I). Comme la réplication dépend elle-même des CDK de la

transition G1/S, il est fort probable que l’inhibition des CDK avant la phase S résulte en une

81
-
altération similaire de l’orientation du fuseau mitotique (chapitre II). Cependant cette hypothèse ne

peut être testée puisque les traitements qui inhibent la transition G 1/S inhibent également la

germination. En revanche, il serait intéressant d’étudier l’effet de tels traitements sur la séparation

et la duplication des centrosomes.

A.4.3. Sortie de mitose et cytodiérèse

L’activité CDK des zygotes bloqués en mitose par le nocodazole est très élevée et est

efficacement inhibée, in vitro, par l’olomoucine. Ces zygotes possèdent des chromosomes

condensés qui se regroupent au centre de la cellule et s’organisent plus rarement en plaque de

métaphase altérée, ce qui suggère un arrêt en prémétaphase (figure 20). Ce blocage résulte très

probablement de l’activation du point de contrôle de l’assemblage du fuseau. L’ajout d’olomoucine

provoque une décondensation des chromosomes, ce qui suggère que le maintien d’une activité

CDK élevée empêche la sortie de mitose. L’inhibition des CDK de Fucus serait donc un

événement nécessaire à la sortie de mitose. Lors de l’activation du point de contrôle de

l’assemblage du fuseau, l’inactivation des CDK serait inhibée. Dans les autres systèmes

biologiques, le complexe de dégradation APC/cyclosome permet la transition métaphase-

anaphase et constitue une cible du point de contrôle de l’assemblage du fuseau (Hardwick,

1998).

Ces résultats impliquent que l’inactivation des CDK soit précisément localisée dans le

noyau ou dans son voisinage, car l’activité CDK semble être requise pour la cytodiérèse qui est

postérieure à la mitose (figure 20). En effet, l’olomoucine inhibe la division lorsqu’elle est ajoutée

22 h AF, alors que le pic d’activité mitotique se situe entre 16 et 20 h AF et que la mitose se

produit vers 18 h AF. Chez les végétaux, cdc2a est trouvée en association avec la bande

préprophasique et interviendrait dans la formation de cette structure qui détermine le site de

clivage avant la mitose (Colasanti et al., 1993). Chez Fucus, cette structure n’existe pas et le

mécanisme de clivage reste mal compris. L’immunolocalisation des CDK apporterait une

information supplémentaire quant à leur rôle dans la régulation de la cytodiérèse.

82
-
 B. M ECANISMES DE REGULATION DES CDK

B.1. R EGULATION TRADUCTIONNELLE

Chez Fucus, l’activation post-fécondatoire de la synthèse des CDK rappelle celle

observée lors de la ré-entrée dans le cycle, observée chez les cellules végétales et animales

stimulées par des mitogènes. Cependant, chez Fucus, la régulation de la synthèse des CDK

s’effectue uniquement au niveau traductionnel tandis que, lors de la transition, G0/G 1, la régulation

s’effectue principalement au niveau transcriptionnel. La régulation traductionnelle des CDK de

Fucus après la fécondation, est une situation totalement différente de celle observée chez les

embryons animaux, chez qui la protéine cdc2 ayant servi à la maturation méiotique de l’ovocyte

est en quantité suffisante pour assurer les premiers cycles (Edgar, 1995; Hartley et al., 1996).

Chez la plupart des embryons, la synthèse protéique est néanmoins nécessaire à

l’accomplissement du premier cycle (Waagenar, 1983; Minshull et al.,1989). La traduction de la

cycline B à partir d’ARNm maternels est nécessaire et suffisante pour la réalisation de cycles

embryonnaires rapides. En effet, la synthèse de la cycline B est indispensable à l’activité du

MPF (Murray et al., 1989; Murray et Kirschner, 1989; Arion et Meijer, 1989; Meijer et al., 1989;

Hartley et al., 1996). Dans l’ovocyte de xénope, au cours de la maturation méiotique, le facteur de

traduction eIF-4, intervient dans le recrutement spécifique de l’ARNm de la cycline B et de c-mos,

deux protéines qui sont nécessaires à la maturation méiotique (Keiper et al., 1999), ce qui

suggère que la régulation traductionnelle de la synthèse de certains acteurs du cycle cellulaire

pourrait avoir un rôle important dans la régulation de la progression du cycle cellulaire.

Chez Fucus, le niveau des CDK augmente jusqu’à 12 heures après la fécondation. La

signification de cette régulation traductionnelle par rapport à d’autres régulations post-

traductionnelles éventuelles n’est pas déterminée. Il est néanmoins concevable que la régulation

traductionnelle de la synthèse des CDK conduise à une accumulation de ces protéines jusqu’à un

niveau seuil où leur activité serait suffisante pour déclencher la transition G1/S. Des expériences

préliminaires, réalisées en collaboration avec P. Cormier, suggèrent l’existence du facteur eIF-4F

chez Fucus, et il serait intéressant d’étudier le rôle de ce facteur dans la régulation de la traduction

des CDK après la fécondation.

83
-
 B.2. R EGULATION TRANSCRIPTIONNELLE DE L ’ ACTIVITE MITOTIQUE

Nous avons mis en évidence que l’inhibition de la transcription n’influence pas la

synthèse des CDK PSTAIRE au cours du développement précoce, mais inhibe le pic mitotique

d’activité H1 kinase. Ce résultat suggère que l’activité mitotique dépendrait d’un régulateur positif

soumis à une régulation transcriptionnelle. Chez Fucus spiralis, la transcription est nécessaire

jusqu’à 10 heures pour que le premier clivage puisse s’effectuer (observation personnelle), ce

qui laisse supposer que le régulateur mitotique serait transcrit avant la phase G2, mais ne

pourrait être efficace qu’en mitose. Dans les cellules somatiques, les cyclines sont soumises à un

contrôle transcriptionnel, qui, de concert avec leur dégradation programmée, permet la formation de

complexes CDK/cyclines au moment adéquat. A ce mécanisme, s’ajoute un contrôle post-

traductionnel du complexe par phosphorylation. Il est concevable que des cyclines mitotiques

soient transcrites durant la phase G1 et/ou S chez le zygote de Fucus et qu’elles s’associent aux

CDK pour former des complexes mitotiques. L’inhibition de ces complexes par phosphorylation

sur tyrosine, en phase S, permettrait de retarder leur activation jusqu’en mitose (figure 20). Une

expérience très préliminaire laisse présager que des cyclines de Fucus sont reconnues par un

anticorps anti-cycline de large spécificité. Cet anticorps révèle une bande d’environ 60 kDa, dont

le niveau, faible jusqu’à 8 h AF, augmente fortement à 12 h AF (début de G2). Nous projetons de

réitérer cette expérience au delà de ce stade de développement et de réaliser une

immunoprécipitation avec cet anticorps, afin de réaliser un test d’activité H1 kinase et

l’immunodétection d’éventuelles CDK PSTAIRE liées à cette protéine de 60 kDa. Si le résultat est

positif, il serait intéressant de connaître l’effet des inhibiteurs de la transcription et de la traduction

sur la synthèse de cette protéine.

Une autre possibilité, qui n’exclue pas l’hypothèse précédente, est que la phosphatase

responsable de l’activation des complexes mitotiques soit soumise à une régulation

transcriptionnelle à l’image des protéines phosphatases cdc25 (Jinno et al., 1994; Zwicker et al.,

1995).

84
-
 B.3. R EGULATIONS PAR PHOSPHORYLATION

Les travaux de Zhang (1996) avaient permis de mettre en évidence que les

phytohormones régulent l’activité de cdc2 par un mécanisme de phosphorylation inhibitrice sur

tyrosine. Chez Fucus, nous avons montré que les CDK PSTAIRE mitotiques sont soumises à

une régulation négative sur residu tyrosine en phase G2 et que leur déphosphorylation en mitose

est directement corrélée à une augmentation de leur activité. Ce résultat constitue la première

évidence d’une régulation par phosphorylation des CDK au cours de la progression normale

dans le cycle chez les végétaux. Nous avons également démontré que le point de contrôle de la

réplication de l’ADN utilise cette régulation pour inhiber l’entrée en mitose. Il semble probable que

les cibles de ce point de contrôle soient les CDK mitotiques et non les CDK de phase S. En effet,

in vitro, la déphosphorylation, par cdc25, des CDK d’extraits de zygotes bloqués par

l’aphidicoline, résulte en une augmentation de l’activité CDK jusqu’à un niveau mitotique (chapitre

I). Il est intéressant de noter que les zygotes bloqués en G1/S par l’olomoucine, contiennent des

CDK phosphorylées sur tyrosine, qui une fois déphosphorylées par cdc25, possèdent

également une activité comparable à celle observée en mitose. Il semble qu’in vivo l’inhibition

des CDK de G 1/S n’empêchent pas la formation des complexes mitotiques. L’alternative selon

laquelle des complexes de G 1/S possèdent potentiellement une activité aussi élevée que

l’activité mitotique mais sont, in vivo, partiellement inhibés par phosphorylation sur tyrosine

apparaît improbable mais ne peut être exclue. Afin de connaître l’état de phosphorylation des

CDK lors des phase précoces du cycle, nous envisageons d’employer la technique

d’isoélectrofocalisation en gel (IEF) qui nous permettrait de séparer les différentes formes

phosphorylées des CDK PSTAIRE et de les détecter avec l’anticorps anti-PSTAIRE qui donne

un signal bien supérieur à celui de l’anticorps anti-phosphotyrosine (PY-20) en immuno-détection.

L’inhibition directe des complexes mitotiques par de faibles concentrations d’olomoucine,

conduit également à une accumulation in vivo des CDK sous forme phosphorylée (chapitre II).

Ces résultats laissent supposer que l’activité des CDK mitotiques pourrait être nécessaire à leur

propre activation, et est en accord avec le mécanisme d’amplification en boucle, où cdc25 et

wee1 sont respectivement activée et inhibée par cdc2 (Lew et Kornbluth, 1996). De manière

générale, plus les zygotes sont bloqués tôt dans le cycle, plus l’activité in vitro des extraits

85
-
(débarrassés de l’inhibiteur) est faible, et plus leur activation par déphosphorylation est

importante. Ce phénomène est particulièrement net entre l’inhibition en phase G 2, par de fortes

concentrations d’olomoucine et l’inhibition en mitose, par une faible concentration d’olomoucine

(chapitre II). Ceci suggère, qu’in vivo, les CDK sont progressivement activées au fur et à mesure

de la progression vers la mitose. Ce mécanisme d’activation pourrait impliquer la

déphosphorylation d’un résidu inhibiteur thréonine par une phosphatase coopérative de cdc25

comme la phosphatase 2A. Chez les ovocytes d’étoile de mer, la déphosphorylation séquentielle

de cdc2/cycline B a été décrite lors de la transition prophase/métaphase. Il a été proposé que la

forme intermédiaire déphosphorylée sur thréonine et phosphorylée sur tyrosine soit responsable

de l’activation de cdc25 et de la répression de wee1 et constitue l’origine du phénomène

d’autoamplification de l’activité du MPF (Borgne et Meijer, 1996). Il serait intéressant de savoir si

ce mécanisme de déphosphorylation séquentiel est utilisé au cours de la mitose chez Fucus.

L’identification de la CAK chez Orizae sativa indique que la phosphorylation activatrice

des CDK serait également conservée dans le règne végétal (Yamaguchi et al., 1998). De plus

une phosphorylation sur thréonine a été détectée sur une protéine de type CDK, chez l’algue

unicellulaire Scenedesmus en phase G 1 (Zachleder et al., 1999). L’utilisation du même clone

d’anticorps pourrait permettre de détecter, sur les CDK, des épitopes phosphorylés sur thréonine

au cours du cycle cellulaire de Fucus.

C. RELATIONS CYCLE CELLULAIRE ET DEVELOPPEMENT

C.1.I M P O R T A N C E D E L A D I V I S I O N C E L L U L A I R E P O U R L A P O L A R I S A T I O N E T

LA MORPHOGENESE

La coordination entre le cycle cellulaire et la morphogenèse est une question importante en

biologie du développement (introduction chapitre III-D). Chez les végétaux, le mode de

différenciation cellulaire peut intervenir à tout moment de la vie de l’organisme et peut être

réversible. La capacité des cellules à sortir du cycle cellulaire en G 1 ou en G 2 répond

probablement à ces exigences de différenciation, et accroît la possibilité d’intervention d’acteurs

86
-
du cycle cellulaire dans la différenciation cellulaire, par rapport aux cellules animales qui quittent le

cycle, principalement en G 1. Ainsi, les inhibiteurs du cycle tels que ccs52 chez la luzerne,

peuvent-ils être considérés comme des acteurs du cycle qui sont nécessaires à la différenciation

cellulaire (Cebolla et al., 1999). Chez Arabidopsis, cdc2b agit plus directement sur la

différenciation cellulaire, car il intervient au niveau de la différenciation des chloroplastes et de la

croissance hypocotylaire, qui sont responsables d’un phénotype bien particulier adopté par la

plante en réponse aux contraintes environnementales (Yoshizumi et al., 1999). Cdc2b pourrait

donc être considéré comme un médiateur entre le cycle cellulaire et la différenciation, si son rôle

dans le cycle était défini au delà des fluctuations de son expression et de son activité.

Chez S. cerevisiae, la polarisation, qui précède la division cellulaire, est considérée

comme un événement morphogénétique au même titre que la formation du “shmoo“ lors de la

conjugaison, qui nécessite, pour sa part, l’arrêt du cycle, et fait intervenir la CKI, FAR1. Chez

Aspergillus nidulans, NIMXcdc2 intervient également dans la différenciation des conidies. Ces deux

CDK d’ascomycètes régulent les événements de division et de croissance polarisée et

constituaient, jusqu’à ce jour, les seuls exemples où le contrôle direct de la morphogenèse par un

acteur du cycle cellulaire était clairement établi (revue par Mendenhall et Hodge, 1998; Ye et al.,

1999).

Chez le Fucus, la polarisation est un prérequis indispensable à la différenciation initiale

des deux premières cellules de l’embryon ainsi qu’au modelage de l’embryon et peut, de ce fait,

être considérée comme un événement très précoce de la morphogenèse (chapitre IV, voir ci-

dessous). Le fait que l’orientation altérée de la première division n’influence pas l’orientation de la

germination des embryons, indique que la polarisation a une importance fondamentale par rapport

à la position des clivages dans le modelage initial de l’embryon (revue par Quatrano et Shaw,

1997). Cependant, lorsque l’angle entre le plan de division et l’axe est supérieur à 45°, la

croissance apicale est nettement réduite, et des développements anormaux sont attribués à ces

altérations trop importantes de la position du clivage. Toutefois, à terme, l’influence de l’orientation

des plans de division a peu d’effet sur le modelage. Un cas de figure similaire a été décrit chez les

mutants fass d’Arabidospis, chez qui l’orientation anormale des plans de divisions embryonnaires

a peu d’effet sur le modelage de l’embryon (Torrez-Ruiz et Jürgens, 1994). Chez Fucus, lors du

87
-
développement normal, l’orientation des divisions initiales est très conservée (transversales

dans le rhizoïde et périclines dans le thalle) et permettraient l’organisation correcte des structures

différenciées telles que le crampon et la fronde. Ainsi, l’orientation des divisions n’est pas dénuée

d’importance pour le développement initial de l’embryon mais n’est pas essentielle à la

polarisation zygotique. Cependant, à l’instar des études réalisées chez les plantes supérieures

qui s’intéressent au rôle de l’orientation des divisions pour le développement, les études chez

Fucus ne nous informent pas directement sur le rôle des acteurs du cycle cellulaire dans le

développement de l’organisme. Chez Fucus, nous avons pu directement montrer qu’il existe une

corrélation étroite et précoce entre la morphogenèse et le cycle cellulaire, qui est orchestrée par

les CDK. Ce cas de figure ne semble donc pas être l’apanage des levures et pourrait se

rencontrer chez d’autres organismes que le Fucus.

C.2.LA CDK PSTAIRE DE 34 K D A CONTROLE LA POLARISATION PRECOCE DU

ZYGOTE

L’utilisation conjointe d’outils pharmacologiques et de tests classiques de polarisation

nous a permis de situer temporellement les phases du cycle cellulaire par rapport aux

événements de polarisation du zygote de Fucus (figure 21). La phase S est initiée au même

moment que la formation de l’axe de polarité qui s’achève avant la phase G2. La germination

s’effectue juste avant, ou pendant la mitose. La corrélation des événements précoces de

polarisation et du cycle cellulaire est vraisemblablement assurée par la CDK PSTAIRE de 34

kDa, p34. En effet, l’inhibition de la polarisation par les inhibiteurs de CDK tels que la roscovitine,

l’olomoucine et le purvalanol ainsi que par la CKI p21cip1 indiquent que les CDK contrôlent la

polarisation. Le fait que l’anticorps anti-PSTAIRE, microinjecté précocement dans l’embryon,

inhibe la polarisation et que l’olomoucine inhibe la germination seulement lorsqu’elle est ajoutée

avant ou pendant la formation de l’axe, précise que ce contrôle est assuré par une CDK

PSTAIRE et s’effectue au niveau de la formation de l’axe. La rétention spécifique de p34 sur les

billes de purvalanol, désigne cette CDK comme un régulateur potentiel de la formation de l’axe.

Ainsi, cette CDK qui serait le contrôleur principal des transitions G1/S et G 2/M, jouerait à l’image de

CDC28 de levure le rôle de contrôleur de la polarisation. Il est également possible que seule

88
-
 Figure 21 : Relations entre le cycle cellulaire
et la polarisation

22-24 h 0h

M
G1
Anticorps anti-PSTAIRE
(1 h AF)
Fécondation p21cip1
Olomoucine 100 M
Purvalanol
Roscovitine
Perception
du signal
lumineux
GERMINATION CDK

16-18 h 5-6 h
POLARISATION

Fixation de l’axe Formation de l’axe

G2
S

10-12h

La formation de l’axe coïncide avec la phase S, et dépend de l’activité de la CDK

PSTAIRE p34 à la transition G1/S. La fixation de l’axe débute en fin de phase S ou en
phase G2. La polarisation est nécessaire à la germination et s’opère pendant la
mitose (pour plus de détails voir texte principal).
l’entrée en phase S permette la transcription d’un acteur essentiel à la formation de l’axe et dans

ce cas, p34 contrôlerait plus spécifiquement le cycle cellulaire que la polarisation. Enfin, il est

concevable que le cycle cellulaire n’interagisse avec les phénomènes de polarisation que dans le

cas d’une progression anormale du zygote à la transition G1/S, et inhibe la formation de l’axe tant

que cette transition ne s’est pas effectuée (contrôle négatif) (chapitre III). La nature du contrôle de

la polarisation par la CDK PSTAIRE de 34 kDa reste donc à définir.

Chez les végétaux, cdc2a intervient aux deux transitions G1/S et G 2/M mais son rôle pour

le développement embryonnaire n’est pas défini. De Veylder décrit que la surexpression du gène

muté non fonctionnel de cdc2aAt (cdc2aN147) sous le contrôle du promoteur du gène 2S2 (seed

storage albumin), promoteur qui permet une expression spécifique du gène au cours du

développement embryonnaire, conduit à des anomalies du développement telles que l’absence

de germination, la fusion de cotylédons, ou des déformations des premières feuilles (De Veydler

et al., 1998). Une analyse microscopique des embryons surexprimant cdc2aN147, qui devrait

permettre de préciser les conséquences précoces de cette surexpression, n’a, pour l’instant, pas

été décrite. Il serait, notamment, intéressant de connaître les conséquences de cette

surexpression sur le développement de la polarité dans l’embryon. L’interprétation de ces

expériences resterait, néanmoins, délicate. En effet, on peut concevoir par exemple que la

surexpression de cdc2aN147 puisse entraîner la déplétion de cyclines devant normalement

interagir avec cdc2b, ce qui ne permettrait pas de conclure quant au rôle de cdc2a dans le

développement.

Chez le zygote de Fucus, l’inhibition de la polarité par les inhibiteurs de CDK

s’accompagne d’une inhibition des sécrétions polarisées de composés sulfatés au pôle

rhizoïdien. CDC28 contrôle la dynamique du cytosquelette d’actine, chez la levure, et il serait

primordial de connaître l’influence de p34 sur la polarisation des microfilaments d’actine au pôle

rhizoïdien. Les fenêtres temporelles de sensibilité aux inhibiteurs de PTK et aux inhibiteurs de

CDK sont similaires, et ces deux types de kinases (PTK et CDK) contrôlent toutes deux la

formation de l’axe de polarité. Il est donc concevable que les voies de transduction faisant

intervenir ces kinases coexistent et interagissent. L’analyse des profils de phosphorylation

d’extraits de zygotes bloqués dans leur polarisation par des inhibiteurs de CDK, pourrait nous

89
-
renseigner sur cette possibilité. Il est probable que les CDK se situent soit en parallèle soit en

amont des kinases de type PTK de Fucus dans la voie de signalisation aboutissant à la

polarisation car l’inhibition de la polarisation par les inhibiteurs de PTK retardent la division mais

ne l’empêchent pas.

C.3.I MPORTANCE DE LA POLARISATION POUR L ’ EMBRYOGENESE

Les zygotes dont la formation de l’axe est inhibée par des inhibiteurs de PTK présentent

un développement très perturbé. Des parties rhizoïdiennes et thalle peuvent se différencier mais

chez une proportion non négligeable des embryons, elles sont mises en place de manière

aléatoire par rapport à l’axe imposé par la lumière. Ces résultats mettent en avant l’importance de

la polarisation zygotique pour le développement ultérieur de l’embryon. Les cellules des

embryons globulaires sont vraisemblablement non différenciées mais établissent secondairement

une polarité permettant d’enclencher les programmes de développement rhizoïdien et thalle.

L’influence des inhibiteurs de PTK sur l’établissement secondaire de cette polarité n’est pas

connue. Néanmoins, il faut noter que les zygotes ayant dépasser le stade précoce de formation

de l’axe peuvent répondre à la lumière en présence de génistéine. Le processus sensible à la

génistéine contrôle donc un événement propre à la formation précoce de l’axe de polarité. Comme

tous les phénomènes physiologiques détectés lors de la formation de l’axe sont amplifiés au

cours de la fixation, il se pourrait que l’initiation et l’amplification d’un ou de plusieurs de ces

événements fassent intervenir des voies de signalisation différentes. Ainsi, la création initiale d’un

gradient de calcium pourrait faire intervenir des protéines de type PTK puis, la polarité

s’autoamplifierait par une activation des canaux calciques. Une relation entre la voie de

phosphorylation sur tyrosine et la voie calcique a été mise en évidence dans des lymphocytes T

(Mustelin et al., 1990). Lors de l’activation des lymphocytes T, la phosphorylation de PTK-src

associées aux récepteurs membranaires, active la phospholipase C (PLC) par l’intermédiaire de

protéines G, ce qui enclenche la voie calcique et les réponses dépendantes du calcium. L’effet de

l’inhibiteur de PLC (U-73122) sur le zygote de Fucus, a été initialement testé par C. Brownlee,

qui observa une inhibition de la germination, alors que son analogue inactif (U-73343) n’a aucun

90
-
effet (résultats non publiés). Des test cellulaires, similaires à ceux réalisés avec la génistéine, ont

par la suite, été réalisé par F.-Y. Bouget dans notre laboratoire. La polarisation des zygotes est

inhibée par le U-73122 alors que la division cellulaire n’est pas retardée par l’inhibition. J’ai pu

observer qu’à long terme le développement des zygotes, initialement traités par l’inhibiteur de

phospholipase C, est très similaire à celui des zygotes traités par la génistéine. La mise au point

d’un test d’activité enzymatique pour la PLC, serait un bon moyen de confirmer l’existence d’une

activité phospholipase C chez Fucus et pourrait préciser les éventuelles interactions entre les

PTK-like de Fucus, la phospholipase C et le calcium, dans la mise en place de la polarité

cellulaire.

D. E XISTE - T - I L U N C O N T R O L E D U C Y C L E C E L L U L A I R E P A R L E S A C T E U R S D E

LA POLARISATION ?

Tandis que les zygotes traités en continu par de faibles doses de cytochalasine B

(10 µg/ml) ne germent pas mais sont capables de se diviser, l’altération du cytosquelette

d’actine par de fortes concentrations de cytochalasine inhibe la polarisation (Quatrano, 1973;

Nelson et Jaffe, 1973). Ceci a conduit à l’idée unanimement acceptée que la première division

est indépendante de la polarisation. Cependant, les fortes concentrations utilisées pour bloquer

la polarisation (100 µg/ml) inhibent aussi la division (Bouget et al., 1996). La bréféldine A, pour

sa part, inhibe la polarisation et la division. Etant donné l’implication de l’actine et des

phénomènes sécrétoires dans la division il n’est pas possible de conclure quant à la

dépendance de la division vis à vis de la polarisation, au regard de ces expériences. Le fait que

l’inhibiteur de la PLC inhibe la polarisation mais permette la division sans qu’aucun retard ne soit

observé corrobore l’hypothèse d’une indépendance de la division vis à vis de la polarisation.

Cette vue mérite, néanmoins, quelques nuances. Lors des traitements avec l’inhibiteur de PLC,

le découplage observé entre la polarisation et la division cellulaire pourrait être du au fait que la

PLC se situe en aval d’un embranchement d’une voie de transduction commune au contrôle du

cycle cellulaire et de la polarisation. Il est remarquable, que l’inhibition de la polarisation par les

inhibiteurs de PTK autorise, également, la division mais avec un retard conséquent (24 h). Chez

91
-
S. cerevisiae, le point de contrôle de la morphogenèse provoque, lui aussi, un retard de division

sans pour autant l’inhiber totalement. Ce phénomène pourrait résulter de l’adaptation de la

cellule à l’activation prolongée d’un point de contrôle, un mécanisme qui a été observé lors du

point de contrôle de l’assemblage du fuseau mitotique. L’utilité de cette adaptation serait de

donner à la cellule une chance de survie alors que l’activation continue du point de contrôle

empêche la prolifération cellulaire et peut être létale (revue par Rudner et Murray, 1996). Chez

la levure bourgeonnante, le point de contrôle de la morphogenèse, assure que l’assemblage de

l’actine s’effectue correctement au site de bourgeonnement avant que la division n’ait lieu.

Lorsque le point de contrôle est activé, il inhibe CDC28 par phosphorylation sur tyrosine 19. Il

serait intéressant d’analyser l’état de phosphorylation des CDK dans des zygotes inhibés

dans leur polarisation par la génistéine ou encore par des inhibiteurs de la polymérisation de

l’actine. Il se peut que la phosphorylation sur tyrosine des CDK persiste en raison d’un retard

général du développement. Toutefois, les points de contrôle que nous avons caractérisés

jusqu’à présent, n’agissent pas sur la synthèse des CDK. Aussi, l’analyse de la synthèse des

CDK dans des zygotes dont la polarisation est inhibée par la génistéine, devrait nous permettre

de faire la distinction entre un retard général du développement et un retard spécifique provoqué

par un éventuel point de contrôle de Fucus, similaire au point de contrôle de la morphogenèse

chez S. cerevisiae.

Depuis de nombreuses années, le zygote de Fucus est un modèle d’étude de la

polarisation cellulaire et permet d’appréhender les mécanismes mis en jeu au cours de

l’embryogenèse végétale. Nos travaux ouvrent à présent de nombreuses perspectives pour

comprendre les régulations du cycle cellulaire chez les végétaux par une approche biochimique

et cellulaire, et étudier les inter-régulations entre le cycle cellulaire et le développement.

92
-
 REFERENCES
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