Chap 7

Chapitre 7
Les contaminations en
culture de lignées cellulaires
1/ Généralités
La qualité des résultats de recherche dépend de la santé des

cultures cellulaires.
Les contaminants agissent sur :

• La croissance
• Altèrent les caractéristiques et les fonctions cellulaires
• Perte d’argent et de temps
• Résultats expérimentaux erronés ou inappropriés
• Perte de produits importants
• Embarras personnel (réputation dû à des résultats erronés)
2/ Contaminants chimiques
Définition :
Sont définis comme étant une présence de produits
non vivants ayant un effet indésirable sur la culture
cellulaire.
Source :
•Ions métalliques, endotoxines et autres impuretés du milieu,
du sérum ou de l’eau.
• Qualité du plastique jetable (pétris, tubes, bouteilles)
•Radicaux libres et peroxyde d’hydrogène présents dans le
milieu causés par la photo activation du tryptophane et de la
riboflavine exposé à la lumière.
• Ammoniaque dans le cas de la dégradation de la
glutamine. L-
• Dépôt de matière sur le verre ou sur les pipettes causé par
un reste de détergent, résidu qui vient du papier aluminium.
•Résidu de germicides ou pesticides utilisés
lorsqu’on désinfecte les incubateurs, comptoirs ou autres
instruments.
• Impureté de CO2 de l’incubateur.
Exemples de sources :
• Milieu
La qualité de l’eau qu’on utilise pour préparer le
milieu. Les réactifs achetés doivent être de qualité
supérieure (degré de pureté) et toujours testés
pour la culture cellulaire.
L’entreposage et le chauffage du milieu peuvent
affecter ce dernier. LES MILIEUX à l’abri de la
chaleur et de la lumière.
• Sérum
La composition d’un sérum est variable d’un numéro
de lot à l’autre pour sa quantité d’hormones de
croissance, de facteurs de croissance et de matières
toxiques. Cette variation peut ainsi causer des
changements aux cultures. Il est préférable de le
décongeler au frigo plutôt qu’à 37°C. On voit souvent
de petits débris dans le sérum causés par le gel-dégel,
ce n’est pas contaminé mais ce sont des protéines
précipitées et c’est normal.
• Endotoxines
Ce sont des lipopolysaccarides produits
par les déchets des bactéries gram- dans
l’eau, aussi appelés pyrogène. D’autres
origines du sérum : ils sont une source
significative de problèmes qui affectent
la performance des cellules.
• Entreposage de la vaisselle
On peut retrouver dans les bouteilles utilisées, des
métaux lourds, des composantes organiques, des
colorants, des solvants, des pesticides. La même
chose peut se retrouver dans les bouchons, sur les
pipettes.
Résidus de désinfectant, savon, détergent, papier
aluminium…
• Lumière
Certaines composantes du milieu exposées à la
lumière, ainsi qu’a la chaleur, produisent du
peroxyde hydrogène, de l’ammoniaque et des
radicaux libres, toxiques pour les cellules.
• Incubateur
Les produits utilisés pour nettoyer l’incubateur
peuvent être toxiques. Il est important de bien
rincer.
Le CO2 peut contenir d’autres composantes telles
que de l’huile ou autres gaz (CO). La qualité de gaz
(CO2) MEDICAL est supérieure au gaz (CO2)
INDUSTRIEL. Le prix du gaz médical est plus cher.
3/ Contaminants biologiques
Ces derniers sont plus facilement détectables et

souvent visibles à l’oeil nu (bactéries,
levures,
moisissures, etc.). La croissance rapide de ses
micro-organismes (surtout en absence
d’antibiotique) permet de les détecter en peu de
temps : turbidité, changement de pH, mort
cellulaire.
D’autres bactéries sont moins perceptibles au

microscope comme les bactéries de
dimensions ou intracellulaires. petites
• Bactéries
Mobilité, forme définies, pousse rapide, le

pH du milieu, turbidité.. Les bactéries
anaérobies poussent beaucoup plus
lentement.
• Levures et moisissures
Plus gros, poussent en colonies, signes de

bourgeonnement. Les spores qui sont invisibles
restent latentes et éclosent sous l’effet d’un
stress.
Une des souches fréquentes, Candida (contour
très défini et l’intérieur brillant en contraste de
phase). Ne pas ouvrir les pétris dans la salle de
culture, pour ne pas libérer les spores dans l’air
ambiant.
• Virus
-Trop petits pour être détectables

à moins de tests sophistiqués.
-Les virus sont souvent spécifiques
à certaines espèces ou à certains tissus.
-Plusieurs donnent un
effet cythopatique (mort des cellules)
-Source : Le sérum peut contenir
des virus bovin.
• Protozoaire
- La plupart sont unicellulaires, tel que les amibes

- Certains peuvent former des spores
- Certains ont un effet cythopatique
(cellules détruites en moins de 10 jours).
- Source : poussière, saleté, air,
occasionnellement des tissus (tissu de gorge)
• Invertébré
- Araignées ou insectes (mites)

- Source : boîtes de cartons, chariot
• Mycoplasmes
-Le mycoplasme est le plus dévastateur et le plus
répandu des contaminants.
- Il en existe de nombreuses souches.
-Ils agissent sur les cellules soit par la production de
substances codées par le génome bactérien ou soit
par l’utilisation de constituants du milieu de culture.
- Les mycoplasmes ont la capacité d’affecter leur
cellule hôte dans leur fonction, croissance,
métabolisme, morphologie,
membranaire, propagation de virus, causent attachemen
des
dommages au niveau des chromosomes t et enfin
amener les cellules vers leur mort.
Source
Les sources principales sont la flore orale humaine, les
bactéries en suspension dans l’air, aérosol soit sous la hotte
ou par les incubateurs, le sérum animal, le milieu et les
diverses solutions. La contamination se propage aussi par
des nouvelles cultures cellulaires provenant des
compagnies, des labos extérieurs ou de nouvelles souches
décongelées récemment.
Les autres cultures cellulaires : Le plus répandu de ces cas

est sans doute la cellule HeLa. Des chercheurs ont
démontré qu’environ 25% des cellules humaines sont
contaminées par les cellules de types HeLa.
Traitement
Plusieurs compagnies développent des
produits d’élimination
• Plasmocin (InvivoGen) 25ug/ml pendant 2 semaines
• Mynox (Minerva Biolab)
• Ciprofloxacin : 10 jours à 10ug/ml (Bayer)
• Clean Cell
• Mycoplasma-Ex et Biomyc-3 (Promokine)
Prévention : n’utiliser qu’une bouteille de milieu par lignée
cellulaire
• Même chose pour la trypsine, PBS…
• Bien désinfecter la hotte entre chaque type cellulaire
4/ Source de contamination
Solution, vaisselle
• Autoclave :
Le choix du cycle approprié, le volume
parfois critique (>500ml)
La forme, la grosseur et la nature des objets
à autoclavés.
• Entreposage : endroit propre et sans poussière.
•Vaisselle jetable : garder les pétris stériles une
fois le sac ouvert, fermer le sac…
• Tout produit biologique : milieu, sérum
(bien que filtré sur 1micron, il n’est pas rare que le
sérum commercial soit contaminé avec des
mycoplasmes.)
Particules aérosols, poussières en
suspension
Une partie des contaminants microbiens se
retrouvent dans l’air accrochés à de fines
particules de poussière en suspension.
• Réservoir d’eau dans l’incubateur
• Tablettes souillées par de pétris renversés
• Bain-marie
• Ventilateur au plafond de l’incubateur
• Transport des cellules d’un labo à un autre
Conseils
• Ne pas éternuer ou parler sous la hotte
• Évitez d’entraver la circulation de l’air de la hotte
• Passez toutes vos choses à l’éthanol (ou autre) avant de les amener
sous la hotte.
• Limitez les mouvements brusques sous la hotte
• Limitez les mouvements derrière la hotte
• Testez de façon régulière la présence de mycoplasmes.
• Une bouteille mal fermée
• Une goutte de milieu entre le couvercle et le côté extérieur du pétris
est une bonne porte d’entrée pour les micro-organismes.
• Les étagères sales dans l’incubateur
• Transports des pétris de l’incubateur au microscope.
5/ Stratégie d’usage d’antibiotiques
Les antibiotiques sont indirectement responsables de la contamination, ils

empêchent de faire ressortir rapidement la contamination.
• Avec antibiotiques : on trouve 72% des cellules qui ont des problèmes.
•Sans antibiotique : on a trouvé 7% des cellules qui sont contaminées
Travailler sans antibiotique permet vraiment de savoir s’il y a le moindre
risque de contamination. Les situations qui font exceptions sont : dans le cas
de culture primaire, lors de transfections transitoires ou lorsqu’on a besoin
d’une grosse quantité de pétris (pour récolter).
Les antibiotiques ne remplacent pas de bonnes techniques aseptiques
Évitez la résistance aux antibiotiques
• 80% des mycoplasmes sont résistants à la gentamicine
• 15% des mycoplasmes sont résistants au ciprofloxacin
• 28% des mycoplasmes sont résistants à la lincomycin
• 21% des mycoplasmes sont résistants à la Tyrosine
Conseil pratique
 Il est préférable de jeter ce qui est contaminé et de

recommencer le tout avec des cellules congelées (saines).
Le traitement à l’aide d’autres antibiotiques peut
modifier les caractéristiques des cellules. Notez que la
fongizone ne permet pas de se débarrasser des levures
mais d’arrêter leur croissance. L’utilisation massive
d’antibiotique peut occasionner des problèmes de
résistance.
Ne pas jeter les contaminants dans l’évier de la salle de
culture (plutôt dans un autre labo).

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La qualité des résultats de recherche dépend de la santé des

Les contaminants agissent sur :

Ces derniers sont plus facilement détectables et

D’autres bactéries sont moins perceptibles au

Mobilité, forme définies, pousse rapide, le

Plus gros, poussent en colonies, signes de

-Trop petits pour être détectables

- La plupart sont unicellulaires, tel que les amibes

- Araignées ou insectes (mites)

Les autres cultures cellulaires : Le plus répandu de ces cas

Les antibiotiques sont indirectement responsables de la contamination, ils

 Il est préférable de jeter ce qui est contaminé et de

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