Utilisateur:Nastena147
La chromatographie d’exclusion stérique (SEC pour « Size-Exclusion Chromatography ») est une technique analytique relative pour la caractérisation des polymères : la détermination de la masse moyenne en poids (Mw) et de la masse moyenne en nombre (Mn). Parfois, le terme chromatographie par perméation de gel (GPC) sera privilégié dans le domaine des polymères synthétiques, tandis que l’expression chromatographie par filtration sur gel (GFC) sera utilisé dans le domaine de biochimie pour l’analyse des macromolécules tels les protéines. Malgré les différentes appellations, la chromatographie d’exclusion stérique est de loin de terme qui décrit le mieux la méthode de cette technique : les molécules de polymères sont séparées en fonction de leurs volume hydrodynamique, unique pour une composition chimique et une masse molaire caractéristiques.
PRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE D’EXCLUSION STÉRIQUE
[modifier | modifier le code]Le principe de la SEC est la séparation de macromolécules selon leur taille en solution en utilisant leur différence de pénétration dans les pores d’un gel de polymère réticulé et gonflé. Ce processus est basé sur la diminution d’entropie[2], en raison de la diminution du nombre de conformations permises, de la pelote statistique lorsque cette dernière pénètre dans une pore de diamètre prédéfini par la phase stationnaire. Dans le but d’éviter une telle baisse d’entropie, les macromolécules seront portées à garder une distance spécifique de leur volume hydrodynamique entre la phase stationnaire et leur centre de masse. Le volume hydrodynamique est le volume d’une sphère solide creuse ayant un rayon hydrodynamique proche du rayon de giration quadratique moyen de la pelote statistique non perturbée. La distance spécifique entre la phase stationnaire et la macromolécule représente la conformation de la pelote statistique non perturbée, i.e. l’entropie de la macromolécule est maximale. Lorsqu’une solution de macromolécules de différentes tailles, ayant des volumes hydrodynamiques différents, passe à travers un gel, les petites macromolécules peuvent pénétrer plus en profondeur et dans un plus grand nombre de pores, sans voir leur entropie diminuer grâce à leur distance spécifique plus petite, alors que les grandes macromolécules pénètrent dans moins de pores. Étant moins retardés, les macromolécules de grande taille s’écoulent dans les interstices avec le solvant plus vite et sont détectés plus tôt que les petites molécules.
CONSTITUANTS DU SYSTÈME
[modifier | modifier le code]Phase Stationnaire
[modifier | modifier le code]Un des grands avantages de la SEC est l’utilisation du gel de polymère réticulé avec des pores de dimensions prédéfinis[3], qui nous permet de couvrir une large gamme de séparation en poids moléculaire des macromolécules. La phase stationnaire est un polymère spécifique synthétisé pour une extraction donnée. Autrement dit, afin d’assurer une bonne séparation de toute la gamme de poids moléculaire de notre échantillon, il peut être utile de créer un mélange de phases stationnaires de différentes porosités, correspondants aux volumes hydrodynamiques des composés de l’échantillon. La séparation totale se fait dans le volumes des pores qui représente parfois 40% du volume total de la colonne. Ce volume libre est défini par le degré de réticulation et d’enchevêtrement des chaines amorphes du gel organique semi-rigide, i.e. la porosité de la silice. Les gels de copolymères de polystyrène sont souvent utilisés en raison du faible coût de production et de la grande variété de produits synthétisés.
Colonne de Séparation
[modifier | modifier le code]Une bonne séparation peut parfois engendrer la nécessité d’employer de longues colonnes de séparation, un ensemble de colonnes de différentes porosités en série ou bien une colonne remplie d’un mélange de phases stationnaires. La nature de la colonne optimale pour une séparation est définie pour un polymère donné selon les caractéristiques[4] suivantes :
- Le volume d’exclusion stérique limite[5] de la colonne doit être choisi en fonction de la gamme des masses moléculaires des macromolécules analysées.
- La grosseur des particules possède une grande influence sur les autres caractéristiques de la colonne. Voir le tableau de comparaison des petites particules (5 μm) versus des grosses particules (10 μm)
- La grosseur des particules (20 μm) est prédéfinie pour certains polymères de grande masse en raison de la dégradation du polymère analysé si l’espace entre les particules est trop petite.
- Lors de la combinaison de plusieurs colonnes de porosité différente en série, pour une meilleure connectivité, il est préférable d’utiliser soit deux colonnes de 60cm ou quatre colonnes de 30cm. La bonne fluidité de SEC permet éviter l’élargissement des pics.
Phase Mobile - Échantillon d'analyse
[modifier | modifier le code]La spécialité de la chromatographie d’exclusion stérique est la séparation et caractérisation de grosses molécules, tels les polymères synthétiques, les protéines, etc. ayant tous des masses moléculaires élevés et un degré de solvatation directement proportionnel aux interactions intermoléculaires entre la pelote statistique et les molécules du solvant. Comme pour toutes les techniques de séparation analytiques, il est important d’avoir un solvant approprié pour le polymère analysé afin d’éviter les effets d’exclusion stérique non désirés. La bonne solvatation du polymère dans la phase mobile, i.e. temps et températures appropriés, assure le bris des agrégats en chaines individuelles et la formation d’une pelote statistique non perturbée. La température de la solution doit être supérieure à la température de transition vitreuse du polymère (Tg)[6], afin de permettre le mouvement collectif de segments des chaines. L’élévation de la température conduit à des mouvements de chaines plus rapides et, par conséquent, le temps nécessaire pour compléter les mouvements devient plus court. Autrement dit, il existe une équivalence entre la température et le temps car augmentation de la température a le même effet que prolonger le temps d’observation à une température plus basse.
Pompe - Controle du Débit
[modifier | modifier le code]Chromatographie d’exclusion stérique exige un débit très constant pendant tout le temps d’analyse de l’échantillon. Une telle importance est due à la relation logarithmique entre la masse molaire du polymère et le volume d’élution. La fluctuation du débit de seulement 0,1% provoque une marge d’erreur dans la détermination de la masse molaire jusqu’à 10% de sa valeur réelle. La majorité des pompes disponibles sur le marché peuvent reproduire un débit avec un degré de précision de 0,2-0,3%[7]. Le degré de précision peut diminuer à cause des fuites dans le système de plusieurs colonnes mises en série ou à cause de l’augmentation de pression interne de la colonne. La solution à ces inconvénients est l’utilisation d’un faible standard moléculaire interne pour la calibration de la distribution des masses moléculaires (MMD) des macromolécules. Un débit optimisé est déterminé à partir de rapport de temps d’élutions du pic standard, tandis qu’un débit absolu (pour la calibration) peut être obtenu en mesurant le temps de remplissage d’une colonne calibré. La SEC demeure une technique analytique relativement précise, tant et aussi longtemps que la fluctuation du débit est compensée par l’utilisation d’un standard interne. En fait, le système de pompage, contrôle du débit, est grandement relié au système de détection, et à l’analyse de données. La performance d’un système peut dépendre entièrement de l’efficacité de l’autre. Par exemple, il existe deux grandes catégories de pompes qui offrent des performances différentes :
- Pompe en seringue :
Comme le nom le mentionne, ce système fonctionne au même principe qu’une seringue, tout en étant robotisé afin de préserver une vitesse d’injection constante, sans aucune pulsation et fluctuation du débit. Ce système est particulièrement adapté aux viscosimètres.
- Pompe à piston(s) alternatif(s):
Cette catégorie représente la majorité des pompes disponibles sur le marché. Les pompes à un seul piston ne sont pas appropriées pour la SEC, mais les pompes à deux pistons, placés en parallèle (pompe à pistons axiaux) ou en série (pompe à pistons radiaux), produisent un débit constant et élevé avec un rendement supérieur à 0,951.
Détecteur - Analyse des propriétés du polymère
[modifier | modifier le code]Parmi plusieurs détecteurs de la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) seulement certains peuvent être utilisés pour la chromatographie d’exclusion stérique.
1. Détecteurs sensibles aux changements de concentration
Dans tous les systèmes de la SEC, il doit avoir au moins un détecteur sensible à la fluctuation de la concentration, et si ce système analyse un échantillon de polymères, la présence d’un deuxième détecteur de la concentration (différent du premier) est obligatoire. Un mécanisme sophistiqué, intégré à l’intérieur de chaque détecteur, mesure et analyse les propriétés à la fois de l’éluant ainsi que du soluté.
1.1 Détecteur de l’indice de réfraction
Le réfractomètre différentiel est, de nos jours, le détecteur le plus utilisé dans les systèmes d’analyses de la chromatographie d’exclusion stérique car ce dernier produit un signal proportionnel à la concentration de l’espèce en solution. Le détecteur, très sensible à la température, mesure la différence en indice de réfraction entre l’éluant et le composé, produisant un chromatogramme de la concentration en fonction du temps de rétention. Le réfractomètre différentiel a l’avantage d’être non spécifique et universel, mais possède l’inconvénient d’être peu sélectif, i.e. s’il y a présence d’une impureté, telle une particule de silice, elle peut fausser la concentration de l’espèce avec laquelle elle glissera à travers le détecteur.
1.2 Détecteur d’absorption du rayonnement ultraviolet (UV)
Le spectromètre ultraviolet est particulièrement utilisé lors de la détection des polymères insaturés, par exemple pour la présence des liens doubles et triples, groupements carbonyles, etc. Il est triviale d’avoir un faible coefficient d’absorbance pour le solvant et un coefficient d’absorbance important pour le polymère analysé, de tel sorte qu’à une longueur d’onde de UV bien précise, le solvant est transparent et seul le soluté absorbe le rayonnement.
1.3 Détecteur d’absorption du rayonnement dans l’infrarouge (IR)
La méthode de fonctionnement du détecteur infrarouge est quasi identique au détecteur UV présenté plus haut. Cependant, IR est limité pour certaines phases mobiles qui ne sont pas suffisamment transparentes aux longueurs d’onde de l’infrarouge. Le spectromètre IR est principalement utilisé dans l’analyse des polyoléfines.
2. Détecteurs sensibles aux changements de la masse molaire (M)
L’avantage irréfutable des détecteurs sensibles aux changements de la M pour la SEC est la détection sélective et universelle de la masse molaire de chaque fraction du pic du polymère. Puisque la réponse d’un tel détecteur est basée autant sur la concentration du polymère en solution que sur la masse molaire de la fraction de polymère, il doit être combiné avec le détecteur sensible aux changements de concentration.
2.1 Détecteur de la viscosité
Un viscosimètre fourni l’information importante sur la viscosité intrinsèque qui à son tour est liée à la taille, à la souplesse et à la conformation de la chaine du polymère. Un capteur de pression différentiel mesure la perte de charge dans un tube capillaire à faible volume mort, cette dernière sera proportionnelle à la viscosité de la phase mobile, i.e. la viscosité du polymère passant au viscosimètre. On peut donc en conclure que la viscosité intrinsèque d’un échantillon de polymère est mesurée à partir des mesures de la viscosité relative sur des solutions diluées du polymère en utilisant un viscosimètre. La viscosité intrinsèque [η] est une mesure de la perturbation due à la présence d’une seule macromolécule dans le solvant ; elle est caractéristique d’un polymère dans un solvant donné et à une température donnée.
2.2 Détecteur de la diffusion de la lumière
Au-delà d’une certaine taille, une macromolécule n’est plus considérée comme une source de diffraction unique, elle peut diffuser la lumière à partir de ses différentes parties. En raison de la différence de marche pour les ondes diffusées par différentes parties de la même macromolécule, arrivant à un détecteur, l’interférence entre les ondes se produit. L’amplitude du champ électrique peut soit doubler (ondes en phase), s’annuler (déphasées de 180°) ou prendre des valeurs intermédiaires (selon de déphasage). La perte de l’intensité diffusée due aux interférences augmente avec l’angle d’observation. L’intensité du faisceau diffusé dépend de la taille des macromolécules en solution, de la différence entre l’indice de réfraction du solvant et celui du polymère ainsi que de la longueur d’onde du faisceau lumineux incident. Il existe deux types de détecteurs de la diffusion de la lumière :
- LALS – « Low Angle Light Scattering » - Un détecteur qui mesure l’intensité du faisceau diffusé à un seul angle proches de 0° (afin minimiser l’interférence), habituellement θ=5°.
- MALS – « Multiangle Light Scattering » - Un détecteur de la diffusion de la lumière mesure l’intensité diffusée par les différentes concentrations du polymère et chacun à plusieurs angles d’observation allant de 20 à 150 degrés. À la suite d’une double extrapolation à θ=0° et à []=0 des résultats obtenus, on obtient la masse du polymère ainsi que le rayon de giration de la pelote statistique.
La polarisabilité du polymère est fortement liée à son indice de réfraction et à son taux d’absorption qui doit bien évidemment être nul.
ÉTALONNAGE DE LA COLONNE
[modifier | modifier le code]Chromatographie d’exclusion stérique est une méthode analytique relative d’analyse, de séparation et de caractérisation des macromolécules, tels les polymères synthétiques et des bio-macromolécules (protéines). Comme pour toutes les techniques de séparation analytiques, la réalisation de la chromatographie nécessite un étalonnage de la colonne de séparation.
Étalonnage direct
[modifier | modifier le code]On utilise des échantillons standard (monodisperses) d’un même polymère (souvent polystyrène) dont les masses sont connues à l’avance. En faisant les mesures de SEC, on établit la relation entre la masse et le volume d’élution. On obtient généralement une relation linéaire suivante :
ln(M)=A+BVélution
Cette courbe d’étalonnage est ensuite utilisée pour déterminer les masses des échantillons à partir de leurs volumes d’élution. Il est trivial d’étalonner la colonne avec les échantillons de masses connues du polymère analysé, car le temps de rétention, par conséquent le volume d’élution, dépend de la masse, des interactions intermoléculaires entre la phase stationnaire et le polymère analysé ainsi que des conformations de la chaine de polymère en solution, i.e. architecture.
La nécessité d’étalonner la colonne avec des échantillons standard représente un inconvénient principal pour la SEC, car lors de la caractérisation de nouveaux polymères synthétiques hautement couteux de production, les échantillons standard n’existent pas ou sont trop chers à produire. Donc, l’étalonnage direct est impossible.
Étalonnage universel
[modifier | modifier le code]Parmi plusieurs détecteurs mentionnés plus haut, il existe un qui détecte la viscosité intrinsèque – viscosimètre. Puisque le produit [η]M est directement proportionnel au volume hydrodynamique de la macromolécule, on peut en conclure que c’est le volume hydrodynamique qui détermine le volume d’élution. L’étalonnage universel consiste à utiliser des échantillons standard (masses connues) et déterminer leurs viscosités intrinsèques dans le solvant qui est utilisé ensuite pour les mesures de la SEC. Lorsqu’on trace ln[η] M en fonction du volume d’élution, on obtient une courbe unique pour différents polymères, ayants tous des structures différentes. C’est donc une courbe d’étalonnage universelle qui est applicable pour tous les polymères analysés dans un solvant en particulier. Ceci représente bien évidemment un avantage de l’étalonnage universel par rapport à l’étalonnage direct.
BIBLIOGRAPHIE
[modifier | modifier le code]- Chulam Md Ashraf, Ishfaq Ahmed Sheikh, ADVANCES IN PROTEIN CHEMISTRY, OMICSeBOOKSGroup, [en ligne], [1] (Consulté le 25 mars 2015)
- http://www.ebanque-pdf.com. (s.d.). Chromatographie d'exclusion stérique. DETERMINATION DE LA DISTRIBUTION EN POIDS MOLECULAIRE PAR CHROMATOGRAPHIE A PERMEATION DE GEL (GPC), p.2 .
- http://www.ebanque-pdf.com. (s.d.). Chromatographie d'exclusion stérique. DETERMINATION DE LA DISTRIBUTION EN POIDS MOLECULAIRE PAR CHROMATOGRAPHIE A PERMEATION DE GEL (GPC), p.3.
- Trathnigg, B. (2000). Size exclusion Chromatography of Polymers. Dans MEYERS, Encyclopedia of analytical chemistry (Vol. 9, pp. 8008-8023). Torzano, CA, USA: John Wiley & sons, ramtech LTD.
- Robinson W.James et all., Undergraduate Instrumental Analysis, 7e édition, CRC Press, US, 2014, p.970.
- Zhao, Y. (2015). Chimie des polymères. Méthodes de caractérisation des polymères en solution.
- Trathnigg, B. (2000). Size exclusion Chromatography of Polymers. Dans MEYERS, Encyclopedia of analytical chemistry (Vol. 9, pp. 8008-8023). Torzano, CA, USA: John Wiley & sons, ramtech LTD.
- Daniel, Vincent, Intéractions du rayonnement solaire avec l’atmosphère – Effet de serre, ENS-Lyon, publiée 21/10/2003, [en ligne], [2] (Consulté le 10 avril 2015)
- Zhao, Y. (2015). Chimie des polymères. Méthodes de caractérisation des polymères en solution.