BAB I

PENDAHULUAN

I.I Latar Belakang

Populasi mikroba di alam sekitar kita sangat besar dan komplek. Beratus-ratus spesies
berbagai mikroba biasanya menghuni bermacam-macam bagian tubuh kita, termasuk mulut,
saluran pencernaan, dan kulit. Sebagai contoh, sekali bersin dapat menyebarkan beribu-ribu
mikroorganisme. Satu tinja dapat mengandung jutaan bakteri (Pelczar, 1986).
Isolasi merupakan cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari
lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Kultur murni ialah kultur
yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal (Pelczar, 1986).
Pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru harus
dilakukan secara teliti. Terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alat-alat yang ada sangkut
pautnya dengan medium dan pekerjaan inokulasi itu benar-benar steril. Hal ini untuk
menghindari kontaminasi, yaitu masuknya mikkroorganisme yang tidak diinginkan (Budiarti,
2009).
Hasil inokulasi mikroba yang telah dilaksanakan dapat digunakan untuk
menggambarkan populasi mikroba yang ada di lingkungan dimana sampel digunakan.
Umumnya mikroba yang tumbuh dari proses inokulasi terdiri dari berbagai jenis mikroba.
Kondisi ini menyulitkan untuk mempelajari mikroba tersebut.
Upaya yang dapat dilakukan untuk mempelajari mikroba hasil inokulasi adalah
melakukan pemurnian terlebih dahulu sehingga hanya mikroba yang tumbuh hanya mikroba
yang diharapkan .

I.II Tujuan
Praktikum bertujuan untuk meningkatkan pengetahuan dan keterampilan praktikan dalam
melakukan proses pemurnian mikroba yang berasal dari kultur mikroba
 BAB II
LANDASAN TEORI

Bakteri tersebar sangat luas baik ditanah, air dan udara, bila hendak mengisolasi bakteri
dari tanah/ benda padat yang mudah tersuspensi atau terlarut, atau zat cair lain, maka dilakukan
serangkaian pengenceran (dilution series) terhadap zat tersebut. Sumber isolat dari bakteri benda
yang liat atau padat, misatnya daging maka zat tersebut dihancurkan terlebih dahulu. Terhadap
bakteri yang hanya terdapat dipermukaan maka pengenceran dilakukan terhadap air tempat zat
tersebut dicelupkan/ direndam. Dan jika bakteri hendak diisolasi dari udara, cukup dengan
membuka cawan Petri yang berisi media agar steril beberapa saat.
Identifikasi biakan mikroorganisme seringkali memerlukan pemindahan ke biakan segar
tanpa terjadi pencemaran. Pemindahan mikroorganisme ini dilakukan dengan teknik aseptik
untuk mempertahankan kemurnian biakan selama pemindahan berulangkali. Mikroorganisme
dapat ditumbuhkan dalam biakan cair atau padat. Kekeruhan dalam kaldu menunjukkan
terjadinya pertumbuhan mikroorganisme. Bila mikroorganisme menumpuk pada dasar tabung
maka akan membentuk sedimen, sedangkan pada permukaan kaldu pertumbuhannya terlihat
sebagai pelikel (Lay, 1998).
Pertumbuhan mikroorganisme dalam kaldu seringkali menggambarkan aktivitas
metabolismenya. Mikroba aerob obligat berkembang biak pada lapisan permukaan karena pada
bagian ini kandungan oksigen tinggi. Selain dalam media cair, mikroorganisme juga
memperlihatkan pertumbuhan dengan ciri tertentu dalam biakan padat seperti agar miring atau
lempengan agar. Agar miring lazimnya digunakan untuk menyimpan biakan murni sedangkan
agar lempengan lazimnya digunakan untuk memurnikan mikroorganisme (Lay,1998).
Isolasi merupakan cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari
lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Kultur murni ialah kultur
yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal (Pelczar, 1986).
Kultur murni atau biakan murni sangat berguna didalam mikrobiologi, yaitu untuk
menelaah dan mengidentifikasi mikroorganisme, termasuk penelaahan ciri-ciri cultural,
morfologis, fisiologis, maupun serologis, memerlukan suatu popolasi yang terdiri dari satu
macam mikroorganisme saja (Hadioetomo, 1993). Sifat organisme dalam suatu biakan murni
dapat dipelajari dengan metode yang amat keras dengan hasil yang sangat akurat karena
pengaruh sel hidup yang lain dapat ditiadakan (Volk, 1993).
Terdapat beberapa cara untuk mencegah masuknya mikroorganisme yang tidak
diinginkan dan untuk menanam suatu species yaitu :

1. Penanaman dengan penggoresan : cara ini untuk mengasingkan kuman agar

didapatkan biakan murni.
2. Penanaman lapangan : berguna untuk penentuan jenis kuman dengan bakteriofage
dan uji kepekaan terhadap antibiotic.
3. Biakan agar tabung : biasanya diperhunakan untuk menunjukkan adanya
pertumbuhan murni mikro untuk aglutinasi gelas alas.
4. Biakan tusukan : biasanya diperhunakan untuk menunjukkan adanya pencairan
gelatin dan mempertahankan biakan baru.
5. Biakan agar tuang : menunjukkan jumlah koloni mikroba hidup yang terdapat
pada suspensi.
6. Biakan cairan : kegunaannya untuk menunjukkan biakan yang banyak dan cepat.
Kerugiannya adalah tidak dapat membuat biakan murni dari bahan yang mengandung
berbagai mikroorganisme (Dwidjoseputro, 1994).
Cara yang dapat dilakukan untuk mendapatkan biakan murni terdapat beberapa, yaitu :
• Pengenceran : Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam-
macam spesies diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari enceran inii kemudian
diambil sampel 1 ml untuk diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga
ini diambil 0,1 ml untuk disebarkan pada suatu koloni tumbuh dalam medium
tersebut, tetapi mungkin juga kita hanya memperoleh satu koloni saja. Dalam hal
yang demikian ini kita memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang demikian ini
kita memperoleh satu koloni murni. Kalau kita belum yakin, bahwa koloni tunggal
yang kita peroleh itu murni, kita dapat mengulang pengenceran dengan menggunakan
koloni ini sebagai sampel (Waluyo, 2005).
• Penuangan : Robert koch ( 1943-905 ) mempunyai metode yang lain, yaitu dengan
mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan, dan sampel ini
kemudian disebarluaskan di dalam suatu medium dari kaldu dan gelatin encer.
 Dengan demikian diperoleh hanyalah suatu piaraan adukan. Setelah medium itu
mengental, maka selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni – koloni yang
masing – masing dapat dianggap murni. Denagn mengulang pekerjaan seperti di atas,
maka akhirnya akan diperoleh piaraan murni yang lebih terjamin (Waluyo, 2005).
• Penggesekan : Metode ini sekarang banyak digunakan, karena tidak begitu memakan
waktu, hanya sayang, dengan cara ini maka bakteri anaerob tidak dapat rumbuh. Jika
ujung kawat inokulasi dibengkokan, kemudian ujung kawat inokulasi itu setelah
disentuhkan suatu koloni lalu digesekkan pada permukaan medium padat, maka
beberapa waktu kemudian (kurang lebih 12 jam) akan nampaklah koloni-koloni yang
letaknya tersebar di permukaan medium. Jika diadakan pemindahan sampel dari suatu
koloni yang letaknya terpencil, maka akan diperoleh suatu piaraan murni (Waluyo,
2005).
• Single cell isolatiom : Mikropipet adalah alat yang dapat memungut satu bakteri dari
sekian banyak, dengan tiada ikut sertanya bakteri lain. Mikropipet ditempatkan pada
tangan – tangan suatu mikromanipulator. Dengan mikropipet dibuat beberapa tetesan
bergantung pada suatu kaca penutup. Pekerjaan ini dilakuan di bawah obyektif
mikroskop. Jika tampak suatu tetesan hanya mengandung satu bakteri, maka dengan
lain mikropipet, tetesan tersebut dipindahkan ke medium encer dengan maksud
supaya bakteri tersebut berkembang biak dulu. Kemudian dari sini dapat diperoleh
piaraan murni. Meode ini sangat memerlukan kesabaran, lagipula mikromanipulator
sangat mahal (Waluyo, 2005).
• Inokulasi hewan : Metode ini didasarkan atas suatu kenyataan, bahwa tidak semua
bakteri dapat tumbuh di dalam tubuh seekor hewan. Misal kita ambil dahak dari
seseorang yang disangka menderita tbc. Jika dahak ini disuntikkan ke dalam tubuh
tikus putih, maka bakteri – bakteri _aprobe yang ikut serta itu tidak akan bertahan,
sehingga kemudian kita peroleh semata – mata hasil tbc saja. Piaraan pneumococcus
murni dapat diperoleh dengan jalan demikian juga. Bakteri yang ketinggalan dalam
tubuh tikus yang sakit atau mati akhirnya dapat dipindahkan ke dalam medium yang
sesuai. Inokulasi dapat dilakukan di dalam kulit ( intracutaneous ), dapat di bawah
kulit ( subcutaneous), dapat di dalam otot ( intramuscular), dapat di rongga tubuh atau
lain-lain tempat lagi (Waluyo, 2005).
 • Teknik Aseptik : Sebelum benar-benar dilakukan proses kultur mikroorganisme,
pertama kali kita harus mempertimbangkan bagaimana agar tidak terjadi kontaminasi.
Mikroorganisme ada dimana-mana. Karena ukurannya yang sangat kecil, mereka
mudah lepas dalam udara dan permukaan. Maka dari itu, kita harus mensterilisasikan
medium kultur secepatnya setelah preparasi untuk pemindahan mikroorganisme siap
dikontaminasikan, ini biasanya terbunuh. Bagaimanapun, itu sama pentingnya untuk
tindakan pencegahan sampai penanganan berikutnya mediun kultur harus tetap steril.
Demikian materi yang lain yang akan kontak juga harus tetap terjaga kesterilannya
(Cappuccino, 1983). Teknik yang digunakan dalam pencegahan kontaminasi hingga
kultur manipulasi dan media kultur steril disebut teknik aseptik. Keunggulan itu
dibutuhkan keberhasilan dalam laboratorium mikrobiologi, dan salah satu cara belajar
dengan pendamping mikrobilogi. Kontaminasi udara paling sering menjadi masalah
karena udara selalu kontak dengan partikel debu dan umumnya banyak komunitas
mikroorganisme didalamnya. Ketika wadah dibuka maka segera ditangani agar tidak
terkontaminasi dengan udara sekitar. Transfer aseptik pada kultur dari salah satu
medium ke medium yang lain harus lihai dengan loop inokulasi atau jarum harus
disterilkan oleh pembakaran pada nyala api. Dalam pertumbuhan kultur dibutuhkan
tempat yang mudah dipindahkan ke permukaan agar datar, dimana pertumbuhan
suatu koloni berasal dari pertumbuhan dan pembelahan sel tunggal (Cappuccino,
1983).
Beberapa faktor yang perlu diperhatikan dalam melakukan isolasi mikroba yaitu:
1. Sifat setiap jenis mikroba yang akan diisolasi
2. Tempat hidup atau asal mikroba tersebut
3. Medium pertumbuhan yang sesuai
4. Cara menginokulasi mikroba
5. Cara menginkubasi mikroba
6. Cara menguji bahwa mikrobia yang diisolasi telah berupa kultur murni dan sesuai
dengan yang dimaksud
7. Cara memelihara agar mikrobia yang telah diisolasi tetap merupakan kultur murni
 Penggunaan media bukan hanya untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroba,
tetapi juga untuk tujuan-tujuan lain, misalnya untuk isolasi, seleksi, evaluasi, dan deferensiasi
biakan yang didapatkan. Artinya penggunaan beberapa jenis zat tertentu yang mempunyai
pengaruh terhadap pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroba, banyak dilakukan dan
dipergunakan. Sehingga tiap-tiap media mempunyai sifat (spesifikasi) tersendiri sesuai dengan
maksudnya (Baker, 1986).

Pengertian kultur murni

Isolasi adalah cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari
lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Kultur murni adalah kultur
yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal. Biakan murni diperlukan
karena semua metode mikrobiologis yang digunakan untuk menelaah dan mengidentifikasi
mikroba, termasuk penelaahan ciri-ciri kultur, morfologis, fisiologis, maupun serologis
memerlukan suatu populasi yang terdiri dari satu macam mikroba saja (Waluyo, 2005).
Di dalam mengisolasi mikroorganisme digunakan berbagai cara, antara lain
dengan cara goresan (streak plate), cara taburan/tuang (pour plate) (Lim, 1998). Cara sebar
(spread plate), cara pengenceran (dilution method), serta micromanipulator (the
micromanipulator method). Dua diantaranya yang paling sering digunakan adalah teknik cawan
tuang dan cawan gores. Kedua metode ini didasarkan pada prinsip yang sama yaitu
mengencerkan organisme sedemikian rupa sehinga individu spesies individu spesies dapat
dipisahkan dari lainnya (Hadioetomo, 1993).
\
 BAB III
ALAT DAN BAHAN

III.I Alat
Peralatan utama yang dibutuhkan dalam proses pemurnian mikroba antara lain adalah :
a. Peralatan gelas, seperti tabung reaksi, cawan petri, gelas ukur, labu Erlenmeyer, gelas
beker.
b. Peralatan logam, seperti ose dan pinset
c. Kompor gas
III.II Bahan
Bahan utama yang digunakan dalam proses pemurnian mikroba antara lain adalah :
a. Kultur mikroba
b. Media agar
c. Kertas sampul buku (coklat).
 BAB IV
CARA KERJA

Adapun prosedur kerja pemurnian mikroba adalah sebagai berikut :

a. Siapkan sebuah cawan petri yang sudah disterilisasi. Buka bungkusnya.
b. Siapkan tabung reaksi dan masukkan ke dalamnya 1 ml air akuades.
c. Ambil kultur mikroba yang tumbuh pada media agar tegak, miring atau lempeng. Amati
dan tentukan mikroba mana yang akan dimurnikan.
d. Ambil ose yang ujungnya berbentuk bundar.
e. Hidupkan lampu Bunsen. Lakukan proses sterilisasi ose.
f. Ambil mikroba yang akan dimurnikan dengan menggunakan ose steril. Pengambilan
mikroba cukup dengan menyentuhkan ose ke mikroba yang akan dimurnikan.
g. Celupkan ose ke akuades yang terdapat pada tabung reaksi. Aduk beberapa kali agar
semua mikroba yang menempel pada ose menjadi terlepas.
h. Tuangkan secara aseptik seluruh cairan yang ada di tabung reaksi ke cawan petri.
Lakukan hal yang sama terhadap media agar yang telah disiapkan. Lakukan pengadukan
dengan cara menggerakkan cawan petri secara perlahan di atas permukaan meja
membentuk angka delapan.
i. Simpan cawan petri dalam incubator dan lakukan inkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu
37oC.
j. Setelah diinkubasi, lakukan pengamatan terhadap mikroba yang tumbuh. Perhatikan
apakah mikroba yang tumbuh sudah murni atau belum.
 BAB V
HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

Hasil Pengamatan
Pembahasan
Pengisolasian merupakan suatu cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba
tertentu dari lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Kultur murni
ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal.
Ada beberapa cara yang dapat dilakukan untuk mengisolasi mikroba antara lain dengan
cara goresan (streak plate), cara tuang atau taburan (pour plate), cara pengenceran (dilution
method), serta micromanipulator.
Beberapa teknik ini memiliki kelebihan dan kekurangan masing-masing. Pada teknik
pengenceran, apabila kita hanya mengambil 1 ml, kemungkinan akan di dapat satu koloni saja,
tetapi apabila kita tidak yakin dengan koloni tersebut kita dapat melakukan pengenceran ulang.
Piaraan murni yang dihasilkan akan lebih terjamin apabila kita melakuka isolasi dengan
penuangan. Dimana metode ini yaitu dengan mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang
sudah diencerkan dan sampel itu kemudian disebarkan di dalam suatu medium. Dulu digunakan
medium kaldu atau gelatin, sekarang digunakan dengan medium agar. Metode dengan
penggesekan, sekarang banyak digunakan karena hemat waktu, tetapi bakteri anaerob tidak dapat
tumbuh. Dengan metode micromanipulator, kita memerlukan kesabaran dalam pengerjaannya
selain itu harganya sangat mahal, tetapi dengan menggunakan alat micromanipulator ini kita
dapat dapat memungut satu bakteri dari sekian banyak, dengan tiada ikut sertanya bakteri lain.

Pada praktikum kali ini, Setelah dilakukan pemilihan mikroba untuk dimurnikan dan di
inkubasi dalam incubator selama 2 x 24 jam, dilihat dengan bantuan kaca pembesar, maka di
dapatkan satu jenis mikroba yang sama, yang sebelumnya dipilih dari beberapa macam mikroba
pada satu sampel.

BAB VI
PENDALAMAN

a. Apa manfaat yang diperoleh dengan melakukan pemurnian mikroba?

Jawab
 Manfaat dari pemurnian mikroba adalah kita akan mendapatkan satu jenis mikroba yang
kita pilih dan kita inginkan dari bermacam jenis mikroba dalam suatu komunitas
mikroba.
b. Mengapa pengambilan mikroba yang akan dimurnikan cukup dilakukan dengan
menyentuhkan ose ke permukaan populasi mikroba yang dan tidak disarankan
mencukilnya?
Jawab
Karena apabila kita menyentuh secara berlebih atau mencukil mikroba dari medianya,
ditakutkan akan terbawa lebih dari satu mikroba yang kita inginkan.
 BAB VII
KESIMPULAN

Pengisolasian merupakan suatu cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba

tertentu dari lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni. Kultur murni
ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal.
Berdasarkan hasil praktikum yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan sebagai
berikut :
1. Isolasi adalah cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari
lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan murni.
2. Media yang digunakan dalam percobaan ini adalah media Nutrient agar (NA)
3. Pemurnian dan isolasi mikroba penting dilakukan agar didapatkan kultur murni dan
sebagai stock mikroba, sehingga tidak perlu repot lagi ketika melakukan percobaan yang
menggunakan mikroba.
4. Didapatkan satu jenis mikroba setelah pemilihan dan pemurnian mikroba
 DAFTAR PUSTAKA

Waluyo, L. 2005. Mikrobiologi Umum. MM Press: Malang.

Pelczar, M.1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi I. Erlangga : Jakarta.
Cappuccino, J.G and N.Sherman. 1983. Microbiology: a Laboratory Manual. Adison-
Wesley Publishing company: California

Baker Fj, Silverton RE, 1986. Microssopy and Microbiology. Saunder Collage Publishing,
London.
Buckle, K.A. 1987. Ilmu Pangan. Penerbit Universitas Indonesia. Jakarta.

Budiarti, Lia Yulia. 2009. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Terintegrasi. Penerbit

Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Lambung Mangkurat,
Banjarbaru.