Pemetaan DNA Plasmid

I. Tujuan
Memahami pemetaan DNA plasmid dengan pemotongan/restriksi
menggunakan beberapa enzim restriksi.

II. Prinsip
DNA yang telah dipurifikasi di inkubasi pada suhu 37
o
C dengan
enzim restriksi (endonuklease restriksi) menghasilkan DNA yang
terpotong pada posisi yang sesuai dengan sisi restriksi. Kontrol negatif,
yaitu sampel yang diinkubasi tanpa penambahan enzim restriksi, akan
tetap utuh.

III. Teori Dasar
Plasmid merupakan salah satu vektor pembawa molekul DNA di
dalam proses rekayasa DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid
banyak sekali digunakan dalam pengklonan DNA, karena relatif mudah
dalam penanganannya. Plasmid adalah molekul DNA utas ganda sirkuler
(tidak berujung) yang berukuran kecil yang terdapat di dalam sitoplasma
dan dapat melakukan replikasi secara autonom (Suharsono dan
Widyastuti, 2006).
Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat
digunakan sebagai wahana (vektor) kloning, antara lain adalah : a).
plasmid mempunyai ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih
mudah diisolasi dan dimanipulasi; b). DNA nya berbentuk sirkuler
sehingga DNA akan lebih stabil selama diisolasi secara kimia; c).
mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga dapat memperbanyak
diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara otonomi; d). mempunyai
jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga terdapat di dalam sel
dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah diamplifikasi; e).
mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap antibiotik
tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang
membawa gen tertentu (Brock, et al., 1994)
Teknologi DNA rekombinan memanfaatkan pemotongan dan
penyambungan DNA. Salah satu yang menyebabkan perkembangan
teknologi DNA menjadi cepat adalah penemuan berbagai macam enzim
yang dapat mengkatalisis pembelahan DNA di beberapa tempat yang
dapat di produksi. Enzim-enzim tersebut dikenal sebagai enzim restriksi
yang ditemukan pertama kali pada bakteri pada akhir tahun 1960-an. Kerja
enzim endonuklease (enzim restriksi) mengenali urutan nukleotida spesifik
dan memotong DNA pada posisi di antara atau di luar sekuen yang
dikenalinya tersebut. Selain itu dikenal juga istilah ruas restriksi, yaitu
ruas-ruas DNA tempat pemotongan oleh enzim. Pemotongan DNA
dilakukan pada lokasi-lokasi yang spesifik, mengenali daerah atau urutan
DNA pendek dalam molekul DNA, dimana urutan DNA yang dikenali
tersebut bersifat palindrome. Selanjutnya, enzim akan memotong DNA
pada titik tertentu di dalam urutan DNA tersebut. Enzim restriksi yang
berhasil dimurnikan pertama kali adalah EcoRI dan EcoRII dari
Escherichia coli, dan HindII dan HindIII dari Haemophilis influenza.
Enzim-enzim tersebut diketahui memotong DNA pada urutan basa tertentu
yang spesifik, yang menghasilkan fragmen-fragmen seukuran gen yang
dapat disambungkan kembali (Muladno 2002).
Secara umum, enzim restriksi dapat dibedakan ke dalam 3 tipe,
berdasarkan pada komposisi sub unit, posisi pemotongan, spesifisitas
sekuen DNA, dan perlu tidaknya kofaktor. Beberapa faktor yang harus
diperhatikan untuk melakukan pemotongan dengan enzim restriksi
(enzyme digestion). Di antaranya, gunakan jumlah DNA, enzim, dan
buffer yang benar dalam volume reaksi total yang sesuai. DNA harus
terbebas dari kontaminan seperti fenol, kloroform, alkohol, EDTA,
deterjen (SDS) atau garam yang berlebih. Metilasi DNA dapat
mengakibatkan penghambatan digesti dengan enzim tertentu. DNA
plasmid superkoil dan DNA yang terikat gel agarose pada umumnya
memerlukan lebih dari 1 unit/ug untuk dapat terpotong sempurna.
(Muladno 2002).
Enzim restriksi memotong DNA double strands dengan memutus
ikatan kovalen di antara fosfat dari satu deoksiribonukleotida dengan gula
dari deoksiribonukleotida yang berbatasan dengannya. Terdapat dua tipe
hasil pemotongan, ujung rata (blunt end) dan ujung kohesif (sticky end).
Ujung rata (blunt end) dihasilkan ketika dua utas molekul dipotong pada
posisi yang sama, bagian akhirnya rata dan tidak ada nukleotida yang tidak
berpasangan. Ujung kohesif (sticky end) dihasilkan ketika setiap molekul
DNA dipotong pada posisi yang tidak sama sehingga salah satu utas (5
atau 3) menggantung dengan beberapa nukleotida. Akhiran single strand
yang tidak rata ini dapat berpasangan secara spontan dengan basa
pasangannya sehingga disebut sticky (mudah lengket) atau kohesif
(Suharsono & Widyastuti, 2006).
Hasil pemotongan enzim restriksi endonuklease ada dua macam
yaitu ujung blunt atau flush dan ujung sticky atau cohesive :

(A) ujung blunt dan ujung sticky. (B) Tipe ujung sticky berbeda.
(C) Tipe ujung sticky sama dihasilkan oleh dua enzim restriksi
endonuklease berbeda. Ujung blunt atau flush menghasilkan fragmen yang
double-stranded, sedangkan ujung sticky atau cohesive menunjukkan
enzim restriksi endonuklease pada posisi yang berbeda dari dua untai
DNA yang komplementer. Beberapa pemotong ujung sticky menghasilkan
ujung 5 atau ujung 3 yang menggantung (Brown, 2002).
Enzim restriksi mampu memotong DNA pada situs pengenal
dengan sekuensi DNA yang sangat spesifik (recognition site). Dengan
demikian enzim ini mampu memproses DNA menjadi potongan-potongan
yang lebih pendek asal DNA tersebut memiliki situs pengenal untuk enzim
restriksi tertentu. Pada umumnya situs pengenalan enzim restriksi terdiri
atas empat atau enam basa, selain itu enzim restriksi yang berbeda akan
memiliki situs pengenalan yang berbeda juga. Akan tetapi, terdapat
beberapa beberapa enzim yang diisolasi dari sumber yang berbeda
memiliki situs pengenalan yang sama. Enzim-enzim seperti ini disebut
isoschizomer, contohnya adalah enzim MboI dan Sau3AI. Walaupun situs
pengenalannya sama, aktivitas pemotongannya mungkin akan berbeda.
Situs pengenalan enzim restriksi ini adalah daerah simetri atau palindrom,
yaitu situs atau sekuen pengenalan yang memiliki urutan basa yang sama
pada kedua utas DNA bila dibaca dari arah kiri dan kanan (Saputra, 2008).
Enzim restriksi merupakan enzim yang tidak stabil. Oleh karena
itu, sebaiknya disimpan pada suhu -20C untuk sebagian besar enzim.
Beberapa enzim perlu disimpan pada -70C. Enzim ini harus tetap
disimpan di dalam es ketika dikeluarkan dari freezer dan harus selalu
menjadi komponen yang ditambahkan terakhir pada campuran reaksi.
Selain stabilitas, harga enzim restriksi pun mahal. Campur reaksi dengan
baik dengan cara pemipetan atau menggoyang tabung reaksi. Sentrifus
dengan cepat selama beberapa detik jika ada cairan yang menempel di
dinding tabung. Untuk menghentikan reaksi enzim, dapat dilakukan
penambahan stopper reagent yang mengandung SDS-EDTA (Suharsono &
Widyastuti, 2006).
Enzim restriksi memiliki 3 tipe, tipe I memotong DNA secara acak
dan jauh dari sekuens pengenalannya, tipe II memotong DNA dekat atau
pada situs pengenalan, enzim tipe II yang umum digunakan adalah HhaI,
HindIII, EcoRI, dan NotI. Tipe III tidak digunakan
dalam laboratorium. Hal ini dikarenakan enzim ini memotong di luar situs
pengenalan dan membutuhkan dua sekuen dengan orientasi berlawanan
pada DNA yang sama untuk menyelesaikan pemotongan sehingga enzim
ini jarang menghasilkan potongan sempurna. Enzim restriksi EcoRI
mendeskripsikan bakteri Escherichia coli strain RY13 dan Urutan I enzim
yang ditemukan pada bakteri ini. Enzim ini termasuk subtipe ortodoks,
yang memotong pada situs pengenalan urutan heksanukleotida 5-
GAATTC-3 (Pingoud & Jeltsch, 2001).
Dalam menyusun peta restriksi harus dilakukan suatu rangkaian
digesti restriksi. Jumlah dan ukuran fragmen yang dihasilkan oleh tiap-tiap
endonuklease restriksi harus ditentukan dengan elektroforesis gel,
kemudian dibandingkan dengan ukuran marka. Hasil yang didapat harus
didukung oleh hasil rangkaian digesti ganda, yaitu DNA dipotong dengan
dua enzim restriksi secara bersamaan. Pembandingan hasil digesti tunggal
dan digesti ganda akan memungkinkan pemetaan banyak tempat restriksi
(Glick & Pasternak, 1994).
Enzim restriksi dan situs restriksi pada pCambia 1380 :

(GSL Biotech, 2013)

IV. Alat dan Bahan
A. Alat
1. Lemari pendinginan dan freezer
2. Mikropipet
3. Mikrosentrifuga
4. Pemanas air (water bath)
5. Tabung Eppendorf
6. Tabung sentrifuga
7. Tip mikropipet
8. Termometer

B. Bahan
1. Enzim restriksi BamH1
2. Enzim restriksi EcoR1
3. Plasmid pCAMBIA

C. Gambar Alat

Mikropipet & Tip Tabung Eppendorf Tip mikropipet

V. Prosedur
Tabung Eppendorf kosong disiapkan. Selanjutnya dengan
menggunakan mikropipet, ke dalam tabung eppendorf tersebut
dimasukkan ddH
2
O sebanyak 6 L, lalu ditambahkan 2 L buffer Tango
dan 8 L plasmid pJ express. Setelah itu dilakukan pipetting. Selanjutnya
ditambahkan enzim restriksi XHO I 2 L dan NDE I 2 L, kemudian
diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 1 jam. Semua prosedur diatas dilakukan
secara aseptis. Setelah diinkubasi kemudian dilanjutkan dengan
elektroforesis.

VI. Data pengamatan
Pemetaan DNA plasmid
No. Perlakuan Hasil
1 Sebanyak 8 l ddH
2
O
dimasukkan ke dalam tabung
eppendorf, lalu ditambahkan
larutan buffer 10x sebanyak 2 l,
dan 8 l DNA plasmid yang akan
dipotong-potong.
Larutan belum tercampur sempurna.











2 Isi tabung eppendorf
dicampurkan.
Larutan menjadi homogen.

3 Ditambahkan enzim restriksi Eco
RI dan Bam HI sebanyak 2 l.
Enzim tercampur dengan larutan tadi.
4 Dilakukan inkubasi selama 1 jam
pada suhu 37
o
C.
Larutan berisi DNA plasmid yang telah
terfragmentasi siap di deteksi dengan
elektroforesis.









VII. Pembahasan
Pada praktikum kali ini dilakukan pemetaan DNA plasmid yang
bertujuan untuk memahami pemetaan DNA plasmid dengan pemotongan
atau restriksi menggunakan beberapa enzim restriksi. Prinsip percobaan
pemetaan DNA plasmid adalah DNA yang telah dipurifikasi di inkubasi
pada suhu 37
0
C dengan enzim restriksi (endonuklease restriksi)
menghasilkan DNA yang terpotong pada posisi yang sesuai dengan sisi
restriksi. Sedangkan kontrol negatif, yaitu sampel yang diinkubasi tanpa
penambahan enzim restriksi tetap utuh.
Prosedur pertama dimasukkan terlebih dahulu dd H
2
O atau aqua
bidestillata sebanyak 6 L ke dalam tabung eppendorf. Larutan dd H
2
O ini
digunakan sebagai zat untuk mempermudah proses pencampuran
komponen-komponen yang dimasukkan ke dalam tabung eppendorf.
Selain itu, ddH
2
O juga berfungsi untuk meresuspensikan endapan DNA.
Selanjutnya dimasukkan larutan buffer. Larutan buffer yang digunakan
adalah buffer Tango yang terdiri dari 33 mM Tris-acetate (pH 7.5 at
37C), 10 mM Mg-acetate, 66 mM K-acetate, 0.1 mg/mL BSA (Bovine
Serum Albumin). BSA pada buffer ini dapat mengikat kontaminan-
kontaminan yang mungkin ada pada sampel DNA. Buffer ini berfungsi
sebagai zat yang dapat menstabilkan enzim restriksi sehingga enzim dapat
memotong plasmid dengan sempurna. Kemudian dimasukkan plasmid p-
CAMBIA 1380 hasil isolasi sebelumnya sebanyak 8 L. Dan terakhir
dimasukkan enzim-enzim restriksi yang digunakan yaitu Eco R1 dan Bam
H1 masing-masing sebanyak 2 L. Enzim-enzim ini yang akan memotong
plasmid pada daerah restriksi tertentu. Kemudian dilakukan pengocokan
menggunakan vortex. Pengocokan dengan menggunakan vortex selama 5
detik dilakukan untuk mempercepat reaksi pemotongan DNA plasmid
dengan enzim restriksi. Volume akhir untuk komponen reaksi biasanya
berkisar antara 1050 L. Hal ini disebabkan karena pada volume akhir di
bawah 10 L terdapat kemungkinan yang besar untuk terjadinya kesalahan
pipeting sehingga volume akhir yang diperoleh tidak sesuai.
Enzim restriksi adalah enzim yang dapat memotong DNA. Enzim
restriksi yang diproduksi oleh bakteri dinamakan endonuklease yang
secara tipikal mampu mengenali 4 8 bp urutan nukleotida yang spesifik.
Urutan nukleotida yang spesifik tersebut dinamakan restriction site yang
secara umum merupakan sekuens palindromic (run back) yang pendek
dengan pola urutan sekuens yang sama ketika dibaca pada arah 5 3.
Sisi pengenalan enzim restriksi berbeda-beda pada suatu fragmen DNA.
Enzim restriksi yang digunakan pada praktikum kali ini adalah BamH1
dan EcoR1. Penggunaan dua enzim restriksi yang berbeda dilakukan
supaya DNA plasmid dapat terpotong dengan sempurna. Enzim restriksi
EcoR1 diisolasi oleh Herbert Boyer pada tahun 1969 dari
bakteri Eschericia coli. Enzim EcoR1 ini memutus atau memotong DNA
pada bagian urutan basa GAATTC (sekuens pengenal bagi Enzim EcoR1
adalah GAATTC). Pada DNA utas ganda, sekuen GAATTC ini akan
berpasangan dengan pasangan sekuen yang sama tetapi berlawanan arah.
Jadi pasangan GAATTC adalah CTTAAG. Pada pasangan sekuen ini
enzim EcoR1 ini memotong bagian antara A dan G. Sebagai akibatnya,
potongan-potongan atau fragmen-fragmen DNA utas ganda yang
dihasilkan akan memliki ujung berutas tunggal. Ujung seperti ini yang
dikenal dengan istilah sticky ends atau cohesive ends.
Enzim restriksi BamH1 diisolasi dari bakteri Bacillus
amylolyquefaciens. Enzim restriksi ini mengenali double strand dari DNA
dengan sekuens spesifik 5-GGATCC-3, yang selanjutnya memecah
ikatan fosfodiester antara dua residu G. Hasilnya adalah berupa dua
fragmen yang ujungnya sticky ends. Penambahan enzim restriksi sebagai
komponen terakhir pada reaksi disebabkan karena enzim restriksi
merupakan enzim yang tidak stabil. Oleh karena itu enzim restriksi
sebaiknya disimpan pada suhu -20
0
C dan -70
0
C untuk beberapa enzim
tertentu. Enzim ini harus tetap disimpan di dalam es ketika dikeluarkan
dari freezer. Selanjutnya, campuran DNA plasmid dan komponen-
komponen tadi diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37
o
C. Setelah
diinkubasi, dilakukan elektroforesis gel agarosa untuk melihat hasil
restriksi DNA menggunakan enzim EcoR1 dan Bam H1.

Berdasarkan literatur peta plasmid p-Cambia 1380 memiliki 8861
pasang basa (bp). Enzim EcoR1 memotong pada 8786 pasang basa (bp)
sedangkan enzim BamH1 memotong pada 8796 pasang basa (bp).
Sehingga secara teoritis, pemotongan dengan menggunakan enzim ini
menghasilkan dua fragmen DNA yaitu fragmen pertama sebesar 10 pasang
basa (bp) dan fragmen kedua sebesar 8851 pasang basa (bp). Kemudian
dilakukan analisis fragmen DNA untuk menentukan jumlah dan ukuran
fragmen yang dihasilkan oleh setiap endonuklease restriksi (enzim
restriksi) yang digunakan dengan metode elektroforesis gel agarosa.
Setelah dilakukan elektroforesis gel agarosa pada DNA plasmid
yang direstriksi menggunakan enzim EcoR1 dan Bam H1, didapatkan hasil
sebagai berikut:

DNA marker yang digunakan pada elektroforesis ini adalah DNA
ruler 1 kb (kilo basa). DNA marker ini digunakan karena diharapkan hasil
dari restriksi DNA plasmid dapat terlihat. DNA ruler 1 kB ini dapat
mendeteksi ukuran fragmen DNA dengan rentang 10.000 bp (terbesar)
sampai dengan 250 bp (terkecil). Pada kolom well kedua, yaitu tempat
meletakkan sampel DNA plasmid yang direstriksi, terlihat fluoresensi kuat
dari fragmen DNA plasmid di atas ukuran 10.000 bp dan fluoresensi
lemah pada rentang 8000 bp - 10.000 bp. Berdasarkan hasil pengamatan,
DNA plasmid yang terdeteksi oleh DNA marker 1 kb hanya fragmen DNA
plasmid yang kedua yaitu fragmen DNA pasmid dengan ukuran 8851 bp.
Fragmen DNA plasmid pertama dengan ukuran 10 bp tidak dapat
terdeteksi karena batas minimal yang dapat dideteksi oleh DNA ruler 1 kb
adalah fragmen dengan ukuran 250 bp. Oleh karena itu, diperlukan DNA
ruler yang lebih spesifik untuk mendeteksi adanya fragmen DNA plasmid
dengan ukuran 10 bp. Pada rentang 8000 bp 10.000 bp, terlihat adanya
fluoresensi yang sangat lemah sehingga diduga fragmen DNA plasmid
kedua (8851 bp) terletak di daerah tersebut namun dengan jumlah yang
sedikit. Dan terdapat fluorsensi kuat pada rentang di atas 10.000 bp. Hal
tersebut membuktikan bahwa terdapat DNA selain DNA plasmid yang
memiliki ukuran di atas 10.000 bp. DNA yang berukuran di atas 10.000 bp
diduga sebagai DNA lain yang bukan merupakan DNA plasmid. Hal ini
dikarenakan suatu DNA plasmid yang belum terpotong atau masih utuh
hanya berukuran 8861 bp.

VIII. Kesimpulan
Pemetaan DNA plasmid pada praktikum ini dapat dipahami.
Pemetaan DNA plasmid dilakukan dengan cara melakukan pemotongan
plasmid p-Cambia 1380 (8861 bp) dengan enzim restriksi EcoR1 dan
BamH1. Enzim EcoR1 memotong pada daerah bp 8786 dan BamH1
memotong pada bp 8796 sehingga dihasilkan 2 fragmen DNA dengan
ukuran 10 bp dan 8851 bp.









Daftar Pustaka
Brock, T. D., Michael T. Madigan, John M. Martinko and Paker. 1994. Biology of
Microorganisms. 7
th
edition. Prentice Hall. USA.
Brown, T.A. 2002. Genome 2
nd
Edition. Available online at
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=genomes.figgrp.6026
[diakses tanggal 29 Oktober 2013].
Glick, B.R. and J.J. Pasternak. 1994. Molekuler Biotechnology, Principles and
applications of Recombinan DNA. ASM Press. Washinton D.C
GSL Biotech. 2013. pCAMBIA1380. Available at :
http://www.snapgene.com/resources/plasmid_files/plant_vectors/pCAMBIA1
380/ [diakses tanggal 30 Oktober 2013]
Muladno. 2002. Teknik Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda. Bogor.
Pingoud, A. & Jeltsch, A. 2001. Structure and function of type II restriction
endonucleases. Available online at
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC55916/ [diakses tanggal 29
Oktober 2013]
Saputra A. 2008. Analisis ukuran kromosom dan pola restriksi Bacillus
thuringiensis dengan elektroforesis medan berpulsa. Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Suharsono & Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik
Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi,
IPB.