LAPORAN SEMENTARA

PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

“RESTRIKSI”

Disusun Oleh :
Nama : Muhammad Bagus Firdaus
NPM : 18025010179
Golongan : A3

PROGRAM STUDI AGROTEKNOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS PEMBANGUNAN NASIONAL “VETERAN” JAWA TIMUR
SURABAYA
2021
 I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

DNA (Deoxyribo Nukleid Acid) adalah macam asam nukleat yang
berhubungan dengan hereditas. Penemu DNA adalah seorang ahli kimia asal
Jerman Friederich Mieschier (1869), yang menyelidiki susunan kimia dari nucleus.
Berdasarkan hasil penelitian Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins pada DNA
dengan menggunakan sinar – X, James Watson dan Francis Crick (1953).
mengemukakan suatu model gen yang terkenal dengan nama double helix (tangga
tali berpilin ganda). Watson dan Crick mendapatkan hadiah nobel pada tahun 1962
atas penemuan tersebut. Deoxyribo Nukleid Acid mengandung informasi genetik
dari makhluk hidup, dan kebanyakan terdapat di dalam kromosom (Brown 2002)
Enzim restriksi memotong DNA double strands dengan memutus ikatan
kovalen di antara fosfat dari satu deoksiribonukleotida dengan gula dari
deoksiribonukleotida yang berbatasan dengannya. Terdapat dua tipe hasil
pemotongan, ujung rata (blunt end) dan ujung kohesif (sticky end). Ujung rata
(blunt end) dihasilkan ketika dua utas molekul dipotong pada posisi yang sama,
bagian akhirnya rata dan tidak ada nukleotida yang tidak berpasangan. Ujung
kohesif (sticky end) dihasilkan ketika setiap molekul DNA dipotong pada posisi
yang tidak sama sehingga salah satu utas (5’ atau 3’) menggantung dengan beberapa
nukleotida (Suharsono dan Widyastuti 2006).
Enzim restriksi yang berbeda memiliki situs pemotongan yang berbeda,
namun ada beberapa jenis enzim restriksi yang diisolasi dari sumber yang berbeda
memiliki situs pemotongan yang sama. Enzim restriksi memiliki palindrom yaitu
situs pengenalan enzim restriksi yang terdiri atas beberapa basa dan memiliki basa
komplemen yang sama. Enzim restriksi dengan situs pengenalan yang sama tetapi
situs pemotonganya berbeda disebut neoshizomer. Enzim restriksi dengan situs
pengenalan dan pemotongan yang sama disebut isoschizomer. Enzim restriksi yang
memiliki situs pengenalan berbeda tetapi ujung terminasinya identik
disebut isocaudomer (Solomon. dkk. 1993). Praktikum ini bertujuan memahami
dan dapat melakukan proses serta memahami dan dapat melakukan pemotongan
DNA dengan enzim restriksi.
1.2 Tujuan
Tujuan praktikum materi ini adalah praktikan mampu memahami prinsip
restriksi DNA dan mampu secara mandiri melakukan kegiatan restriksi DNA.
 II. TINJAUAN PUSTAKA

Enzim restriksi adalah enzim yang memotong dsDNA pada situ yang
spesifik. Enzim restriksi secara alami merupakan suatu mekanisme pertahanan
bakteri terhadap benda asing. Penamaan enzim restriksi biasanya berdasarkan
inangnya, misalnya EcoRI berasal dari bakteri E.coli. Enzim restriksi hanya
memotong pada situs yang spesifik dari DNA. Enzim restriksi akan menghasilkan
dua situs hasil pemotongan yang berbeda, yaitu blunt end dan sticky end. Blunt end
dapat disebabkan karena ujung dari DNA hasil pemotongan enzim restriksi
menghasilkan ujung yang tidak saling berpasangan. Sedangkan, dihasilkan ujung
sticky end dikarenakan ujung hasil pemotongan enzim restriksi menghasilkan basa
yang saling berkomplemen (Austin community, 2006).
Enzim restriksi yang pertama diisolasi adalah HmdII. Ada empat macam
enzim restriksi seperti, enzim restriksi tipe I, tipe II, tipe III, dan tipe IV. Enzim
restriksi akan mengenali situs DNA karena memiliki recognition site, biasanya
enzim restriksi akan mengenali sekuens nukleotida sebanyak 4 dan 8 nukleotida.
Nukleotida yang ada biasanya memiliki gugus palindrom yaitu bagian forward site
dan backward site memiliki sekuens yang sama (Nwankwo dan Abalaka, 2011).
Buffer berfungsi untuk melisiskan membran sel dan membran fosfolipid
bilayer,TE Buffer adalah campuran antara larutan Tris-HCl dengan EDTA pada
konsentrasi tertentu. ddH2O atau disebut juga aqua bidestillata atau ultrapure water,
adalah air yang sangat murni, lebih murni dari aquadest atau pun air reverse osmosis
karena telah melalui berbagai macam cara pemurnian. Biasanya ddH2O tidak perlu
disterilkan lagi menggunakan autoclave. Kedua pelarut di atas paling umum
digunakan untuk melarutkan DNA atau RNA, karena keduanya dapat melarutkan
DNA atau RNA dengan baik. DNA atau RNA akan lebih stabil jika dilarutkan
dalam TE buffer karena pH-nya djaga sekitar 8. Jika dilarutkan dalam ddH2O, ada
peluang untuk berubahnya pH. Ini dapat terjadi karena DNA dan RNA memiliki
sifat asam lemah. yang dalam waktu lama dapat menyebabkan degradasi
DNA/RNA, apalagi DNase juga bekerja pada pH yang sedikit asam. Jadi untuk
alasan kestabilan, buffer TE lebih unggul dibanding ddH2O. Larutan komposisi
merupakan larutan campuran yang terdiri dari DNA, EcoR1, Buffer 10x, dan
ddH2O (Lodish et al., 2000).
 II. METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum Biologi Molekuler materi IV “Restriksi” ini dilaksanakan pada
hari Jumat, 12 November 2021 pukul 09.20-11.00 WIB yang dilaksanakan secara
daring di rumah masing-masing praktikan.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat
Alat yang digunakan dalam praktikum ini yaitu waterbath, pipet
mikro, seperangkat alat elektroforesis, UV transluminator, rak berdiri untuk
tube eppendorf, pena marker (permanen) dan kamera.
3.2.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam praktikum ini yaitu enzim restriksi
BamHI (10 U/µL), buffer tango, DNA sampel, ddH2O, 1 kb DNA ladder,
10X BPB, 0,5X TBE, gel agarose, ethidium bromide, tip pipet, tissue,
masker, tube eppendorf, dan sarung tangan.

3.3 Langkah Kerja

a. Menyiapkan sekitar 500 ng DNA sampel yang akan direstriksi. Jika 1
µL DNA sampel memiliki konsentrasi 50 ng, maka jumlah DNA sampel
yang digunakan untuk mendapatkan konsentrasi 50 ng adalah 10 µL.
b. Membuat cocktail restriksi untuk DNA sampel dengan komposisi.
Bahan Konsentrasi Konsentrasi Kebutuhan (µL)
Stok yang
1 rx 4,5 rx
dibutuhkan
Enzim BamHI 10 U/ µL 4U 0,4 1,8

Buffer tango 10 x 2,5 x 2,5 11,25

DdH2O - - 12,1 54,45

Jumlah volume cocktail 15,0 67,5

c. Membagi larutan master mix cocktail tersebut ke dalam 4 tube
eppendorf berbeda (masing-masing sebanyak 15 µL) dan diberi label.
b. Menambahkan DNA sampel yang digunakan ke masing-masing tube
eppendorf dan di-tipping untuk menghomogenkan.
c. Menginkubasi larutan restriksi di dalam waterbath selama 3 jam dengan
suhu 30 °C.
d. Melaky inaktivasi pada suhu 60 °C selama 15 menit.
e. Melakukan analisis elektroforesis (menyertakan DNA sampel yang
belum direstriksi sebagai perbandingan.
 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

Tabel 1. Hasil Restriksi DNA
Gambar Keterangan

1 kb = marker 1 kb DNA ladder

M = lambda DNA (50 ng/µL)

A = hasil PCR gen target dengan

primer T7/SP6

B = hasil restriksi dari hasil PCR

(A) dengan enzim BamHI dan
SmaI

4.2 Pembahasan
Praktikum biomolekuler ini dilaksanakan secara daring dengan mengamati
video tentang restriksi. Menurut Suriasih (2015), enzim restriksi adalah protein
yang diproduksi oleh bakteri untuk menghentikan invasi oleh DNA asing yang
memotong DNA asing tanpa merusak basa nitrogen menjadi fragmen-fragmen
sehingga tidak dapat melakukan replikasi. Prinsip kerja dari enzim restriksi adalah
enzim berikatan dengan molekul DNA dan menyebabkan reaksi hidrolisa pada
ujung 5’ DNA dan terbatasnya perkembangan bacteriophage dalam sel inangnya.
Sekuen pengenalan sering disebut situs pengenalan merupakan sekuen
DNA yang menjadi tempat menempelnya enzim restriksi dan melakukan
pemotongan pada sekuen tersebut. Panjang sekuen pengenalan enzim restriksi
berbeda-beda, misalnya enzim EcoRI, SacI, dan SstI mempunyai sekuen
pengenalan sepanjang 6 pasang basa, sedangkan NotI 8 pasang basa, dan Sau3AI
hanya 4 pasang basa. Menurut Pandin (2010), kebanyakan dari enzim restriksi
bersifat palindromik yang berarti sekuen pengenalan sama jika dibaca dari sisi 5’
sampai 3’ baik utas atas maupun utas bawah.
 Enzim restriksi memiliki titik potong yang dapat memotong DNA asing
sehingga dapat ditentukan kekerabatan dari titik potong tersebut. Titik potong ini
akan dimasukkan ke dalam elektroforesis. Setiap enzim mempunyai sekuens
pengenalan yang unik pada utas DNA, biasanya sepanjang 4-6 pasang basa. Pada
umumnya enzim restriksi yang berbeda memiliki situs pengenalan yang berbeda.
Oleh karena itu, harus diketahui terlebih dahulu ruas-ruas restriksi yang mengapit
gen yang akan diisolasi. Selain itu, setiap enzim restriksi bersifat selektif sehingga
akan dikenali oleh nama dan runtutan basa ruas restriksinya.
Enzim restriksi secara tradisional dibagi menjadi 3 tipe berdasarkan
komposisi sub unit, posisi pemotongan, spesifisitas sekuens, dan kofaktor yang
diperlukan, yaitu enzim restriksi tipe I, enzim restriksi tipe II, dan enzim restriksi
tipe III. Menurut Effendi, dan Pambudi (2018), enzim restriksi tipe II adalah enzim
yang umum digunakan pada teknik molekular biologi. Enzim ini memotong DNA
dekat atau pada situs pengenalan, dan menghasilkan fragmen-fragmen sesuai yang
diinginkan sehingga umum digunakan untuk analisis DNA dan kloning gen.
Enzim yang digunakan dalam praktikum ini adalah enzim BamHI. Enzim
ini hanya mengenali urutan (sekuen) G*GATCC(hexanukleotid) dengan titik
potong antara G dan G. Suhu inkubasi enzim ini adalah 30 °C serta organisme
asalnya Bacillus amyloliquefaciens H. Indikator keberhasilan proses restriksi
adalah ada atau tidaknya DNA smear pada saar dilihat menggunakan sinar UV.
Berat molekul fragmen DNA yang sudah terpotong berbeda-beda karena kecepatan
migrasi molekul dari kutub negatif ke kutub positif pada saat elektroforesis juga
berbeda-beda sehingga DNA tidak berkumpul satu baris namun terjadi bayang-
bayang yang disebut semar. Semakin banyak smear DNA yang terjadi maka
semakin banyak fragmen DNA yang terpotong.
Hasil restriksi DNA yang telah dilakukan pada pengamatan praktikum ini
menunjukkan adanya pemotongan DNA sampel yang terjadi pada 1000 bp 1kb
DNA ladder, hasil restriksi DNA sampel terlihat jelas di bawah sinar UV dengan
arti tidak ada DNA smear. DNA sampel A merupakan DNA yang menjadi
pembanding dengan hasil isolasi dari praktikum hasil restriksi.
 V. KESIMPULAN

Berdasarkan kegiatan praktikum Biologi Molekuler materi Restriksi dapat

disimpulkan sebagai berikut:
1. Proses restriksi dibantu oleh enzin restriksi.
2. Enzim restriksi adalah enzim yang berfungsi memotong molekul DNA pada
rangka gula fosfat tanpa merusak basa nitrogen.
3. Sisi pengenalan enzim restriksi (recognition site) adalah sisi dimana enzim
restriksi dapat berikatan dan mengenal DNA.
4. Titik potong (cutting site) adalah sisi dimana enzim restriksi dapat
memotong DNA.
5. Enzim restriksi bekerja secara spesifik, enzim restriksi endonuklease
tersebut tidak dapat melakukan ‘scanning’ pada untain molekul DNA jika
tidak menemukan restriction sites yang spesifik.
 DAFTAR PUSTAKA

Austin Community. 2006. BIO 1406 Laboratory Manual 12th Ed. New York

Brown TA. 2002. Genomes 2nd edition. Oxford (UK): Willey – Liss.

Effendi, Y., dan A. Pambudi. 2018. Pedoman Praktikum Biologi Sel dan Molekuler
II. Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Al Azhar Indonesia. Jakarta.

Lodish H., Arnold B., Lawrence Z., Paul M., David B., James D.2000.Molecular
Cell biology. New York: White Freeman Company.

Nwankwo D.C., Abalaka M.E. 2011. Restriction Enzymes and Their Uses In
Specific Sequencing to Produce Predictable Fragment of DNA Making
Genetic Engineering Simply. Journal of Pharmaceutical Research And
Opinion, 1 (5): 148 – 152.

Pandin, D. S. Penanda DNA untuk Pemuliaan Tanaman Kelapa (Cocos nucifera

L.). Perspektif, 9 (1) : 21 – 35.

Solomon EP, Berg LR, Martin DW, Ville C. 1993. Biology 3nd ed. Florida (US):
Saunders College Publishing,.

Suharsono & Widyastuti, U. 2006. Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Bogor (ID):
Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi.

Suriasih, K. 2015. Pemotongan dan Menyambung DNA dalam Kloning Gen, Studi
pada Kloning Gen Prolidase dari Bakteri Asam Laktat. J. Ilmiah Teknologi
Pangan, 2 (1) : 78 – 88a.