BAB I

PENDAHULUAN

I.1 Latar belakang

Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus
pandang (transparan) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa sehingga sukar dilihat
karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama indeks bias
lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dan latar belakangnya dapat
dipertajam dengan cara mewarnai sel-sel tersebut dengan zat warna. Pewarna yang
digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang akan memberikan
reaksi kalau mengenai bagian tubuh jasad. Karena pewarna tersebut berbentuk ion yang
bermuatan positif ataupun negatif.
Pengenalan beberapa metode pengecatan, merupakan hal yang sangat penting
khususnya dalam mengidentifikasi bentuk morfologi pada mikroba. Pada mikroba tertentu,
Pengecatatan mikroba menjadi sangat penting bukan hanya untuk mengatahui bentuk
morfologi tumbuhan namun juga untuk mengetahui perbedaan-perbedaan

bentuk

morfologi mikroba itu berdasarkan karakteristiknya dalam berikatan dengan zat warna.
Pengecatan mikroba dalam praktikum ini, dilakukan terhadap berbagai jenis
bakteri dan dengan menggunakan beberapa zat pewarna, seperti kristal violet, metilen
biru, KI, safranin, karbolsuksin, malachite green, dan tembaha sulfat. Hal ini agar dapat
diketahui prinsip penggunaan masing-masing metoda tersebut terhadap mikroba uji.

I.2 Maksud dan Tujuan

I.2.1 Maksud percobaan
Mengetahui dan memahami teknik pengecatan bakteri.
I.2.2 Tujuan percobaan
Melakukan pengecatan sederhana dan negatif pada bakteri E.coli dan Bacillus
subtilis.
Melakukan pengecatan gram pada bakteri E-coli, Staphylococcus aureus dan
Bacillus subtilis.
Melakukan pengecatan tahan asam pada bakteri Mycobacterium dan Bacillus
subtilis.
Melakukan pengecatan kapsul pada bakteri Acetobacter aceti dan Proteus
vulgaris
Melakukan pengecatan spora pada bakteri Bacillus subtilis dan Clostridium sp

I.3 Prinsip Percobaan

Pengamatan morfologi bakteri E.coli dan Bacillus subtilis. dengan pengecatan
sedrrhana berdasarkan penambahan warna metilen biru dengan pengamatan di
bawah mikroskop dengan perbesaran 1 x 40.
Pengamatan morfologi bakteri E.coli dan Bacillus subtilis. dengan pengecatan
negatif berdasarkan penambahan tetesan nigrosin pada ujung gelas objek
bersama inokulum yang digeserkan dengan gelas objek lain yang digeser

perlahan-lahan hingga membentuk lapisan tipis dan diamati di bawah mikroskop

dengan perbesaran 1 x 40.
Pengamatan warna bakteri dengan melakukan pengecatan gram pada bakteri
E-coli, Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis menggunakan tetesan gram
A, gram B, gram C dan gram D yang diteteskan secara berturut-turut dan
diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1 x 40 yang ditandai dengan
perubahan warna menjadi ungu untuk bakteri gram positif dan berwarna merah
untuk gram negative.
Pengamatan warna bakteri dengan melakukan pengecatan tahan asam pada
bakteri Mycobacterium dan Bacillus subtilis menggunakan pengecat karbolfuksin, lalu dicuci dengan alkohol asam sampai berwrna kemerahan dan
penambahan metilen biru dan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran
1 x 40.
Pengamatan struktur bakteri dengan melakukan

pengecatan kapsul pada

bakteri Acetobacter aceti dan Proteus vulgaris dengan menggunakan kristal

violet dan dibilas dengan CuSO 4 dan diamati di bawah mikroskop dengan
perbesaran 1 x 40.
Pengamatan letak dan bentuk spora, sel vegetatif dan struktur bakteri dengan
melakukan pengecatan spora pada bakteri Bacillus subtilis dan Clostridium sp
menggunakan hijau malakit dan safranin berturut-turut dan diamati di bawah
mikroskop dengan perbesaran 1 x 40.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Teori Umum

Tujuan dari pewarnaan tersebut ialah untuk (1:42):
1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi maupun fungi.
2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.
3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.
4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikasn sehingga sifat-sifat fisik dan
kimia yang ada akan dapat diketahui.
Secara kimiawi, zat warna yang digunakan untuk mengamati mikroorganisme
bersifat (2:21-22):
1. Basa, bila zat warna yang digunakan memiliki muatan pada bagian kationnya. Zat
warna ini biasanya mewarnai struktur sel yang bersifat asam.
Contoh zat warna basa :
Biru metil
Kristal violet
Fuksin basa
Karbol fuksin

2. Asam, bila zat warna yang digunakan memiliki muatan pada bagian anionnya. Zat
warna ini biasanya mewarnai struktur sel yang bersifat basa.
Contoh zat warna asam :
Eosin dalam bentukgaram Na-cosin
Fuksin asam
3. Netral, bila zat warna merupakan garam yang terdiri dari zat warna asam dan basa.
Langkah-langkah utama dalam mempersiapkan spesimen mikroba yang diwarnai
untuk pemeriksaan mikroskopik (3:82) :
1. Penempatan olesan, atau lapisan tipis spesimen, pada kaca objek.
2. Fiksasi olesan itu pada kaca objek, biasanya dengan pemanasan, menyebabkan
mikroorganisme itu melekat pada kaca objek.
3. Aplikasi pewarna tunggal (Pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan pewarna
atau reagen (Pewarnaan diferensial).
Fiksasi yang dilakukan sebelum zat warna digunakan, bertujuan untuk (1:43) :
1. Melekatkan sel pada gelas objek.
2. Membunuh mikroba, karena sel dalam keadaan mati lebih muda diwarnai dari pada sel
dalam keadaan hidup.
3. Melepaskan granular protein menjadi gugus reaktif NH 3+ yang akan bereaksi dengan
gugus OH- dari satu warna.

4. Mencegah terjadinya otolisis sel yaitu proses pecahnya sel yang disebabkan oleh
enzim yang ada di dalamnya.
5. Merubah daya ikat satu warna.
A. Pewarnaan Sederhana
Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan 1 macam zat warna untuk
meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazimnya prosedur
pewarnaan ini menggunakan zat warna basa. Seperti kristal violet, biru metilen, karbol
fuksin basa, safranin atau hijau malakit. Kadang kala digunakan zat warna negatif
untuk pewarnaan sederhana; zat warna asam yang sering digunakan adalah nigrosin
dan merah kongo (4:16).
Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan
bermacam-macam tipe morfologi (kokus, basilus, vibrio, spirilum, dan sebagainya) dari
bahan-bahan lainnya yang ada pada olesan yang diwarnai. Di samping itu dapat pula
diamati struktur-struktur tertentu seperti endospora. berbeda denga spesimen hidup,
sel-sel yang diwarnai terfiksasi pada kaca objek sehingga dapat disimpan sebagai
dokumentasi untuk jangka waktu lama (5:99).
B. Pewarnaan Negatif
Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi
mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. Pada metode ini mikroba dicampur
dengan tinta Cina atau nigrosin, kemudian digesekkan di atas kaca obyek. Zat
warna tidak akan mewarnai bakteri, akan tetapi mewarnai lingkungan sekitar

bakteri. Dengan mikroskop, mikroba akan terlihat tidak berwarna dengan latar
belakang berwarna (4:17).

C. Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram memilah bakteri mejadi kelompok Gram positif dan Gram
negatif. Bakteri-Gram positif berwarna ungu disebabkan kompleks zat warna kristal
violet-yodium tetap dipertahankan meskipun diberi larutan pemucat, sedangkan bakteri
Gram-negatif berwarna merah karena kompleks tersebut larut sewaktu pemberian
larutan pemucat dan kemudian mengambil zat warna kedua yang berwarna merah.
Perbedaan hasil dalam pewarnaan ini disebabkan perbedaan struktur kedua kelompok
bakteri tersebut (4:18).
Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri positif Gram
dan negatif Gram (6:15)

Ciri

Positif gram

Negatif gram

Lebih tebal

lebih tipis

1-4%

11-22%

tidak larut

Larut

3. Kepekaan terhadap yodium

lebih peka

kurang peka

4. Toksin yang dibentuk

eksotoksin

endotoksin

5. Resistensi terhadap tellurit

lebih tahan

lebih peka

1. Dinding sel
lapisan peptidoglikan
kadar lipid
2. Resistensi terhadap alkali
(1%KOH)

6. Sifat tahan asam

ada yang tahan asam

tidak ada yang tahan asam

tahan asam

D. Pewarnaan Ziehl-Neelsen
Pewarnaan Ziehl-Neelsen atau pewrnaan tahan asam memilahkan kelompok
Mycobacterium dan Nocardia dari bakteri lainnya. Kelompok bakteri ini disebut tahan
asam karena dapat mempertahankan

zat warna pertama (karbol fuksin) sewaktu

dicuci dengan larutan pemucat (4:21).

Sekali sitoplasma terwarnai maka sel-sel mikroorganisme seperti mikobakteri
menahan zat warna tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat
yang bersifat keras seperti asam alkohol (yaitu 3% HCl dalam etanol 95%). Alkohol
asam ini merupakan pemucat yang sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan
alkohol-aseton yang banyak digunakan dalm prosedur pewarnaan Gram (5:108).
E.

Pewarnaan Khusus
1. Pewarnaan Kapsel
Kapsel merupakan lapisan yang melekat di luar dinding selyang terdiri dari
polisakarida atau polipeptida dengan tebal sekitar 1-2 m. Kapsel berfungsi untuk
melekatkan diri pada permukaan dan melindungi bakteri terhadap sel fagosit (4:23).
Lapisan kapsel cukup tebal, sehingga dapat dilihat dengan mikroskop cahaya,
namun demikian sulit diwarnai sehingga digunakan pewarnaan spesimen atau
prosedur pewarnaan khusus lainnya. Pada pewarnaan spesimen, latar belakang
diwarnai zat warna spesimen, sedangkan bakteri diwarnai dengan zat basa. Kapsel
tidak akan menyerap warna sehingga terlihat sebagai lapisan terang-tembus
dengan latar belakang yang berwarna (4:23).

2. Pewarnaan Spora
Spora pada bakteri merupakan struktur yang tahan panas dan bahan kimia. Spora
dibentuk oleh bakteri tertentu untuk mengatasi lingkungan yang tidak
menguntungkan bagi bakteri (4:24).
Sifat endospora yang demikian itu menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang
keras untuk mewarnainya. Hanya bila diberi perlakuan panas yang cukup, pewarna
yang sesuai dapat menembus endospora (5:112).
3. Pewarnaan Flagela
Flagela merupakan struktur yang sangat tipis dan panjang bakteri dapat bergerak
karena mempunyai flagella. Ketebalan flagella sekitar 0,025 m sehingga sulit
terlihat dengan mikroskop cahaya (4:26).
Cat bakteri adalah senyawa garam, cat ini dibagi menjadi dua macam yaitu cat
basis dan cat asam tergantung pada muatan listrik cat.
1. Cat asam
Cat yang ion catnya (khromofornya) adalah anion-anion dan kation-kationnya Na +,
K+,Ca++,NH4++. Asam pikrat adalah zat asam yang menghasilkan khromogen nionik.
2. Cat basis
Yaitu garam-garam cat yang ion-ion (khromofornya) adalah ktion (bermuatan +)
misalnya methylene blue, safranin, dan lain-lain. Sedang anion pada umunya ialah Cl -,
SO4,, asetat dan oksalat

II.2 Uraian Bahan

1. Alkohol (FI III : 65)
Nama resmi

: Aethanolum

Sinonim

: Etanol, alkohol

RM / BM

: C2H6O / 46,06

Pemerian

Cairan tidak berwarna, jernih, mudah menguap dan mudah

bergerak, bau busuk, rasa panas. Mudah terbakar dengan
memberikan nyala biru yang tidak berasap.

Kelarutan

: Sangat mudah larut dalam air, dalam kloroform P, dan dalam eter
P.

Penyimpanan

: Dalam wadah tertutup rapat, terlindung dari cahaya, ditempat

sejuk, jauh dari nyala api.

Kegunaan

: Sebagai pelarut, pencuci

2. Aquadest (FI III : 96)

Nama resmi

: Aqua Destillata.

Nama lain

: Air suling/aquades.

RM/BM

: H2O/18,02.

Pemerian

: Cairan jernih, tidak berwarna, tidak berbau, dan tidak mempunyai

rasa.

Penyimpanan

: Dalam wadah tertutup baik.

Kegunaan

: Sebagai pelarut, pencuci

3. Iodium (FI III : 684)

Nama Resmi

: Iodum

Sinonim

: Iod

RM / BM

: I / 126, 90

Pemerian

: Keping / granul, berat hitam keabuan, bau khas, berkilauan

seperti metal

Kelarutan

: Sangat sukar larut dalam air, mudah larut dalam karbon sulfida,
dalam kloroform, dalam karbon tetraklorida dalam eter larut
dalam etanol, agak sukar larut dalam gliserin

Penyimpanan

: Dalam wadah tertutup rapat

Kegunaan

: Bahan pewarna

4. Karbol fuchsin (FI III : 676)

5. Kristal violet (FI III : 698)
Nama resmi

: Kristal violet

Pemerian

: Hablur berwarna hijau tua.

Kelarutan

: Sukar larut dalam air, etanol (95 %)P, dan dalam asetat glasial P,
dalam larutan berwarna lembayung tua.

Penyimpanan

: Dalam wadah tertutup rapat

Kegunaan

: Bahan pewarna

6. Larutan mordan (FI

7. Malacit hijau (FI III : 682)
8. Metil biru (FI III : 381)

Nama resmi

: Methilthionini chloridum

Sinonim

: Basic blue

RM / BM

: C16H18ClN3S.H2O / 372, 90

Pemerian

: Serbuk mengkilap, seperti logam atau suram kehijauan tua atau

serbuk warna coklat, hampir tidak berbau, higroskopik.

Kelarutan

: Larut dalam 40 bagian air, dalam 100 bagian etanol (95%) P, dan
450 bagian kloroform.

Penyimpanan

: Dalam wadah tertutup rapat

Kegunaan

: Bahan pewarna

9. Nigrosin (FI
10. Safranin (FI
11. Tembaga (II) Sulfat (FI III : 731)
Nama resmi

: Cupri sulfas

Nama lain

: Tembaga (II) sulfat

RM

: CuSO

Pemerian

: Prisma triklinik atau serbuk hablur; biru.

Kelarutan

: Larut dalam tiga bagian air dan dalam tiga bagian gliserol P,
sangat sukar larut dalam etanol (95%) P.

Penyimpanan

: Dalam wadah tertutup rapat.

Kegunaan

: Sebagai pembilas warna kristal violet.

II.3 Uraian Mikroba

1. Escherichia coli (1:123, 8:9)
Dunia

: Procaryotae

Divisio

: Scotobacteria

Kelas

: Bacteria

Ordo

: Eubacteriales

Suku

: Enterobacteriaceae

Genus

: Escherichia

Spesies

: Escherichia coli

Morfologi

: Termasuk bakteri batang anaerobik fakultatif gram negatif, batang

pendek (0,5-1,0 x 1,0-3,0 m), sel-selnya peritrikus (yakni flagella
secara merata tersebar di seluruh permukaan sel) atau nonmotil.
Bakteri ini, karena merupakan penghuni normal dalam saluran
pencernaan manusia dan hewan, maka digunakan secara luas sebagai
indikator pencemaran (3:169-170).

2. Bacillus subtilis (1:123, 8:9)

Dunia

: Procaryotae

Divisio

: Scotobacteria

Kelas

: Bacteria

Ordo

: Eubacteriales

Suku

: Bacillaceae

Genus

: Bacillus

Spesies

: Bacillus subtilis

Morfologi

: Termasuk bakteri kelompok batang aerobik, motil karena flagella. Ciri

pembeda yang menonjol dari bakteri ini ialah kemampuannya
membentuk endospora (3:176).

3. Staphylococcus aureus (1:123, 8:9)

Dunia

: Procaryotae

Divisio

: Scotobacteria

Class

: Bacteria

Ordo

: Eubacteriales

Familia

: Micrococcaceae

Genus

: Staphylococcus

Species

: Staphylococcus aureus

Morfologi

: Termasuk bakteri kelompok kokus gram positif, berbentuk kokus

terdapat tunggal atau berpasangan dalam paket, atau bergerombol,
nonmotil, anaerobik fakultatif atau mikroaerofilik (3:175).

4. Mycobacterium sp. (1:123, 8:9)

Dunia

: Procaryotae

Divisio

: Scotobacteria

Kelas

: Bacteria

Ordo

: Actinomycetales

Suku

: Mycobacteriaceae

Genus

: Mycobacterium

Spesies

: Mycobacterium sp.

Morfologi

: Merupakan bakteri gram positif, nonmotil, bentuk selnya beragam dan

pleomorfik, bentuk batang tak beraturan, filamen, dan filamen
bercabang; struktur miselium (3:178).

5. Acetobacter sp. (1:123, 8:9)

Dunia

: Procaryotae

Divisio

: Scotobacteria

Class

: Bacteria

Ordo

: Acetobacteriales

Famili

: Acetobacteriaceae

Genus

: Acetobacter

Species

: Acetobacter sp.

Morfologi

: Sel berupa bola. Tidak mempunyai endospora. Gram negatif, aerob.

Dapat mengikat N2 bebas. Habitatnya ditanah.

6. Proteus vulgaris (1:123, 8:9)

Dunia

: Procaryotae

Divisio

: Scotobacteria

Kelas

: Bacteria

Ordo

: Eubacteriales

Suku

: Enterobacteriaceae

Genus

: Proteus

Spesies

: Proteus vulgaris

Morfologi

: Bakteri berbentuk batang pendek dengan ukuran 0,5 m x 3,0 m,

gram negatif, tidak berspora, gerak positif dengan flagel peritrik
(6:155).

7. Clostridium sp. (1:123, 8:9)

Dunia

: Procaryotae

Divisio

: Scotobacteria

Kelas

: Bacteria

Ordo

: Eubacteriales

Suku

: Bacillaceae

Genus

: Clostridium

Spesies

: Clostridium sp.

Morfologi

: Termasuk bakteri berbentuk kelosan benang yang kecil. Biasanya

berflagel peritrik, sehingga dapat bergerak. Merupakan bakteri Gram
positif, pembentuk endospora, bersifat anaerobik (3:176, 6:126).

BAB III
METODE KERJA

III.1 Alat dan Bahan

III.1.1 Alat
Botol semprot
Botol steril
Mikroskop
Objek dan deck glass
Ose bulat
Ose lurus
Pipet tetes
Spiritus
Spoit
Tabung reaksi
III.1.2 Bahan
Alkohol asam
Aquadest
Biakan bakteri Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus,
Mycobacterium sp, Acetobacter sp, Proteus vulgaris dan Clostridium sp

CuSO 20%
Kertas isap
Kristal violet
Larutan Karbol Fuksin
Larutan hijau Malakit
Larutan Mordan (iodium)
Larutan Nigrosin
Larutan Safranin
Metilen biru
Tissue

III.2 Cara Kerja

A. Pengamatan morfologi bakteri
1. Pengecatan sederhana
Diambil 1 ose suspensi bakteri Escherichia coli.
Diratakan diatas objek glass.
Difiksasi di atas lampu spiritus.
Ditetesi metilen biru sebanyak 1-2 tetes, dibiarkan selama 1-2 menit.
Dicuci dengan air mengalir, sisa air dikeringkan dengan kertas isap.
Diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 10x10.

 Digambar bentuk morfologinya.

Diulangi cara yang sama untuk Bacillus subtilis.

2. Pengecatan negatif
Diletakkan setetes nigrosin pada ujung objek glass.
Dimasukkan inokulum bakteri Escherichia coli dari ose kedalam nigrosin,
dicampurkan.
Diambil objek glass lain lalu diletakkan di sebelah luar nigrosin dengan posisi
miring (30).
Objek glass digeser secara perlahan-lahan hingga membentuk lapisan tipis.
Diamati dibawah nikroskop dengan perbesaran 10x10
Digambar bentuk morfologinya.
Diulangi cara yang sama untuk Bacillus subtilis.
B. Pengamatan jenis bakteri (pewarnaan diferensial)
1. Pengecatan Gram
Disiapkan preparat olesan bakteri Staphylococcus aureus kemudian difiksasi.
Diteteskan sebanyak 2-3 tetes kristal violet, dibiarkan selama 1 menit kemudian
dicuci dengan air mengalir dan kelebihannya dikeringkan dengan kertas isap.
Diteteskan 1 tetes larutan Mordan, dibiarkan selama 30 detik kemudian dicuci
dengan air mengalir dan kelebihannya dikeringkan dengan kertas isap.

 Diteteskan 1 tetes etanol 95%, dibiarkan selama 20 detik kemudian dicuci

dengan air mengalir dan kelebihannya dikeringkan dengan kertas isap.
Diteteskan 1 tetes larutan safranin kemudian dicuci dengan air mengalir dan
kelebihannya dikeringkan dengan kertas isap.
Diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 10x10.
Diamati warna mikroorganismenya.
Diulangi cara yang sama untuk Bacillus subtilis dan Escherichia coli.
2. Pengecatan tahan asam
Diambil satu ose biakan Mycobacterium sp suspensikan kemudian diratakan di
atas gelas objek
Dikering anginkan lalu difiksasi.
Preparat ditutup dengan kertas saring.
Ditambahkan 1 tetes larutan karbol fuksin kemudian dipanasi selama 3-5 menit
setelah itu dibuka kertas saring, didinginkan lalu dicuci dengan air mengalir.
Dicuci dengan larutan alkohol asam, sibiarkan selama 20 detik lalu dicuci
dengan air mengalir kemudian dikeringkan.
Ditambahkan metilen blue lalu dicuci dengan air mengalir.
Diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 10x10 dan diamati warna
mikroorganismenya.
Diulangi cara yang sama untuk Bacillus subtilis.
C. Pengamatan struktur sel bakteri

1. Pengecatan spora
Disterilkan alat-alat
Disiapkan preparat olesan bakteri Bacillus subtilis.
Diambil 1 ose suspensi bakteri lalu diletakkan di atas gelas objek.
Ditutup preparat dengan kertas isap.
Diteteskan larutan hijau malakit.
Dipanaskan preparat diatas spiritus selama beberapa menit hingga preparat
tidak terlalu kering.
Diangkat kertas isap, preparat dicuci dengan air mengalir.
Ditetesi dengan safranin.
Dikeringkan dengan kertas saring.
Diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 10x10.
Digambar hasil pengamatan.
Diulangi cara yang sama untuk Clostridium sp.
2. Pengecatan kapsul
Disterilkan alat-alat
Disiapkan preparat olesan bakteri Acetobacter sp.
Diambil 1 ose suspensi bakteri lalu diletakkan di atas gelas objek.
Ditetesi dengan larutan kristal violet hingga menggenangi preparat.
Dibilas dengan CuSO, kelebihannya dikeringkan dengan kertas isap.

 Diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 10x10 dan digambar.

Diulangi cara yang sama untuk Proteus vulgaris.

BAB IV
HASIL PENGAMATAN

IV.1 Data pengamatan

Metode Pewarnaan
Pewarnaan sederhana
Pewarnaan negatif
Pewarnaan Gram

Pewarnaan tahan asam

Pewarnaan kapsul
Pewarnaan spora

Bakteri
Eschericia coli

Warna yang diamati

Latar warna ungu, sel biru

Bacillus subtilis

Latar warna ungu, sel biru

Eschericia coli

Latar warna merah muda, sel bening

Bacillus subtilis

Latar warna Biru tua, sel biru muda

Staphylococcus aureus

Biru ungu

Bacillus subtilis

Biru ungu

Eschericia coli

Merah muda

Mycobacterium sp.

Latar merah, sel biru

Bacillus subtilis

Latar merah, sel putih

Acetobacter sp.

Kapsul biru pucat, sel ungu

Proteus vulgaris

Violet

Bacillus subtilis

Merah

Clostridium sp.

Spora warna hijau, sel vegetatif warna

merah

IV.2 Gambar Pengamatan

LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN
Keterangan :
A. Eschericia coli
B. Bacillus subtilis

Bakteri

: E. coli dan B. subtilis

Metode

: Pewarnaan sederhana

1.

Bentuk sel bakteri

2.

Latar belakang

LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN
Keterangan :
A.

Eschericia coli

B.

Bacillus subtilis
1. Bentuk sel bakteri
2. Latar belakang

Bakteri

: E. coli dan B. subtilis

Metode

: Pewarnaan negatif

LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN
Keterangan :
A. Staphylococcus aureus
B. Eschericia coli
C. Bacillus subtilis
1. Bentuk sel bakteri
2. Latar belakang

Bakteri

: S. Aureus, E. coli dan B. subtilis

Metode

: Pewarnaan gram

LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN
Keterangan :
A. Mycobacterium sp.
B. Bacillus subtilis
1. Bentuk sel bakteri
2. Latar belakang

Bakteri

: Mycobacterium sp. dan B. subtilis

Metode

: Pewarnaan tahan asam

LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN
Keterangan :
A.

Acetobacter sp.

B.

Proteus vulgaris
1. Bentuk sel bakteri
2. Latar belakang

Bakteri

: Acetobacter sp. dan P. vulgaris

Metode

: Pewarnaan kapsul

LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN
Keterangan :
A. Clostridium sp.
B. Bacillus subtilis
1. Bentuk sel bakteri
2. Latar belakang

Bakteri

: Clostridium sp. dan B. subtilis

Metode

: Pewarnaan spora

BAB V
PEMBAHASAN

Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus

pandang (transparan) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa sehingga sukar dilihat
karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama indeks bias
lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dan latar belakangnya dapat dipertajam
dengan cara mewarnai sel-sel tersebut dengan zat warna.
Tujuan dari pewarnaan tersebut ialah untuk:
1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi maupun fungi.
2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.
3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.
4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikasn sehingga sifat-sifat fisik dan kimia
yang ada akan dapat diketahui.
Percobaan ini dilakukan untuk mengetahui bentuk dan morfologi dari berbagai jenis
bakteri dengan melakukan pengamatan dengan pengecatan/pewarnaan mikroba. Pengecatan
yang dilakukan untuk pengamatan morfologi bakteri meliputi pengecatan sederhana dan
pengecatan negatif. Untuk pengamatan jenis bakteri dilakukan dengan pengecatan gram dan
pengecatan tahan asam. Dan untuk pengamatan struktur sel bakteri dilakukan dengan
pengecatan kapsul dan pengecatan spora.

1. Pengamatan morfologi bakteri

Pewarnaan sederhana
Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk
meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Pengecatan
sederhana ini dilakukan karena sel-sel bakteri umumnya tembus cahaya karena
sitoplasma sel memiliki indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias lingkungan
yang bersifat cair. Lazimnya prosedur pewarnaan ini menggunakan zat warna basa.
Seperti kristal violet, biru metilen, karbol fuksin basa, safranin atau hijau malakit.
Kadang kala digunakan zat warna negatif untuk pewarnaan sederhana; zat warna
asam yang sering digunakan adalah nigrosin dan merah kongo.
Pada percobaan ini digunakan bakteri Eschericia coli dan Bacillus subtilis
dengan zat warna metilen biru. Adapun fungsi penambahan zat warna tersebut adalah
untuk memberikan warna pada sel bakteri agar mudah diamati karena dapat bereaksi
dengan sitoplasma bakteri yang bersifat basofilik. Dinding sel bakteri bermuatan negatif
dan pewarna yang digunakan bermuatan positif sehingga dinding sel bakteri tersebut
dapat mengikat pewarna metilen biru
Pada pewarnaan bakteri Eschericia coli terlihat bentuk sel menyerupai batang
pendek berwarna biru dengan latar belakang berwarna ungu, sedangkan pada
pewarnaan bakteri Bacillus subtilis terlihat bentuk sel batang kecil yang juga berwarna
biru dengan latar belakang warna ungu.

 Pewarnaan Negatif
Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi
mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. Pewarnaan negatif ini dilakukan untuk
mewarnai latar belakang preparat. Pada metode ini mikroba dicampur dengan tinta
Cina atau nigrosin, kemudian digesekkan di atas kaca obyek. Zat warna tidak akan
mewarnai bakteri, akan tetapi mewarnai lingkungan sekitar bakteri. Dengan mikroskop,
mikroba akan terlihat tidak berwarna dengan latar belakang berwarna.
Pada percobaan ini digunakan bakteri Eschericia coli dan Bacillus subtilis
dengan zat warna nigrosin yang bermuatan negatif. Adapun fungsi penambahan zat
warna yang bermuatan negatif yaitu akan menyebabkan zat warna tersebut mewarnai
permukaan sel bakteri yang bermuatan positif.
Pada pewarnaan bakteri Eschericia coli terlihat latar belakang berwarna biru
dan selnya tidak berwarna, sedangkan pada pewarnaan bakteri Bacillus subtilis terlihat
latar belakang berwarna biru tua dan sel berwarna biru muda dan sedikit bening.
2. Pengamatan jenis bakteri (pewarnaan diferensial)
Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram memilah bakteri mejadi kelompok Gram positif dan Gram
negatif. Bakteri Gram-positif adalah bakteri yang mengikat cat utama sehingga tidak
dilunturkan oleh cat peluntur dan tidak terwarnai lagi oleh cat penutupnya. Bakteri jenis
ini akan berwarna ungu sesuai dengan pewarna utamanya yaitu kristal violet karena

disebabkan kompleks zat warna kristal violet-yodium tetap dipertahankan meskipun

diberi larutan pemucat. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang daya ikatnya dengan
cat utama tidak kuat sehingga dapat dilunturkan dan dapat terwarnai lagi dengan
adanya cat penutup. Bakteri jenis ini akan berwarna merah sesuai warna dari cat
penutupnya yaitu safranin, karena kompleks tersebut larut sewaktu pemberian larutan
pemucat dan kemudian mengambil zat warna kedua yang berwarna merah.
Perbedaan hasil dalam pewarnaan ini disebabkan perbedaan struktur dinding
sel kedua kelompok bakteri tersebut. Dinding sel bakteri gram negatif susunannya lebih
rumit dari dinding sel bakteri gram positif. Bakteri gram negatif memiliki dua lapisan
dinding sel yaitu lapisan luar yang tersusun atas lipopolisakarida dan protein, serta
lapisan dalam yang tersusun atas peptidoglikan. Sedangkan bakteri gram positif
memiliki dinding sel yang hanya tersusun atas satu lapis sel saja yaitu lapisan
peptidoglikan yang relatif tebal. Karena struktur dinding sel inilah sehingga bakteri gram
positif dapat mengikat dengan kuat iodin yang terdapat pada pewarna utama metilen
biru dan pada bakteri gram negatif ikatan ini tidak kuat.
Pada percobaan ini digunakan bakteri Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis
dan Eschericia coli dengan kristal violet sebagai zat pewarna awal, larutan mordan
yaitu iodium, etanol 95% sebagai larutan pemucat/peluntur warna dan safranin sebagai
zat warna kedua.
Pemberian kristal violet akan menyebabkan bakteri tersebut berwarna ungu,
lalu ditambahkan larutan mordan (iodium) yang berfungsi untuk meningkatkan afinitas
pengikatan zat warna oleh bakteri menjadi lebih kuat. Selanjutnya ditambahkan larutan

pemucat untuk melarutkan zat warna dimana bakteri Gram positif akan tetap berwarna
ungu karena kompleks persenyawaan kristal violet-iodium tetap terikat pada dinding
sel. Sedangkan pada bakteri Gram negatif berwarna pucat atau tidak berwarna karena
larutan pemucat melarutkan lipida dan menyebabkan pori-pori dinding sel membesar,
sehingga meningkatkan daya larut persenyawaan kristal violet-iodium pada dinding sel.
Pada pewarnaan bakteri Eschericia coli terlihat selnya berwarna merah muda
yang berarti termasuk bakteri Gram negatif, sedangkan pada Bacillus subtilis dan
Staphylococcus aureus berwarna biru ungu yang berarti termasuk bakteri Gram positif.
Hasil yang diperoleh pada bakteri Eschericia coli dan Staphylococcus aureus sudah
sesuai dengan pustaka yang ada, sedangkan bakteri Bacillus subtilis menurut pustaka
adalah bakteri gram negatif. Hasil yang diperoleh dari bakteri Bacillus subtilis ini tidak
sesuai pustaka. Hal ini mungkin disebabkan karena kesalahan prosedur dalam
pengamatan pada bakteri ini.
Pewarnaan tahan asam
Pewarnaan Ziehl-Neelsen atau pewarnaan tahan asam memilahkan kelompok
Mycobacterium dan Nocardia dari bakteri lainnya. Kelompok bakteri ini disebut tahan
asam karena dapat mempertahankan zat warna pertama (karbol fuksin) sewaktu
dicuci dengan larutan pemucat.
Pada percobaan ini digunakan bakteri Mycobacterium sp. dan Bacillus subtilis
dengan karbol fuksin sebagai zat warna awal, Alkohol-asam sebagai larutan pemucat
dan metilen biru sebagai zat pewarna kedua.

Pada pewarnaan tahan asam, diadakan pemanasan setelah penambahan

karbol fuchsin yang berfungsi agar zat warna dapat masuk ke dalam sel bakteri yang
dilapisi oleh lipid. Zat warna awal yaitu karbol fuksin merupakan fuksin basa yang
dilarutkan dalam larutan fenol 5%. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu
penyerapan/pemasukan zat warna ke dalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan.
Selanjutnya ditambahkan larutan pemucat untuk melarutkan zat warna. Dan biru
metilen sebagai zat warna kedua tidak akan menyebabkan perubahan warna merah
pada bakteri tahan asam sedangkan pada bakteri tidak tahan asam biru metilen akan
diikat oleh sel bakteri yang tidak berwarna.
Dari hasil pengamatan terlihat bahwa bakteri Mycobacterium sp. berwarna
merah dan Bacillus subtilis berwarna bening. Hal ini menunjukkan bahwa
Mycobacterium sp. tergolong bakteri tahan asam, sedangkan bakteri Bacillus subtilis
tergolong bakteri yang tidak tahan asam.
3. Pengamatan struktur sel bakteri
Pewarnaan kapsul
Lapisan kapsul cukup tebal, sehingga dapat dilihat dengan mikroskop cahaya,
namun demikian sulit diwarnai sehingga digunakan pewarnaan spesimen atau
prosedur pewarnaan khusus lainnya. Pada pewarnaan spesimen, latar belakang
diwarnai zat warna spesimen, sedangkan bakteri diwarnai dengan zat basa. Kapsel
tidak akan menyerap warna sehingga terlihat sebagai lapisan terang-tembus dengan

latar belakang yang berwarna. Pengecatan ini bertujuan untuk melihat ada tidaknya
lapisan kapsul pada bakteri.
Kapsul merupakan bagian yang melekat diluar dinding sel yang terdiri atas
polisakarida atau polipeptida. Kapsul ini merupakan lapisan transparan. Bahan yang
membentuk kapsul diekskresi dari sel dan karena kekentalannya, maka kapsul tidak
akan mudah berdifusi lepas dari sel sehingga tetap menyelubungi dinding sel. Kapsul
bertindak sebagai lapisan pelindung yang dapat menahan serangan dari bakteri lainnya
atau sel-sel fagosit inang. Kebanyakan bakteri yang memiliki kapsul adalah bakteri
patogen. Kemampuan bakteri untuk menyebarkan penyakit tergantung pada adanya
kapsul tersebut. Hilangnya kapsul menyebabkan hilangnya kemampuan bakteri untuk
menyebabkan penyakit, karena kapsul mencegah perusakan sel dalamnya dari kondisi
yang tidak menguntungkan bagi bakteri tersebut.
Pada percobaan ini digunakan bakteri Acetobacter sp. dan Proteus vulgaris
dengan kristal violet sebagai zat warna dan dibilas dengan CuSO 4. Pemberian kristal
violet akan menyebabkan bakteri tersebut berwarna ungu, pembilasan dengan CuSO 4
untuk membilas kelebihan kristal violet.
Pada pewarnaan bakteri Acetobacter sp. terlihat kapsul berwarna biru pucat
yang agak transparan dan sel berwarna ungu sedangkan pada Proteus vulgaris terlihat
warna violet. Hasil ini yang diperoleh pada Proteus vulgaris tidak sesuai dengan
literatur, hal ini mungkin disebabkan karena rusaknya kapsul sewaktu difikasasi.
Pewarnaan spora

Lapisan luar spora merupakan penahan yang baik terhadap bahan kimia,
sehingga spora sukar diwarnai. Spora bakteri dapat diwarnai dengan dipanaskan.
Pemanasan menyebabkan lapisan luar spora mengembang, sehingga zat warna dapat
masuk. Sedangkan pendinginan bertujuan agar zat warna terperangkap pada spora.
Pada percobaan ini digunakan bakteri Bacillus subtilis dan Clostridium sp.
dengan penambahan larutan hijau malakit sebagai zat warna awal dan larutan safranin
sebagai zat warna kedua. Pemberian larutan hijau malakit ini akan menyebabkan
bakteri tersebut berwarna hijau sedangkan larutan safranin akan mewarnai spora
menjadi berwarna merah. Pada percobaan ini juga digunakan kertas saring sebagai
penutup untuk menghindari penguapan yang tidak merata dan menjaga agar sediaan
tidak kering.
Pada pewarnaan bakteri Bacillus subtilis yang merupakan bakteri berspora
terlihat sel warna merah sedangkan sporanya tidak tampak jelas warnanya. Hal ini
mungkin disebabkan karena tidak sempurnanya pemanasan sehingga zat warna tidak
memasuki spora, atau bakteri belum membentuk spora karena keadaan lingkungan
sekitarnya yang menyebabkan tidak dibentuknya spora. Pada pewarnaan Clostridium
sp. terlihat spora berwarna hijau dan sel vegetatif berwarna merah.

BAB VI
PENUTUP

VI.1

Kesimpulan
Berdasarkan percobaan diperoleh kesimpulan sebagai berikut :
1. Pada pewarnaan sederhana, pada bakteri Eschericia coli terlihat bentuk sel seperti
batang pendek berwarna biru, sedangkan pada Bacillus subtilis terlihat bentuk sel
batang kecil berwarna biru dengan latar belakang ungu.
2. Pada pewarnaan negatif, pada bakteri

Eschericia coli terlihat latar belakang

berwarna merah muda keunguan dan selnya tidak berwarna, sedangkan pada
Bacillus subtilis terlihat latar belakang berwarna biru tua dan sel berwarna biru
muda agak bening.
3. Pada pewarnaan Gram, pada bakteri Eschericia coli terlihat selnya berwarna merah
yang berarti bakteri tersebut termasuk bakteri Gram negatif sedangkan pada
Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis berwarna biru ungu yang berarti
termasuk bakteri Gram positif.
4. Pada pewarnaan kapsul, pada bakteri Acetobacter sp. terlihat kapsul berwarna biru
pucat dan sel berwarna ungu sedangkan pada Proteus vulgaris terlihat warna
violet.
5. Pada pewarnaan spora, pada bakteri Bacillus subtilis terlihat sel warna merah
sedangkan sporanya tidak tampak jelas warnanya. Pada pewarnaan Clostridium
sp. terlihat spora berwarna hijau dan sel vegetatif berwarna merah.

VI.2

Saran
Sebaiknya asisten memperhatikan praktikan dalam pengerjaan sampel agar
tidak terjadi kekeliruan yang dapat mempengaruhi hasil percobaan.

DAFTAR PUSTAKA

1. Suriawiria, Unus, (1986), Pengantar Mikrobiologi Umum, Angkasa: Bandung.

2. Lay, Bibiana W dan Sugyo H., (1992), Mikrobiologi, CV. Rajawali : Jakarta.
3. Pelczar, Jr dan E.C.S. Chan, (1986), Dasar-Dasar Mikrobiologi 1, UI-Press: Jakarta.
4. Lay, Bibiana W., (1994), Analisis Mikroba di Laboratorium, PT RajaGrafindo Persada :
Jakarta.
5. Hadioetomo, Ratna S., (1990), Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek, PT Gramedia: Jakarta.
6. Staf Pengajar Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, (1993), Buku Ajar Mikrobiologi
Kedokteran Edisi Revisi, Binarupa Aksara: Jakarta.
7. Dirjen POM, (1979), Farmakope Indonesia, Edisi III, Depkes RI: Jakarta.
8. Buchanan, R.E. dan N.E. Gibbons, (1975), Bergeys Manual of Determinative Bacteriology
2 Eight Edition, The Williams and Wilkins Company: Baltimore.
9. Tim Dosen Mikrobiologi Umum,2001, Mikrobiologi Umum dalam Praktek, Universitas
Hasanddin, Makassar

LAMPIRAN
Komposisi Zat Pewarna
1.

Alkohol asam
HCl P

3 ml

Etanol 95 %

ad 100 ml

2.

Karbol suksida
Suksin basa

1 gram

Etanol absolut

10 ml

Fenol 5 % larutan berair

ad 100 ml

3.

Kristal violet
Kristal violet

0,5 gram

Aquadest

ad 100 ml

4.

Malachite green
Malachite green

1 gram

Aquadest

ad 1 liter

5.

Metilen biru
KOH 1 %

1 ml

Metilen biru larutan jenuh dalam alkohol

30 ml

Aquadest

ad 100 ml

Skema Kerja
1.

Pengecatan sederhana
1 ose suspensi biakan bakteri

Ratakan diatas gelas objek

Fiksasi

Tetesi metilen biru 1-2 tetes

Biarkan 1-2 menit
Cuci dengan air mmengalir

Cuci dengan air mmengalir

(Sisa air dikeringkan dengan tisu

Amati dibawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 10

Hasil digambar

2.

Pengecatan negatif

Teteskan nigrosin di ujung objek gelas

Masukkan inokulan dari ose

Objek gelas lain diletakkan disebelah luar nigrosin dengan posisi

miring (300)

Geser perlahan hingga membentuk lapisan tipis

Amati dibawah mikroskop dengan perbesaran 10 x 10

Hasil digambar

3.

Pengecatan tahan asam

Teteskan air steril pada objek glas
Teteskan suspensi bianan bakteri
Keringkan dan fiksasi
Tutup preparat dengan kertas saring
+ karbol-fuksin
Panaskan 5 menit
Lepaskan kertas saring
Dinginkan dan cuci dengan air mengalir
Cuci dengan alkohol asam sampai berwarna kemerahan
Cuci dengan air mengalir dan keringkan
+ Metilen biru dan biarkan 1 menit
Cuci dengan air mengalir
Amati dibawah mikroskop
Hasil digambar

4.

Pengecatan gram
Preparat olesan bakteri
Fiksasi
+ 2 tetes gram A (kristal violet)
biarkan 1 menit
Cuci dengan air mengalir dan keringkan dengan tisu
+ gram B (larutan iodum)

biarkan 1 menit
Cuci dengan air mengalir dan keringkan dengan tisu
+ gram C (etanol 95 %)
biarkan 1 menit
Cuci dengan air mengalir dan keringkan dengan tisu
+ gram D (Safranin)
biarkan 1 menit
Amati di bawah mikroskop

5.

Pengecatan kapsul
Preparat olesan bakteri
Fiksasi
+ kristal violet
Panaskan diatas penangas air selama 1 menit
Bilas dengan larutan CuSO4
Keringkan dengan kertas isap
Amati di bawah mikroskop
Gambar bentuk kapsul

6.

Pengecatan spora
Preparat olesan bakteri
Tutup preparat dengan kertas isap
Teteskan larutan hijau malakit
Panaskan 5 menit (jangan terlalu kering)
Dinginkan dan lepas kertas isap
Cuci dengan air mengalir
Keringkan dengan tisu
+ larutan safranin
Cuci dengan air mengalir
Keringkan dengan tisu
Amati di bawah mikroskop
Hasil digambar