pewarnaan bakteri

BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar belakang
Bakteri adalah domain yang terdiri dari makhluk hidup yang tidak memiliki membran
inti (prokariota). Bakteri memiliki beragam variasi bentuk,seperti coccus, basil, dan
spiral, serta dapat hidup soliter maupun berkoloni.Habitat bakteri sangat bervariasi,
dari air, tanah, udara, hingga dalam tubuhhewan, (Betsy dan Keogh. 2005). Bakteri
umumnya tidak memiliki pigmensehingga tidak berwarna dan hampir tidak kelihatan
karena tidak kontrasdengan medium dimana mereka hidup. Oleh karena itu, perlu
dilakukanpewarnaan agar bakteri tampak jelas bila diamati dengan mikroskop
(Harleydan Presscot, 2002). Pewarnaan dikelompokkan menjadi pewarnaan
langsungdengan pewarnaan basa, pewarnaan tak langsung atau pewarnaan negatif
danpewarnaan

gram

(Dwidjoseputro,

2003).

Pewarnaan

basa

adalah

pewarnaanyang langsung mewarnai bakteri. Pewarnaan negatif adalah pewarnaan

yangtidak langsung mewarnai bakteri, melainkan mewarnai latar belakang
preparatbakteri tersebut. Pewarnaan ini dilakukan dengan menggunakan pewarna
yangbersifat asam seperti nigrosin atau tinta cina (Harley dan Presscot,
2002).Pewarnaan

gram

merupakan

pewarnaan

umum

dalam

bidang

bakteriologi.Dengan pewarnaan ini, kelompok bakteri dibedakan menjadi dua yaitu

bakterigram positif dan bakteri gram negatif (Ramona dkk, 2007). Hasil akhir
daripewarnaan gram adalah bakteri gram positif akan berwarna ungu/biru,sementara
bakteri gram negatif akan berwarna merah (Harley dan Presscot,2002).
B. Tujuan
1. Untuk mengetahui morfologi sel bakteri yang digunakan saatpraktikum.
2.
Untuk mengetahui cara membedakan bakteri gram positif dan
negatif melalui pewarnaan.

gram

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Pewarnaan garam atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram positif dan gram
negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama
berdasarkan penemunya, ilmuan Denmark Hans Cristian Gram (1853-1938) yang
mengembangkan tehnik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara
pneumokokus dan bakteri klebsiella pneumoniae.
Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil
ungu pada metode pewarnaan gram bakteri gram positif akan mempertahankan
warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif
tidak. Pada uji pewarnaan gram, suatu pewarnaan penimbang (counterstain)
ditambahkan setelah metil ungu yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi
berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan
kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
Banyak spesies bakteri gram negatif yang bersifat patogen,yang berarti mereka
berbahaya bagi organisme inang. Sifat potogen ini berkaitan dengan komponen
tertentu pada dinding sel gram negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal
juga dengan LPS atau Endotoksin).
Tujuan pewarnaan yaitu :

Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, ataupu fungi.

Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.

Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.

Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang di berikan sehingga sifat-sifat fisik dan
kimia yang ada akan dapat di ketahui.
Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :

1. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak
digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna

untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan

pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka
dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana
umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk
dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk
pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana
pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan.
a. Pewarnaan Asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan
hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan
positif adalah metilen biru dan air furksin.
b. Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai
bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini
mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk
menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau
tinta cina.
2. Pewarnaan Diferensial (Gram)
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan
gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi
nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853
1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara
pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah
bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan
Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap
setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji
pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil
ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau
merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini
berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
a. Bakteri Gram Negatif
Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil
ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan

warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative
tidak.
b. Bakteri Gram Positif
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu
sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di
bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda.
Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada
perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010)
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu
lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai
dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding
sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, poripori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel
tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).
Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi
terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu
dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009).
Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.
Sifat

Bakteri garam (+)

Komposisi dinding sel Kandungan

Bakteri
negatif(-)
lipid Kandungan

gram
lipid

rendah (1-4%)
Ketahanan terhadap Lebih sensitif

tinggi
Lebih tahan

penisilin
Penghambatan

Kurang dihambat

oleh Lebih dihambat

pewarna basa (VK)

Kebutuhan nutrisi

Kebanyakan

Ketahanaa terhadap

relatif kompleks
Lebih tahan

spesies Relatif sederhana

Kurang tahan

perlakuan fisik
(Manurung, 2010).
Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh
Neelson dengan pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna
tandingan metilen blue Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti dengan
penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen untuk mengurangi tegangan permukaan

lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang mengandung pembasah ini disebut
pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010).
Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri
menahan zat warna tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh
zat yang bersifat keras seperti asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%).
Alkohol asam ini merupakan pemucat yang sangat intensif dan jangan dikelirukan
dengan alkohol-aseton yang banyak digunakan dalam prosedur pewarnaan Gram.
Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat warna itu dikatakan
tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang dindingnya tidak bersifat
terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah
dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam. Tercucinya
karbol fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan biru metilen
oleh sel, sehingga bakteri tersebut tampak biru (Hadioetomo, 1993).
Pewarnaan Ziehl Neelsen. Larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada
seluruh permukaan sediaan, kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar
asap tetapi tidak sampai mendidih atau kering selama 5 menit. Sediaan kemudian
dibiarkan dingin selama 5-7 menit lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci
dengan air yang mengalir perlahan. Setelah itu larutan asam alkohol 3%
(hydrochloric acid-ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4 menit kemudian
dicuci dengan air mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan dibuang. Larutan
methylene blue 0,1% dituang sampai menutup seluruh permukaan, dibiarkan 1 menit
lalu larutan dibuang dan dicuci dengan air mengalir (Karuniawati, 2005).
4. Pewarnaan Khusus
Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur
khusus atau tertentu dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb. Contoh
pewarnaan khusus :Pewarnaan Endospora Anggota dari genus Clostridium,
Desulfomaculatum, dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam
siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga
metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia
seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya
pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif,
sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat dilihat di bawah
mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan

sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit

dibedakan dengan badan inklusi (Aditya, 2010)
a. Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat
sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika
pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi
warna pada latar belakang yang berwana biru gelap.
b. Pewarnaan spora
Dinding spora relatif tidak permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan
cara memanaskan preparat.
c. Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi suspensi koloid garam asam tanat yang tidak
stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.
d. Pewarnaan nucleoid
Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA (Rudi,
2010).

BAB III
PELAKSANAAN PRAKTIKUM
a. Bahan

Bakteri Salmonella sp.

Bakteri Staphylococcus aureus
Kristal violet atau metilen blue
Alkohol
Safranin
Larutan iodium

b. Alat
Gambar alat

Nama alat
Mikroskop

Ose

Pipet

bunsen

c. Prosedur kerja
a.
1.
2.
3.

Pengecatan sederhana
Teteskan ose suspense yang mengandung bakteri diatas gelas obyek yang bersih
Suspense ini diratakan sampai tipis, dengan diameter 1 cm
Kemudian kering anginkan hingga noda yang kering , lakukan fiksasi dengan cara
melewatkan gelas obyek pada nyala api berkali-kali

4. Tetsilah kristal violet atau biru metilen. Biarkan selama 1-2 menit, lalu cucilah dengan
air yang mengalir
5. Kemudian kering anginkan
6. Amati preparat dengan mikroskop pembesaran kuat (dengan minyak immersi) selsel (bakteri akan berwarna biru sedang sporanya berwarna merah).
b. Pengecatan gram
1. Ambillah 1 ose suspense, keringkan diudara, dan fiksasi diatas nyala api
2. Tetesilah egnan kristal violet, biarkan 1-2 menit. Cucilah dengan air mengalir
kemudian keringkan diudara
3. Tetesilah dengan larutan iodium, biarkan 1-2 menit. Cucilah dengan air mengalir
kemudian keringkan diudara
4. Cucilah dengan alkohol (dengan cara meneteskan alkohol pada permukaan noda
bakteri) sampai air cucian tidak berwarna. Cucilah dengan air mengalir kemudian
keringkan diudara
5. Tetesilah dengan safranin, biarkan selama 20 detik, cucilah dengan air mengalir lalu
keringkan diudara. Tutup permukaan preparat dengan gelas penutup
6. Amati preparat dengan mikroskop perbesaran kuat (dengan minyak ibbersi)

BAB IV
HASIL PENGAMATAN
Gambar pengamatan

Keterangan
Salmonella

Staphylococcus

Pewarnaan sederhana

BAB V
PEMBAHASAN
Praktikum ini memiliki tujuan agar praktikan terampil dalam melakukan
pewarnaan gram untuk bakteri gram positif dan negatif, mempelajari teknik
pewarnaan gram untuk pengamatan mikroba, mempelajari bentuk-bentuk dan
struktur sel bakteri dari hasil pengamatan dengan pewarnaan gram, sera
membedakan kelompok bakteri berdasarkan reaksinya terhadap warna dan
sekaligus menunjukkan sifat bakteri tersebut.
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen
selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen.
Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun
pada pewarna (Manurung, 2010).
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan
paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan
tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada
tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan
lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi
menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding
sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai
dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Manurung, 2010).
Langkah-langkah utama dalam teknik pewarnaan antara lain:
a. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis.
b. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia
seperti sabun, formalin, fenol.
c. Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna. Pewarnaan gram pada
praktikum ini dilakukan dalam 4 tahap yaitu:
a. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
b. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin.
Keempat tahap tersebut dijelaskan langsung dalam langkah percobaan di bawah ini.

Langkah selanjutnya, 1 tetes kristal violet diteteskan di atas gelas benda

tersebut kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas
dengan aquades hingga warnanya hilang. Kristal violet merupakan reagen yang
berwarna ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan
memberi warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga
mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan
perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna
(ungu). Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna
ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri
adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram
positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi
lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama
30 detik bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding
sel bakteri.
Langkah percobaan yang dilakukan oleh praktikan dimulai dengan 1 tetes
sampel yang berupa bakteri sampel A dan bakteri sampel B diteteskan di atas gelas
benda yang berbeda. Kedua gelas benda berisi sampel tersebut dipanaskan (fiksasi)
di atas bunsen burner. Hal ini bertujuan untuk menguapkan air sehingga hanya akan
didapat bakteri saja. Proses fiksasi juga bertujuan supaya bakteri benar-benar
melekat pada gelas benda sehingga olesan bakteri berupa tetesan sampel tidak
akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses
fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api.
Langkah selanjutnya, 1 tetes iodine diteteskan di atas gelas benda tersebut
kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan
aquades hingga warnanya hilang. Iodine merupakan pewarna Mordan, yaitu
pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme
target atau mengintensifkan warna utama. Pemberian iodine pada pengecatan Gram
dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat iodin
terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif,
sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan
pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Iodine yang diteteskan didiamkan
selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih
kuat.

Selanjutnya, 1 tetes alkohol 96% diteteskan di atas gelas benda tersebut

kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan
aquades hingga warnanya hilang. Etanol 95% merupakan solven organik yang
berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel
bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi
dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan
tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka
warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan
terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna
ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 96% juga
menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.
Reaksi yang terjadi ketika penambahan alkohol 96%
gram + : lipid << + alkohol 96% pori dinding sel yang terbentuk kecil, protein
dinding sel terdehidrasi, pori tertutup (kompleks kristal violet-iodine tidak tercuci)
gram - : lipid >> + alkohol 96%

pori dinding sel yang terbentuk besar,

protein dinding sel terdehidrasi, pori tidak tertutup (kompleks kristal violet-iodine
tercuci)
Alkohol 96% yang diteteskan di atas gelas benda didiamkan selama 30 detik
kemudia dibilas dengan aquades dengan tujuan agar warna dapat luntur secara
sempurna dan tidak ada yang tersisa di dalam gelas benda.
Setelah pembilasan reagen alkohol 96% pada gelas benda sebelumnya,
selanjutnya diteteskan 1 tetes safranin di atas gelas benda tersebut kemudian
didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan aquades hingga
warnanya hilang. Safranin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder.
Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna
utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, safranin memberikan
warna pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa cat atau
pewarna. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi
berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif
dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya
rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat
masuk sehingga sel berwarna ungu.

Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna
lain dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut
dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena
itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama
sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat (efisiensi waktu).
Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan
terhadap gelas benda dengan menggunakan aquades. pembilasan ini bertujuan
untuk mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir
pembilasan pada masing-masing reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan
dari aquades dengan menggunakan kertas tissu agar aquades tidak tercampur
dengan reagen atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan
terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk
warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna
merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu
ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif.
Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena
reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah
yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi
menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif
dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif,
maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue,
safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah Cl -,
SO4 -, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat
bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa
mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel (Rudi, 2010).
Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti fiksasi, peluntur
warna, substrat, intensifikasi pewarnaan, dan penggunaan zat warna penutup. Pada
bakteri gram positif menunjukkan warna biru ungu dan bakteri gram negatif
berwarna merah. Dalam praktikum ini digunakan salah satu pewarnanya yaitu
safranin yang sesuai teori bersifat basa sehingga lebih mudah bersenyawa atau
bereaksi dengan bagian-bagian inti sel bakteri.
Bakteri Gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna
metil

ungu

pada

metode

pewarnaan

Gram.

Bakteri

gram

positif

akan

mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol,
sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna
penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua
bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini
berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan
struktur dinding sel mereka (Rudi, 2010).
Pengamatan bentuk dan ukuran sel bakteri akan tampak jelas jika dilakukan
pewarnaan terhadap sel. Kebanyakan sel-sel bakteri tidak berwarna, sehingga jika di
lihat di bawah mikroskop tidak memperlihatkan warna kontras. Demikian pula
bagian-bagian tertentu misalnya spora, flagella, kapsul atau dinding sel hanya dapat
diamati jika dilakukan pengecatan atau pewarnaan khusus. Dengan pewarnaan ini,
bakteri mula-mula dilapisi dengan larutan zat warna karbol gentinviolet (karbol kristal
violet, karbolmetil violet) dan didiamkan beberapa lama, kemudian disiram dengan
larutan yodium dan dibiarkan terendam dalam waktu yang sama. Sampai tingkat
pewarnaan ini selesai, semua bakteri akan berwarna ungu.
Langkah-langkah utama dalam mempersiapkan spesimen mikroba yang diwarnai
untuk pemeriksaan mikroskopik ialah :
1. Penempatan olesan atau lapisan tipis spesimen pada kaca objek.
2. Fiksasi olesan itu pada kaca objek, biasanya dengan pemanasan, menyebabkan
mikroorganisme itu melekat pada kaca objek.
3. Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan pewarna
atau reagen (pewarnaan diferensial).
Pewarna yang digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang
akan memberikan reaksi kalau mengenai bagian tubuh jasad. Karena pewarnaan
tersebut berbentuk ion yang bermuatan positif ataupun negatif.
Sel bakteri bermuatan mendekati negatif kalau dalam keadaan pH mendekati netral.
Sehingga kalau kita memberikan pewarna yang bermuatan positif, misalnya metilen
biru, hasil pewarnaan akan nampak jelas.
Secara kimia, zat warna dapat digolongkan kedalam senyawa basa dan senyawa
asam. Jika warna terletak pada muatan positif, maka senyawa tersebut dinamakan
zat warna basa. Sebaliknya jika warna terdapat pada ion bermuatan negatif, maka
senyawa tersebut dinamakan zat warna asam.
Contoh zat warna basa misalnya : metilen biru, safranin, merah netral dan
sebagainya, dengan anionnya adalah Cl-, SO2-4, CH3OO-, COOHOO-, dsb.

Sedangkan zat warna asam misalnya : Na-eosinat kationnya adalah Na +, K+, Ca2+,
NH3. Disamping zat warna asam dan zat warna basa, juga didapatkan zat warna
indeferen seperti sudan III, dimetil-amid-azo-benzol, dan zat warna netral seperti
eusin-metilen biru.
Salah satu sifat dari zat warna untuk menggunakan pewarnaan mikroba ialah bahwa
zat warna asam pada umumnya mempunyai sifat bersenyawa lebih cepat dengan
bagian-bagin sitoplasma sel, sedang zat warna basa mudah bereaksi dengan
bagian-bagian inti sel.
Faktor faktor penentu keberhasilan dalam pewarnaan mikroba ialah :

Fiksasi
Fiksasi dilakukan sebelum zat warna digunakan, bertujuan untuk :
v Melekatkan sel pada gelas objek.
v Membunuh mikroba, karena sel dalam keadaan mati lebih mudah diwarnai
daripada sel dalam keadaan hidup.
v Melepaskan granular protein menjadi gugus reaktif-NH 3 yang akan bereaksi
dengan gugus OH- dari zat warna.
v Mencegah terjadinya otolitis sel, yaitu proses pecahnya sel yang disebabkan oleh
enzim yang ada didalamnya.
v Merubah daya ikat zat warna.
Fiksasi dapat dilakukan secara fisik dengan pemanasan ataupun pengeringan
secara dingin, sedangkan yang paling umum dilakukan secara kimia dengan
penambahan sabun, formalin, fenol, dan sebagainya.

Pelunturan warna
Pelunturan warna bermaksud untuk menghilangkan warna sel yang telah diwarnai.
Senyawa ini digunakan untuk menghasilkan keadaan yang kontras pada sel mikroba
sehingga dengan jelas dapat dilihat dibawah mikroskop misalnya.
Pada umumnya sel mikroba yang mudah diwarnai akan lebih cepat pula dilunturkan,
sedangkan sebaliknya sel mikroba yang sukar diwarnai akan sulit pula untuk
dilunturkan. Sifat cepat dan lambatnya cara pelunturan inilah yang diperbedakan
untuk membedakan kelompok mikroba setelah diberi pewarnaan.
Dari segi ketahanan sel terhadap senyawa kimia, dibidang mikrobiologi dikeSnal ada
tahan asam, tahan alkohol, tahan air dan sebagainya. Ketahanan terhadap suatu zat
kimia inipun dipergunakan untuk membedakan kelompok mikroba.

BAB VI
JAWAB PERTANYAAN
1. Buat tabel yan berisi berisi urutan pewarna gram serta reaksi yang terjadi dan warna
yang terbentuk
Reaksi bakteri
Zat warna dan
urutan pewarnaan
Gram positif
Gram negatif
Kristal violet / carbol Sel berwarna ungu
Sel berwarna ungu
gentian violet
Lugol
Komplek
KV-L Komplek
KV-L
terbentuk dalam sel, terbentuk dalam sel,
sel tetap berwarna sel tetap berwarna
ungu
ungu
Alkohol 70/96%
Dinding
sel Lipid terekstraksi dari
dehidrasi, pori-pori dinding sel, pori-pori
mengecil,
daya mengembang,
serap dinding sel komplek KV-L keluar
dan membran KV-L dari sel sehingga sel
tidak
keluar tidak berwarna
sehingga sel tetap
berwarna ungu
Safranin
Sel
tidak Sel menyerap zat
berpengaruh
pewarna
sehingga
sehingga sel tetap berwarna merah
berwarna ungu
2. Buatkan gambar sel bakteri (dan sporanya) dan beri keterangan (warna, bentuk dan
ciri-ciri lain)
Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram Positif, tidak bergerak,tidak
berspora dan mampu membentuk kapsul. (Boyd, 1980), berbentuk kokusdan
tersusun seperti buah anggur (Todar, 2002) sebagaimana terlihat padagambar 2.4.
Ukuran Staphylococcus berbeda-beda tergantung pada mediapertumbuhannya.
Apabila ditumbuhkan pada media agar, Staphylococcusmemiliki diameter 0,5-1,0
mm dengan koloni berwarna kuning. Dinding selnyamengandung asam teikoat, yaitu
sekitar 40% dari berat kering dinding selnya.Asam teikoat adalah beberapa
kelompok antigen dari Staphylococcus. Asamteikoat mengandung aglutinogen dan
N-asetilglukosamin. (Boyd, 1980).
Salmonella berbentuk batang, tidak berspora dan tidak bersimpai tetapimempunyai
flagel feritrik (fimbrae), pada pewarnaan gram bersifat gram negatif, ukuran 2- 4
mikrometer x 0,5- 0,8 mikrometer dan bergerak. Padabiakan agar koloninya besar,
bergaris tengah 2- 3 milimeter, bulat, agak cembung, jernih, lucin, dan tidak
menyebabkan hemolisis (Gupte, 1990)

3. Berdasarkan ciri-cirinya, klasifikasikan jenis bakteri yang saudara amati

Staphylococcus:
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Berbentuk bulat dengan diameter kira-kira 0,5-1,5 m.

Sel-selnya bersifat gram positif, dan tidak aktif melakukan gerakan (non motile)
Bersifat patogen dan menyebabkan lesi lokal yang oportunistik
Bersifat anaerob fakultatif
Menghasilkan katalase
Sebagian besar adalah saprofit yang hidup dialam bebas, namun habitat

alamiahnyaadalah pada permukaan epitel golongan primate / mamalia

7. Bersifat -hemolitik
8. Toleran garam (halodurik)
9. Meiliki protein A pada permukaannnya yang mengikat Fclg (menghambat fagositosis)
10. Menghasilkan pigmen kuning dan mungkin memproduksi eksotoksin.
Salmonella:
Salmonella sp. adalah bakteri batang lurus, gram negatif, tidakberspora, bergerak
dengan flagel peritrik, berukuran 2-4 m x 0.5-0,8 m. Salmonella
sp. tumbuh cepat dalam media yang sederhana (Jawetz,dkk, 2005), hampir tidak
pernah memfermentasi laktosa dan sukrosa,membentuk asam dan kadang gas
dari glukosa dan manosa, biasanyamemporoduksi hidrogen sulfide atau H2S, pada
biakan agar koloninyabesar bergaris tengah 2-8milimeter, bulat agak cembung,
jernih, smooth,pada media BAP tidak menyebabkan hemolisis, pada media Mac
Concey koloni Salmonella sp. Tidak memfermentasi laktosa (NLF),konsistensinya
smooth (WHO, 2003) Salmonella sp. tahan hidup dalam air yang dibekukan
dalamwaktu yang lama, bakteri ini resisten terhadap bahan kimia tertentu.

11.

BAB VII
KESIMPULAN
Percobaan kali ini didapatkan kesimpulan sebgai berikut:
1. Bakteri dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan tersebut
dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan
pewarnaan merah, sedangkan yang positif berwarna ungu.
2. Salmonella sp dari isolate ikan mentah termasuk bakteri gram negative,karena hasil
pengamtan secara mikroskopis berwarna merah.
3. Sel-sel bakteri secara khas berbentuk kokus, basil, dan spiral. Kokus adalahbakteri
yang serupa bola- bola kecil. Kokus yang bergandeng dua disebut diplokokus, yang
mengelompok berempat disebut tetrakokus. Basil adalah bakteri panjang berbentuk
batang, yang bergandengan panjang disebut streptobasil dan yang bergandeng dua
disebut diplobasil. Spiral adalah baktreri yang bengkok yang menyerupai spiral