ANAFAR
ANAFAR
ANAFAR
Disusun oleh :
I. LATAR BELAKANG
Levofloxacin merupakan antibiotika fluoroquinolon yang selama ini belum ada penetapan
kadarnya dalam urin menggunakan teknik solid phase extraction (SPE) diikuti kuantifikasinya
secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dengan detektor UV. Tujuan dari penelitian ini
adalah untuk menemukan metode yang tepat untuk meneliti levofloxacin di dalam urinLe.
vofloxacin merupakan antibiotik berspektrum luas yang efektif terhadap sejumlah bakteri Gram
positif dan Gram negatif antibiotik baru yang belum diketahui penetapan kadar Levofloxacin baku
yang digunakan sebagai acuan untuk penetapan kadar Levofloxacin. Oleh karena itu, perlu
dilakukan penelitiPLan lebih lanjut dalam labolatorium klinik mengenai farmakokinetik dan
farmakodinamiknya. Untuk penetapan kadar Levofloxacin, dilakukan analisis obat dalam urin
secara in vitro. Sebelum dilakukan metode analisis, terlebih dahulu dilakukan validasi. Beberapa
prosedur dan teknik telah dikembangkan untuk menetapkan kadar levofloxacin dalam matrik cairan
hayati antara lain dengan metode KCKT dengan metode Pengembangan penetapan kadar secara
konduktometri, potensiometri, spektrofotometri dan secara KCKT dengan detektor UV (Utami,
2006). sementara dalam cairan hayati (plasma/urin) secara KCKT telah digunakan detektor
fluoresensi diode array detektor, dan spektrometer massa (Tobin et al., 1999). Namun demikian,
selama ini belum pernah dilaporkan penelitian mengenai penetapan levofloxacin dalam urin
menggunakan KCKT dengan detektor UV.
Bahan yang digunakan dalam analisis ini Levofloxacin baku pembanding (Zhejiang Jinxin-
China), ciprofloxacin baku pembanding (Zhejiang Jinxin-China). Natrium dihidrogen fosfat
dihidrat p.a (Merck®), asetonitril p.a (Merck®), dan asam fosfat (Merck®), metanol pro liquid
chromatography (J.T Baker), akuabides (IPHA pharmindo), urin manusia.
Peralatan yang digunakan dalam analisis ini adalah Seperangkat alat kromatografi cair
kinerja tinggi (Shimadzu LC-10 ATVP) yang terdiri dari detektor UV-VIS SPD, Auto injector
Shimadzu System Controler SCL-A, kolom KCKT (Phenomenex), panjang 250 mm, diameter
dalam 2,6 mm, ukuran partikel 10 μm, seperangkat alat spektrofotometer UV-Vis (analytical Jena,
specord 200), pH meter (Ohmeter), ultrasonic bath (NEY 1510), SPE cartridge HLB 30 mg 1 cc
(Oasis), timbangan analitik (Sartorius) kepekaan 0,1 mg, penyaring vakum beserta saringan berpori
0,45 m, dan alat gelas yang lazim.
Prosedur
1. Penentuan panjang gelombang pengukuran
2. Pembuatan fasa gerak.
3. Pembuatan larutan baku
konsentrasi akhir larutan baku 5x10–3 mg/ml, kemudian larutan discanning dengan
spektrofotometer ultraviolet pada panjang gelombang 200-380 nm, hingga diperoleh
panjang gelombang maksimum levofloxacin
5. Penentuan ekstingsi molar (ε)
Dari larutan baku konsentrasi 0,5 mg/ml dibuat konsentrasi 6,4; 10,8; dan 13,5 μM
menggunakan HCl 0,05M dalam labu ukur 50 ml Ketiga larutan tersebut kemudian
dianalisis dengan spektrofotometer dan dibaca serapannya pada panjang gelombang
maksimum 295 nm, dan ditentukan nilai ekstingsi molarnya dengan menggunakan
persamaan :
ε =A/bC
b = tebal kuvet dalam cm ; C = konsentrasi (Molar)
6. Penentuan kondisi optimum KCKT
Untuk memperoleh kondisi optimum levofloxacin dengan SI ciprofloxacin, dilakukan
percobaan dengan berbagai kombinasi fase gerak yang sesuai
Ekstraksi dengan SPE (Oasis HLB 1CC).
Dilakukan conditioning menggunakan metanol: air (1: 3ml), lalu dimasukkan konsentasi sampel
yang akan diukur, lalu dilakukan tahap washing menggunakan 3% metanol dalam akuabides, dan
tahap terakhir adalah eluting, menggunakan 20% ACN dalam dapar fosfat 0,025M pH2,5
Recovery absolute/efisiensi ekstraksi
Recovery absolute dilakukan pada konsentrasi 1,15 dan 23µg/ml
%Recovery Luas area dari urin
X 100%
Luas area dari fase gerak
Ket: a:intercep
Akurasi dan Presisi
Akurasi dan presisi pada hari yang sama diperoleh dengan cara penetapan kadar tiga
sampel masing-masing tiga kali (n = 3) selama tiga kali berturut-turut. Persen akurasi diperoleh
dengan cara melihat kedekatan hasil dari sampel
terhadap nilai nominal dan presisi dilihat dari KV (%), recovery dihitung dengan persamaan:
CT
% Re cov ery x100%
CA
CT adalah konsentrasi levofloxacin hasil pengukuran, dan CA adalah jumlah levofloxacin yang
dispike (konsentrasi nominal) ke dalam urin. Presisi dinyatakan dengan KV (%), dengan
persamaan :
SD
% KV X 100%
X
III. HASIL
A. Penentuan panjang gelombang pengukuran
Hasil panjang gelombang dari larutan baku levofloxacin dan ciprofloxacin sebagai standar internal
menggunakan perbandingan fasa gerak dapar fosfat : asetonitril (85,5:14,5) didapatkan panjang
gelombang maksimum levofloxacin 295 nm dan panjang gelombang maksimum ciprofloxacin 279
nm.
Hasil penetapan ekstingsi molar
1. Penetapan Kondisi analisis
2. Efisiensi Ekstraksi
Hasil dari tabel 3 yang didapat berdasarkan persyaratan masuk kedalam rentang % recovery
80-120% (Harahap, 2006), dan hasil koefisien variasi (KV%) masuk ke dalam rentang untuk
cairan biologis adalah <15% (Harahap, 2006).
3. Validasi metode penetapan kadar levofloxacin secara KCKT
a. Selektivitas dari suatu metode, dapat dilihat dari nilai resolusi/daya pisah antara internal
standar ciprofloxacin dengan levofloxacin sebagai sampel yang memiliki nilai resolusi
yang baik yaitu ≥ 1,5.
d. LOD dan LOQ, Hasil koefisen korelasi (r) terbaik yang diperoleh dari kurva baku
levofloxacin dapat digunakan untuk pengujian limit of detection (LOD). Nilai LOD dari
rasio luas area adalah 0,0220μg/ml dan nilai LOD berdasarkan tinggi puncak adalah 0,1679
μg/ml.
Hasil pengujian limit of Quantitation (LOQ) didapatkan berdasarkan kurva kalibrasi dari
persamaan yang mempunyai koefisien korelasi yang paling baik dari kurva kalibrasi. Hasil
LOQ didapatkan dari kurva kalibrasi rasio luas area kromatogram. Nilai LOQ dari rasio
luas area kromatogram adalah 0,0733μg/ml dan nilai LOQ pada tinggi puncak adalah
0,5598μg/ml.
e. Akurasi dan presisi, dibuat 3 macam konsentrasi sampel levofloxacin dalam matrik urin
diambil kurva kalibrasi nilai rendah, nilai sedang dan nilai tinggi, berturut-turut adalah
1,15; 5,75; dan 23 μg/ml dan mengandung standar internal ciprofloxacin 10 μg/ml.
f. Uji kesesuaian sistem dari konsentarsi 1,15 μg/ml, memenuhi persyaratan koefisien variasi
≤ 15%.
IV. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, didapatkan kesimpulan sebagai berikut
1. Optimasi kondisi KCKT dan ekstraksi levofloxacin dengan matrik urin menggunakan SPE
Oasis HLB 1cc dapat dilakukan dengan hasil yang cukup baik.
2. Berdasarkan hasil validasi metode analisis dengan parameter selektivitas, ketelitian,
ketepatan, keterulangan, linieritas, batas deteksi, batas kuantitasi dan kesesuaian sistem,
diperoleh hasil bahwa metode yang telah dilakukan telah sesuai persyaratan sehingga dapat
digunakan untuk penetapan levoflocxacin menggunakan KCKT dengan detektor UV