BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Jenis penelitian yang dilakukan adalah penelitian non eksperimental dan
eskperimental, dengan menggunakan rancangan penelitian pre test post test
control group design. Penelitian non eksperimental meliputi determinasi
tanaman pegagan, ekstraksi, uji kualitatif flavonoid dan triterpenoid pegagan,
uji kuantitatif flavonoid tanaman pegagan, dan pembuatan sediaan krim.
Penelitian eksperimental meliputi uji aktivitas anti aging. Rancangan penelitian
dapat digambarkan sebagai berikut:

Gambar 3.1. Bagan rancangan penelitian pre test post test control group design. Hewan uji
sejumlah 30 ekor mencit jantan balb/c yang memenuhi kriteria inklusi dikelompokkan
secara acak menjadi 5 kelompok. Selanjutnya dilakukan pengukuran parameter anti
aging sebelum perlakuan. Proses perlakuan selama 4 minggu. Setelah proses perlakuan,
kembali dilakukan pengukuran parameter anti aging.

B. Variabel Penelitian

28
UJI AKTIVITAS ANTI AGING ...,ANI YUPITAWATI, FARMASI, , UMP 2017
 1. Variabel bebas : Konsentrasi THC dan ekstrak pegagan
2. Variabel tergantung : Sensitivitas kulit, kadar air, kadar kolagen,
elastisitas dan besar pori-pori
3. Variabel terkendali : Galur mencit, umur mencit, berat badan mencit,
jenis kelamin mencit, luas punggung mencit
yang diolesi THC, ekstrak pegagan, dan
kombinasi THC-ekstrak pegagan, nutrisi,
kandang, jumlah bahan yang dioleskan,
dosis penyinaran UVA dan UVB, durasi
penyinaran UVA dan UVB

C. Definisi Variabel Operasional

1. Variabel bebas
Tetrahydrocurcumin (THC) diperoleh dari RONGSHENG®. Pegagan
segar diambil dari daerah Sumbang, Banyumas. Ekstrak pegagan diperoleh
dari remaserasi serbuk herba pegagan kering dengan menggunakan pelarut
etanol 70%.
2. Variabel tergantung
1. Sensitivitas adalah jumlah dan luas area kulit hewan uji yang
mengalami eritema sebelum dan sesudah perlakuan yang diukur dengan
Skin Analyzer EH 900 U.
2. Kadar air (moisture) adalah persentase jumlah air pada kulit hewan uji
sebelum dan sesudah perlakuan yang diukur dengan Skin Analyzer
EH 900 U.
3. Kadar kolagen adalah prosentase jumlah kolagen kulit hewan uji
sebelum dan sesudah perlakuan yang diukur dengan Skin Analyzer EH
900 U.
4. Elastisitas kulit adalah kekenyalan kulit hewan uji sebelum dan sesudah
perlakuan yang diukur dengan Skin Analyzer EH 900 U.
5. Besar pori adalah besarnya pori kulit hewan uji sebelum dan sesudah
perlakuan yang diukur dengan Skin Analyzer EH 900 U.

3. Variabel terkendali

29
UJI AKTIVITAS ANTI AGING ...,ANI YUPITAWATI, FARMASI, , UMP 2017
 Mencit yang digunakan adalah mencit galur balb/c, berjenis kelamin
jantan berumur 6-8 minggu dengan berat 20-25 gram. Luas area
punggung mencit yang diolesi bahan adalah 2x2 cm2. Nutrisi untuk
mencit berupa konsentrat makanan ayam 30%, jagung giling 40%, dan
dedak 30%, diberikan secara ad libitum 12-25 gram/ekor/hari. Kandang
mencit berupa kandang pemeliharaan berupa kotak plastik ukuran
25x20x10 cm dengan tutup kawat strimin pada bagian atas, diletakkan
pada ruangan yang cukup ventilasi dan pencahayaan. Tiap kelompok
perlakuan ditempatkan dalam satu kandang atau 1 kandang berisi 6 ekor
mencit. Jumlah bahan yang dioleskan adalah 2 mg/cm2 per hari yang
terbagi menjadi 2 kali/hari. Dosis sinar UVA 630 µW/cm2 dan UVB 105
µW /cm2. Durasi penyinaran UVA dan UVB 10 menit setiap hari
selama 4 minggu. Penyinaran UVA dan UVB menggunakan lampu Repti
Glo 13 W dari Exoterra®.

D. Waktu dan Tempat Penelitian

Waktu penelitian dilakukan dari bulan Oktober 2016 – Juni 2017. Tempat
penelitian dilakukan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan dan Laboratorium
Biologi, Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto.
Laboratorium Biologi Farmasi, Laboratorium Teknologi Farmasi, dan
Laboratorium Farmakologi Universitas Muhammadiyah Purwokerto.

E. Sampel Penelitian
1. Kriteria inklusi
Kriteria inklusi untuk sampel adalah mencit jantan sehat, galur balb/c,
umur 6-8 minggu, berat badan 20-25 gram, terlihat aktif.
2. Kriteria dropout
Mencit mati saat penelitian berlangsung.
3. Besar sampel
Dalam penelitian ini masing-masing perlakuan PN, PP, P1, P2, dan P3
direplikasi sebanyak 6 kali, sehingga jumlah mencit yang digunakan adalah
30 ekor. Jumlah mencit yang digunakan tidak menggunakan rumus Federer
(1977) dan jumlah 30 ekor.
F. Bahan dan Alat
1. Bahan uji

30
UJI AKTIVITAS ANTI AGING ...,ANI YUPITAWATI, FARMASI, , UMP 2017
 Pada penelitian ini digunakan herba pegagan yang diperoleh dari daerah
Sumbang, Banyumas, Tetrahydrocurcumin (Rongsheng®), quersetin
(PT Brataco, Indonesia), HCl pekat, Mg, etanol 96%, AlCl3, metanol, Ethyl
Ascorbyl Ether (PT. Brataco, Indonesia), Natrium benzoat, asam stearat,
trietanolamin, gliserin ( PT. Brataco, Indonesia).
2. Alat penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah:
a. Alat untuk pembuatan simplisia
Lemari pengering, nampan untuk wadah herba.
b. Alat untuk pembuatan serbuk simplisia
Grinder, ayakan.
c. Alat untuk remaserasi
Alat gelas (Iwaki-pyrex), timbangan analitik, bejana maserasi,
cawan porselen, kertas saring, rotary evaporator, waterbath.
d. Alat untuk penetapan kadar flavonoid esktrak pegagan
Alat gelas (Iwaki-pyrex), timbangan analitik, spektrofotometer
UV-Vis
( Shimadzu).
e. Alat untuk pembuatan basis krim
Alat gelas (Iwaki – pyrex), timbangan analitik, cawan porselen,
waterbath, mortir, stamper, sudip, pot salep.
f. Alat untuk uji anti aging
Lampu UVA dan UVB Repti Glo 13 W dari Exoterra®, kandang
mencit, holder, kerokan bulu, Skin Analyzer EH 900 U, dan seperangkat
komputer.

G. Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman pegagan
Determinasi tanaman dilakukan untuk menetapkan kebenaran sampel
yang digunakan dalam penelitian. Determinasi dilakukan terhadap sampel
herba segar pegagan (Centella asiatica) di Laboratorium Taksonomi
Tumbuhan, Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman, purwokerto.
2. Pengeringan herba pegagan

31
UJI AKTIVITAS ANTI AGING ...,ANI YUPITAWATI, FARMASI, , UMP 2017
 Herba pegagan yang telah disortasi basah dan ditiriskan, kemudian
dikeringkan dalam oven suhu 40-500 C, selama 72 jam (Darwati dan
Makmun, 2012).
3. Penyerbukan herba pegagan kering
Herba pegagan kering diserbuk dengan grinder, kemudian diayak
dengan ayakan ukuran 80 mesh (Sapri et al., 2014).
4. Ekstraksi herba pegagan
Metode ekstraksi yang digunakan adalah remaserasi dengan pelarut
etanol 70% yang mengacu pada metode remaserasi yang dilakukan oleh
Pratiwi (2010) dengan modifikasi. Remaserasi herba pegagan dengan
pelarut etanol 70% dilakukan dengan cara sebanyak 200 gram serbuk herba
pegagan kering dimasukkan ke dalam bejana maserasi, kemudian dituangi
penyari etanol 70% 2000 ml. Diaduk selama 4-5 jam pertama, lalu
direndam hingga 24 jam. Kemudian dilakukan pengadukan kembali selama
4-5 jam dan diamkan lagi hingga 48 jam. Lakukan kembali pengadukan
setiap hari selama 4-5 jam kemudian diamkan lagi hingga 24 jam hingga 5
hari. Selanjutnya maserat disaring dengan kain katun. Filtrat dimaserasi
kembali dengan 1000 ml etanol 70% selama 3 hari. Maserat disaring
dengan kain katun, lalu ditambahkan dengan maserat sebelumnya,
selanjutnya diuapkan dengan rotay evaporator suhu 50-600 C kecepatan
100 rpm, dan dipekatkan dengan waterbath suhu 40-500 C hingga diperoleh
ekstrak kental.

5. Uji total flavonoid ekstrak pegagan

a. Uji kualitatif flavonoid
Ekstrak pegagan sebanyak 1 gram ditambahkan etanol 95%, lalu
dipanaskan. Lapisan atas dipipet dan ditambahkan dengan HCL pekat 2
N dan serbuk mg. Adanya flavonoid ditandai dengan munculnya warna
merah (Lumbessy et al., 2013).

b. Uji kuantitatif flavonoid

1) Pembuatan kurva baku kuersetin
Ditimbang baku kuersetin 5 mg, dimasukkan dalam labu ukur 5
ml, kemudian ditambah etanol 80% ad 5 ml, sehingga diperoleh
larutan induk kuersetin 1000 μg/ml (A). Larutan A diambil 1 ml

32
UJI AKTIVITAS ANTI AGING ...,ANI YUPITAWATI, FARMASI, , UMP 2017
 kemudian ditambahkan etanol 80% hingga 10 ml (B). Selanjutnya
dari larutan B diambil
0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,45 ml dan masing – masing
larutan tersebut ditambah dengan 1 ml AlCl3 2% dan aquabidest
hingga 5 ml. Setelah diinkubasi 30 menit pada suhu 250 C,
serapannya diukur pada λ 400-800 nm, menggunakan
spektrofotometer UV Vis. Kemudian dilihat lamda maksimum hasil
spektrofotometri dan dibuat kurva kalibrasi dengan
menghubungkan sumbu X sebagai nilai konsentrasi larutan standar
dan sumbu Y sebagai nilai serapan (Azizah et al., 2014).
2) Pembuatan larutan uji ekstrak pegagan
Ektrak etanol pegagan ditimbang 10 mg, kemudian dilarutkan
dalam etanol 80% hingga 10 ml. Selanjutnya dari larutan tersebut
diambil 1 ml ditambah 1 ml AlCl3 2% dan akuabidest hingga 5 ml.
Selanjutnya diinkubasi hingga 30 menit pada suhu 250 C, dan dibaca
serapannya pada lamda maksimum (Azizah et al., 2014)
3) Penentuan kadar flavonoid
Penentuan kadar flavonoid menggunakan rumus penentuan
kadar flavonoid yang dilakukan oleh Azizah et al. (2014) yaitu
sebagai berikut:
F = c x V x f x 10-6 x 100%
m
Keterangan:
F : Jumlah flavonoid metode AlCl3
c : kesetaraan kuersetin (μm/ml)
V : volume total esktrak
f : faktor pengenceran
m : berat sampel (g)

6. Uji kualitatif triterpenoid ekstrak pegagan

Ekstrak pegagan sebanyak 5 mg dilarutkan dalam 5 ml etanol 96%,
kemudian ditambahkan 2 ml kloroform dan 3-5 tetes asam sulfat pekat.
Campuran ini dikocok-kocok, lalu didiamkan hingga beberapa saat, dan
diamati warna yang tebentuk (Patel et al., 2016).

33
UJI AKTIVITAS ANTI AGING ...,ANI YUPITAWATI, FARMASI, , UMP 2017
7. Pembuatan sediaan krim
Sediaan krim sebagai pembawa berupa krim tipe minyak dalam air
(o/w). Formulasi krim mengacu kepada formulasi krim ekstrak pegagan
yang dibuat oleh Putri (2013).
Tabel 3.1 Formula krim
Formula krim (gram)
Bahan Kontrol Kontrol THC EP THC
negatif positif EP
Asam stearat 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5
Trietanolamin 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75
Gliserin 5 5 5 5 5
Natrium benzoat 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Ethyl ascorbil ether - 1,5 - - -
Tetrahydrocurcumin - - 1 - 1
Ekstrak pegagan - - - 5 5
Aquadest Ad 50 Ad 50 Ad 50 Ad 50 Ad 50
a. Pembuatan basis krim
Fase minyak asam stearat dan fase air (trietanolamin, gliserin,
natrium benzoat dan akuades) masing-masing dilebur dalam cawan
porselen di atas waterbath suhu 700 C. Fase minyak dituang ke dalam
fase air, diaduk dalam mortir hangat hingga dingin. Bahan-bahan untuk
masing-masing perlakuan dituang ke mortir lain, lalu ditambahkan basis
krim sedikit demi sedikit, sambil diaduk hingga homogen.
b. Kontrol negatif (KN)
Kontrol negatif berupa basis krim 50 gram tanpa penambahan
bahan lain.
c. Kontrol positif (KP)
Ethyl ascorbyl ether sebanyak 1,5 gram dicampurkan dengan
basis krim hingga 50 gram.
d. Tetrahydrocurcumin (THC)
Tetrahydrocurcumin 1 gram dicampur dengan basis krim hingga
50 gram.
e. Ekstrak pegagan (EP)
Ekstrak kental pegagan 5 gram dicampur dengan basis krim hingga
50 gram.
f. Kombinasi tetrahydrocurcumin dan ekstrak pegagan (THCEP)
Tetrahydrocurcumin 1 gram dan ekstrak kental pegagan 5 gram
dicampur dengan basis krim hingga 50 gram.

34
UJI AKTIVITAS ANTI AGING ...,ANI YUPITAWATI, FARMASI, , UMP 2017
8. Uji aktivitas anti aging
a. Pendekatan uji aktivitas anti aging ini adalah Pre Test Post Test
Control Group Design, mengacu pada uji anti aging yang dilakukan
oleh Herawati (2014) dan Nazliniwaty (2016) dengan modifikasi.
b. Mencit yang memenuhi kriteria inklusi dipilih secara acak, lalu
ditimbang berat badannya. Mencit dikelompokkan secara acak menjadi
5, yaitu 6 mencit untuk kontrol negatif, 6 mencit untuk kontrol positif, 6
mencit untuk perlakuan 1, 6 mencit untuk perlakuan 2, dan 6 mencit
untuk perlakuan 3.
c. Mencit diletakkan dalam kandang ukuran 25 cm x 20 cm x 10 cm. Suhu
ruangan 25-27° C, cahaya berasal dari jendela pada siang hari,
kelembaban udara 50-60%, ventilasi silang. Dalam 1 kandang diisi 6
ekor mencit.
d. Kandang mencit dijaga kebersihannya setiap hari. Kotoran dan sisa
makanan dibuang. Setiap satu minggu sekali alas kandang berupa
sekam kering diganti.
e. Seluruh mencit diaklimatisasi selama selama 7 hari dengan tujuan agar
hewan uji mampu beradaptasi dengan kondisi lingkungan yang akan
ditempati selama penelitian berlangsung.
f. Nutrisi untuk mencit berupa konsentrat makanan ayam 30%, jagung
giling 40%, dan dedak 30%, diberikan secara ad libitum 12-25
gram/ekor/hari. Air minum berupa air putih matang diberikan ad
libitum setiap hari.
g. Seluruh kelompok mencit dicukur bulunya pada bagian punggung
belakang seluas 2x2 cm2 menggunkaan alat cukur bulu elektrik dan
alat cukur bulu manual.
h. Pengukuran kondisi hewan uji sebelum perlakuan dengan Skin
Analyzer EH 900 U meliputi sensitivitas kulit, kadar air, kadar kolagen,
elastisitas, dan besar pori-pori.
i. Penyinaran UVA dan UVB terhadap seluruh mencit dilakukan 10
menit setiap hari selama 4 minggu. Dosis penyinaran UVA sebesar
630 µW/cm2 dan UVB 105 µW/cm2. Jarak kulit dorsal mencit dengan
lampu UV adalah 15 cm.

35
UJI AKTIVITAS ANTI AGING ...,ANI YUPITAWATI, FARMASI, , UMP 2017
j. Pengaplikasian bahan anti aging dengan cara kelompok kontrol negatif
diolesi KN, kelompok kontrol positif diolesi KP, kelompok perlakuan 1,
2, 3 diolesi THC, EP, dan THCEP. Bahan dioleskan 2 kali per hari,
yaitu 2 jam sebelum penyinaran UV, dan 15 menit setelah penyinaran
UV dengan dosis 2 mg/cm2 selama 4 minggu (Ashawat et al., 2007).
k. Pengontrolan berat badan dan kesehatan hewan uji dilakukan dengan
cara berat badan mencit dikontrol dengan cara ditimbang setiap 2
minggu selama penelitian berlangsung, untuk memastikan bahwa berat
badan mencit tidak naik ataupun berkurang terlalu jauh dari rentang
berat badan yang sudah ditentukan. Kesehatan mencit juga selalu
dipantau dengan mengamati keaktifan bergerak dan nafsu makan
mencit.
l. Pengukuran parameter aktivitas anti aging pada kulit hewan uji setelah
perlakuan yaitu setelah 4 minggu dengan Skin Analyzer EH 900 U
meliputi sensitivitas kulit, kadar air, kadar kolagen, elastisitas, dan
besar pori. Evaluasi anti aging dengan Skin Analyzer EH 900 U
mengacu kepada Aramo (2012) dan Susana (2013). Evaluasi dilakukan
kepada hewan uji dalam keadaan aktif, karena penggunaan skin
analyzer tidak menyakiti kulit dan tidak bersifat invasif.
(1) Sensitivitas
Kamera diletakkan di permukaan kulit dorsal hewan uji. Pilih
menu sensitivity, shooting, dan freeze. Daerah berwarna kemerahan
yang menunjukkan sensitivitas pada foto, ditandai dengan menu tool
yang tersedia untuk menentukan jumlah dan luas area kulit yang
mengalami sensitivitas. Selanjutnya pilih menu analysis.
(2) Kadar air
Kamera diletakkan pada permukaan kulit dorsal hewan uji.
Selanjutnya pilih menu moisture, shooting, freeze, dan analysis.
(3) Kadar kolagen
Pengukuran kadar kolagen dilakukan dengan perangkat Skin
Analyzer EH 900 U dengan kamera sensor CCD resolusi 5.0 mega
pixel. Kamera diletakkan pada permukaan kulit dorsal hewan uji
kemudian pada layar komputer yang menampilkan software skin
analyzer dipilih menu collagen fibers, shooting, selanjutnya pilih

36
UJI AKTIVITAS ANTI AGING ...,ANI YUPITAWATI, FARMASI, , UMP 2017
 menu freeze untuk memfoto. Setelah kulit terfoto, pilih menu
analysis. Hasil analisis berupa persentase kadar kolagen akan
ditampilkan pada layar komputer.
(4) Elastisitas
Kamera diletakkan pada permukaan kulit dorsal hewan uji.
Selanjutnya dipilih secara berurutan menu elasticity, shooting,
freeze, dan analysis. Kondisi elastisitas kulit berupa persentase
ditampilkan pada layar komputer.
(5) Besar Pori
Kamera diletakkan pada permukaan kulit dorsal hewan uji.
Pilih menu pore, shooting, freeze. Selanjutnya dengan
menggunakan tool bergambar pensil, ditentukan diameter pori yang
terfoto. Terakhir, pilih menu analysis.
m. Penggantian hewan uji
Apabila dijumpai adanya hewan uji yang mati sebelum penelitian
berakhir, maka hewan uji tersebut diganti dengan hewan uji baru
dengan kriteria inklusi yang sama, dan selanjutnya diberi perlakuan
sesuai alur protokol penelitian.
n. Pemulihan kondisi hewan uji
Pada akhir penelitian, kemungkinan pada bagian kulit hewan uji
yang dicukur bulunya akan mengalami penuaan dini. Hewan uji
dipulihkan kondisinya dengan dibiarkan beraktivitas normal, diberi
nutrisi dan air minum yang cukup, bagian kulit yang mendapat perlakuan
selama penelitian diolesi etil ascorbyl ether 3% setiap hari selama 1
minggu.

H. Analisis Data
Data aktivitas anti aging THC, ekstrak pegagan, kombinasi THC ekstrak
pegagan, dianalisis dengan program SPSS 17. Data diuji normalitasnya dengan
Shapiro-Wilk dan diuji homogenitasnya dengan uji Levene’s test. Bila data
normal dan homogen, data kemudian diuji dengan One Way Anova,
dilanjutkan dengan uji Pos-hoc dengan tes LSD. Jika data tidak normal,
menggunakan analisis nonparametrik Kruskal –Wallis test yang dilanjutkan
dengan Mann-Whitney test.

37
UJI AKTIVITAS ANTI AGING ...,ANI YUPITAWATI, FARMASI, , UMP 2017