Scribd Logo
Unggah

Selamat datang di Scribd!

  • 268 tayangan

    PCR Pendahuluan

    Diunggah oleh

    Novia Sinta Varadina
    PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah teknik amplifikasi DNA secara in vitro yang dikembangkan oleh Kary Mullis pada tahun 1980-an. Dokumen ini menjelaskan tujuan dan landasan teori PCR serta faktor-faktor yang mempengaruhinya seperti primer, DNA template, dan suhu. Selanjutnya dijelaskan metode PCR untuk amplifikasi gen D-Loop pada DNA hewan dan mikrosatelit pada tumbuhan.

    Hak Cipta:

    © All Rights Reserved
    Unduh sebagai DOCX, PDF, TXT atau baca online dari Scribd

    PCR Pendahuluan

    Diunggah oleh

    Novia Sinta Varadina
    268 tayangan7 halaman
    PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah teknik amplifikasi DNA secara in vitro yang dikembangkan oleh Kary Mullis pada tahun 1980-an. Dokumen ini menjelaskan tujuan dan landasan teori PCR serta faktor-faktor yang mempengaruhinya seperti primer, DNA template, dan suhu. Selanjutnya dijelaskan metode PCR untuk amplifikasi gen D-Loop pada DNA hewan dan mikrosatelit pada tumbuhan.

    Deskripsi Asli:

    Judul Asli

    pcr pendahuluan.docx

    Hak Cipta

    © © All Rights Reserved

    Format Tersedia

    DOCX, PDF, TXT atau baca online dari Scribd

    Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

    Apakah konten ini tidak pantas?

    PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah teknik amplifikasi DNA secara in vitro yang dikembangkan oleh Kary Mullis pada tahun 1980-an. Dokumen ini menjelaskan tujuan dan landasan teori PCR serta faktor-faktor yang mempengaruhinya seperti primer, DNA template, dan suhu. Selanjutnya dijelaskan metode PCR untuk amplifikasi gen D-Loop pada DNA hewan dan mikrosatelit pada tumbuhan.

    Hak Cipta:

    © All Rights Reserved
    Unduh sebagai DOCX, PDF, TXT atau baca online dari Scribd
    Unduh sebagai docx, pdf, atau txt
    268 tayangan7 halaman

    PCR Pendahuluan

    Diunggah oleh

    Novia Sinta Varadina
    PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah teknik amplifikasi DNA secara in vitro yang dikembangkan oleh Kary Mullis pada tahun 1980-an. Dokumen ini menjelaskan tujuan dan landasan teori PCR serta faktor-faktor yang mempengaruhinya seperti primer, DNA template, dan suhu. Selanjutnya dijelaskan metode PCR untuk amplifikasi gen D-Loop pada DNA hewan dan mikrosatelit pada tumbuhan.

    Hak Cipta:

    © All Rights Reserved
    Unduh sebagai DOCX, PDF, TXT atau baca online dari Scribd
    Unduh sebagai docx, pdf, atau txt
    dari 7

    POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

    Disusun oleh :

    1. Novia Sinta Varadina (4401416101 / 3)


    2. Rafika Nur Handayani (4401416052 / 3)
    3. Ulfa Lutfiana (4401416093 / 3)
    4. Istighfaroh Tsaniyah (4401416099 / 3)

    PENDIDIKAN BIOLOGI

    FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

    UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG

    SEMARANG
    2019
    POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

    I. Tanggal Praktikum : 8 Mei 2019


    II. Tujuan Praktikum :

    Untuk mengamplifikasi DNA hasil isolasi

    III. Landasan Teori

    Keberhasilan sekuensing DNA sangat bergantung dari keberhasilan proses


    PCR. Asas PCR adalah melipat gandakan secara eksponensial sekuen nukleotida
    tertentu secara in vitro (Triyani, dkk, 2016). Polymerase Chain Reaction (PCR), yang
    dikemukakan oleh Kary Mullis pada pertengahan 1980-an, merupakan salah satu
    tonggak revolusi dalam bidang genetika molekuler. Teknik ini memungkinkan
    pendekatan baru dalam studi dan analisis gen (Retnoningsih dkk, 2019). Muhsinin dkk
    (2018), menyebutkan bahwa PCR memiliki beberapa keunggulan, diantaranya: cepat
    dalam menganalisis hasil (1 hari), memiliki nilai sensitifitas dan spesifisitas yang tinggi
    (>90%).

    Dalam penelitian Tang et al. (2016), PCR dilakukan di bawah kondisi


    thermocycling sebagai berikut: 95°C selama 5 menit, diikuti oleh 36 siklus 94°C selama
    30 detik, 50°C selama 30 detik, 72°C selama 30 detik, dan perpanjangan akhir selama
    7 menit pada 72°C. Menurut Ahrberg et al (2016), tahapan PCR biasanya terdiri dari
    tiga tahap yaitu, denaturasi, anealing, dan ekstensi. Pada langkah denaturasi (±95°C),
    DNA untai ganda terdenaturasi menjadi dua untaian tunggal. Setelah itu suhu menurun
    untuk langkah pendinginan (±56 ° C). Primer, yang merupakan sekuens pendek dan
    komplementer dari DNA, dapat dianil pada target DNA untai tunggal. Untuk
    meningkatkan aktivitas polimerase, suhu dinaikkan untuk langkah ekstensi, biasanya
    sekitar 72°C.

    Menurut Muhsinin dkk (2018), keberhasilan amplifikasi fragmen DNA


    dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu DNA template, primer, MgCl2, enzim
    polimerase, suhu, waktu dan jumlah siklus. Konsentrasi template DNA yang terlalu
    kecil sering menghasilkan pita DNA amplifikasi yang tipis dan tidak jelas. Enzim
    polimerase berfungsi sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA pada proses PCR
    enzim ini diperlukan untuk tahap ekstensi DNA. Konsentrasi enzim polimerase yang
    tidak tepat dapat menyebabkan hasil pita DNA yang smear. Konsentrasi ion Mg2+
    berpengaruh besar terhadap spesifisitas dan jumlah produk (yield) PCR. Umumnya jika
    ion Mg2+ kurang akan menurunkan yield, sedangkan jika ion Mg2+ berlebih akan
    menghasilkan produk non spesifik. Magnesium mempengaruhi penempelan primer
    serta aktifitas enzim. Pada penelitian ini konsentrasi MgCl2 yang rendah menyebabkan
    intensitas pita yang rendah pada produk PCR. Hal ini disebabkan rendahnya aktifitas
    Taq polimerase. Konsentrasi MgCl2 yang tinggi juga mempengaruhi jumlah pita yang
    dihasilkan dan mengakibatkan penurunan intensitas.

    Berdasaerkan penelitian yang dilakukan oleh Muhsinin dkk (2018), diperoleh


    konsentrasi komponen PCR yang optimum sebagai berikut:

    Tabel 1. Tabel Konsentrasi Optimal Komponen PCR


    Konsentrasi
    No Komponen Konsentrasi PCR Volume
    Awal

    1. Taq Polimerase 5U 1U 0,2 µl

    2. Buffer 5X 1X 10 µl

    3. MgCl2 25 µM 1,5 µM 3 µl

    4. dNTPs 10 µM 150 µM 0,75 µl

    5. Primer Forward 100 µM 100 nM 5 µl

    6. Primer Reverse 100 µM 100 nM 5 µl

    7. DNA Template 4,5 ng/µl 4,5 ng/µl 1 µl

    8. NFW ad 50 µl

    Dalam penelitian lain, Triyani dkk (2016) menyebutkan bahwa keberhasilan


    reaksi PCR sangat ditentukan oleh beberapa faktor, yaitu: Deoksiribonukleotida
    trifosfat (dN-TP); Oligonukleotida primer; DNA template; Susunan larutan bufer;
    Jumlah dauran reaksi; Enzim yang digunakan dan faktor teknis lainnya, seperti
    pencemaran. Oligonukleotida primer (rancangan primer) memegang peran penting
    untuk kekhasan terbesar dan keberhasil-gunaan PCR. Green et al (2015) dalam
    penelitiannya menyebutkan beberapa kriteria ideal untuk primer, antara lain: (i) primer
    harus cocok dengan gen dari semua organisme yang dikenal dalam kelompok yang
    diminati, dan harus dapat menargetkan gen dari organisme yang tidak dikenal di tingkat
    sub-taksonomi, (ii) pasangan primer harus seimbang untuk suhu leleh dan
    menghasilkan amplifikasi yang kuat, dan (iii) primer perlu menjangkau satu atau lebih
    daerah gen yang hipervarabel.

    IV. Alat dan Bahan

    - Alat : - Bahan :
    1. Mesin Thermal cycler 1. Kit PCR
    (PCR) 2. Primer Forward dan Reserve
    2. Tube PCR 3. H2O nuclease free
    3. Mikropipet 1 ul, 10 ul, dan 4. Sample DNA
    100 ul.
    V. Metode
    1. Cara kerja PCR Gen D-Loop untuk DNA Hewan

    Amplifikasi Gen D-loop Menggunakan KAPA 2G Hotstart Ready Mix Kit.

    Primer Untuk Amplifikasi D-loop


    (Primer Forward Dl-anaspf (L56)) Dan (Primer Reserve Dl-anaspr (H773))

    Komposisi Cocktail PCR :

    Komposisi Cocktail PCR Dicampurkan Dengan Cara Pipetting Dan Dihomogenkan


    Menggunakan Vortex Selama 1 - 2 Menit.

    Melakukan Program PCR : SEBANYAK 35x

    Pre-denaturasi 94˚C 5 Menit

    Denaturasi 94˚C 30 Detik

    Annealin 56,1˚C 30 Detik

    Ekstensi 72˚C 1 Menit

    Final Ekstensi 72˚C 5 Menit

    Produk PCR divisualisasikan menggunakan Agarose 2%


    2. Cara kerja PCR marker mikrosatelit untuk tumbuhan

    Amplifikasi lokus Mikrosatelit dangan menggunakan Dream Taq Green


    master mix

    Primer DZgccg01 digunakan untuk Amplifikasi lokus mikrosatelit.


    sekuen primer forward DZgccg01 dan primer reserve

    Komposisi Cocktail PCR

    dicampur dengan cara pipetting

    diVortex 1-2 menit

    Melakukan Program PCR : SEBANYAK 35x

    Pre-denaturasi 94˚C 5 Menit

    Denaturasi 94˚C 30 Detik

    Annealin 60,9˚C 30 Detik

    Ekstensi 72˚C 30 detik

    Final Ekstensi 72˚C 10 Menit

    Produk PCR divisualisasikan menggunakan Agarose 2%


    DAFTAR PUSTAKA

    Ahrberg, C. D., Manz, A., and Chung, B. G. 2016. Polymerase Chain Reaction in Microfluidic
    Devices. Journal of Lab Chip. 16: 3866 – 3884
    Green, S. J., Venkatramanan, R., and Naqib, A. 2015. Deconstructing the Polymerase Chain
    Reaction: Understanding and Correcting Bias Associated with Primer Degeneracies
    and Primer-Template Mismatches. Journal of PLoS One. 10(5): 1 – 21.
    Muhsinin, S., Sulastri, M. M., dan Supriadi, D. 2018 Deteksi Cepat Gen InvA pada Salmonella
    spp. Dengan Metode PCRm. Jurnal Sains Farmasi & Klinis. 3 (5) :191–200.
    Retnoningsih, A., dan Susanti, R. 2019. Petunjuk Praktikum Biologi Molekuler. Semarang:
    Jurusan Biologi FMIPA UNNES.
    Tang, Y., Bo, l., Jianguo, D., Jianfang, D., Wang, X., Si, J., Ali, Z., Taotao, L., and Nongyue,
    H. 2016. Genotyping of Pseudomonas aeruginosa Type III Secretion System Using
    Magnetic Enrichment Multiplex Polymerase Chain Reaction and
    Chemiluminescence. Journal of Biomedical Nanitechnology. 4(12): 762 – 769.
    Triyani, Y., Nafsi, N., Yuniarti, L., Sekarwana, N., Sutedja, E., Gurnida, D. A., Parwati, I., dan
    Alisjahbana, B. 2016. Rancangan Primer Spesifik Gen Macrophage Mannose
    Receptor (MMR) untuk Polymerase Chain Reaction (PCR) dan Sekuensing
    Deoxyribo Nucleic Acid (DNA). Indonesian Journal of Clinical Pathology and
    Medical Laboratory. 2 (22): 158 – 162

    Anda mungkin juga menyukai