BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Hasil Penelitian Terdahulu

Penelitian dengan judul “Development and Validation of Analytical
Method for Qualitative and Quantitative Determination of Glibenclamide in
Different Brands of Tablet Dosage form Using UV-Visible Spectroscopy” (Bilal
et al, 2013) merupakan metodologi untuk mengembangkan metode baru untuk
penentuan kualitatif dan kuantitatif glibenklamide (GLB) di tiga merek tablet
GLB. Validasi metode yang dikembangkan untuk linearitas, akurasi, presisi,
batas deteksi (LOD) dan batas kuantifikasi (LOQ) sesuai dengan pedoman dari
Konferensi Internasional. Jumlah kualitatif dan kuantitatif dari GLB dalam tiga
merek tablet GLB menggunakan metode validasi. Perbedaan non signifikan
diamati dalam profil tablet GLB. Validasi metode yang dikembangkan
menunjukkan bahwa hubungan linier (r2 > 0,999) diamati pada absorbansi
maksimum (λ max) di 229,5 nm dengan kisaran konsentrasi 3-15 mg / ml GLB.
Akurasi dari metode yang dikembangkan ditemukan dalam batas 95-105%.

Tabel 2.1 Hasil Penetapan Kadar Glibenklamid dalam Merk

nama-nama parameter
merek dari Label diklaim Jumlah terdeteksi
GLB RSD (%) Recovery (%)
(mg / tablet) (mg / tablet)
Daonil 5.0 5.12 0.56 101,09
Diabeta 5.0 5.08 1,18 100,58
Euglucon 5.0 5.02 2,08 100,07

Pada tabel 2.1 hasil Spektro dari 3 merk tablet glibenklamid (5mg) yang
telah ditentukan kadarnya diperoleh % RSD < 3%. Dalam tiga merek tablet
GLB, nilai-nilai LOD dan LOQ masing-masing adalah 10 dan 35 µg/ml. Jumlah
GLB di setiap tablet berhubungan dengan persyaratan 95-105% dari label
diklaim dalam tablet. Hasil validasi menunjukkan linearitas yang memuaskan,
presisi dan akurasi untuk analisis bahan aktif produk farmasi yang tersedia
secara komersial (Bilal et al, 2013).

VALIDASI METODE ANALISIS ... RAHARJO BINO YULIANTORO,FARMASI, UMP 2017

B. Landasan Teori
1. Glibenklamid
Glibenklamid termasuk golongan BCS (Biopharmaceutical
Classification System) kelas II, yang memiliki permeabilitas tinggi dan
kelarutan rendah. Sifat kelarutan glibenklamid yang rendah menyebabkan
rendahnya absorbsi dan bioavailabilitas glibenklamid (Nawale dan Metha,
2013). Glibenklamid merupakan sulfonilurea generasi kedua yang digunakan
untuk pengobatan diabates melitus tipe II, yang memiliki dosis tiga kali sehari
dan waktu paruh pendek 5 jam. Penggunaan glibenklamid dalam dosis berulang
dapat menyebabkan ketidakpatuhan pasien dalam terapi pengobatan (Bilandi et
al, 2014).

Gambar 2.1. Struktur glibenklamida (Anonim, 1995)

Glibenklamid mengandung tidak kurang dari 99,0% dan tidak lebih dari
101,0% mempunyai rumus kimia C23H28ClN3O5S atau (5-Kloro-2-
metoksibenzamido-etil-benzenasulfonil-3-sikloheksilurea). Mempunyai berat
molekul sebesar 494,00. Titik lelehnya 169,5 ºC (Abdul et al, 2011).
Glibenklamid tidak larut dalam air, agak sukar larut dalam etanol dan metanol
(Dirjen POM, 2014). Glibenklamid memiliki nilai pKa sebesar 5,3 (Rohayati et
al, 2015).
Menurut Farmakope Indonesia Edisi IV, glibenklamid dapat dianalisis
menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan cara menotolkan secara
terpisah masing-masing 10 µl larutan dalam campuran sama banyak kloroform
P dan metanol P. Spektrum serapan ultraviolet larutan glibenklamid 0,02%
dalam asam klorida metanol 0,01 N pada panjang gelombang antara 230 nm
dan 350 nm menunjukan maksimum dengan intensitas lebih rendah pada 275
nm; serapan pada 300 nm lebih kurang 1,26 (Anonim, 1995). Glibenklamid
memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang 229,5 nm dalam
methanol (Bilal et al, 2013).

VALIDASI METODE ANALISIS ... RAHARJO BINO YULIANTORO,FARMASI, UMP 2017

C. Spektrofotometri
1. Spektrofotometri
Spektrofotometri Sinar Tampak (Uv-Vis) adalah pengukuran energi
cahaya oleh suatu system kimia pada panjang gelombang tertentu (Day,
2002). Sinar Ultraviolet (UV) mempunyai panjang gelombang antara 200-
400 nm, dan sinar tampak (visible) mempunyai panjang gelombang 400-
750 nm. Spektrofotometri digunakan untuk mengukur besarnya energy
yang diabsorbsi atau diteruskan. Sinar radiasi monokromatik akan melewati
larutan yang mengandung zat yang dapat menyerap sinar radiasi tersebut
(Harmita, 2006).
Pengukuran spektrofotometri menggunakan alat spektrofotometer
yang melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang
dianalisis, sehingga spektrofotometer Uv-Vis lebih banyak dipakai untuk
analisis kuantitatif dibandingkan kualitatif. Spectrum Uv-Vis sangat
berguna untuk pengukuran secara kuantitatif. Konsentrasi dari analit di
dalam larutan bisa ditentukan dengan mengukur absorban pada panjang
gelombang tertentu dengan menggunakan hukum Lambert-Beer (Rohman,
2007).
Hukum Lambert-Beer menyatakan hubungan linearitas antara
absorban dengan konsentrasi larutan analit dan berbanding terbalik dengan
transmitan. Dalam hukum Lambert-Beer tersebut ada beberapa pembatasan
(Rohman, 2007) yaitu:
a. Sinar yang digunakan dianggap monokromatis
b. Penyerapan terjadi dalam suatu volume yang mempunyai penampang
yang sama
c. Senyawa yang menyerap dalam latutan tersebut tidak tergantung
dalam senyawa larutan lain dalam larutan tersebut
d. Tidak terjadi fluorosensi atau fosforisensi
e. Indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi larutan
Hukum Lambert-Beer dinyatakan dalam persamaan (Rohman, 2007):
A = a.b.c (1)
Keterangan:

VALIDASI METODE ANALISIS ... RAHARJO BINO YULIANTORO,FARMASI, UMP 2017

 A = absorban
a = absorpsivitas molar
b = tebal kuvet
c = konsentrasi
Salah satu syarat senyawa dianalisis dengan spektrofotometri adalah
karena senyawa tersebut mengandung gugus kromofor. Kromofor adalah
gugus fungsional yang mengabsorbsi radiasi ultraviolet dan tampak, jika
diikat oleh gugus auksokrom. Hamper smua kromofor mempunyai ikatan
rangkap berkonjugasi (diena(C=C-C=C), dienon (C=C-C=O), benzene dan
lain-lain. Auksokrom adalah gugus fungsional yang mempunyai elektron
bebas, seperti –OH, NH2, NO2, -X (Harmita, 2006).

2. Instrument Spektrofotometri Uv-Vis

Menurut Khopkar (2003) Instrument Spektrofotometri Uv-Vis
adalah:
a. Sumber Cahaya
Sumber yang biasa digunakan pada spektroskopi absorbsi adalah
lampu wolfram. Pada daerah UV digunakan lampu hydrogen atau lampu
deuterium. Kebaikan lampu wolfram adalah energi radiasi yang
dibebaskan tidak bervariasi pada berbagai panjang gelombang.
b. Monokromator
Monokromator adalah alat yang akan merubah cahaya
polikromatis menjadi cahaya tunggal (monokromatis) dengan
komponen panjang gelombang tertentu. Monokromator berfungsi untuk
mendapatkan radiasi dari sumber radiasi yang memancarkan radiasi
polikromatis. Monokromator terdiri dari susunan: celah (slit) masuk –
filter – prisma – kisi (grating) – celah (slit) keluar.
c. Wadah sampel (kuvet)
Kuvet merupakan wadah sampel yang akan dianalisis. Kuvet dari
lebuan silica (kuarsa) dipakai untuk analisis kualitatif dan kuantitatif
pada daerah pengukuran 190 - 1100 nm, dan kuvet dari bahan gelas
dipakai pada daerah pengukuran 380 - 1100 nm, karena bahan dari gelas
mengabsorbsi radiasi UV.

VALIDASI METODE ANALISIS ... RAHARJO BINO YULIANTORO,FARMASI, UMP 2017

 d. Detektor
Dektetor akan menangkap sinar yang diteruskan oleh larutan.
Sinar kemudian diubah menjadi sinyal listrik oleh amplifier dan dalam
rekorder akan ditampilkan dalam bentuk angka-angka pada reader
(Komputer).
e. Recorder
Merupakan sistem baca yang memperagakan besarnya isyarat
listrik, menyatakan dalam bentuk % transmitan maupun Absorbansi.
3. Prinsip Kerja Spektrofotometri
Cahaya yang berasal dari lampu deuterium maupun wolfram yang
bersifat polikromatis diteruskan melalui lensa menuju ke monokromator
pada spektrofotometer dan filter cahaya pada fotometer. Monokromator
kemudian akan mengubah cahaya polikromatis menjadi cahaya
monokromatis (tunggal). Berkas-berkas cahaya dengan panjang tertentu
kemudian akan dilewatkan pada sampel yang mengandung suatu zat dalam
konsentrasi tertentu. Oleh karena itu terdapat cahaya yang diserap
(diabsorsbsi) dan ada pula yang dilewatkan. Cahaya yang dilewatkan ini
kemudian diterima oleh detektor. Detektor kemudian akan menghitung
cahaya yang diserap sebanding dengan konsentrasi zat yang terkandung
dalam sampel sehingga akan diketahui konsentrasi zat dalam sampel secara
kuantitatif (Triyati, 1985).
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam analisis Spektrofotometri
Uv-Vis menurut Rohman (2007):
1) Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar Uv-Vis
Hal ini perlu dilakukan jika senyawa yang dianalisis tidak menyerap
pada daerah tersebut. Cara yang digunakan adalah dengan merubah
menjadi senyawa lain atau direaksikan dengan pereaksi tertentu.
2) Waktu oprasional (operating time)
Cara ini biasa digunakan untuk pengukuran hasil reaksi atau
pembentukan warna. Tujuannya adalah untuk mengetahui waktu
pengukuran yang stabil. Waktu operasional ditentukan dengan

VALIDASI METODE ANALISIS ... RAHARJO BINO YULIANTORO,FARMASI, UMP 2017

 mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan absorbansi
larutan.
3) Pemilihan Panjang Gelombang
Panjang gelombang yang digunakan untuk dianalisis kuantitatif adalah
panjang gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal. Untuk
memilih panjang gelombang maksimal, dilakukan dengan membuat
kurva hubungan antara absorbansi dengan panjang gelombang dari
suatu larutan baku pada konsetrasi tertentu.
D. Validasi Metode Analisis
Validasi metode analisis merupakan suatu tindakan penelitian
terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium untuk
membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk
penggunaannya (Harmita, 2004).
Beberapa parameter yang dipertimbangkan dalam validasi metode
analisis meliputi:
1. Linearitas
Linearitas merupakan kemampuan suatu metode yang
memberikan gambaran langsung maupun melalui bantuan perhitungan
matematis yang menghasilkan data yang proporsional terhadap
konsentrasi analit dalam sampel. Linearitas suatu metode dapta dilihat
dari menghitung regresi linear antara hasil pengukuran vs konsentrasi
(Harmita, 2004). Data berupa slope (b), intercept (a) dan koefisien
korelasi (r) dari perhitungan hasil regresi linear antar hasil yang terukur
vs konsentrasi berupa Y=bx+a akan memberikan gambaran tentang
linearitas, nilai dari koefisien korelasi (r) merupakan parameter untuk
mengetahui hubungan yang linear. Hubungan linear yang ideal dicapai
jika nilai b = 0 dan r = +1 atau -1 bergantung pada arah garis. Sedangkan
nilai a menunjukan kepekaan analisis terutama instrumen yang
digunakan. Nilai r hitung yang dibandingkan dengan r table pada taraf
kepercayaan dan derajat kebebasan tertentu yang menunjukan r hitung
> r tabel dapat dikatakan linearitasnya baik, dan dapat digunakan untuk
perhitungan (Harmita, 2004).

VALIDASI METODE ANALISIS ... RAHARJO BINO YULIANTORO,FARMASI, UMP 2017

 Koefisien kolerasi yang positif menunjukan bahwa hubungan
yang terjadi adalah searah, yaitu besarnya skor pada satu variabel terjadi
bersamaan dengan besarnya skor pada variabel lain dan rendahnya skor
pada suatu variabel terjadi bersamaan dengan kecilnya skor pada
variable yang lain dan rendahnya skor pada variabel yang satu terjadi
bersamaan dengan tingginya skor pada variabel yang lain (Azwar,
2007).
2. Batas deteksi dan batas kuantitasi (LOD dan LOQ)
a. Batas deteksi (limit of detection: LOD)
Batas deteksi (limit of detection: LOD) adalah jumlah terkecil
analit yang masih memberikan respon yang signifikan dibanding
dengan blanko. Batas deteksi merupakan parameter uji batas pada
suatu penelitian (Harmita, 2004).
Batas deteksi (LOD) dapat dihitung secara statistic dengan
persamaan:
3xSy/x 3 x Sb
LOD = atau LOD = (2)
Sl 𝑏

Keterangan :
K = Konstanta (untuk LOD k= 3)
Sb= simpangan baku respon analitik blanko (simpangan baku
residual Sy/x)
Sl= arah garis linear (kepekaan arah) dari kurva antara respon
-terhadap konsentrasi yaitu slope (b pada persamaan garis
y=bx+a)
b = slope

b. Batas kuantitasi (limit of quantity: LOQ)

Batas kuantitasi (limit of quantity: LOQ) merupakan
parameter pada anlisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil
analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan
seksama. Pada analisis instrument batas deteksi dapat dihitung
dengang mengukur respon blanko dan formula (Harmita,2004).
Batas kuantitasi (limit of quantity: LOQ) dapat dihitung
secara statistik dengan persamaan:

VALIDASI METODE ANALISIS ... RAHARJO BINO YULIANTORO,FARMASI, UMP 2017

 10xSy/x 3xb
LOQ = atau LOQ = (3)
Sl b

Keterangan:
K = konstanta (untuk LOQ k=10)
Sb = simpangan baku
B = slope

3. Keseksamaan (presisi)
Keseksamaan atau ketelitian dapat dinyatakan sebagai
keterulangan (repeatiblity) atau ketertiruan (reproducibility).
Keterulangan adalah keseksamaan metode yang dilakukan oleh individu
yang sama secara berulang pada kondisi yang sama serta dalam interval
waktu yang pendek. Ketertiruan didefinisikan sebagai keseksamaan
metode jika dilakukan pada kondisi yang berbeda. Biasanya analisis
dilakukan dalam laboraturium-laboraturium yang berbeda
menggunakan peralatan, pereaksi, pelarut, dan analisis yang berbeda
pula. Analisis dilakukan terhadap sampel-sampel yang diduga identik
yang dicuplik dari batch yang sama. Ketertiruan dapat juga dilakukan
dalam laboraturium yang sama dengan menggunakan peralatan,
pereaksi, dan analisis yang berbeda pada kondisi yang normal (Harmita,
2004).
Keseksamaan diukur sebagai simpangan baku relatif atau
koefisien variasi. Kriteria keseksamaan diberikan jika metode
memberikan relative standard devision (RSD) 2 % atau kurang. Kriteria
ini sangat fleksibel tergantung pada kondisi laboraturium. Pada kadar
1% atau lebih RSD 2,5 % dan satu per seribu adalah 5%. Pada kadar
satu persejuta (ppm) RSD 16% dan pada kadar satu permilyar (ppb)
adalah 32% (Harmita, 2004).
Keseksamaan dapat dihitung dengan persamaan:

SD
RSD = ̅ x 100% (3)
X

Keterangan:

RSD = relatif standar devisiasi

VALIDASI METODE ANALISIS ... RAHARJO BINO YULIANTORO,FARMASI, UMP 2017

 SD = standar devisiasi

̅
X = kadar rata-rata

Percobaan keseksamaan diakukan terhaadap paling sedikit enam

replikasi sampel yang diambil dari camuran sampel dengan matriks
yang homogeny (Harmita, 2004).

4. Kecermatan (accuracy)
Kecermatan didefinisikan sebagai ukuran yang menunjukan
drajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit sebenarnya.
Kecermatan dinyatakan sebagai persen perolehan kemabali (rekovery)
analit yang ditambahkan. Kecermatan hasil analisis sangat tergantung
pada sebaran kesalahan sistemik di dalam keseluruhan tahapan analisis.
Oleh karena itu untuk mencapai kecermatan yang tinggi hanya dapat
dilakukan dengan cara mengurangi kesalahan sistemik tersebut seperti
menggunakan peralatan yang telah dikalibrasi, menggunakan pereaksi
yang dan pelarut yang baik, pengontrolan suhu dan pelaksanaan yang
cermat, taat sesuai prosedur (Harmita, 2004).
Kecermatan dapat dilakukan dengan du acara yaitu metode
simulasi (spiked-plasebo recovery) atau metode penambahan baku
(standard addition method). Dalam metode simulasi sejumlah analit
bahan murni (senyawa pembanding kimia) ditambahkan kedalam
campuran bahan pembawa sediaan farmasi (plasebo) lalu campuran
tersebut dianalisis lalu hasilnya dibandingan dengan kadar analit yang
ditambahkan (kadar sebenarnya). Dalam metode penambahan baku,
sampel dianalisis lalu sejumlah tertentu analit yang diperiksa
ditambahkan kedalam sampel dicampur dan dianalisis lagi. Selisih
kedua kadar dibandingkan dengan kadar sebenarnya (Harmita, 2004).

Perhitungan perolehan kembali ditetapkan dengan persamaan

(Harmita, 2004):
(kadar terukur)
% Perolehan kembali = (𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑖𝑡𝑖𝑠) x 100% (5)

VALIDASI METODE ANALISIS ... RAHARJO BINO YULIANTORO,FARMASI, UMP 2017

 Rentang kesalahan yang diizinkan pada setiap konsentrasi
analit pada matriks dapat dilihat pada tabel dibawah ini (Harmita,
2004):
Tabel 2.1 Rentang kesalahan yang diizinkan pada setiap konsentrasi analit pada
matriks (Harmita, 2004)
Analit pada matriks sampel Rata-rata yang diperoleh (%)
>100% 98-102
>10% 97-102
>1% 97-103
>0,1% 95-105
0,01% 90-107
0,001% 90-107
1ppm 80-110
100ppb 80-110
10 60-115
1ppb 40-120

VALIDASI METODE ANALISIS ... RAHARJO BINO YULIANTORO,FARMASI, UMP 2017