PRAKTIKUM ANALISIS PRODUK HALAL

SEMESTER GASAL TA 2019/2020

• Peranan analisis dalam penentuan kehalalan produk pangan:
Metode analisis dapat diterapkan untuk mendeteksi adanya
kandungan non halal pada produk pangan.
FTIR

PCR PCR GC
Metode
(Polimerase Chain Reaction):
Analisis
Teknik perbanyakan Halal
DNA pada daerah
spesifik, menghasilkan
copy fragmen DNA
DSC HPLC
• Analisis berbasis DNA (molekul yang relatif stabil)
DNA tahan terhadap temperatur tinggi sehingga produk pangan
yang diproses pada suhu tinggi pun masih dapat dianalisis

• Analisis yang spesifik

PCR menggunakan primer spesifik yang dapat mengenali urutan
khas DNA dalam suatu spesies
(dalam analisis halal, digunakan primer spesifik babi)

• Dapat mendeteksi jumlah DNA yang sedikit

Walaupun DNA yang diperoleh sedikit, ada tahapan perbanyakan
DNA sehingga jumlahnya cukup untuk dianalisis
 • Mengeluarkan DNA dari sel atau matriks sampel
Isolasi DNA

• Memperbanyak DNA hasil isolasi, pada bagian yang

Amplifikasi spesifik sesuai tujuan analisis
DNA

• PCR real time : pembacaan chart selama proses PCR

berlangsung
Analis post- • PCR konvensional : visualisasi hasil PCR dengan
PCR elektroforesis
Isolasi DNA dapat dilakukan secara konvensional, maupun
menggunakan kit reagen isolasi yang tersedia secara komersial.

Tahapan isolasi DNA:

• Pengambilan sampel sel dari produk yang akan dianalisis
• Lisis (pemecahan sel)
• Sel dipecah dengan bantuan detergen, atau reagen lain yang bersifat
merusak dinding sel
• Pemisahan DNA dari protein dan biomolekul lainnya
• Penambahan proteinase K untuk degradasi molekul protein
• Penambahan kloroform untuk pengendapan molekul protein
• Pemisahan DNA dengan pengendapan dalam isopropanol dan/atau etanol
 Lisis
Sel
(Pemecahan Sel)

Sentrifuga Supernatan Pelet

Pemisahan
Protein, Supernatan Endapan Buang
Sentrifuga

Penam- ENDAPAN
bahan Supernatan Buang
DNA
etanol

 Page 7
• Membuat proses isolasi menjadi lebih cepat dan praktis, dengan
hasil yang lebih murni (namun harganya lebih mahal).
• DNA yang diperoleh lebih murni, karena setelah isolasi ada tahap
pemurnian (kit dilengkapi dengan kolom pemurnian).
• Komposisi (dan penamaan) reagen kit bervariasi tergantung
produsennya, namun secara umum fungsinya sama:
• Reagen isolasi : bufer lisis, bufer isolasi, proteinase K
• Reagen pemurnian : bufer penyeimbang, bufer pembilas, bufer elusi
Tahapan pemurnian DNA:
• Pengikatan
Sampel yang berisi DNA dilewatkan ke kolom. DNA akan terikat
pada matriks dalam kolom permunian.

• Pembilasan
Kolom dialiri bufer pembilas, yang akan melepaskan senyawa non
spesifik (komponen selain DNA yang terikat ke matriks).

• Elusi
Kolom dialiri bufer elusi untuk melepaskan DNA dari matriks. DNA
murni (terbebas dari pengotor) ditampung dalam wadah baru.
• Pengecekan kemurnian DNA dapat dilakukan dengan mengukur
serapan UV produk hasil isolasi
• DNA memiliki koefisien serapan UV (260 nm) yang tinggi karena
adanya ikatan rangkap terkonjugasi pada basa penyusunnya
(Adenine, Guanine, Thymine, Cytosine)
 •

• A260 = λ serapan asam nukleat

• A280 = λ serapan protein
• A320 = koreksi turbiditas

• Rentang nilai 1,7 – 2,0 menunjukkan tingkat kemurnian DNA yang baik.
• Nilai < 1,7 menunjukkan adanya protein yang tinggi (DNA kurang murni)
• Nilai > 2,0 menunjukkan adanya RNA tercampur DNA (DNA kurang murni)
• Tidak diperoleh DNA
• Kesalahan dalam mencampurkan reagen
• Terdapat reagen/tahapan yang terlewat

• Perolehan DNA rendah

• Sel belum benar-benar terpecah pada proses lisis
• Kesalahan dalam proses homogenisasi: terlalu kasar, ada gelembung, dsb.

• DNA rusak atau hancur (terdegradasi)

• Adanya kontaminasi DNAse, yang dapat mendegradasi molekul DNA
(kontaminasi dapat berasal dari perlengkapan yang tidak steril, atau
tangan bebas)
• Metode PCR diusulkan Kary Mullis pada 1983, dan Mullis mendapat
nobel Kimia pada 1993.
• PCR (Polimerase Chain Reaction): Reaksi Polimerisasi Berantai
• Polimerisasi yang terjadi adalah perpanjangan monomer nukleotida
(membentuk polinukleotida/DNA) dengan bantuan enzim DNA Polimerase
• DNA Polimerase yang digunakan stabil di suhu tinggi, berasal dari
mikroorganisme termofilik yang terbiasa hidup di suhu ekstrim
• Taq Pol adalah jenis DNA Polimerase yang paling umum digunakan (berasal
dari mikroorganisme Thermus aquaticus)
• Amplifikasi: proses perbanyakan DNA
• perbanyakan dilakukan pada bagian tertentu (tidak keseluruhan DNA)
• menghasilkan copy fragmen DNA
• Amplikon: fragmen DNA spesifik hasil perbanyakan
• Preparasi PCR dilakukan dengan mencampurkan reagen (mixing):
• Master mix
• dNTP (deoksiribosa nukelotida trifosfat) : monomer pembentuk DNA
• Enzim DNA Polimerase : untuk polimerisasi dNTP
• Bufer : untuk menunjang kerja enzim
(jika tidak tersedia dalam bentuk master mix, harus dimasukkan satu per satu)
• Template : DNA sampel yang akan diperbanyak
• Primer yang spesifik untuk jenis analisisnya
• Primer maju (forward) : Penanda bagian awal amplifikasi
• Primer mundur (reverse) : Penanda bagian akhir amplifikasi
• ddH2O (double distilled H2O atau aquabides), nuclease free

• (CATATAN: selalu sediakan daftar cek/check list saat akan mixing)

• Thermal Cycler merupakan alat yang digunakan untuk mengatur
perubahan suhu secara berulang.
• Hasil mixing dimasukkan ke dalam thermal cycler, dengan
pengaturan suhu sebagai berikut:
• Denaturasi/Penguraian (94 oC)
• Penguraian untai DNA
• Annealing/Penempelan
• Penempelan dua set primer untuk menandai bagian DNA yang diperbanyak
• Primer maju (forward): menandai bagian awal
• Primer mundur (reverse): menandai bagian ujung
• Elongasi/Perpanjangan (72 oC)
• Perpanjangan rantai DNA oleh enzim DNA Polimerase

• (CATATAN: suhu annealing bergantung pada primer yang digunakan)

• Satu siklus PCR meliputi penguraian, penempelan, dan perpanjangan
• Proses yang terjadi dalam satu siklus PCR meniru proses replikasi
yang terjadi dalam sel, namun:
• Hasil replikasi berupa DNA kromosom utuh, sedangkan hasil PCR berupa
fragmen DNA (bagian dari DNA kromosom).
• Proses replikasi melibatkan banyak enzim dalam sel, yang tidak mungkin ditiru
sepenuhnya.
• Penguraian dan penempelan untai DNA dalam PCR terjadi dengan perubahan
suhu (tanpa bantuan enzim), hanya proses perpanjangan rantai polinukleotida
yang dibantu oleh enzim DNA Polimerase.

• Setiap siklus PCR, akan dihasilkan dua copy DNA. Di akhir proses
PCR sebanyak n siklus, akan dihasilkan copy DNA sebanyak 2n.
• (DNA target sebanyak 2n – 2n)
• Pemilihan primer harus tepat, sesuai dengan jenis analisis yang
dibutuhkan

• Karakter primer yang dipilih akan menentukan siklus suhu yang

harus digunakan, terutama untuk proses annealing

• Pencampuran reagen dilakukan dengan tertib, pengenceran

template (DNA sampel) kadang diperlukan untuk memperoleh hasil
yang diharapkan
(ANALISIS POST-PCR)
• DNA dan reagen yang terlibat selama PCR tidak berwarna.
• Tidak ada perubahan makroskopis yang dapat dibandingkan
sebelum dan sesudah PCR.
• Perlu dilakukan visualisasi DNA hasil PCR melalui gel elektroforesis.

• Elektroforesis merupakan teknik pemisahan DNA dalam media

berpori (phorous), dengan menggunakan arus listrik (electric).
• DNA bermuatan negatif, molekulnya akan bermigrasi ke kutub
positif saat dialiri listrik.
• Fragmen DNA terpisah berdasarkan ukurannya (satuan ukuran
dalam “bp”/ base pair/ pasang basa).
 Fragmen DNA yang berukuran lebih besar akan tertahan oleh pori-pori gel,
sedangkan fragmen DNA yang lebih kecil dapat bermigrasi lebih jauh.
 Penentuan ukuran dilakukan dengan membandingkan jarak migrasi sampel
dengan jarak migrasi DNA standar (“DNA marker”).

• Visualisasi DNA:
• Dilakukan dengan bantuan etidium bromida (EtBr), yang membentuk kompleks
berpendar dengan DNA (dilihat di bawah sinar UV).
• EtBr bersifat mutagenik. Peralatan/perlengkapan yang kontak dengan EtBr
harus dibersihkan/dibuang secara terpisah.
• Telah ada pengganti EtBr yang lebih aman digunakan, yaitu GelRed.
• Elektroforesis dilakukan setelah tahapan PCR konvensional (non real
time) dengan tujuan untuk mengecek keberadaan DNA

• Gel agarosa dicetak sebagai media untuk elektroforesis. GelRed

ditambahkan ke dalam gel sebelum dicetak.

• Informasi yang diperoleh

• Ada/tidaknya DNA
• Ukuran fragmen DNA
• Perbandingan DNA sampel dengan kontrol positif dan kontrol negatif
• Pembuatan gel harus homogen
• Dipanaskan hingga larutan agarosa bening, sebelum dituang ke cetakan

• Injeksi sampel dilakukan dengan tertib

• Pastikan volume sampel tidak melebihi kapasitas “sumur”

• Kutub positif dan negatif jangan sampai tertukar!

• Elektroforesis umumnya berlangsung dengan voltase konstan
• Voltase rendah akan menghasilkan pemisahan yang lebih baik, namun
memerlukan waktu yang lebih lama
 Ukuran (bp) K (+) sampel K (–)

2000
1000
700
500
400
300
200
100

Primer spesifik babi yang digunakan,

berhasil mendeteksi kandungan babi dalam sampel yang dianalisis.