LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI FARMASI

ISOLASI DNA KROMOSOM DAN PLASMID DARI BAKTERI SERTA ANALISIS DNA
KROMOSOM DAN PLASMID

Disusun Oleh :
Nama : Ollive Filsa Hawa
NIM : 182210101042
GOL./KEL. : B2/B2-3
TGL.Prak : Kamis, 9 April 2020
Dosen : Endah Puspitasari S.Farm.,M.Sc.,Apt.

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI DAN BIOTEKNOLOGI

BAGIAN BIOLOGI FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS JEMBER
2020
1. Tujuan

1.1. Isolasi DNA Kromosom dari Bakteri

a. Mahasiswa mampu melakukan isolasi DNA kromosom bakteri.

b. Mahasiswa mampu mengetahui dan mampu mengisolasi plasmid rekombinan
pET ads dari bakteri Escherichia coli.
c. Mahasiswa mampu menganalisis DNA plasmid menggunakan elektroforesis
agarosa.
d. Mahasiswa mampu menentukan ukuran DNA plasmid hasil restriksi.

1.2. Isolasi DNA Plasmid dari Bakteri

Mahasiswa mengetahui dan mampu mengisolasi plasmid rekombinan pET

ads dari bakteri Escherichia coli.

1.3. Analisis DNA Kromosom dan Plasmid

a. Mahasiswa mampu menganalisis DNA plasmid menggunakan elektroforesis

agarosa.

b. Mahasiswa mampu menentukan ukuran DNA plasmid hasil restriksi.

2. Dasar Teori

Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling penting

dalam makhluk hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik
makhluk hidup dari satu generasi ke generasi selanjutnya.

Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi
bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA genom
meliputi gen dan intergen (Campbell dkk.2004).

DNA organisme prokariot dan eukariot mempunyai perbedaan bentuk. Organisme

prokariot memiliki DNA berbentuk sirkular, sedangkan organisme eukariotik
mempunyai DNA berbentuk linier. DNA eukariot terletak dalam inti sel, sedangkan
DNA prokariot terletak dalam sitoplasma (Jusuf, 2001).

Kromosom adalah suatu struktur makromolekul yang berisi DNA di mana

informasi genetik dalam sel disimpan. sekuens DNA yang terletak pada kromosom
disebut DNA Kromosomal. Kata kromosom berasal dari kata khroma yang berarti
warna dan soma yang berarti badan Kromosom terdiri atas dua bagian, yaitu sentromer
/ kinekthor yang merupakan pusat kromosom berbentuk bulat dan lengan kromosom
yang mengandung kromonema & gen berjumlah dua buah (sepasang).

Kromosom adalah pembawa gen yang terdapat di dalam inti sel (nukleus).
Kromosom terdiri dari DNA, RNA (asam ribo nukleat) dan protein. Kromosom
homolog (2n) adalah kromosom yang terdapat berpasangan dan memiliki struktur dan
komposisi yang sama. sel yang memiliki 2n kromosom (kromosom homolog) disebut
sel diploid. Bila tidak berpasangan kromosom diberi simbol n kromosom. Sel dengan n
kromosom adalah sel haploid, misalnya sel kelamin jantan saja atau sel kelamin betina
saja.

Plasmid bekteri yang biasanya merupakan molekul DNA untai ganda dengan
ukuran dari 1 kb sampai dengan lebih dari 200 kb. Plasmid ini terdapat dalam berbagai
spesies bakteri dan merupakan satuan genetik tambahan yang bereplikasi dengan tidak
tergantung pada kromosom bakteri dan diturunkan kepada anakan. Akan tetapi, dalam
replikasi dan transkripsi tetap tergantung pada enzim yang terdapat pada sel inang.
Biasanya, plasmid membawa gen yang menjadi enzim yang pada keadaan tertentu
menguntungkan sel inang, di antaranya resisten terhadap antibiotik, produksi antibiotik,
degradasi senyawa organic kompleks, produksi kolkisin, produksi enterotoksin, enzim
restriksi, dan enzim modifikasi (Sudjadi, 2008).

Plasmid sebagai DNA ekstrakromosomal merupakan molekul DNA pada sel

bakteri, berbentuk bulat kecil yang berbeda dan merupakan tambahan dari molekul
DNA utama pada kromosom bakteri. Kebanyakan plasmid adalah sirkular dan tersusun
dari beberapa ribu pasangan basa. Plasmid mempunyai titik ori (origin of replication)
sehingga mampu mereplikasi diri tanpa pengaturan dari DNA kromosom. Replikasi
dimulai dari titik ori hingga semua plasmid tereplikasi.

Berbagai tipe plasmid telah ditemukan pada sel bakteri. Distribusi plasmid pada
bakteri bersifat sporadis karena ada bakteri yang mengandung plasmid tetapi ada juga
yang tidak, misalnya pada sel E.coli terdapat plasmid F yang menyebabkan bakteri ini
mempunyai sifat konjugatif tertentu. Plasmid F biasa digunakan sebagai vector untuk
membawa DNA yang akan disisipkan pada genom sel target. Plasmid juga merupakan
alat yang efisien untuk mengamplifikasi klon DNA karena memiliki kopi yang sangat
banyak per selnya.
 Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain
seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga
yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti
selulosa dan protein, serta pemurnian DNA.

Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya
ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk
memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang
mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul
ringan akan berada pada bagian atas tabung.

Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu
supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell dkk. 2002).
Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen
dari campuran.

3. Alat dan Bahan

3.1. Isolasi DNA Kromosom dari Bakteri

Alat :

• Shaker
• Sentrifuge
• Mikropipet
• Vortex
• Pemanas air
• Freezer
• Tabung reaksi
• Lampu Bunsen
• Tip
• Tabung mikrosentrifus 1,5 ml
• Cawan petri
• Sengkelit
• Erlenmeyer

Bahan :
• Bakteri Escherichia coli PET 32b
• Media LB cair
• Buffer STE (10 mM Tris Cl pH 8, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl)
• Buffer Lisozim (50 mM Tris HCl pH 8, 10 mM EDTA, 5 mg/ml Lisozim)
• Buffer Lisis (SDS 2%, 200 mM EDTA (dibuat baru))
• PCl (phenol : chloroform : isoamilalkohol (25:24:1))
• Etanol dingin
• Buffer TE
• Air suling steril

3.2. Isolasi DNA Plasmid dari Bakteri

Alat :

• Shaker incubator 37°C

• UV transilluminator
• Mikropipet
• Ose bulat
• Sentrifus
• Tabung mikrosentrifus 1,5 ml
• Tip Biru (1 ml)
• Tip kuning (100 µl)
• Tip putih (10 µl)

Bahan :

• Bakteri Escherichia coli PET 32b

• Medium Luria Bertani
• Ampisilin
• Solution I (150 mM glukosa, 25 mM Tris Cl pH 8, 10 mM EDTA pH 8)
• Solution II (0,2 N NaOH, 1 % SDS (dibuat baru))
• Solution III (60 ml 5 M potassium asetat, 11,5 ml asam asetat glasial, 28,5 ml
akuades)
• PCl (phenol/chloroform/isoamilalkohol)
• Buffer TE
 • Etanol pa
• Na Asetat

3.3. Analisis DNA Kromosom dan Plasmid

Alat :

• Neraca analitik
• Erlenmeyer
• Microwave
• Mikropipet dan mikrotip
• Tabung mikrosentrifus
• Cetakan gel
• Mesin elektroforesis
• UV Transilluminator

Bahan :

• Loading dye
• Ekstrak DNA
• DNA ladder 1 kb sebagai marker
• Agarose
• TBE 1 x (tris boric EDTA)
• SYBR Safe

4. Prosedur Kerja

4.1. Isolasi DNA kromosom dari bakteri

Diambil koloni tunggal bakteri E.coli dari media LB padat dibiakan dalam 5 ml
media LB cair dan diinkubasi selama 18 jam pada suhu 370C dalam incubator
goyang dengan kecepatan 150 rpm.

1 ml biakan bakteri dimasukkan dalam tabung mikrosentrifus 1,5 ml, dan disentrifus
selama 5 menit dengan kecepatan 12000 rpm, supernatant dibuang dengan
melektakkan diatas ertas tissue dengan posisi terbalik. diualng 2x hingga 3 ml
biakan bakteri yang disentrifugasi, untuk mendapatkan pelet sel bakteri.
 Pelet sel yang diperoleh disuspensi dengan 1 ml larutan STE dengan vortex,
kemudian di sentrifus dengan kecepatan 7500 rpm selama 5 menit.

Supernatan dibuang dan pelet sel ditambah dengan 200 µl larutan lisozim dengan
vortex dan diinkubasi pada suhu 370C selama 1 jam.

Campuran ditambah dengan 200 µl biffer lisis dan diresuspensi dengan di bolak-
balik (4-6) x.

Campuran ditambah dengan PCl dan diresuspensi dengan di bolak-balik (4-6) x dan
disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm.

Fase air (bagian atas) diambil dengan pipet yang ujungnya lebar dan dimasukkan ke
dalam tabung mikrosentrifus. Perkirakan volume fase airnya.

Kemudian ditambah dengan CI (24:1) sama banyak dengan volume fase air.
Campuran diresuspensi dengan dibolak-balik dan disentrifus dengan kecepatan
10000 rpm suhu 40C selama 10 menit.

Fase air diambil dan ditambah dengan Na Asetat 0,1 volume fase air dan etanol
absolut 2x volume fase air kemudian campuran diresuspensi dan diinkubasi suhu
200C selama 2 jam.

Campuran disentrifus dengan kecepatan 10000 rpm pada suhu 40C selama 10 menit.
 Supernatan yang dihasilkan dibuang, dan dalam tabung ditambah 500 µl etanol 70%
diresuspensi perlahan dan disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm 40C selama
10 menit.

Supernatan dibuang, etanol dihilangkan dengan dikeringkan. DNA yang diperoleh

dilarutkan dalam 50 µl buffer TE.

4.2. Isolasi DNA Plasmid dari Bakter

4.2.1. Pembiakan dan Pemanenan Bakteri

Diambil koloni tunggal bakteri E.coli pET 30b diambil dari media LB padat dibiakan dalam 5
ml media LB cair yang telah diberi kanamisin (konsentrasi akhir 25 µg/ml) dan diinkubasi
selama 18 jam suhu 37°C dalam incubator goyang dengan kecepatan 150 rpm.

Sebanyak 1,5 ml biakan bakteri dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifus 1,5 ml, lalu
disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 12.000 rpm, supernatant dibuang dengan
membalikkan tabung dan diletakkan di atas kertas tisu dengan posisi terbalik.

Prosedur diatas diulangi 2 kali hingga 4,5 ml biakan bakteri yang disentrifugasi, untuk
mendapatkan pelet sel bakteri.

4.2.2. Isolasi Plasmid

Pelet diresuspensi dengan 100 µl solution I dengan cara memipet naik turun beberapa kali
hingga benar-benar tersuspensi (jika perlu dengan vortex).

Ditambahkan sebanyak 200 µl Solution II (fress solution/rp), lalu dihomogenkan dengan cara
membolak-balikkan tube secara perlahan selama 6-8 kali, kemudian didiamkan selama 5 menit
hingga lisat jerni. Jangan divortex.
 Solution III sebanyak 150 µl dihomogenkan dengan cara membolak-balikkan tube secara
perlahan (6-8 kali). Jangan divortex. Simpan dalam es selama 5 menit.

Campuran disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit 4°C. Sentrifugasi diulangi jika supernatant
tidak jernih.

Supernatan dipindahkan ke tabung mikrosentrifus baru (Hati-hati jangan sampai ada endapan
yang terikut).

Ditambahkan PCI sama banyak dengan volume supernatant, kemudian divoteks 3 menit dan
disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit.

Lapisan atas diambil dimasukkan pada tabung mikrosentrifus baru dan ditambahkan etanol pa
dan 3 M Na Asetat dengan perbandingan (2,5:0,1) dari volume supernatant. Kemudian
didiamkan pada freezer (-20°C) selama 1 jam untuk mempresipitasi plasmid.

Setelah 1 jam presipitasi, tabung mikrosentrifus disentrifugasi 12.000 rpm, 1 menit suhu 4°C.

Supernatan dibuang dan pelet dicuci dengan 1 ml etanol 70% kemudian disentrifus kembali
dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4°C.

Pelet dikeringkan dan diresuspensi dalam 20 µl buffer TE dan disiapkan pada suhu 4°C untuk
analisis selanjutnya.

4.3. Analisis DNA Kromosom dan Plasmid

4.3.1. Elektroforesis Agarosa
 Ditimbang agarosa 0,4 g dan dilarutkan dalam 40 ml buffer TBE 1x dengan cara
pemanasan sampai semua agarosa larut sehingga diperoleh gel agarosa 1%, kemudian
ditambahkan 1 µl SYBR Safe. Larutan didiamkan hingga suhu ± 60°C.

Cetakan/tray agarosa disiapkan dengan menutup sisi berlubang cetakan dengan selotip dan
menempatkan sisir elektroforesis untuk membentu sumur.

Larutan agarosa dituang ke dalam cetakan dan dibiarkan hingga memadat.

Setelah gel memadat, penutup cetakan dan sisir dilepaskan, kemudian cetakan ditempatkan
dalam tangki elektroforesis yang berisi buffer TBE 1x.

Sampel 5 µl hasil isolasi (DNA genom/DNA plasmid) yang telah dicampur dengan 2 µl
loading buffer (6x) dimasukkan ke dalam salah satu sumur dan 6 µl marka DNA 1 kb ke
dalam sumur lainnya.

Elektroforesis dijalankan pada 80 V, 400 mA selama 60 menit.

Gel hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV.

4.3.2. Penentuan Ukuran DNA

Dibuat garis regresi antara log BM DNA (x) dengan jarak migrasi (y).

Jarak migrasi DNA yang akan ditentukan diukur dan diinterpolasikan ke dalam garis
regresi yang telah dibuat sehingga dapat diketahui bilai log BM dari DNA tersebut.

5. Hasil Pengamatan
5.1. Pembacaan Hasil Elektroforesis Agarosa
 Berikut hasil Elektroforesis Agarosa dari DNA plasmid yang diisolasi dari 4 koloni
transforman bakteri yang berbeda, 1 : transforman 1, 2 : transforman 2, 3 : transforman 3,
4 : transforman 4.

Jawab :
Berdasarkan hasil tersebut, dapat disimpulkan bahwa DNA plasmid yang
diisolasi dari 4 koloni transforman bakteri memiliki ukuran DNA yang berbeda-beda.

a. Plasmid dari transforman 1 : hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa dalam plasmid
tersebut terdapat beberapa molekul DNA (2 DNA) dengan ukuran yang berbeda. Pita
yang dihasilkan cukup tipis, artinya DNA plasmid ini memiliki konsentrasi yang rendah.
Jaraknya pun cukup jauh, menandakan ukuran DNA kecil.
b. Plasmid dari transforman 2 : hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa dalam plasmid
tersebut terdapat beberapa molekul DNA (3 DNA) dengan ukuran yang berbeda. Pita
yang dihasilkan ada yang tipis dan ada yang tebal. Pita yang tebal berarti memiliki
konsentrasi yang tinggi. Jaraknya lebih dekat disbanding plasmid dari transforman 1,
menandakan ukuran DNA cukup besar.
c. Plasmid dari transforman 3 : hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa dalam plasmid
tersebut terdapat beberapa molekul DNA (3 DNA) dengan ukuran yang berbeda. Pita
yang dihasilkan sangat tipis, menunjukkan DNA dalam keadaan yang tidak utuh dan
memiliki konsentrasi yang rendah. Jaraknya cukup jauh. Hal ini berarti ukuran DNA
semakin kecil.
d. Plasmid dari transforman 4 : hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa plasmid dari
transforman 4 tidak terdapat DNA. Hal ini ditunjukkan oleh tidak adanya pita yang
terlihat.

5.2. Penentuan Ukuran DNA

Berikut Elektroforegram plasmid transforman 4 yang direstriksi dengan enzim restriksi
tertentu. Tentukan ukuran dari pita a, b dan c dalam pb (pasangan basa).

1. Plasmid dipotong dengan enzim

restriksi EcoR1
2. Plasmid dipotong dg enzim retriksi
EcoR1 dan BamH1

Jawab :
Ukuran marka DNA Jarak migrasi
Jarak migrasi
Pb Log pb (x) sampel
10.000 4 3
6.000 3,8 3,3
5.000 3,7 3,5
3.000 3,5 4 Sampel A = 4
2.500 3,4 4,3 Sampel B = 5,2
2.000 3,3 4,6 Sampel C = 5,6
1.500 3,2 5,2
1.000 3 6
800 2,9 6,5
 600 2,8 7
400 2,6 7,9
200 2,3 8,9
Persamaan regresi Y = -3,715x + 17,269

Ukuran sampel (pb)

• Pita A = -3,715x + 17,269

4 = -3,715x + 17,269
3,715x = 13,269
X = 3,572
Log-1 (x) = 3.730 bp
• Pita B = -3,715x + 17,269
5,2 = -3,715x + 17,269
3,715x = 12,069
X = 3,249
Log-1 (x) = 1.773 bp
• Pita C = -3,715x + 17,269
5,6 = -3,715x + 17,269
3,715x = 11,669
X = 3,141

Log-1 (x) = 1.383 bp

6. Soal Latihan
6.1. Isolasi DNA Kromosom dari Bakteri

1) Sebutkan metode untuk DNA kromosom ?

a. Metode fisik : Freeze thaw, bead mill homogenization, atau resonansi misalnya
metode sonikasi
b. Metode kimia : Sel dapat rusak dengan buffer lisis berisi senyawa kimia (lisosim,
EDTA, Tris HCl, atau detergen sodium dodecyl sulfat (SDS)) yang dapat merusak
integritas barrier dinding sel
2) Apakah perbedaan DNA kromosom dan DNA plasmid ?
DNA Kromosom DNA Plasmid
 Memiliki ukuran yang besar (>0,5 Mb) Memilki ukuran relative kecil ±2 kb

Berbentuk linier, sirkuler Berbentuk sirkuler

Tidak tahan denaturasi Tahan terhadap denaturasi

Terletak pada inti sel Terletak di ekstrakromosom

sitoplasma
Digunakan untuk penetapan kadar Digunakan untuk elektroforesis

3) Bagaimana cara mengetahui keberhasilan isolasi DNA kromosom ?

Isolasi DNA kromosom dikatakan berhasil apabila saat dipanaskan tiba-tiba sel akan
pecah dan DNA genom keluar dari sel

6.2. Isolasi DNA Plasmid dari Bakteri

1) Bagaimana cara mengisolasi DNA plasmid?

a. Pembiakan bakteri

b. Pemanenan dan lisis sel bakteri

c. Pemurnian plasmid DNA

2) Bagaimana cara memisahkan DNA plasmid dari DNA kromosom?

DNA plasmid dipisahkan dari DNA kromosom dengan cara menambahkan detergen
sehingga dapat melisiskan membrane sel. Proses ini dapat membebaskan DNA
kromosom, DNA plasmid, dan komponen lainnya.

3) Sebutkan fungsi PCl?

PCl berfungsi sebagai pendenaturasi protein. Namun, DNA dan RNA tidak
terdenaturasi karena molekul ini tidak larut dalam pelarut organik, sehingga
dilakukan presipitasi DNA dengan etanol untuk menghilangkan fenol-kloroform.

4) Sebutkan fungsi Solution I, II, dan III?

a. Solution I : Untuk meresuspensi pelet sel bakteri setelah pemanenan.

b. Solution II : Untuk melisiskan sel dengan cara melarutkan membrane sel dan
mendenaturasi DNA kromosom (tidak DNA plasmid).
 c. Solution III : Untuk menetralisir pH, menghentikan denaturasi DNA kromosom
sehingga bentuk presipitat DNA kromosomal yang menempel, dan memisahkan
DNA plasmid yang larut.

6.3. Analisis DNA Kromosom dan Plasmid

1. Apa yang dimaksud dengan elektroforesis?

Elektroforesis adalah suatu cara untuk memisahkan fraksi-fraksi suatu zat berdasarkan
migrasinya di bawah pengaruh medan listrik.
2. Sebutkan matriks untuk pemisahan DNA menggunakan elektroforesis?
a. Pati (agarosa)

b. Poliakrilamid

3. Bagaimana cara mengamati DNA plasmid menggunakan elektroforesis agarosa?

Keberadaan DNA dalam gel agarosa dapat dideteksi menggunakan senyawa
berfluoresensi, misal: etidium bromida, akridin orange, propidium iodide, SYBR Safe.
Senyawa tersebut mampu berinterkalasi diantara untai DNA, saat diberi sinar UV 254
nm, DNA akan mengabsorbsi sinar dan ditransmisikan pada senyawa pewarna DNA.
Sedangkan, radiasi pada 302 dan 366 nm akan diserap oleh senyawa pewarna DNA.
Pada kedua keadaan ini, energi dipancarkan pada 590 nm pada daerah jingga-merah.
7. Pembahasan
7.1. Isolasi DNA Kromosom dan Plasmid
7.1.1. Prinsip Isolasi DNA
Isolasi DNA merupakan teknik ekstraksi dan atau purifikasi DNA dari suatu sel
sebagai tahap awal suatu analisis genetik. Isolasi DNA diperlukan dengan tujuan untuk
memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Terdapat 3
prinsip utama dalam isolasi DNA yaitu : (1) penghancuran (lisis), (2) ekstraksi atau
pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa atau protein, (3) pemurnian DNA.
Secara umum, tahap isolasi DNA dimulai dari pengambilan sampel, pelisisan
membrane atau dinding sel, ekstraksi DNA, presipitasi DNA, pemurnian DNA, dan
pengawetan DNA. Isolasi DNA berfungsi sebagai media pembelajaran genetik, dapat
mengetahui kelainan genetik yang diderita, dapat mengetahui agen penyebab penyakit
infeksi, dll. (Yuwono, 2006.; Soedjadi, 2008.; Maftuchah, 2014).
Isolasi DNA dapat dibedakan menjadi 2 macam yaitu: isolasi DNA kromosom dan
isolasi DNA plasmid. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu
sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi
berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga
substansi yang lebih besar akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan
akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin
bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm
atau 3000 rpm, dll.
7.1.2. Fungsi Bahan/Reagen yang digunakan dalam Isolasi DNA
a. Media LB cair
Digunakan untuk pembiakan bakteri yang akan digunakan (E.coli).
b. Buffer STE
Larutan penyangga yang digunakan untuk resuspensi DNAdan penyimpanan DNA
dalam plasmid kit untuk pemurnian plasmid dan dalam beberapa protocol
tambahan plasmid.
c. Buffer Lisis
Buffer atau larutan penyangga yang digunakan untuk pemecahan/lisis dinding sel
bakteri.
d. Buffer Lisozim
Buffer atau larutan penyangga yang digunakan untuk pemecahan dinding sel
bakteri.
e. EDTA
EDTA (Ethylene Diaminetetra Acetic acid) berfungsi sebagai penghancur sel
dengan cara mengikat ion magnesium yang diperlukan oleh sel untuk menjaga
keutuhan selubung sel secara keseluruhan.
f. SDS
SDS adalah Sodium Dodecyl Sulphate, larutan yang digunakan untuk melisiskan
membrane sel juga dapat berperan dalam mengurangi aktivitas enzim nuklease
yang merupakan enzim pendegradasi DNA.
g. PCl
Digunakan untuk memisahkan DNA dari pengotornya.
h. Etanol
Digunakan untuk presipitasi DNA atau fase pencucian DNA untuk menghilangkan
isopropanol dan garam yang terkandung.
i. Buffer TE
Untuk menjaga agar DNA tidak terdegradasi saat proses penyimpanan.
 j. Ampisilin
Sebagai marka seleksi dan membuat isolate yang digunakan akan membawa gen
resistensi antibiotika.
k. Na asetat
Digunakan untuk ekstraksi DNA.
l. Solution I
Untuk meresuspensi pelet sel bakteri setelah pemanenan.
m. Solution II
Untuk melisiskan sel dengan cara melarutkan membrane sel dan mendenaturasi
DNA kromosom (bukan DNA plasmid).
n. Solution III
Untuk menetralisir pH, menghentikan denaturasi DNA kromosom sehingga bentuk
presipitat. DNA kromosomal yang menempel, serta memisahkan DNA plasmid
yang larut.
7.1.3. Titik Krisis
o Pemipetan reagen harus tepat dan teliti.
o Saat meletakkan sampel pada mesin sentrifugasi, harus dilakukan dengan benar
dan seimbang.
o Pengerjaan praktikum yang berhubungan dengan bakteri dan DNA harus dilakukan
dengan steril.
o Pembuangan supernatan harus dengan hati-hati dan benar, agat pelet bakteri tidak
ikut terbuang.
o Penghomogenan sampel harus hati-hati dan benar. Agar larutan sampel tidak
tumpah (saat dibolak-balikkan).
o Pengambilan koloni bakteri yang digunakan harus benar, teliti dan dalam kondisi
aseptis (steril).
o Penumbuhan bakteri yang digunakan harus benar dan dalam kondisi aseptis (steril)
agar bakteri yang tumbuh adalah bakteri yang diinginkan (tidak terkontaminasi
bakteri/mikroorganisme yang lain).
o Penggunaan alat dan bahan yang digunakan harus sesuai dengan perintah, agar alat
dan bahan yang digunakan tidak rusak.
7.2. Analisis DNA Kromosom dan Plasmid

7.2.1. Elektroforesis
 Elektroforesis adalah suatu metode pemisahan yang memanfaatkan medan
listrik yang dihasilkan dari elektroda-elektroda untuk memisahkan senyawa-senyawa
yang memiliki muatan berupa kation atau anion. Prinsip kerja elektroforesis adalah
jika semakin besar kekentalan (viskositas) fluida maka akan sulit mengalir atau sulit
bergerak dalam fluida tersebut. Begitu juga pada elektroforesis DNA. Jika molekul
yang digunakan memiliki ukuran yang besar, molekul dengan ukuran yang lebih besar
akan sulit bergerak dibandingkan dengan molekul yang kecil.

Pada elektroforesis, media pemisahnya berupa gel agarosa atau lainnya yang
memiliki tingkat viskositas yang tinggi. Laju dalam elektroforesis sangat bergantung
pada kekentalan medium, ukuran dan bentuk molekul, serta muatan molekul.
Kekuatan asam pada medium juga mempengaruhi besar muatan pada saat ionisasi
berlangsung sehingga diperlukan buffer untuk mengatasi masalah tersebut. Dalam
elektroforesis, terdapat beberapa faktor yang dapat mempengaruhi proses pemisahan
yaitu: sampel, larutan buffer, dan medan listrik.

Pada praktikum ini, didapatkan hasil data seperti gambar di bawah ini :

Dapat dilihat bahwa hasil dari elektroforesis tersebut kurang baik/kurang bagus.
Hal ini dikarenakan hasil yang diperoleh terdapat beberapa pita yang tipis atau kurang
jelas, yang menunjukkan DNA dalam keadaan yang tidak utuh. Sehingga, DNA
tersebut sulit untuk diamati maupun dihitung ukurannya.
 Berdasarkan hasil elektroforesis tersebut, dapat dihitung ukuran DNA tersebut.
Berdasarkan perhitungan yang telah dilakukan, hasil yang diperoleh untuk DNA (a)
sebesar 3.730 pb, DNA (b) sebesar 1.773 pb, dan DNA (c) sebesar 1.383 pb. Hasil
ukuran DNA tersebut, merupakan hasil perhitungan dari persamaan regresi antara Log
BM DNA (pb) dengan jarak migrasi DNA.

7.2.2. Syarat Hasil Elektroforesis yang Baik

a. Pita DNA yang dihasilkan tebal dan jelas.

b. Tidak terjadi smear (bayangan yang berada di bawah pita) atau tailing pada hasil
elektroforesis.
c. Hasil elektroforesis terbentuk band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi
dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasangan basanya.
d. DNA yang dihasilkan murni (tidak terdapat kontaminan zat lain).

7.2.3. Fungsi Reagen/Bahan yang digunakan pada Elektroforesis

a. Loading dye

Loading dye berfungsi sebagai penanda pergerakan DNA dalam gel agarosa.

b. Gel Agarosa
Gel agarosa digunakan sebagai matriks penyangga (media pemisah).
c. SYBR Safe
 SYBR safe digunakan untuk mewarnai DNA agar dapat diketahui keberadaan DNA
dalam gel agarosa.
d. BE (Tris Boric EDTA)
Tris Boric EDTA digunakan sebagai larutan penyangga atau buffer pada elektroforesis
DNA agar dapat mempertahankan pH di dalam medium pemisah dan sebagai media
penyedia elektrolit pada proses pergerakan aliran listrik.

7.2.4. Titik Kritis

a. Pembuatan gel agarosa harus dilakukan dengan benar, agar didapatkan konsentasi gel
yang diinginkan dan bagus.

b. Saat memasukkan larutan buffer dan gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis harus
cermat, teliti, dan hati-hati.

c. Pemipetan sampel harus dilakukan dengan benar dan teliti.

d. Saat memasukkan sampel ke dalam sumur, harus hati-hati dan jangan sampai
salah/keliru. Agar hasil yang didapatkan bagus.

e. Pada saat menentukan ukuran DNA, perhitungan yang dilakukan harus cermat dan
teliti.

8. Kesimpulan

▪ Isolasi DNA merupakan teknik ekstraksi dan atau purifikasi DNA dari suatu sel
sebagai tahap awal suatu analisis genetik.
▪ Terdapat 3 prinsip utama dalam isolasi DNA yaitu : (1) Penghancuran (lisis), (2)
Ekstraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa atau protein, (3)
pemurnian DNA.
▪ Terdapat beberapa reagen yang digunakan pada isolasi DNA, seperti media LB cair,
EDTA, Solution I, Solution II, Solution III, etanol, dll.
▪ Elektroforesis adalah suatu metode pemisahan yang memanfaatkan medan listrik yang
dihasilkan dari elektroda-elektroda untuk memisahkan senyawa-senyawa yang
memiliki muatan berupa kation atau anion.
▪ Terdapat beberapa reagen yang digunakan pada elektroforesis, seperti loading dye, gel
agarosa, SYBR safe, dan BE.
 ▪ Berdasarkan hasil yang diperoleh, hasil elektroforesis pada praktikum ini kurang
bagus/kurang baik. Ukuran DNA yang didapatkan juga bervariasi yaitu: DNA (a)
sebesar 3.730 pb, DNA (b) sebesar 1.773 pb, dan DNA (c) sebesar 1.383 pb.

9. Saran

a. Sebelum melakukan praktikum, praktikan harus memahami materi yang akan

dilakukan/dipraktikkan.
b. Dalam melakukan isolasi DNA (kromosom dan plasmid) serta elektroforesis DNA
harus dilakukan dengan teliti dan sesuai dengan aturan yang diberikan.
c. Penggunaan bahan yang bersifat karsinogenik sebaiknya dilakukan dengan hati-hati.

10. Daftar Pustaka

Anonim. 2013. What is the composition of Buffer STE ?.

https://www.qiagen.com/us/resources/faq?id=0154abce-6a20-4028-b37e-
69b017eb6b87&lang=en. Diakses pada tanggal 21 April 2020.

Campbell, N.A. 2002. Biologi 5th ed. Jakarta : Erlangga.

Faatih, Mukhlissul. 2009. Isolasi dan Digesti DNA Kromosom. Jurnal Penelitian Sains
& Teknologi. 10(1): 61-67.

Harahap, Muhammad Ridwan. 2018. Elektroforesis: Analisis Elektronika terhadap

Biokimia Genetika. Jurnal Ilmiah Pendidikan Teknik Elektro. 2(1): 21-26.

Jusuf. 2001. Genetika I: Struktur dan Ekspresi gen. Jakarta : Sagung Seto.

Khusnuryani, Arifah, Jumailatus Solihah, dan Anif Yuni Muallifah. 2016. Isolasi dan
Analisis Kualitas DNA Plasmid (pGEM®-3Zf(+)) sebagai Sediaan Kebutuhan
Praktikum di Laboratorium Biologi Fakultas Sains dan Teknologi. Integrated Lab
Journal. 4(1): 63-70.

Nurhayati, Betty dan Sri Darmawati. 2017. Biologi Sel dan Molekular. Jakarta:
Kementerian Kesehatan Republik Indonesia.

Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta : Kasinius.