10

FAKTOR –FAKTOR YANG MEMPENGARUHI

AKTIVUTAS ENZIM

Tujuan : untuk mengetahui pengaruh konsentrasi enzim terhadap aktivitas

00
Landasan Teori
enzim dan membuat kurva pengaruh konsentrasi enzim tersebut
terhadap aktivitasnya.

Enzim sebagai katalisator juga mempunyai sifat- sifat seperti katalis pada
umumnya, yaitu ikut bereaksi, tetapi pada akhir reaksi akan didapat kembali dalam
bentuk semula. Hal tersebut mengakibatkan emzim dapat dipakai kembali setelah
melaksanakan aktivitasnya, sehingga tubuh kita tidak membutuhkan enzim dalam
jumlah yang besar. Jumlah atau kadar enzim yang besar. Jumlah atau kadar enzim
yang yang kecil tersebut menimbulkan kesulitan tersendiri bagi kita untuk mengukur
aktivitas enzim, sehingga memerlukan teknik yang rumit. Secara klinis pengukuran
aktivitas enzim sangat penting dilakukan.
Ada banyak faktor yang dapat mempengaruhi aktivitas enzim antara lain(1)
suhu; (2) pH; (3) konsentrasi enzim; (4) konsentrasi substrat; (5) aktivator; (6)
inhibitor. Pada percobaan kali ini akan dilakukan pengaruh konsentrasi enzim
terhadap aktivitasnya. Pada penentuan aktivitas dialkukan pada pH optimum dengan
konsentrasi substrat dan ko-faktor berrlebih (mendekati jenuh), sehingga laju reaksi
yang terjadi merupakan laju reaksi tingkat ke nol terhadap konsentrasi enzim.
Kecepatan reaksi yang dikatalisis oleh suatu enzim umumnya dilaporkan
-1), karena kecepatan
paling tinggi terjadi pada suatu keadaan dimana produk reaksi belum terbentuk. Pada
keadaan ini konsentrasi substrat paling besar dan enzim belum dihambat secara
umpan balik oleh produknya. Plot produk reaksi yang terbentuk terhadap waktu pada
reaksi enzimatis menunjukkan bahwa pada tahap awal terjadi grafik linier, kemudian
diikuti oleh penurunan kecepatan reaksi karena sebagian substrat sudah digunakan
dalam reaksi atau aktivitas enzim menurun. V0 diperoleh dengan menarik garis lurus
melalui bagian linier kurva mulai pada titik waktu nol (gambar 1). Kemiringan garis
lurus sama dengan V0.
Satuan Unit enzim
Aktifitas enzim dapat diungkapkan dengan berbagai cara. Ungkapan yang
paling umum adalah dengan kecepatan awal dari reaksi yang dikatalisis (V0)

PENUNTUN PRAKTIKUM BIOKIMIA- INYOMAN TIKA 69

 -1). Ada dua satuan
aktivitas enzim standar, unit enzim (U) dan katal (kat). Unit enzim adalah jumlah

pada kondisi optimal enzim bersangkutan. Katal merupakan satuan SI dari aktivitas
enzim yang didefinisikan sebagai aktivitas katalitik yang dapat meningkatkan
kecepatan reaksi sebanyak satu mol per detik dalam system khusus. Jika kita ingin
mengubah diantara satuan-satuan aktivitas enzim, kita dapat menggunakan hubungan
-1 = 1U = 16,67 nanokat. Istilah aktivitas (atau aktivitas total) mengacu
pada satuan total enzim dalam sample, sedangkan aktivitas spesifik adalah jumlah unit
enzim per milligram protein (unit mg-1). Aktivitas spesifik adalah ukuran kemurnian
enzim. Selama pemurnian enzim, aktivitas spesifiknya meningkat serta nilai aktivitas
spesifiknya menjadi maksimal dan konstan jika enzim murni.

4. Konsentrasi substrat
Ketergantungan kecepatan reaksi enzimatis pada konsentrasi substrat ([S])
sebagai berikut. Pada konsentrasi substrat rendah, jika konsentrasi substrat dinaikkan
dua kali, maka kecepatan reaksi awal (V0) meningkat dua kali lipat. Ini berarti bahwa
pada konsentrasi substrat rendah kecepatan reaksi enzimatis berorde satu. Akan tetapi,
pada konsentrasi substrat yang lebih tinggi, peningkatan konsentrasi substrat akan
menyebabkan perubahan V0 sangat kecil dan pada konsentrasi substrat yang sangat
tinggi, peningkatan konsentrasi substrat tidak akan mempengaruhi harga V0 (harga
V0 konstan). Keadaan ini disebabkan oleh enzim telah jenuh oleh substrat, atau
dengan kata lain semua sisi aktif enzim telah mengikat substrat. Kecepatan reaksi
secara keseluruhan tergantung pada kecepatan disosiasi produk dari enzim dan
penambahan substrat lebih lanjut tidak akan mempengaruh V0. Plot V0 terhadap [S]
berbentuk hiperbolik (gambar 2),
5. Konsentrasi enzim
Pada keadaan enzim telah jenuh oleh molekul-molekul susbtrat (yaitu semua
molekul enzim mengikat substrat), peningkatan kecepatan reaksi awal secara linier.
Ini akan menghasilkan kurva garis lurus jika V0 diplot terhadap konsentrasi enzim

6. Suhu
Suhu mempengaruhi reaksi yang dikatalisis oleh enzim dengan dua cara.
Pertama, peningkatan suhu akan meningkatkan energi termal molekul-molekul
PENUNTUN PRAKTIKUM BIOKIMIA- INYOMAN TIKA 70
substrat. Keadaan ini akan meningkatkan proporsi molekul-molekul substrat yang
memiliki energi yang
kecepatan reaksi meningkat. Akan tetapi, pada temperatur tinggi, di samping energi
termal molekul-molekul substrat meningkat, struktur protein enzim akan rusak yang
diakibatkan oleh putusnya interaksi non kovalen (ikatan hidrogen, gaya van der
Waals, interaksi elektrostatik dan sebagainya). Interaksi non kovalen ini
sesungguhnya mempertahankan struktur tiga dimensi protein enzim. Akibat lebih jauh
adalah terjadinya denaturasi enzim. Perubahan kecil pada struktur tiga dimensi enzim
dapat mengubah struktur sisi aktif enzim yang akan menyebabkan penurunan aktivitas
katalitik. Pengaruh secara keseluruhan dari peningkatan suhu pada kecepatan reaksi
enzim adalah kesetimbangan antara dua pengaruh yang bertentangan ini. Grafik
temperatur diplotkan terhadap V0 menunjukkan suatu kurva dengan temperatur
optimum (gambar 3a). Untuk beberapa enzim mamalia, temperatur optimum
umumnya sekitar 370C, tetapi ada juga organisme yang mempunyai enzim yang
bekerja pada suhu lebih tinggi atau lebih rendah. Sebagai contoh, polymerase Taq
yang digunakan dalam polymerase chainreaction (PCR) ditemukan dalam bakteri
yang hidup pada suhu tinggi dalam sumber air panas, sehingga enzim ini bekerja
optimal pada suhu tinggi.
Ketika suhu bertambah sampai suhu optimum, kecepatan reaksi enzim naik
karena energi kinetik bertambah. Hal tersebut akan mengakibatkan aktivitas enzim
turun karena tidak terbentuk komplek enzim substrat, sehingga konsentrasi produk
rendaH
Enzim biasanya diuji pada pH tinggi (optimum), pada suhu antara 25oC sampai
dengan suhu 38oC dan pada konsentrasi substrat mendekati jenuh. Pada keadaan ini,
laju reaksi awal biasanya sebanding dengan konsentrasi enzim. Dengan mengetahui
konsentrasi enzim yang digunakan dalam reaksi, maka akan terlihat pengaruhnya
terhadap aktivitas enzim. Assay enzim secara konvensional dilakukan dengan
pengukuran kecepatan terbentuknya produk atau kecepatan hilangnya substrat. Jika
substrat atau produk menyerap sinar pada panjang gelombang yang spesifik,
perubahan konsentrasi substrat atau produk dapat diukur melalui perubahan
absorbansi pada panjang gelombang tertentu. Untuk itu, dapat dilakukan dengan
mengunakan spektrofotometer. Karena absorbansinya berbanding lurus dengan
konsentrasi, maka kecepatan perubahan absorbansi berbanding lurus dengan

PENUNTUN PRAKTIKUM BIOKIMIA- INYOMAN TIKA 71

kecepatan aktivitas enzim dalam mol substrat yang digunakan (atau produk yang
terbentuk persatuan waktu).
Adapun tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengetahui pengaruh
konsentrasi enzim terhadap aktivitas enzim dan membuat kurva pengaruh konsentrasi
enzim tersebut terhadap aktivitasnya.

Alat dan bahan

Nama Alat Jumlah Nama Bahan Jumlah
Pipet Tetes 3 buah Serbuk TCA 10 gram
Gelas Kimia 100 ml 3 buah Serbuk Kasein 5 gram
Gelas Kimia 500 ml 1 buah Buffer fosfat 8 gram
Batang Pengaduk 1 buah Serbuk Tripsin 5 gram
Gelas Ukur 25 ml 1 buah Kristal NaOH 2 gram
Pipet Volumetri 5 ml 1 buah Reagen Folin Coicalteu 10 mL
Cawan Petri 1 buah Aquadest Secukupnya
Sikat Cuci 1 buah Kertas Saring Secukupnya
Corong 1 buah Tisu Secukupnya
Erlenmeyer 100 ml 1 buah Es Batu Secukupnya
Pemanas 1 buah Kertas Indikator Universal Secukupnya
Spatula 1 buah
Termometer 1 buah
Penjepit Kayu 1 buah
Kaca Arloji 2 buah
Spektronik 20 1 buah

Prosedur Keja
Dapat dilihat dalam tabel berikut
Uji aktivitas enzim terhadap variasi pH

Tabung Waktu Substrat Buffer Fosfat Larutan

(menit) kasein pH (mL) tripsin (mL)
1%
6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5
(mL)
t=0 5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 0,5
I
t = 20 5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 0,5
t=0 5 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
II
t = 20 5 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
t=0 5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 1,5
III
t = 20 5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 1,5
IV t=0 5 0 0 0 0 0 0 0 2,0
t = 20 5 0 0 0 0 0 0 0 2,0

Catatan

PENUNTUN PRAKTIKUM BIOKIMIA- INYOMAN TIKA 72

 1. Uji aktivitas enzim terhadap Konsentrasi Substrat kasein

Tabung Waktu Substrat kasein 5 % (mL) Larutan tripsin

(menit) Buffer Fosfat (mL)
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 pH (mL) 8,0
7,0

t=0 2,5 5 7,5 10 12,5 1,5 0,5

I
t = 20 2,5 5 7,5 10 12,5 1,5 0,5
t=0 2,5 5 7,5 10 12,5 1,0 1,0
II
t = 20 2,5 5 7,5 10 12,5 1,0 1,0
t=0 2,5 5 7,5 10 12,5 0,5 1,5
III
t = 20 2,5 5 7,5 10 12,5 0,5 1,5
IV t=0 2,5 5 7,5 10 12,5 0 2,0
t = 20 2,5 5 7,5 10 12,5 0 2,0

1. Uji aktivitas enzim terhadap Variasi suhu : 30 C

Tabung Waktu Subs Larutan tripsin

(menit) trat Buffer Fosfat (mL)
kasei pH (mL) 8,0
n 1% 7,0
(mL)
t=0 5 1,5 0,5
I
t = 20 5 1,5 0,5
t=0 5 1,0 1,0
II
t = 20 5 1,0 1,0
t=0 5 0,5 1,5
III
t = 20 5 0,5 1,5
IV t=0 5 0 2,0
t = 20 0 2,0

Catatan
2. Tabel yang sama dibuat untuk shu 37 C dan 40 C

No. Prosedur Kerja Hasil

Pengamatan
1. Sesuai dengan Tabel

2. Inkubasi 0 menit
 Dalam tabung reaksi berisi pengaduk, dimasukkan
larutan buffer fosfat dan larutan tripsin sesuai dengan

PENUNTUN PRAKTIKUM BIOKIMIA- INYOMAN TIKA 73

 tabel diatas
 Kemudian kedalam masing-masing tabung
ditambahkan 3 mL larutan TCA 20%, diaduk kuat.
 Kedalam tabung diatas ditambahkan 5 mL larutan
kasein 1 %.
 Didiamkan selama 30 menit dalam air es.
 Selanjutnya disentrifugasi selama 10 menit, kemudian
disaring menggunakan kertas saring. Filtrat dikerjakan
melalui cara ANSON
Metode ANSON
 Kedalam 2 mL filtrat yang dihasilkan ditambahkan 4
mL NaOH 0,5 M. Kemudian ditambahkan 1 mL
reagen Folin-Ciocalteu, lalu aduk.
 Didiamkan selama 10 menit, kemudian diukur
absorbansinya dengan spektronik-20 pada panjang
gelombang 650 nm.
3. Inkubasi 20 menit
 Masing- masing tabung disi dengan larutan kasein
sesuai tabel diatas.
 Setiap tabung yang berisi larutan kasein dan
pengadukannya diinkubasi selama 5 menit dalam
inkubator air 35oC.

 Ke dalam masing- masing tabung ditambahkan

berturut-turut larutan buffer fosfat dan tripsin (sesuai
dengan tabel di atas) sambil aduk perlahan-lahan
(jangan sampai berbusa)

 Tabung diinkubasi selama 20 menit dalam inkubator

air 35 oC dihitung mulai tripsin ditambahkan.
 Sebanyak 3 mL TCA 20 % ditambahkan ke dalam
masing-masing tabung disertai dengan pengadukan
yang kuat. Agar pengendapan berlangsung sempurna

PENUNTUN PRAKTIKUM BIOKIMIA- INYOMAN TIKA 74

 didiamkan selama 30 menit dalam air es
 Selanjutnya disentrifugasi selama 10 menit, kemudian
disaring menggunakan kertas saring.
 Filtrat dikerjakan menurut cara ANSON

Metode ANSON
 Kedalam 2 mL filtrat yang dihasilkan ditambahkan 4
mL NaOH 0,5 M. Kemudian ditambahkan 1 mL
reagen Folin-Ciocalteu, lalu aduk.

 Didiamkan selama 10 menit, kemudian diukur

absorbansinya dengan spektronik-20 pada panjang
gelombang 650 nm.

Pertanyaan
1. Buatlah kesimpulan dari percobaan yang dibuat
2. Jelaskan mengapa suhu, konsentrasi substrat dan pH dapat
mempengaruhi kecepatan reaksi enzim matis
3. Buatlah garfik hubungan antara kecepatan reaksi dengan konsentrasi
substrat, pH dan suhu yang digunakan

Daftar Pustaka

Muderawan, I Wayan. 2007. Buku Ajar Instrumen. Singaraja: Universitas Pendidikan

Ganesha
Redhana, I Wayan. 2004. Penuntun Praktikum Biokimia. Yogyakarta: Universitas
Negeri Yogyakarta
Sudarmadji, Slamet, dkk. 1996. Analisis Bahan Makanan dan Pertanian. Yogyakarta
: Liberty Yogyakarta
Tika, I Nyoman. 2007. Penuntun Praktikum Biokimia. Singaraja : Universitas
Pendidikan Ganesha

PENUNTUN PRAKTIKUM BIOKIMIA- INYOMAN TIKA 75

Wirahadikusuma, Muhamad. 1989. Biokimia : Protein, Enzim, dan Asam Nukleat.
Bandung : Penerbit ITB.

JAWABAN PERTANYAAN

4. Maksud dan tujuan dari penyaringan adalah untuk memperoleh filtrat yang bebas
dari endapan yang terbentuk dari koagulasi dari enzim dan protein. Hal ini
dilakukan karena dalam pengukuran spektronik-20, sampel harus dal;am keadaan
cair sehingga dapat absorbansinya.
5. Pengukuran absorbansi pada t = 0 menit dilakukan sebagai pembanding
kecepatan enzim jika tidak diinkubasi dengan yang diinkubasi selama 20 menit.
6. Kurva yang menggambarkan pengaruh konsentrasi enzim terhadap aktivitasnya
adalah sebagai berikut:

PENUNTUN PRAKTIKUM BIOKIMIA- INYOMAN TIKA 76

PENUNTUN PRAKTIKUM BIOKIMIA- INYOMAN TIKA 77