HPLC Effendy de Lux Putra-5
HPLC Effendy de Lux Putra-5
HPLC Effendy de Lux Putra-5
PENDAHULUAN
1. 1. Sejarah
Kata “chromatography” berasal dari kata bahasa Greek “chroma” berarti “color”
dan “graphein” berarti “writing”. Kromatografi pertama sekali diperkenalkan oleh
Mikhail Tswett, seorang ahli botani Rusia yang mengembangkannya pada tahun
1903. dia memisahkan zat-zat warna yang terdapat dalam hijau daun, 2 klorofil
(hijau), karotin (merah) dan xantofil (kuning) dengan mengekstraksi daun
kering menggunakan petroleum eter, kemudian menuangkan ekstrak berwarna
gelap ini ke dalam sebuah kolom gelas vertikal yang telah diisi dengan serbuk
kalsium karbonat. Zat-zat berwarna diabsorbsi oleh kalsium karbonat dan ditahan
sebagai suatu garis / pita warna hijau gelap di kolom bagian atas. Kemudian dia
menuang petroleum eter lagi ke dalam kolom. Zat-zat berwarna secara perlahan
bergerak menurun di dalam kolom, tetapi pada kecepatan yang berbeda; karotin
yang berwarna merah jingga bergerak paling cepat dan membentuk suatu pita
berwarna khas pada kalsium karbonat yang berwarna putih ketika ia bergerak
terus di depan yang lain. Di atas pita ini, bergerak lebih lambat, muncul sebuah
pita warna kuning dari xantofil, kemudian dua pita hijau dari klorofil. Susunan
pita-pita berwarna ini dinamakannya “kromatogram”. Dia menemukan bahwa
wilayah berwarna ini bergerak lebih cepat bila dia mencampur sedikit alkohol
dengan petroleum eter. Ketika ia melanjutkan menuangkan solven, zat-zat
berwarna keluar dari dasar kolom, satu persatu, karotin muncul pertama, mereka
dapat dikumpulkan di dalam wadah-wadah yang terpisah (lihat Gambar 1-1).
Tentu saja teknik ini tidak dibatasi dengan zat-zat berwarna saja. Zat-zat tidak
berwarna dapat juga dipisahkan, dan kita dapat membuat pemisahan bila kita
1
mempunyai suatu cara untuk mendeteksi zat-zat ketika mereka keluar dari kolom.
Pereaksi-pereaksi kimia penghasil warna dapat digunakan pada larutan, atau
berbagai sifat-sifat fisika dapat juga digunakan, seperti perubahan indeks refraksi
atau konduktivitas elektrik. Dewasa ini jarang terlihat wilayah berwarna di dalam
kolom; yang lebih umum adalah mendeteksi larutan ketika dia baru keluar dari
kolom. Oleh karena itu, tidak perlu adsorben harus berwarna putih di dalam
kolom, juga tidak perlu membuat kolom dari gelas. Meskipun telah banyak
perubahan dibuat pada teknik ini, kita masih menamakannya metode
kromatografi.
2
Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang
proses kromatografi.
Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah pertama mengenai
kromatografi gas. Di antara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an, kromatogarafi
gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih.
3
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan salah satu metode kimia
dan fisikokimia. KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik
kromatografi dengan fase gerak cairan dan fase diam cairan atau padat. Banyak
kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya.
4
II. PRINSIP-PRINSIP UMUM KROMATOGRAFI
Fase gerak (mobile phase) dapat berupa suatu gas atau cair, sedangkan fase diam
(stationary phase) bisa berupa suatu cair atau suatu senyawa padat (Tabel 2-1).
Chromatography
Bonded-Phase Ion-Pair
(BPC) (IPC)
Bila pemisahan terutama melibatkan suatu partisi sederhana diantara dua fase cair
yang tidak dapat bercampur satu sama lain, satu sebagai fase diam dan yang
lainnya sebagai fase gerak, prosesnya dinamakan kromatografi cair-cair
(Liquid-Liquid Chromatography, LLC). Bila fase diam padat (kekuatan
permukaan fisik terutama dilibatkan dalam kemampuan retensi dari fase diam)
dan fase gerak cair, maka prosesnya berarti kromatografi padat-cair (Liquid-Solid
Chromatography, LSC).
Dua metode kromatografi cair lainnya berbeda kadang-kadang dalam cara kerja
mereka. Dalam Kromatografi Penukar-Ion (Ion Exchange Chromatography, IEC),
komponen-komponen ionik dari cuplikan dipisahkan oleh penukar selektif dengan
ion-ion tanding (counterions) dari fase diam. Penggunaan kemasan eksklusi
5
sebagai fase diam memberi suatu klasifikasi molekul-molekul didasarkan pada
bentuk dan ukuran molekul. Kromatografi eksklusi (Exclusion Chromatography,
EC) dikenal sebagai kromatografi permeasi gel oleh ahli kimia polimer dan
sebagai filtrasi gel oleh ahli biokimia.
Bila fase gerak merupakan gas dan fase diam adalah cairan, metode ini dinamakan
kromatografi cair-gas (Gas-Liquid Chromatography, GLC); bila fase gerak adalah
gas sedangkan fase diam adalah padat, metode ini dinamakan kromatografi
padat-gas (Gas-Solid Chromatography, GSC).
Sifat kromatografi dari suatu senyawa dapat dijelaskan dalam beberapa cara.
Untuk kromatografi kolom (Column Chromatography, CC), volume retensi, VR
(atau waktu retensi yang cocok, tR), dan koefisien partisi, k’, adalah istilah-istilah
yang sering digunakan. Dengan berbagai kombinasi fase diam – fase cair dan
bermacam-macam parameter operasi, derajat retensi dapat dibedakan mulai dari
total sampai suatu kedudukan migrasi bebas.
2. 2. 1. Sifat retensi
Sifat retensi merefleksikan distribusi dari suatu senyawa diantara fase gerak dan
fase diam. Gambar 2-1 menunjukkan pemisahan dari dua isomer alkene. Volume
fase gerak perlu untuk menjalankan suatu pita senyawa dari titik permulaan
injeksi, melewati kolom, dan sampai pada detektor (sampai pada puncak pita
senyawa) didefinisikan sebagai volume retensi, VR. Dia dapat diperoleh secara
langsung dari waktu retensi yang sesuai, tR, pada kromatogram dengan
mengalikan tR dengan volume kecepatan alir, Fc, didefinisikan sebagai volume
fase gerak per satuan waktu :
VR = tR . Fc ………………………………………………… (2-1)
Kecepatan alir, Fc, dalam istilah parameter kolom, adalah sebagai berikut :
………………………………… (2-2)
6
dc adalah rongga kolom, L adalah panjang kolom, εtot adalah jumlah porositas
dari kemasan kolom, Vcol adalah volume kolom. Porositas mengekspresikan
perbandingan volume interstitial dari kemasan kolom dan berat totalnya. Untuk
kemasan-kemasan padat jumlah total porositas adalah 0,35 - 0,45; dimana untuk
kemasan-kemasan berporos adalah 0,70 – 0,90. Dalam kolom-kolom kapiler harga
εtot adalah 1. Kecepatan linier rata-rata, u, dari fase gerak diukur dengan waktu
transit dari suatu senyawa yang tidak ditahan, tM
………………………………………………………… (2-3)
7
Dalam kromatografi interaktif tidak ada material dapat dielusi lebih dulu pada
waktu ini. Bila dikonversi ke volume, VM (atau Vo), dia merepresentasikan apa
yang dinamakan “dead space, void volume, or holdup volume” dari suatu kolom.
Ia mencakup kontribusi volume efektif dari cuplikan yang diinjeksikan, beberapa
pipa / kapiler yang dihubungkan, kolom itu sendiri, dan detektor.
Volume retensi yang disesuaikan, V’R atau waktu retensi, t’R dirumuskan sebagai
berikut
Bila fase gerak adalah suatu gas, suhu dan tekanan harus tertentu, dan volume
retensi harus dikoreksi untuk gas yang dapat dimampatkan, karena gas bergerak
lebih lambat mendekati inlet dari pada di bagian luar kolom. Faktor koreksi
tekanan gradien (atau kompresibilitas), j, diekspresikan sebagai :
………………………………………………….. (2-5)
dimana Pi adalah tekanan gas pembawa pada bagian dalam (inlet) kolom dan Po
pada bagian luar (outlet).
2. 2. 2. Koefisien partisi
Bila suatu senyawa masuk ke dalam suatu sistem kromatografi, dia segera
terdistribusi diantara fase diam dan fase gerak. Bila aliran fase gerak dihentikan
pada waktu tertentu, senyawa diasumsikan sebagai suatu distribusi kesetimbangan
diantara dua fase. Konsentrasi dalam tiap-tiap fase ditampilkan dengan koefisien
partisi termodinamik :
………………………………………………………… (2-6)
dimana CS dan CM adalah konsentrasi senyawa di dalam fase diam dan fase gerak
berturut-turut. Bila K = 1, senyawa secara merata terdistribusi diantara dua fase.
8
Koefisien partisi menentukan kecepatan rata-rata dari tiap-tiap wilayah (zone)
senyawa – lebih khusus, pusat wilayah sebagai fase gerak bergerak terus keluar
kolom.
Untuk suatu puncak simetris, bila maksimum puncak muncul pada bagian luar
kolom, setengah dari senyawa telah dielusi dalam volume retensi, VR, dan
setengah lagi tinggal terdistribusi diantara volume fase gerak, VM, dan volume
fase diam, VS. Sehingga,
Ini berhubungan dengan volume retensi dari suatu senyawa terhadap “dead
volume” kolom dan hasil dari koefisien partisi dan volume fase diam. Persamaan
ini benar untuk kolom-kolom partisi cair, tetapi untuk kolom-kolom adsorpsi, VS
harus diganti dengan A S, luas permukaan dari adsorben.
2. 2. 3. Rasio partisi
Rasio partisi (atau rasio kapasitas), k’, sangat penting jumlahnya dalam
kromatografi kolom. Dia berhubungan dengan kesetimbangan distribusi cuplikan
dalam kolom terhadap sifat-sifat termodinamik kolom dan terhadap suhu. Untuk
suatu susunan parameter kerja, k’ adalah suatu ukuran waktu yang dihabiskan
dalam fase diam dihubungkan dengan waktu yang dihabiskan di dalam fase gerak.
Ini didefinisikan sebagai perbandingan molekul-molekul suatu senyawa dalam
fase diam terhadap molekul-molekul di dalam fase gerak :
…………………………………………………. (2-9)
9
senyawa yang tidak ditahan (untuk k’ = 0), dibagi dengan waktu elusi dari suatu
pita yang tidak ditahan :
= ………………………………………… (2-10)
hubungan ini menyatakan secara eksplisit berapa banyak “dead volume” (atau tM)
dibutuhkan untuk memperoleh VR (atau tR). Penyusunan kembali persamaan
(2-10) dan dimasukkan pada persamaan (2-3), waktu retensi dihubungkan dengan
k’ oleh persamaan :
………………………………………… (2-11)
Contoh 1:
Pada sebuah kolom sepanjang 1000 cm yang dindingnya dilapisi 0,25 mm,
kecepatan gas pembawa helium adalah 37 cm/detik. Waktu retensi, tR, untuk
dekana adalah 1,27 menit; luas puncak pada setengah tinggi adalah 0,88 detik.
Waktu retensi untuk suatu senyawa yang tidak ditahan, tM, adalah :
Fraksi waktu dimana suatu senyawa menghabiskannya dalam fase utama adalah
sangat dekat dengan fraksi semua molekul-molekul senyawa utama yang saat itu
juga berada dalam fase yang sama. Oleh karena itu, fraksi waktu rata-rata yang
dihabiskan suatu senyawa dalam fase gerak adalah
10
…………………………………………. (2-12)
…………………………………………. (2-13)
retensi relatif, α, dari dua senyawa, dimana senyawa 1 dielusi sebelum senyawa 2,
ditampilkan sebagai :
…………………………………………. (2-14)
Retensi relatif sangat tergantung pada : 1) sifat-sifat fase diam dan gerak; 2) suhu
kolom. Salah satu harus selalu seselektif mungkin dipilih pasangan fase gerak
untuk senyawa-senyawa yang berdekatan dan sangat sukar dipisahkan.
Di bawah kondisi operasi dimana partisi diantara fase diam dan gerak adalah
linier (berarti memenuhi Hukum Henry), K dan k’ tidak tergantung konsentrasi
senyawa total. Setelah 50 atau lebih partisi diantara fase-fase, menghasilkan profil
dari suatu pita senyawa mendekati kurva distribusi Gauss (Gambar 2-2). Namun,
ketika pita senyawa lewat melalui kolom kromatografi, dia melebar dan
konsentrasi pada puncak maksimum berkurang. Pelebaran ini akhirnya
mempengaruhi resolusi dari pita-pita senyawa yang berdekatan.
11
Gambar 2-2 : Profil suatu kromatogram dari suatu senyawa
………………………………………………… (2-15)
dimana L adalah panjang kolom, H adalah tinggi plat, t’R adalah waktu yang
disesuaikan untuk elusi dari pusat kromatogram, dan σ2 adalah varians
kromatogram dalam satuan waktu.
Lebar pada dasar puncak, Wb (ditentukan dari interseksi tangen terhadap titik-titik
infleksi dengan garis dasar), adalah sama untuk 4 deviasi standar (asumsikan
12
suatu distribusi ideal Gauss; lihat Gambar 2-3). Sehingga dalam persamaan
(2-15), σ =Wb/4
………………………………………………… (2-16)
Bagian yang lebih atas dari kromatogram menjelaskan garis tangen, yang
meminimalkan beberapa kontribusi segmen tailing (atau fronting) dari suatu
kromatogram.
Selalu lebih mudah untuk mengukur lebar pada setengah tinggi kromatogram.
Karena , maka
…………………………………………… (2-17)
13
Walaupun ini tidak dianjurkan, efisiensi kolom kadang-kadang dinyatakan sebagai
jumlah plat teoritis (the number of theoritical plates). Dalam konteks ini tidak ada
koreksi dibuat untuk waktu transit dari suatu senyawa yang tidak ditahan.
Jumlah plat adalah suatu indikasi untuk mengetahui suatu kolom telah dibuat
dengan baik; ia tidak dapat secara tepat memprediksi kinerja kolom di bawah
semua kondisi. Ia dirancang pada mulanya untuk suatu ukuran dari
kontribusi-kontribusi kinetik terhadap pelebaran pita / kromatogram. Kontribusi
lain terhadap lebar puncak, seperti efek ekstra kolom dan faktor-faktor
termodinamik dapat memainkan suatu peranan yang signifikan.
Tinggi plat, H, adalah jarak suatu senyawa bergerak sambil mengalami satu partisi
………………………………………………………….. (2-18)
tinggi plat adalah suatu cara yang baik untuk mengekspresikan efisiensi kolom
dalam satuan panjang tanpa spesifikasi panjang kolom. Dari suatu titik pandang
teoritis, tinggi plat dapat secara langsung dihubungkan terhadap kondisi
eksperimental dan parameter operasi. H jumlahnya kecil untuk suatu kolom yang
efisien.
2. 3. 2. Pita asimetri
14
dan selalu mungkin untuk mendiagnosa alasan terbentuknya pita asimetri dalam
satu pemisahan. Pita-pita simetri biasanya diobservasi hanya untuk
cuplikan-cuplikan yang tidak terlalu besar ukurannya, biasanya 1 mg cuplikan per
gram fase diam (0,1 mg/g for pellicular packings). Bila k’ lebih tinggi pada
konsentrasi senyawa lebih rendah, maka satuan konsentrasi rendah dari puncak
eluen bergerak lebih lambat dari pada satuan konsentrasi tinggi. Ketika suatu pita
simetri mula-mula bergerak menuruni kolom, dia menjadi miring dan akhirnya
berkembang suatu bentuk kromatogram bagian depan tajam dan bagian ekor
memanjang. Tipe sebaliknya dari asimetri dikenal sebagai fronting. Untuk
mengatasi masalah ini adalah dengan mengurangi ukuran cuplikan sampai
diperoleh waktu retensi dan puncak yang tajam untuk semua pita sehingga
menjadi simetri.
…………………………………………… (2-19)
15
Gambar 2-4 : Faktor asimetri puncak; (a) puncak simetri & (b) Puncak tailing
Puncak-puncak asimetri bisa dihasilkan dari aksi yang terjadi diluar kolom,
terutama problem-problem injeksi. Mereka dapat juga muncul dari kemasan
kolom yang tidak baik.
16
2. 3. 3. Resolusi
Derajat pemisahan atau resolusi dari dua pita yang berdekatan didefinisikan
sebagai jarak antara puncak-puncak pita (atau pusat-pusat) dibagi dengan luas pita
rata-rata. Bila retensi dan luas pita diukur dalam satuan waktu, seperti dalam
Gambar 2-5, resolusi, R, didefinisikan sebagai
…………………………………………………… (2-20)
Contoh 2 : Pada suatu kolom 122 cm, dioperasikan pada suhu 160ºC, diperoleh
waktu retensi : puncak udara 0,90 menit; heptan 1,22 menit; dan
oktan 1,43 menit. Luas puncak heptan 0,14 dan oktan 0,20. Berapa
retensi relative dan resolusi dari puncak-puncak ini ?
Jawab :
17
Harga luas puncak pada garis dasar dari pita-pita yang berdekatan hampir konstan;
berarti W1 W2. Karena luas puncak garis dasar adalah sama terhadap empat
standar deviasi untuk puncak-puncak yang dihasilkan, maka resolusi dapat juga
diekspresikan sebagai :
............................................................................................
(2-21)
Bila tidak cukup, resolusi dari puncak-puncak yang berdekatan dapat juga
diperbaiki baik dengan memperbesar pemisahan diantara puncak-puncak maupun
mengurangi luas masing-masing puncak. Hal ini mencakup selektivitas kolom bila
pergeseran puncak-puncak lebih jauh terpisah dan efisiensi kolom ketika mencoba
mendekati lebar puncak yang sempit. Perbaikan selektivitas mencakup perubahan
termodinamik dari sistem kromatografi. Perbaikan kinetik dari sistem menambah
efisiensi dari pemisahan. Seperti ditunjukkan pada Gambar 2-6 pada kromatogram
paling atas, kolom mempunyai selektivitas yang cukup tetapi menunjukkan
miskin efisiensi (jika dibandingkan dengan kromatogram tengah). Kromatogram
paling bawah menunjukkan efisiensi yang baik sekali tetapi kurang selektivitas;
harga k’ disini sangat rendah.
18
Gambar 2-6 : Selektivitas, efisiensi dan rasio partisi kolom
Beberapa kriteria dari resolusi dapat dibuat. Untuk akurasi kuantitatif yang pantas,
maksimum puncak harus paling sedikit 4σ (berarti Wb atau 2W1/2) berpisah. Bila
begitu, maka Rs = 1,0 yang mana mendekati kira-kira 3% tumpang tindih (overlap
= cross contamination) untuk luas puncak. Suatu harga Rs = 1,5 (untuk 6σ)
mewakili secara esensial resolusi sepenuhnya dengan hanya 0,2% luas puncak
tumpang tindih. Catatan : kriteria ini berhubungan dengan konsentrasi yang sama
dari senyawa-senyawa yang dipisahkan. Menaikkan resolusi dibutuhkan bila suatu
pita dari satu komponen besar berdekatan dengan suatu pita dari satu konstituen
kecil. Dalam kenyataan terdapat jarak dimana resolusi garis dasar untuk semua
komponen mungkin tidak dapat dicapai. Pemisahan memuaskan bila
sekurang-kurangnya pasangan komponen yang terpisah dapat secara kuantitatif
ditentukan dalam suatu taraf yang dapat diterima.
Persamaan 2-20 dan 2-21 mendefinisikan resolusi dalam suatu situasi tertentu,
tetapi mereka tidak menghubungkan resolusi kepada kondisi pemisahan dan tidak
juga mereka menyarankan bagaimana untuk memperbaiki resolusi. Untuk maksud
ini suatu persamaan resolusi dapat diturunkan ke dalam suatu bentuk yang secara
19
eksplisit memasukkan terminology yang mencakup termodinamik dan kinetik dari
sistem kromatografi. Untuk menyesuaikan ini, persamaan 2-16 dan 2-20
dikombinasi, menggunakan Wb sebagai luas garis dasar rata-rata. Sehingga
menghasilkan :
.......................................................
(2-22)
Persamaan 2-10, yang diekspreikan dalam terminologi tR.2 dan tR.1, disubstitusikan
ke dalam persamaan 2-22 menghasilkan :
............................................ (2-23)
......................................................... (2-24)
(2) Suatu faktor kapasitas atau suatu kecepatan migrasi yang ditandai dengan
k’ (ditandai bervariasi seperti k, atau harga rata-rata dari k 1 dan k2)
(3) Suatu faktor efisiensi yang tergantung pada L/H (atau jumlah plat teoritis)
Setiap faktor dapat dihitung secara langsung dari kromatogram yang direkam dan
dapat disesuaikan lebih atau kurang secara tidak langsung. Dua faktor pertama
secara esensial adalah termodinamik, sedangkan L/H suatu terminologi terutama
dihubungkan dengan ciri kinetik dari kromatografi.
20
Perubahan dalam α dan k’ dicapai dengan memilih fase diam dan fase gerak yang
berbeda atau dengan memvariasi suhu dan jarang sekali tekanan. Disamping itu k’
dapat divariasi dengan merubah jumlah relatif fase gerak dan fase diam di dalam
kolom. Bila optimasi suatu pemisahan utama, maka k’ harus pertama
dipertimbangkan. Resolusi maksimum dalam satuan waktu diperoleh bila k’ = 2.
Rentang optimum harga k’ antara 1 s/d 10. Selanjutnya, komponen yang dielusi
pertama dari suatu pasangan yang diberikan seharusnya mempunyai waktu retensi
dua kali dari waktu yang dilalui oleh satu solute yang tidak ditahan; berarti tR =
2tM. Namun, dalam suatu campuran yang kompleks dari banyak komponen, maka
seringkali memungkinkan untuk mengoptimasi kondisi pemisahan untuk hanya
satu pasang komponen. Solusi yang efektif dari permasalahan ini hanya bila
bekerja dengan cuplikan yang benar-benar kompleks ialah dengan memprogram
k’. Di dalam kromatografi gas suatu harga optimum dari k’ dapat dicapai dengan
memvariasi suhu. Di dalam kromatografi cair biasanya lebih menguntungkan
memvariasi secara sistematik komposisi dari fase gerak. Bila resolusi masih
menjadi masalah, maka menaikkan baik α maupun L/H harus dilakukan.
Contoh 4 : Karena pemisahan dari heptan dan oktan pada contoh 3 tidak pada luas
puncak kedua kromatogramnya, berapa panjang kolom seharusnya dari
panjang semula 122 cm?
Jawab : Karena resolusi adalah proporsional terhadap akar kuadrat dari panjang
kolom, untuk suatu resolusi 1,5 maka panjang kolom adalah :
maka L = 179 cm
Terminologi pertama dalam persamaan 2-24 sangat sensitif untuk merubah harga
α, seperti ditunjukkan dalam Tabel 2-2. Umumnya dapat diharapkan untuk
memilih harga α dalam rentang 1,05 s/d 2,0. Sebagai contoh, suatu kenaikan α
dari 1,05 menjadi 1,10 akan memperbaiki resolusi dengan suatu faktor dari 4
untuk L/H yang sama. Bila α sangat dekat dengan 1, ini menjadi tidak praktis
21
untuk bekerja karena panjang kolom yang dibutuhkan dan tekanan dalam kolom
menjadi sukar atau tidak mungkin untuk dicapai.
Berbagai proses terjadi pada suatu kolom selama pemisahan kromatografi yang
Teori dari penyebaran pita dalam kromatografi cair dan gas mendekati identik.
Tinggi plat mengekspresikan terminologi sederhana tingkat dari pelebaran pita
22
dan faktor-faktor yang mempengaruhi pelebaran. Ini adalah suatu fungsi dari
proses termodinamik dan kinetik dalam kolom.
(3) Suatu kecepatan terbatas untuk kesetimbangan padatan diantara fase diam
dan gerak (transfer massa)
…………………………… (2-25)
Gambar 2-7 : Tipe H/u (Van Deemter) kurva untuk kolom kromatografi gas
23
Secara eksperimental kecepatan linear rata-rata mudah ditentukan dengan
menginjeksikan suatu solute yang tidak ditahan dan mengukur waktu lintasnya
melalui kolom. Dengan mengetahui panjang kolom, kita mempunyai :
………………………………………………………. (2-26)
2. 4. 1. Difusi Eddy
A = λ dp ……………………………………………………… (2-27)
Dimana dp adalah diameter partikel dan λ adalah suatu fungsi dari keseragaman
kemasan dan geometri kolom. Lintasan alir dari panjang yang tidak sama melalui
kemasan yang kurang sempurna. Beberapa molekul solute dari satu spesies
tunggal bisa ditemukan berenang melalui kolom mendekati dinding kolom dimana
densiti kemasan terhitung rendah, terutama di dalam kolom-kolom berdiameter
kecil. Molekul-molekul solute lainnya lewat melalui pusat kemasan yang lebih
rapat dari kolom pada suatu kecepatan yang lebih rendah. Molekul-molekul yang
mengikuti lintasan yang lebih pendek dielusi lebih dulu sebelum molekul lain
yang mengikuti seri lintasan yang tak beraturan (dan lebih panjang). Hal ini
menyebabkan suatu pelebaran dari pita elusi untuk tiap-tiap solute.
24
yang dibutuhkan. Dalam kromatografi gas-cair, bila digunakan film pada bagian
dalam kolom kapiler, maka terminologi A adalah nol.
2. 4. 2. Difusi longitudinal
B = 2 γ DM ...................................................................................... (28)
Dimana γ adalah suatu faktor hambatan yang dikenal bahwa difusi longitudinal
dirintangi oleh kemasan atau strukur dalam kolom, dan DM adalah koefisien difusi
solute dalam fase gerak. Dalam kolom kapiler yang disalut γ adalah satuan; dalam
25
kolom-kolom yang dikemas, dia mempunyai harga sekitar 0,6. Terminologi B
terlebih dahulu dihubungkan dengan kromatografi gas-cair. Dalam kromatografi
kolom cair, rasio DM/TM seharusnya digunakan, dimana TM, faktor interpartikel
berliku-liku, mengkoreksi koefisien difusi untuk bermacam-macam ukuran dan
arah dari rongga interstitial dalam suatu kemasan.
Kontribusi difusi longitudinal terhadap tinggi plat menjadi signifikan hanya pada
kecepatan fase gerak rendah. Kemudian kecepatan difusi tinggi dari suatu solute
dalam fase gerak dapat menyebabkan molekul-molekul solute terdispersi secara
axial sedangkan migrasi secara perlahan melalui kolom. Bila ini terjadi, maka
muncullah pelebaran pita / kromatogram.
2. 4. 3. Transfer massa
Terminologi Cfase diam dalam persamaan 2-25 hasil dari resistensi terhadap transfer
massa pada solute terhadap permukaan fase diam (Gambar 2-8b). Ini proporsional
terhadap df/Ds, df adalah ketebalan efektif dari fase diam dan Ds adalah koefisien
difusi dari solute dalam fase diam. Pergerakan molekuler yang lambat dalam fase
diam berarti menghabiskan waktu yang lebih lama dalam fase ini oleh suatu
molekul solute, sedangkan molekul-molekul lain bergerak maju dengan fase
gerak. Semakin cepat fase gerak bergerak melalui kolom dan semakin lambat
kecepatan transfer massa, semakin melebar pita solute yang nantinya dielusi dari
kolom. Cairan-cairan yang tidak kental (nonviscous liquids) harus dipilih untuk
fase diam supaya koefisien difusi tidak terlalu kecil. Mengurangi ketebalan fase
diam adalah bermanfaat, sekalipun kapasitas kolom direndahkan.
26
Dalam kromatografi kolom cair, berbeda dengan kromatografi gas-cair, dimana
perbedaan utama muncul dari :
(1) 10.000 kali berkurang harga DM bila suatu cairan merupakan fase gerak
sebagai penyanggah terhadap suatu gas
Molekul-molekul solute bergerak masuk dan keluar dari rongga-rongga ini dengan
difusi (Gambar 2-8d). Molekul-molekul ini relatif diperlambat gerak maju mereka
terhadap pita utama dari suatu solute dan sekali lagi ada penambahan dalam
penyebaran molekul. Juga kecepatan fase gerak berbeda dari satu titik ke titik lain
memperlihatkan kekacauan / gangguan disebabkan oleh partikel-partikel
pendukung. Garis aliran fase gerak yang dekat dengan batas partikel bergerak
lebih lambat, sedangkan garis aliran yang dekat dengan pusat diantara
partikel-partikel bergerak lebih cepat. Transfer molekul-molekul solute secara
konstan oleh difusi lateral kepada suatu garis aliran yang berbeda. Selanjutnya,
lintasan terhambat oleh suatu molekul solute sehubungan dengan difusi diantara
garis aliran dan untuk keperluan perjalanan disekitar partikel-partikel fase diam.
Difusi molukuler, berpasangan dengan garis-garis aliran yang tidak sama
(multipath effect), memberikan suatu campuran konvektif, atau berpasangan,
terminologi :
......................................................................... (2-29)
Efek dari kolam-kolam yang stagnan dapat diminimalisir dalam beberapa cara.
Susunan internal dari kemasan dapat dibuat tidak dapat ditembus air; suatu contoh
adalah permukaan-kemasan pellicular disalut dengan suatu inti padat.
Mengurangi diameter partikel adalah sangat efektif. Juga, pendukung-pendukung
dapat dipilih yang mempunyai rongga-rongga lebar supaya cairan mengalir
dengan mudah masuk dan keluar, atau bahkan melalui rongga kanal-kanal.
27
Tinggi plat dalam kromatografi kolom cair dapat diekspresikan dengan persamaan
berikut:
........................ (2-30)
a b c d
b = campuran konvektif
28
Gambar 2-9 : Kurva tipe H/u untuk kromatografi kolom cair
Karena tp diperoleh dengan tinggi plat dibagi kecepatan pita, u / (1+k’), dimana
1/(1+k’) adalah fraksi waktu yang dihabiskan oleh “solute” fase gerak, persamaan
2-31 menjadi
............................................................................. (2-32)
29
.................................................... (2-33)
................................................................ (2-34)
Sekarang tR adalah minimum bila k’ = 2, yang mana bila tr = 3tM (lihat persamaan
2-10). Ada sedikit kenaikan waktu analisis bila k’ terletak diantara 1 dan 10, asal
saja tidak ada efek terhadap variabel-variabel lain.
Suatu kenaikan dua kali lipat dalam kecepatan fase gerak diharapkan waktu
analisis menjadi setengahnya (lihat persamaan 2-33). Namun, ini tidak tepat benar
karena H akan naik, sebagaimana terlihat dalam gambar 2-9 dan 2-10. Rasio H/u
dapat diperoleh secara langsung dari tinggi plat eksperimental/grafik kecepatan.
Ini adalah slope garis yang ditarik dari titik asalnya sampai ke suatu titik pada
grafik. Slope ini menurun ketika kecepatan bertambah; namun, satu titik yang
berkurang kembali dicapai pada kecepatan lebih tinggi. Walaupun, hal ini dapat
diharapkan untuk menggunakan kecepatan lebih tinggi dari pada u optimum,
dengan suatu kenaikan yang sesuai dengan panjang kolom, pada akhirnya sampai
pada persyaratan tekanan yang masuk ke kolom menjadi berlebihan. Walaupun
suatu kolom yang lebih panjang dibutuhkan, waktu analisis lebih pendek.
2. 6. Penentuan kuantitatif
30
analisis kuantitatif akan dilaksanakan. Pada detektor-detektor berbeda respon
kecepatan alir massa, luas puncak secara langsung proporsional terhadap jumlah
massa / berat komponen dan tidak tergantung pada laju alir fase gerak.
Dalam kromatografi kolom sinyal analog dihasilkan oleh detektor secara grafik
direkam dalam bentuk umumnya puncak-puncak kromatogram. Luas di bawah
puncak-puncak ini dapat diintegrasikan dalam berbagai cara dan data yang
dihasilkan berhubungan dengan komposisi dari cuplikan-cuplikan yang tidak
dikenal (the unknown samples).
Tinggi Kali Lebar Pada Setengah Tinggi (Height Times Width at Half-Height).
Cara kerjanya termasuk menggambar garis dasar puncak, mengukur tinggi
dimulai dari garis dasar, posisi pengukuran skala sejajar dengan garis dasar pada
setengah tinggi, dan ukur lebar dari puncak pada posisi ini. Garis dasar normal
(sinyal nol) tidak digunakan karena deviasi yang besar dapat disebabkan oleh
tailing.
Satu bola diposisikan pada suatu cakram datar berotasi yang berputar pada suatu
kecepatan proposional terhadap jaraknya dari pusat rotasi. Bola diposisikan pada
cakram pada suatu jarak dari pusat dalam hubungan yang sama seperti posisi pena
31
pencatat terhadap garis dasar suatu kromatogram. Bila cakram berputar pada
kecepatan konstan (waktu), bola berputar pada suatu kecepatan proporsional
terhadap posisi pena pencatat dari nol. Kecepatan ini kemudian ditransmisikan
kepada suatu alat mesin tulis melalui bola kedua, yang mana, memakai suatu
bubungan “spiral in” dan “spiral out”, menggerakkan pena integrator pada suatu
kecepatan secara langsung proporsional terhadap posisi pena pencatat. Gerakan
diantara cakram dan bola merupakan tenaga tarik melalui lapisan minyak.
Although this hydrostatic phenomenon is not clearly understood, the oil film acts
similarly to an induction motor where slip is proportional to the driven load.
Membaca runutan integrator dilakukan sebagai berikut (juga lihat Gambar 2-10)
membuat peta interval waktu yang diinginkan dari pena runutan pencatat
kromatogram dan proyeksi secara langsung menuju runutan integrator (lihat tanda
panah). Nilai dari suatu interval diperoleh dari menghitung gradasi-gradasi peta
disilang dengan runutan integrator. Suatu gamparan / buaian pola yang penuh dari
gigi gergaji “sawtooth” dalam tiap-tiap arah menampilkan 100 hitungan. Setiap
divisi horizontal mempunyai nilai 10. Nilai-nilai diestimasikan kurang dari pada
10. dalam contoh, interval dari puncak utama adalah 1083 hitungan. Pola biasanya
dapat dibaca dengan dua hitungan. Pada beberapa model ruangan diantara
“titik-titik” diproyeksikan sedikit di atas garis horizontal bagian atas adalah
ekivalen dengan 600 hitungan, membuatnya memungkinkan mencatat sampai
9600 hitungan per sentimeter peta. Pola pada bagian kanan Gambar 2-10
mengilustrasikan metode untuk mengestimasi koreksi garis dasar bila garis dasar
puncak tidak sesuai dengan garis dasar pencatat.
32
Gambar 2-10: (a) Estimasi luas puncak dengan integrator bola dan cakram,
(b) Metode untuk mengatasi koreksi garis dasar
33
isothermal perangkat lunak dapat secara automatis menambah sensitivitas
kemiringan dengan waktu, oleh karena itu menjamin kemampuan program untuk
mendeteksi keduanya semua puncak-puncak tajam dan akhirnya puncak-puncak
mendatar serta rendah dengan presisi yang sama. Dalam hal puncak-puncak yang
bersatu, luas puncak dapat dialokasi kepada setiap komponen dengan
menjatuhkan garis tegak lurus dari titik-titik lembah ke garis dasar yang dikoreksi
(Gambar 2-12), dalam hal puncak-puncak yang saling tumpang tindih
(overlapping peaks), algoritma-algoritma khusus membagi luas puncak untuk
tiap-tiap komponen.
34
Gambar 2-11 : Hasil cetakan suatu kromatogram dan menunjukkan komputasi
yang dapat dibuat oleh program perangkat lunak komputer
35
Gambar 2-12 : Kemampuan integrator menghitung (Courtesy of Spectra-Physic)
Setiap metode mempunyai tempatnya sendiri, tergantung pada sifat dari analisis.
Bila isi / komponen dalam cuplikan diketahui, metode kalibrasi dengan standar
sering digunakan. Dia mempunyai keuntungan bahwa hanya luas dari puncak
komponen yang diinginkan yang diukur. Dia mensyaratkan bahwa jumlah yang
sama dari cuplikan yang diinjeksikan setiap waktu. Metode standar kalibrasi juga
36
membutuhkan kondisi operasi yang sama bagi cuplikan. Persen konsentrasi
diperoleh dengan menghitung perbandingan volume tiap-tiap komponen yang
dicari dari ukuran cuplikan. Dalam praktek, larutan-larutan standar dari komponen
yang dianalisis disiapkan dan diinjeksikan ke dalam kromatograf. Kemudian
untuk senyawa yang tidak diketahui (unknown),
37
versus konsentrasi dialurkan (plot). Sejumlah tertentu yang diketahui dari standar
kemudian ditambahkan ke dalam campuran cuplikan yang dianalisis. Berbagai
variasi dalam ukuran cuplikan dengan segera diketahui dengan membandingkan
luas puncak standar internal dalam perlakuan yang berbeda. Suatu faktor koreksi
dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi yang tepat dari masing-masing
komponen.
Contoh 5 :
Persen komponen 3 :
38
Metode standar internal umumnya sering digunakan dimana sebagian cuplikan
tidak terelusi secara komplet atau hilang dalam operasi sebelumnya pada langkah
kromatografi. Hal ini penting karena standar internal ditambahkan sebelum
beberapa perlakuan cuplikan.
Dalam suatu sistem kromatografi yang pasti waktu retensi adalah suatu konstanta
untuk suatu partikel solut dan oleh karena itu dapat digunakan untuk
mengidentifikasi solut itu. Sehingga, walaupun kromatografi terutama untuk suatu
teknik pemisahan, namun memungkinkan untuk mengidentifikasi
komponen-komponen yang dipisahkan dari suatu campuran cuplikan yang
kompleks dengan waktu retensi mereka.
Waktu retensi biasanya bervariasi dalam suatu cara biasa dan dapat diprediksi
dengan mengulang substitusi dari beberapa gugus i ke dalam molekul cuplikan,
sebagai contoh, dalam satu seri homolog, benzolog, atau oligomer. Sering
beberapa fungsi dari waktu retensi linier dengan sejumlah gugus-gugus i yang
berulang dengan molekul cuplikan – sebagai contoh, gugus -CH2- untuk satu seri
homolog. Untuk elusi isokratik retensi dari anggota ith suatu seri homolog adalah
sebagai berikut :
m adalah suatu konstanta dan Ni adalah jumlah gugus-gugus yang berulang (atau
jumlah dari atom-atom karbon) dalam homolog. Menggunakan nilai faktor
kapasitas k’ tidak dipengaruhi oleh laju alir fase gerak atau geometri. Beberapa
seri homolog dibuat grafik dalam Gambar 2-14 .
Waktu retensi dapat diprediksi dari sifat anggota-anggota seri homolog yang
dikenal. Kemungkinan berhasilnya waktu retensi yang cocok tergantung pada
pengenalan cuplikan sebelumnya, oleh karena itu kemampuan untuk
mengantisipasi adanya senyawa-senyawa spesifik dalam cuplikan. Berhasil
39
sesuainya nilai retensi juga mensyaratkan ketersediaan dari senyawa-senyawa
referens yang diinginkan.
Metode addisi standar dapat digunakan untuk menguji nilai retensi dari senyawa
dalam masalah yang terdapat dalam matriks cuplikan aktual. Waktu retensi dari
pita cuplikan original harus tidak berubah setelah penambahan senyawa dalam hal
bila dua senyawa adalah sama.
Gambar 2-14 : Plot waktu retensi (skala log) vs jumlah atom karbon untuk
beberapa seri homolog
2.8.2 Pemeriksaan kromatografi
40
satu mengandung fase cair polar dan yang satu lagi mengandung fase cair
nonpolar, satu seri senyawa dilewatkan ke dalam kolom untuk menentukan retensi
dari setiap senyawa (Gambar 2-14). Dengan memplot nilai retensi dari 2 fase
diam versus tiap-tiap kolom lainnya, garis yang memancarkan dari aslinya
diperoleh (satu untuk setiap seri homolog, seperti diberikan persamaan 2-36)
41
Gambar 2-14 : Plot 2 kolom, (a) linier; (b) logaritma
Kerumunan (berkumpulnya) titik-titik terjadi pada sudut dekat titik asalnya karena
titik-titik ditempatkan sepanjang garis dalam satu distribusi logaritma terhadap
berat molekul. Bila logaritma dari retensi diplot lawan lainnya, suatu seri yang
42
sesuai dari garis-garis sejajar diperoleh dengan titik-titik ruang yang linier sesuai
dengan berat molekul.
Bila senyawa-senyawa referensi standar tidak tersedia, jalan lain dapat dicari
untuk informasi struktur bebas dari beberapa teknik spektroskopik didiskusikan
dalam buku spektrometer. Dalam banyak hal, identifikasi positif dari suatu
senyawa yang tidak dikenal dapat ditetapkan hanya dengan mengisolasi puncak
selama satu kromatogram berlangsung dan analisis berurutan dengan metode
tambahan. Spektrometer massa telah berhasil digandeng dengan kromatografi,
baik dengan kromatografi gas maupun kromatografi kolom cair. Untuk
spektrometer massa hanya sekitar 5 ng cuplikan diperlukan. Informasi yang dapat
diperoleh termasuk berat molekul dan rumus empiris, informasi struktur, dan
konfirmasi struktur. Spektroskopi infra merah juga dapat digandeng dengan
kromatografi gas, dimana dia menolong dalam mengidentifikasi gugus-gugus
fungsi dan kemungkinan struktur molekul. Konfirmasi sesuai bila spektrum
referensi tersedia.
43
Gambar 3-1: Bagan alat KCKT
3. 1. Wadah fase gerak.
Wadah fase gerak terbuat dari bahan yang inert terhadap fase gerak. Bahan yang
umum digunakan adalah gelas dan baja anti karat. Daya tampung tandon harus
lebih besar dari 500 ml, yang dapat digunakan selama 4 jam untuk kecepatan alir
yang umumnya 1-2 ml/menit
Pelarut yang digunakan harus bebas dari debu dan partikel padat, pelarut
seharusnya disaring dengan penyaring mikrometer sebelum digunakan pada
sistem KCKT. Gas yang terlarut akan menghasilkan gelembung kemudian secara
tiba-tiba akan menurunkan tekanan dari sistem, untuk mengatasi hal ini maka
pelarut dipanaskan hingga mendidih dan kemudian didinginkan atau dengan
degassing. Degassing digunakan untuk menghilangkan gas terlarut dalam fase
gerak dan mengurangi kemungkinan gelembung yang terbentuk pada pompa atau
detektor selama proses pemisahan.
3. 2. Pompa
Untuk menggerakkan fase gerak melalui kolom diperlukan pompa. Pompa harus
mampu menghasilkan tekanan 6000 Psi pada kecepatan alir 0,1 – 10 ml/menit.
Pompa ada 2 jenis yaitu pompa volume konstan dan pompa tekanan konstan.
Pompa terbuat dari bahan yang inert terhadap semua pelarut. Bahan yang umum
digunakan adalah gelas baja antikarat dan teflon. Aliran pelarut dari pompa harus
tanpa denyut untuk menghindari hasil yang menyimpang pada detektor.
44
3. 3. Injektor
Cuplikan yang akan dianalisis dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan
disturbansi yang minimum dari material kolom. Ada dua model umum :
a. Stopped Flow
b. Solvent Flowing
45
Gambar 3-2 : Tipe injektor putaran
3. 4. Kolom
Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan pada
temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama
untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Kemasan kolom
tergantung pada mode kromatografi cair kinerja tinggi yang digunakan (Liquid
Solid Chromatography,LSC; Liquid Liquid Chromatography, LLC, Ion Exchange
Chromatography, IEC; or Steric Eclusion).
3. 5. Detektor
46
yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan
memberi tanggapan / respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang
rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak
selalu dapat diperoleh.
Elusi pada kromatografi cair kinerja tinggi dapat dibagi menjadi dua sistem yaitu :
1. Sistem elusi isokratik. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan satu macam
atau lebih fase gerak dengan perbandingan tetap.
2. Sistem elusi gradien. Pada sistem ini, elusi dilakukan dengan campuran
fase gerak yang perbandingannya berubah-ubah dalam waktu tertentu.
Elusi gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fase gerak selama suatu
analisis kromatografi berlangsung. Pengaruh yang menguntungkan dari elusi
gradien adalah memperpendek waktu analisis senyawa-senyawa yang secara kuat
ditahan dalam kolom.
47
Gradien dapat bertahap atau kontinu. Gradien optimum dipilih dengan trial and
error. Tabel 3-1 menunjukkan kompabilitas bermacam-macam mode kromatografi
cair dengan analisis gradien. Dalam praktek, gradien dapat dibentuk sebelum atau
sesudah pompa.
3. 7. Pengolahan Data
Hasil-hasil pemisahan kromatografi umumnya ditampilkan pada kertas pencatat
bergaris. Suatu kromatogram yang khas ditunjukkan dalam Gambar 3-3.
48
Dari Gambar 3-3 kromatogram ini, waktu retensi atau volume retensi dapat
diperoleh. Ini dapat digunakan untuk penentuan kualitatif, bila kondisi secara baik
dikontrol. Luas puncak atau tinggi puncak proporsional dengan konsentrasi dan
dapat digunakan untuk memperoleh hasil kuantitatif.
Dengan kemajuan sistem data kromatografi, pekerjaan untuk mereduksi data
dimudahkan; hasil-hasil yang diperoleh pada dasarnya adalah hasil-hasil “real
time”.
3. 8. Fase gerak
Dalam kromatografi cair komposisi pelarut atau fase gerak adalah salah satu
variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat keragaman yang luas dari
solven yang digunakan dalam semua mode kromatografi cair kinerja tinggi, tetapi
ada beberapa sifat-sifat yang diinginkan yang mana umumnya harus dipenuhi oleh
semua solven.
49
menghasilkan banyak noise sehingga data tidak dapat digunakan. Degassing juga
adalah ide yang bagus bila kolom yang digunakan sangat sensitif terhadap oksigen
(contoh: bonded NH2 column)
(a) Cepat
(b) Resolusi
(a) Cepat. Waktu analisis kurang dari pada 1 jam adalah umum. Banyak analisis
dapat diselesaikan dalam 15 – 30 menit. Sebenarnya, untuk analisis yang tidak
rumit, waktu analisis kurang dari 5 menit dapat dicapai.
(b) Resolusi. Berbeda dengan kromatografi gas, kromatografi cair kinerja tinggi
50
mempunyai dua fase dimana interaktif selektif dapat terjadi. Dalam
kromatografi gas aliran gas mempunyai sedikit interaksi dengan solute;
pemisahan terutama dicapai hanya dengan fase diam. Kemampuan solute
untuk berinteraksi secara selektif dengan keduanya fase diam dan fase gerak
dalam kromatografi cair kinerja tinggi memberikan parameter tambahan untuk
mencapai pemisahan yang diinginkan.
(d) Kolom dapat digunakan kembali. Berbeda dengan kromatografi cair klasik,
kolom-kolom kromatografi cair kinerja tinggi dapat digunakan kembali.
Banyak analisis dapat dilaksanakan dalam kolom yang sama sebelum dia
diganti. Namun, kemampuan kolom-kolom akan menurun, kemampuannya
menjadi tergantung pada jenis cuplikan-cuplikan yang diinjeksikan, tingkat
kejernihan dari pelarut, dan jenis-jenis pelarut yang digunakan.
(e) Molekul-molekul besar dan spesies ion. Secara khas, material-material ini
tidak dapat disesuaikan dengan kromatografi gas karena volatilitas mereka
rendah. Kromatografi gas umumnya menggunakan derivatisasi untuk
menganalisis spesies ion. Kromatografi cair kinerja tinggi dalam mode
eksklusi dan pertukaran ion adalah ideal untuk menganalisis material-material
ini.
51
prosedur-prosedur khusus diperlukan.
Seperti telah dijelaskan sebelumnya, ada empat mode dasar kromatografi cair
kinerja tinggi. Dalam kesempatan ini akan diberikan petunjuk pembahasan
ringkas untuk memilih mode yang tepat. Karena kekuatan teknik kromatografi
cair kinerja tinggi, menurut petunjuk harus umum disebabkan satu atau lebih dari
mode-mode mampu mempengaruhi pemisahan. Dalam hal ini analis harus
membuat keputusan mode mana yang dicarinya sehingga dapat memberinya
informasi paling baik.
Tabel 3-2 menampilkan suatu skema cara pendekatan umum untuk seleksi mode
kromatografi cair kinerja tinggi. Informasi ini, merupakan kombinasi dengan
sumber-sumber lain, memudahkan analis memutuskan mode yang mana
mempunyai probabilitas paling baik untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.
Akan ditunjukkan bahwa suatu cuplikan yang betul-betul tidak dikenal jarang
dijumpai. Informasi seperti kelarutam, adanya gugus fungsi, dan rentang berat
molekul selalu tersedia dari informasi pabrik, pemasok cuplikan, atau data
spektroskopik seperti Nuclear Magnetic Resonance, NMR; Infra Red, IR; Ultra
Violet, UV, dan Mass Spectrometry. Semua data-data ini dapat digunakan untuk
mengarahkan analis kepada pemilihan yang tepat dari mode kromatografi cair
kinerja tinggi.
Ingat peraturan dasar “like dissolve like”, sesuatu dapat dengan mudah diputuskan
pada mede yang tepat. Menurut Tabel 3-2, kita dengan cepat melihat bahwa bila
berat molekul lebih besar dari pada 2000 kita harus menggunakan eksklusi.
Pelarut adalah air bila cuplikan mudah larut dalam air; bila dapat larut dalam
pelarut-pelarut organik maka dia digunakan sebagai fase gerak. Kemasan adalah
Sephadex® (cross-linked dextrans) atau µ Bondagel® Series E untuk fase gerak air
dan Styragel® atau MikroPak® TSK gels untuk fase gerak organik.
Bila berat molekul lebih rendah dari 2000, pertama menentukan apakah cuplikan
dapat larut dalam air. Bila cuplikan dapat larut atau sedikit dapat larut dalam air,
52
maka digunakan kromatografi penukar ion atau kromatografi partisi fase balik.
Bila kelarutan dipertinggi dengan penambahan asam atau basa, atau bila pH dari
larutan bervariasi lebih daripada 2 satuan-satuan pH dari 7, maka kromatografi
penukar ion adalah teknik yang dipilih. Bila kelarutan tidak dipengaruhi oleh
asam atau basa dan larutan air pada dasarnya adalah netral, maka kromatografi
partisi fase balik adalah mode yang dipilih. Kromatografi eksklusi menggunakan
ukuran rongga kecil dan fase air dapat juga dicoba.
Bila cuplikan tidak dapat larut dalam air, maka kromatografi partisi atau
cair-padat adalah pilihan yang tepat. Untuk kerja rutin disarankan menggunakan
kromatografi partisi fase terikat normal karena kolom-kolom ini membutuhkan
sedikit pemeliharaan dalam penggunaannya. Untuk cuplikan-cuplikan isomer
maka kromatografi cair-padat membuktikan mode yang paling tepat digunakan.
Bila ada perbedaan ukuran yang besar dalam cuplikan, eksklusi sterik dengan fase
gerak organik dapat juga digunakan.
Penjelasan di atas sudah cukup bagi analis untuk memilih mode yang memberikan
sejumlah maksimum informasi.
Tabel 3-2: Petunjuk untuk memilih mode kromatografi cair kinerja tinggi
53
Untuk laboratorium yang menggunakan mode-mode kromatografi cair kinerja
tinggi, suatu seleksi (Tabel 3-3) dari kolom-kolom berikut harus disediakan.
54
Dalam banyak hal kemasan mikropartikulat dianjurkan karena mereka memiliki
kapasitas cuplikan dan efisiensi yang lebih tinggi.
Partisi:
a) Normal phase 10 µ alkylnitril 2 25 – 30 cm
10 µ alkylamine 2 25 – 30 cm
b) Reverse Phase 10 µ C18 (polymeric) 1 25 – 30 cm
10 µ C18 (monomeric) 2 25 – 30 cm
10 µ phenyl 1 25 – 30 cm
10 µ anion exchange
a) silica base 1 25 – 30 cm
b) polystyrene base 1 25 – 30 cm
55
IV. JENIS-JENIS KROMATOGRAFI
Teknik ini tergantung pada partisi solute diantara dua pelarut yang tidak dapat
bercampur, salah satu diantaranya bertindak sebagai fase diam (stationary phase)
dan yang lainnya sebagai fase gerak (mobile phase). Pada permulaan kromatografi
cair fase diam dibuat dengan cara yang sama seperti pendukung-pendukung
kromatografgi gas. Fase diam (polar atau nonpolar) dilapiskan pada suatu
pendukung inert dan dikemas ke dalam sebuah kolom. Kemudian fase gerak
dilewatkan melalui kolom. Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi
cair cair (Liquid-Liquid Chromatography, LLC).
Untuk memenuhi kebutuhan akan kolom-kolom yang dapat lebih tahan lama,
telah dikembangkan kemasan-kemasan dengan fase diam yang berikatan secara
kimia dengan pendukung inert. Bentuk kromatografi partisi ini disebut
kromatografi fase terikat (Bonded Phase Chromatography, BPC). BPC dengan
cepat menjadi salah satu bentuk yang paling populer dari kromatografi cair kinerja
tinggi. Kromatografi partisi (LLC dan BPC), disebut “fase normal” bila fase diam
lebih polar dari fase gerak dan “fase balik” bila fase gerak lebih polar dari fase
diam.
56
4.3. Kromatografi Penukar Ion (Ion-Exchange Chromatography, IEC)
Teknik ni tergantung pada penukaran (adsorpsi) ion-ion diantara fase gerak dan
tempat-tempat berion dari kemasan. Kebanyakan resin-resin berasal dari
kopolimer stiren divinilbenzen dimana gugus-gugus fungsinya telah ditambah.
Resin-resin tipe asam sulfonat dan amin kuarterner merupakan jenis resin pilihan
paling baik dan banyak digunakan. Keduanya, fase terikat dan resin telah
digunakan. Teknik ini dipakai secara luas dalam life sciences dan dikenal secara
khas untuk pemisahan asam-asam amino. Teknik ini dapat dipakai untuk
keduanya, kation-kation dan anion-anion.
Teknik ini unik karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari
solute. Kemasan adalah suatu gel dengan suatu permukaan berlubang-lubang
sangat kecil (porous) yang inert. Molekul-molekul kecil dapat masuk ke dalam
jaringan dan ditahan dalam fase gerak yang menggenang (stagnant mobile phase).
Molekul-molekul yang lebih besar tidak dapat masuk ke dalam jaringan dan lewat
melalui kolom tanpa ditahan.
57
Kromatogarafi pasangan ion sebagai penyesuaian terhadap kromatografi cair
kinerja tinggi termasuk baru, pemakaian pertama sekali pada pertengahan tahun
1970. Diterimanya IPC sebagai metode baru kromatografi cair kinerja tinggi
merupakan hasil kerja Schill dan kawan-kawan dan mempunyai beberapa
keuntungan yang unik. Kadang-kadang IPC disebut juga kromatografi ekstraksi,
kromatografi dengan suatu cairan penukar pasangan ion dan Paired Ion
Chromatography ( PIC ). Setiap teknik-teknik ini mempunyai dasar yang sama.
Popularitas IPC muncul terutama sekali dari keterbatasan IEC dan dari sukarnya
menangani cuplikan-cuplikan tertentu dengan metode-metode kromatografi cair
lainnya (seperti senyawa yang sangat polar, senyawa yang terionisasi secara
kompleks dan senyawa basa kuat).
IPC dapat dilaksanakan dua tipe yaitu fase normal dan fase balik. Fase diam dan
fase balik IPC dapat terdiri dari suatu kemasan silika yang disilanisasi (misalnya
C8 atau C18 Bonded Phase) atau dari suatu kemasan yang diperoleh secara
mekanik, fase organik yang tidak dapat bercampur dengan air seperti 1 pentanol.
Fase diam yang dipakai adalah C8 atau C18 BPC Packing. Fase gerak terdiri dari
suatu larutan bufer (ditambah suatu kosolven organik seperti metanol atau
asetonitril untuk pemisahan fase terikat) dan suatu penambahan ion tanding yang
muatannya berlawanan dengan molekul cuplikan.
………………………… (4-1)
pasangan ion
58
Tulisan aq dan org menunjukkan fase air dan fase organik. Konstanta ekstraksi E
selanjutnya ditetapkan dengan persamaan :
…………………………………………. (4-2)
Dimana E adalah konstan untuk semua sistem IPC khusus, tetapi bervariasi
dengan pH fase gerak dan kekuatan ion, konsentrasi dan jenis kosolven organik di
dalam fase garak (misal metanol atau asetonitril) dan suhu.
........................................................................ (4-3)
................................................................................... (4-4)
Variasi dari (TBA+)aq memberikan suatu cara untuk mengontrol kekuatan solven
dalam selektifitas. Dalam sistem fase balik, kekuatan solven dengan mudah dapat
divariasi dengan mengubah ion tanding atau konsentrasinya. Untuk sistem fase
balik pemisahan cuplikan anion atau cuplikan kation dapat di rumuskan sebagai
berikut :
59
Disini konsentrasi (C+) dan (C-), berturut-turut menunjukkan konsentrasi ion
tanding kation dan konsentrasi ion tanding anion, dan E adalah konstan walaupun
kondisi-kondisi lainnya dirbah. Maka bertambahnya konsentrasi dari ion tanding
dalam fase gerak menyebabkan bertambahnya k’ untuk IPC fase balik (dan
berkurang pada IPC fase normal). Persamaan (4-5) dan (4-6) untuk ion-ion
cuplikan terionisasi tunggal. Untuk ion-ion cuplikan bivalen atau trivalen, k’
berubah berturut-turut menjadi (C+)2 atau (C+)3.
Dalam IPC fase normal, k’ dapat divariasi dengan mengubah konsentrasi ion
tanding dalam fase diam. Namun, hal ini kurang tepat karena berarti harus
mengubah fase diam (mengisi kembali kolom = reloading the column). Dalam
operasional fase normal ataupun fase balik IPC, k’ dapat juga divariasi dengan
mengubah jenis ion tanding (misalnya mengganti pentan sulfonat dengan heptan
sulfonat). Penambahan satu gugus CH2 kepada molekul ion tanding menghasilkan
suatu faktor sampai 2,5 kali (efek lebih besar pada ion tanding dengan konsentrasi
rendah), molekul-molekul ion tanding yang lebih besar memberikan harga k’ lebih
kecil pada IPC fase normal.
Kekuatan solven baik dalam fase normal ataupun fase balik IPC dapat juga
divariasi dengan merubah polaritas fase gerak. Untuk sistem fase balik IPC tanpa
penambahan fase diam organik, campuran air dengan salah satunya metanol atau
asetonitril biasanya digunakan sebagai fase gerak. Bila persentase air dikurangi,
maka pelarut menjadi lebih kuat dan harga k’ cuplikan berkurang.
Selain dari pada menaikkan konsentrasi ion tanding, menaikkan kekuatan ionik di
dalam fase air biasanya mengurangi pembentukan pasangan-pasangan ion,
sebagai suatu hasil kompetisi dari ion-ion sekunder dalam membentuk
pasangan-pasangan ion dengan ion tanding. Maka suatu kenaikan / pertambahan
kekuatan ion akan menurunkan harga k′ pada IPC fase balik dan akan
meninggikan harga k′ pada fase normal IPC.
Satu studi membuktikan bahwa 2 sampai 3 kali lipat perubahan k’ untuk setiap
menggandakan kekuatan ion. Ion-ion sekunder yang muatannya sama dengan
60
muatan ion cuplikan (misal: kationik atau anionik) memberikan efek yang paling
besar pada harga k’ cuplikan. Dalam suatu studi meliputi pemisahan anion-anion
cuplikan dengan IPC, efek dari ion-ion sekunder terhadap k’ bertambah dengan
urutan
61
V. PENGGUNAAN KCKT DALAM FARMASI
Pada Farmakope Indonesia Edisi III Tahun 1979, KCKT belum digunakan sebagai
metode analisis baik kualitatif maupun kuantitatif. Padahal dalam
Farmakope-Farmakope Negara-negara maju sudah lama digunakan, seperti
Farmakope Amerika, Farmakope Jerman, Farmakope Inggris dan lain-lain.
Pada Farmakope Indonesia Edisi IV Tahun 1995 sudah digunakan KCKT dalam
analisis kualitatif maupun kuantitatif dan uji kemumian sejumlah 277 (dua ratus
tujuh puluh tujuh) obat / bahan obat. Perubahan yang sangat spektakuler dari
Farmakope Indonesia Edisi IV Tahun 1995 ini menunjukkan bahwa Pemerintah
Indonesia melalui Departemen Kesehatan Republik Indonesia dan Direktorat
Jenderal Pengawasan Obat Dan Makanan telah mengikuti perkembangan dan
kemajuan ilmu pengetahuan dan teknologi canggih dalam bidang analisis obat.
Walaupun disadari biaya yang dibutuhkan untuk analisis dengan KCKT sangat
mahal, namun metode ini tetap dipilih untuk digunakan dalam menganalisis 277
jenis obat / bahan obat karena hasil analisis yang memiliki akurasi dan presisi
yang tinggi, waktu analisis cepat. Pada Tabel 6 dapat dilihat Daftar Obat-obat
yang penetapan kadamya dengan KCKT yang tercantum dalam Farmakope
62
Indonesia Edisi IV Tahun 1995.
Tabel 5-1 : Daftar obat yang penetapan kadarnya dengan KCKT (FI Edisi IV)
63
24. Beklometason Dipropionat 50. Kloramfenikol
25. Gel Benzoil Peroksida 51. Krim Kloramfenikol
26. Betametason 52. Tetes Telinga Kloramfenikol
64
76. Krim Klortrimazol 105. Diazepam Injeksi
77. Tablet Vaginal Klotrimazol 106. Dibukain Hidroklorida
78. Kloksasilin Natrium 107. Dikloksasilin Natrium
79. Kolkhisin 108. Dikloksasilin Natrium Steril
80. Kortison Asetat 109. Kapsul Dik1oksasilin Natrium
81. Suspensi Steril Kortison Asetat 110. Dikloksailin Na utk.Susp- Oral
65
132. Etinil Estradiol 162. Lidokain Hidroklorida
133. Injeksi Fentanil Sitrat 163. Injeksi Lidokain Hidroklorida
134. Fluosinolon Asetonida 164. Lrt. Oral-Topikal Lidokain HCl
135. Fluoksimesteron 165. Inj. Lidokain dan Epinefrin
136. Tablet Furosemida 166. Linkomisin Hidroklorida
137. Injeksi Furosemida 167. Kapsul Linkomisin Hidroklorida
138. Gemfibrozil 168. Injeksi Linkomisin Hidroklorida
139. Gentamisin Sulfat 169. TabIet Lorazepam
140. Griseofulvin 170. Manitol
No Nama Obat / Bahan Obat No Nama Obat / Bahan Obat
171. Medroksiprogesteron Asetat 201. Tablet Nitrogliserin
172. Susp.Ster.Medroksiprogest.asetat 202. Metaproterenol Sulfat
173. Metotreksat 203. Oksimetazolin Hidroklorida
174. Tablet Metotreksat 204. Tetes Hidung Oksimetazolin HCl
175. Injeksi Metotreksat Natrium 205. Tablet Parasetamol
176. Metoksalen 206. Larutan Oral Parasetamol
177. Tablet Metilergonovin Maleat 207. Suspensi Oral Parasetamol
178. Injeksi Metilergonovin Maleat 208. Luminal
179. Metilprednisolon Asetat 209. Tablet Fenobarbital
180. Metiltestosteron 210. Luminal Natrium
181. Tablet Metoklopramida HCl 211. Injeksi Fenobarbital Natrium
182. Injeksi Metoklopramida HCl 212. Fenolftalein
183. Lrt. Oral Meloklopramida HCl 213. Penisilin V
184. Tablet Metoprolol Tartrat 214. Tablet Penisilin V
185. Tablet Metronidazol 215. Fenilbutazon
186. Injeksi Metronidazol 216. Fenitoin Natrium
187. Meksiletin Hidroklorida 217. Kapsul Fenitoin Natrium
188. Minosiklin Hidroklorida 218. Vitamin KI (Fitonadion)
189. Mitomisin 219. Tablet Fitonadion
66
190. Mitomisin untuk Injeksi 220. Injeksi Fitonadion
191. Morfin Sulfat 221. Tetes Mata Pilokarpin HCl
192. Injeksi Morfin Sulfat 222. Tetes Mata Pilokarpin Nitrat
193. Tablet Nadolol 223. Pindolol
194. Tablet Naproksen Natrium 224. Piperazin
195. Natrium Aminosalisilat 225. Piroksikam
196. Tablet.Natrium Aminosalisilat 226. Prazikuantel
197. Nifedipin 227. Tablet Prazikuantel
198. Nitrofurantoin 228. Tablet Prazosin Hidroklorida
199. Kapsul Nitrofurantoin, 229. Prednisolon
200. Nitrogliserin Encer 230. Prednisolon Asetat
No Nama Obat / Bahan Obat No Nama Obat / Bahan Obat
231. Tts. Mata Susp. Prednisolon 255. Sulfametizol
asetat
232. Prednison 256. Tablet Kotrimoksazol
233. Tablet Prednison 257. Tablet Tamoksifen Sitrat
234. Probenesid 258. Terbutalin Sulfat
235. Prokainamida HCl 259. Tetrasiklin
236. Progesteron 260. Tetrasiklin HCl
237. Injeksi Prometazin HCI 261. Kapsul Tetrasiklin HCl
238. Propanolol HCl 262. Teofilin
249. Tablet Propanolol HCl 263. Tiamin HCl
240. Injeksi Propanol HCl 264. Injeksi Vitamin B1
241. Tablet Propiltiourasil 265. Tiamin Mononitrat
242. Pirantel Pamoat 266. Tiokonazol
243. Suspensi Oral Pirantel Pamoat 267. Tobramisin
244. Piridoksin HCl 268. Tolbutamida
245. Tablet Kuinin Sulfat 269. Tablet Tolbutamida
246. Ranitidin HCl 270. Triamsinolon
67
247. Tablet Ranitidin HCl 271. Triamsinolon Asetonida
248. Riboflavin Natrium Fosfat 272. Triheksifenidil HCI
249. Rifampisin 273. Vinblastin Sulfat
250. Kapsul Rifampisin 274. Tablet Triheksifenidil HCl
251. Sorbitol 275. Vinkristin Sulfat
252. Spironolakton 276. Tubokurarin Klorida
253. Tts- Mata Sulfasetamida 277. Warfarin Natrium
Natrium
254. Sulfadiazin
Dari Tabel 5-1 di atas dan hasil pengamatan di Farmakope Indonesia Edisi IV
tahun 1995 dapat diketahui bahwa :
1. Penetapan kadar obat / bahan obat baik dalam bentuk murni maupun
dalam bentuk sediaannya ditetapkan dengan KCKT
2. Penetapan kadar obat / bahan obat dalam bentuk murni dilakukan dengan
metode lain seperti titrasi bebas air, nitrimetri, iodo-i/metri dan lain-lain,
sedangkan penetapan kadar sediaannya menggunakan KCKT.
68
VI. ANALISIS KUANTITATIF
Metode ini disebut juga metode normalisasi internal. Untuk analisis kuantitatif
diasumsikan bahwa lebar atau tinggi puncak sebanding (proporsional) dengan
kadar / konsentrasi zat yang menghasilkan puncak. Dalam metode yang.paling
sederhana diukur luas atau tinggi puncak, yang kemudian dinormalisasi (ini
berarti bahwa setiap lebar atau tinggi puncak diekspresikan sebagai suatu
persentase dari total). Hasil normalisasi dari luas atau tinggi puncak memberikan
komposisi dari campuran yang dianalisis, seperti contoh pada Tabel 6-1 berikut :
69
1. Kita harus yakin bahwa kita telah menghitung semua komponen, yang
tiap-tiap komponen muncul sebagai suatu puncak yang terpisah pada
kromatogram. Komponen-komponen dapat berkoelusi, atau ditahan di
dalam kolom, atau r, erelusi tanpa terdeteksi.
Pada metode ini kita membuat suatu standar yang mengandung senyawa /
senyawa-senyawa yang akan ditetapkan kadarnya, idealnya jumlah standar sama
dengan jumlah bahan yang akan dianalisis, dan kita membandingkan
kromatogram standar dengan kromatogram cuplikan. Dari kromatogram standar
dapat dihitung suatu respons faktor untuk setiap puncak yang diinginkan, respons
faktor memberi informasi tentang konsentrasi komponen yang dihasilkan oleh
satuan respons detektor (unit detector respons) :
.........................................
(6-1)
Bila bekerja dengan metode ini, respons detektor harus linier untuk setiap
senyawa pada rentang konsentrasi yang digunakan, dan juga kita harus
menginjeksikan (bila secara manual) jumlah yang sama untuk setiap komponen
pada kromatogfi, sehingga berhasilnya operasi dari metode ini tergantung pada
kemampuan menginjeksi cuplikan dengan presisi yang bagus.
70
Gambar 6-1 : Penetapan kadar benzoat dalam sirup dengan KCKT
Fase gerak : CH3CN/0,005 mol dm-3 pH 4,5 dapar asetat (15 : 85)
Gambar 6-1 menunjukkan beberapa hasil yang diperoleh pada penetapan kadar
benzoat yang ditambahkan sebagai suatu preservatif di dalam sirup. Kromatogram
b adalah standar natrium benzoat (konsentrasi 0,07308 g dm-3 di dalam fase
gerak), Kromatogram a adalah sirup (konsentrasi 90,6726 g dm-3 dalam fase
gerak). Kedua kromatogram direkam dengan sensitivitas detektor yang sama.
Lebar puncak diukur menggunakan suatu integrator, yang mencetak (memprint)
angka proporsional antara konsentrasi dengan lebar puncak. Waktu retensi
benzoat pada sirup sama dengan waktu retensi benzoat standar. Lebar puncak
benzoat yang diperoleh untuk :
71
= 7,044 x 10-4
Maka Konsentrasi Benzoat dalam sirup = 72 859 x 7,044 x 10-4 = 5l,32 ppm
Sebelum dianalisis sirup telah diencerkan dengan fase gerak sampai 1000 ml,
maka konsentrasi benzoat sebenarnya adalah :.
………………………………………………… (6-2)
72
As = Lebar atau tinggi puncak baku dalam
………………………………………….. (6-3)
=
Konsentrasi baku dalam
Pendekatan lain adalah mengkoreksi setiap lebar puncak pada campuran yang
diketahui, dengan mengalikannya dengan respons faktor relatif. Hal ini
menghasilkan lebar puncak yang diperoleh dengan respons detektor yang sama
untuk setiap komponen. Komposisi dari campuran kemudian diperoleh dengan
normalisasi lebar puncak yang telah dikoreksi. Untuk bekerja dengan metode ini
sekali lagi kita harus yakin bahwa kita telah melihat semua komponen di dalam
campuran sebagai puncak-puncak yang terpisah pada kromatogram.
Sebagai contoh dari metode ini ialah penetapan kadar aspirin (asam asetil salisilat)
dan kafein menggunakan standar internal fenasetin. Tablet-tablet analgesik
biasanya mengandung aspirin dan kafein dan pada kesempatan ini dilakukan
analisis kuantitatif tablet yang diperoleh dari perdagangan.
Untuk memisahkan ketiga senyawa di atas, digunakan suatu metode yang diambil
dari literatur (G.B. Cox et. al., Journal of Chromatography 1976, 117, 269-278).
Tablet analgetik yang dibeli di apotik pada etiketnya tertera setiap tablet
mengandung 325 mg aspirin dan 50 mg kafein.
Prosedur kerja : ambil dua tablet tambahkan 0,0773 g fenasetin kocok dengan 10
ml etanol selama 10 menit, tambahkan 10 ml ammonium format 0,5 mol dm-3 dan
campuran ini diencerkan dengan fase gerak sampai 100 ml. Tablet mengandung
73
bahan-bahan pembawa, maka larutan ini harus disaring sebelum dikromatografi.
Dengan kondisi percobaan yang digunakan, ketiga senyawa tersebut dapat
dipisahkan dalam waktu sekitar 3 menit (lihat Gambar 6-2).
Dengan menggunakan persamaan 6-2 maka akan diperoleh harga respons faktor
relatif, r, sebagaimana disajikan pada Tabel 6-3
74
Gambar 6-2 : Pemisahan aspirin, fenasetin dan kafein dengan kckt
Tabel 6-4 : Data cuplikan aspirin dan kafein dengan standar internal fenasetin
Lebar puncak
Nomor injeksi aspirin Fenasetin Kafein
1 157595 170804 50693
2 153541 164174 48478
Hitung respons faktor relatif, kadar aspirin dan kafein dalam tablet. Persyaratan
75
farmakope untuk aspirin tidak boleh kurang dari 95,0 % dan tidak boleh lebih dari
105,0 % dari jumlah yang tertera pada etiket. Persyaratan untuk kafein tidak
boleh kurang dari 90,0 % dan tidak boleh lebih dari 110,0 % dari jumlah yang
tertera pada etiket. Apakah tablet tersebut memenuhi persyaratan ?
Untuk injeksi 1 : .
Kadar aspirin
= 0,6353 g dalam 2
tablet
Kadar Kafein
= 0,1045 g dalam 2
tablet
Untuk injeksi 2 :
Kadar aspirin
= 0,6440 g dalam 2
tablet
Kadar Kafein
76
= 0,1040 g dalam 2 tablet
Untuk membuat kurva kalibrasi dibuat satu seri larutan standar ampisilin dengan
ke sistem KCKT, diperoleh data seperti pada Tabel 6-6. kemudian dengan
memplot konsentrasi versus luas puncak, maka diperoleh kurva kalibrasi (lihat
Gambar 6-3)
77
5. 600 153557 151773 147918 138062 135445 151494 146374,83
6. 700 164546 170610 175855 172666 174585 177392 172609,00
Y = a + bX
78
a=
= - 4305,15
b=
= 249,89
Y = a + bX
Untuk mencari hubungan kadar (X) dengan luas puncak (Y), digunakan pengujian
r=
79
=
r = 0,9984
Tabel 6-8 : Analisa data secara statistik untuk mencari kadar sebenarnya dari
larutan ampisilin baku (Phapros) pada uji perolehan kembali
secara KCKT.
No. Kadar (%) Luas Puncak
X Y ( ) ( )2
1. 102,01 124598 -0,05 0,0025
2. 100,92 123226 -1,14 1,2996
3. 100,81 123076 -1,25 1,5625
4. 105,16 128579 3,1 9,61
5. 102,36 125045 0,3 0,09
6. 101,08 123416 -0,98 0,9604
ΣX= 612,34
Σ(X - )2=13,525
= 102,06
SD = = = 1,6447
μ= ± t(1-1/2 α),dk x
= 102,06 ± 4,03 x
= 102,06 ± 2,70
99,36% ≤ μ ≤ 104,76%
80
Dengan cara yang sama seperti di atas dapat dihitung kadar ampisilin dalam
Keterangan :
U = Kadar teoritis
SD = Standar Deviasi
KR = Kesalahan Relatif
81
KV = Koefisien Variasi
Hasil penentuan linieritas kurva kalibrasi dari ampisilin BPFI dengan rentang
konsentrasi 200 sampai 700 µg/ml yang diukur pada panjang gelombang 254 nm
dengan laju aliran 2,5 ml/menit, didapat hubungan yang linier antara konsentrasi
versus luas puncak dengan koefisien korelasi (r) = 0,9984 dengan persamaan
regresi Y = 249,89 X - 4305,15.
Dari hasil uji perolehan kembali dari ampisilin baku (Phapros), secara statistik
relatif (KR) = 2,06% dan koefisien korelasi (KV) = 1,61%. Sedangkan dalam
KCKT.
Tabel 6-11: Hasil pengolahan data penyuntikan larutan kaplet Ampicillin (Kimia
Farma)
No. Luas Puncak Kadar (%)
1. 120467 100,51
2. 119620 99,83
82
3. 115497 96,51
4. 121090 101,01
5. 119996 100,13
6. 115416 96,44
Tabel 6-14 : Hasil pengolahan data penyuntikan larutan Kaplet Binotal (Bayer)
No. Luas Puncak Kadar (%)
1. 113293 94,73
2. 113222 94,67
3. 114730 95,89
4. 116902 97,64
5. 117296 97,96
6. 113122 94,59
Tabel 6-15: Hasil pengolahan data penyuntikan larutan kaplet Kalpicillin (Kalbe
Farma)
No. Luas Puncak Kadar (%)
1. 116645 97,43
83
2. 111137 92,99
3. 112637 94,20
4. 112359 93,98
5. 115882 96,82
6. 110728 92,66
Tabel 6-16: Hasil pengolahan data penyuntikan larutan kaplet Parpicillin (Prafa)
No. Luas Puncak Kadar (%)
1. 118154 98,65
2. 118448 98,88
3. 117177 97,86
4. 122088 101,82
5. 119227 99,51
6. 119689 99,88
Tabel 6-17: Hasil pengolahan data penyuntikan larutan kaplet Cetacillin (Soho)
No. Luas Puncak Kadar (%)
1. 115046 96,14
2. 115118 96,20
3. 117997 98,52
4. 116087 96,98
5. 116163 97,04
6. 116937 97,67
Dari hasil percobaan yang dilakukan pada sediaan kaplet dengan nama dagang
dan nama generik secara statistik diperoleh kadar ampisilin sebenarnya seperti
Tabel 6-18: Data kadar ampisilin dalam sediaan kaplet dengan nama dagang dan
nama generik yang dianalisis secara KCKT
No. Nama sediaan kaplet ampisillin Kadar ampisillin
1. Ampicillin (PT. Kimia Farma) 95,70% ≤ µ ≤ 102,44%
2. Ampicillin (PT. Indofarma) 99,69% ≤ µ ≤ 104,99%
3. Ampicillin (PT. Phapros) 91,03% ≤ µ ≤ 97,53%
4. Binotal (PT. Bayer) 93,38% ≤ µ ≤ 98,44%
5. Kalpicillin (PT. Kalbe Farma) 91,41% ≤ µ ≤ 97,95%
6. Parpicillin (PT. Prafa) 97,19% ≤ µ ≤ 101,67%
7. Cetacillin (PT. Soho) 95,60% ≤ µ ≤ 98,58%
84
Ketujuh sediaan kaplet dengan nama dagang dan generik yang ditentukan
dari 90,0% dan tidak lebih dari 120% dari jumlah yang tertera pada etiket.
DAFTAR PUSTAKA
Anonim (1998), Analytical Chemistry : the authentic text to the FECS curriculum
analytical chemistry. Ed. By Kellner, R.; Mermet, J. M.; Otto, M.; Widmer, H.
M. Weinheim – Berlin - New York – Chichester – Brisbane – Singapore -
Toronto, Wiley-VCH. pp. 159-208
Anonim, 1979. Farmakope Indonesia Edisi III, Direktorat Jenderal Pengawasan Obat
dan Makanan, Departemen Kesehatan R. I., Jakarta.
Anonim, 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV, Direktorat Jenderal Pengawasan Obat
dan Makanan, Departemen Kesehatan R. I., Jakarta.hal 21-837
85
De Lux Putra, E. (1988). Penetapan Komponen Multivitamin Dengan Kromatografi
Cair Tekanan Tinggi (KCTT), Tesis S-2, Program Studi Ilmu Farmasi, Fakultas
Pasca Sarjana-Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, hal.34-69
De Lux Putra, E. (1994). Beiträge Zur Stabilitätsanalytik Am Beispiel Von Vitamin
A-Zubereitungen. Dissertation fűr Doktor der Naturswissenschaften zu
erreichen an der Universität Wűrzburg Germany. pp 29-92
De Lux Putra, E. (2002). Penetapan Kadar Ampisilin Dalam Tablet Dengan Nama
Generik Dan Dagang Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT),
MAJALAH FARMASI INDONESIA, Vol.13. No. 4. Th. 2002, Fakultas
Farmasi - Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, hal. 223-232
Ewing, G. W. (1985). Instrumental Methods of Chemical Analysis, Fifth Edition,
McGraw-Hill Book Company, New York-St. Louis-San
Francisco-Auckland-Bogota-Hamburg-Johannesburg-London-Madrid-Mexico-M
ontreal-New Delhi-Panama-Paris-Sao Paolo-Singapore-Sydney-Tokyo-Toronto,
pp 340-347, 375-394
Johnson, E. L. and Stevenson, R. (]978), Basic Liquid Chromatography, Varian,
California. pp 1-319
Lindsay, S. (]992),High Performance Liquid Chromatography, Second Edition, John
Wiley & Sons, Chichester, New York, Brishane, Toronto, Singapore.pp. 1-307
Pietrzyk, D. J. And Frank, C. W.,.(1979). Analytical Chemistry, Second Edition,
Academic Press, New York – San Francisco – London, pp 476-516
Roth, H. J. and Blaschke, G. (1989). Pharmazeutische Analytik, 3. überarbeitete
Auflage, Georg Thieme Verlag Stuttgart . New York, pp 351-353
Rücker, G., Neugebauer, M., Willems, G. G., (1988). Instrumentelle pharmazeutische
Analytik : Lehrbuch zu spektroskop., chromatograph. U. Elektrochem.
Analysenmethoden. Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart, Hal :
270-285
Snyder, L. R. and Kirkland, J. J. (1979), Introduction to Modern Liquid
Chromatography, second edition, John Wiley & Sons, Inc., New York,
Chichester, Brisbane, Toronto, Singapore. pp 1-268
Walton, Harold F. and Reyes, Jorge (1973), Modern Chemical Analysis And
Instrumentation, MARCEL DEKKER, INC. New York. pp 240-259
Willard, Hobart H., Merritt, Jr. Lynne. L., Dean, John A., Settle, Jr. Frank A., (1988).
Instrumental Methods of Analysis, Seventh Edition, Wadsworth Publishing
Company, Belmont-California A Division of Wadsworth, Inc. pp 513-539,
580-613
DASAR-DASAR
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)
86
DAN APLIKASINYA DALAM BIDANG FARMASI
Oleh
FARMASI FAKULTAS
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2011
87