BAB III

METODE PENELITIAN

A.Jenis Penelitian
Penelitian ini merupakan experimental dengan dilakukan uji
daya hambat ekstrak etanol buah terong duri (Solanum Carolinense)
dengan variasi konsentrasi 20%, 40%, 60% dan 80% terhadap
pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans. Kontrol yang
digunakan pada penelitian ini ada 2 kontrol yaitu kontrol negatif
yang dibuat dengan merendam cakram disk menggunakan etanol
96%, sedangkan kontrol positif yaitu disk antibiotik Amoxicillin 25
μg. Penggunaan kontrol positif pada penelitian ini hanya digunakan
sebagai kontrol kerja.
Bentuk rancangan pada penelitian ini dapat dilihat pada tabel :
Unit Analisa Posttest
R (Kelompok Eksperimen) R X O2
R (Kelompok Kontrol) K O4

Tabel 3.1 Desain Penelitian Posttest Only Control Group Design Sumber :
(Sugiyono, 2017)
Keterangan :
R :Kelompok eksperimen yang merupakan konsentrasi
ekstrak buah Terong Duri (Solanum carolinense)
dengan konsentrasi yaitu 20, 40, 60, dan 80%
(Kelompok yang di beri perlakuan)
K :Kelompok kontrol yang digunakan yaitu etanol 96%
sebagai kontrol negatif dan antibiotik Amoxicillin 25μg
sebagai kontrol positif
O2:O4 :Pengukuran kedua (posttest) yaitu diameter zona
hambat yang terbentuk
B. Variabel Penelitian
1. Variabel bebas (Independent variable)
Perbedaan konsentrasi ekstrak etanol buah terong duri (Solanum
carolinense) pada konsentrasi 20, 40, 60 dan 80%.
2. Variabel terikat (Dependent variable)
Zona hambat pertumbuhan Streptococcus mutans.
3. Variabel control
Adanya kontaminasi mikroba lain, ketebalan media, kekeruhan suspensi
bakteri, suhu inkibas, jarak cakram disk, waktu inkubasi,sterilisasi alat,
media dan ruangan.

C. Waktu dan Lokasi Penelitian

Penelitian akan dilakukan pada bulan Juli-September 2021,
bertempat di Laboratorium STIKes Ibnu Sina Ajibarang.

D. Objek Penelitian
Objek penelitian yang akan digunakan dalam penelitian ini
adalah ekstrak etanol buah terong duri (Solanum Carolinense), yang
diperoleh di daerah Ciberung. Massa sampel ekstrak etanol buah
terong duri yang diperlukan yaitu 4 gram dengan konsentrasi 100%.
Selanjutnya dibuat variasi konsentrasi yaitu 20, 40, 60 dan 80% dengan
cara mengencerkan ekstrak pekat dengan etanol 96%. Kontrol negatif
pada penelitian ini adalah pelarut yang digunakan yaitu etanol 96%.
 Tabel 3.2. Perbandingan Pembuatan Variasi Konsentrasi Ekstrak Buah Terong Duri
(Solanum Carolinense) (%b/v)
NO Massa C1 V2 C2 Akuades (ml)
(gram) (ml)
1 0,2 100% 1 20% Hingga 1 ml
2 0,4 100% 1 40% Hingga 1 ml
3 0,6 100% 1 60% Hingga 1 ml
4 0,8 100% 1 80% Hingga 1 ml
Keterangan :
M = Masa (gr)
C1 = Control pertama
C2 = Control kedua
V2 = Volume
Jumlah pengulangan sebanyak empat kali dan replikasi
sebanyak dua kali (Hanafiah, 2008). Dengan demikian besar sampel
dalam penelitian ini sebanyak 32 data dan ditambah dengan kontrol
negatif mengandung etanol 96% dan kontrol positif Amoxicillin.
Menurut Hanafiah (2008), syarat minimal jumlah pengulangan
yang bisa dilakukan untuk percobaan laboratorium adalah minimal
tiga kali pengulangan, maka pengulangan yang akan dilakukan dalam
penelitian ini sudah memenuhi syarat.

E. Jenis dan Teknik Pengumpulan Data

1. Jenis data yang digunakan
Jenis data yang diperoleh dalam penelitian ini adalah data
primer yakni dengan melakukan eksperimen laboratorium. Data
yang diperoleh berupa data dari hasil pengukuran diameter zona
hambat pertumbuhan Streptococcus mutans pada berbagai
konsentrasi ekstrak terong duri.
2. Teknik pengumpulan data
Dalam penelitian ini cara atau teknik yang digunakan untuk
mendapatkan data adalah dengan melakukan eksperimen
laboratorium dengan mengukur diameter zona hambat ekstrak
etanol buah terong duri terhadap bakteri Streptococcus mutans
dengan metode Kirby-Bauer. Hasil pengukuran diameter zona
hambat dari masing-masing konsentrasi ekstrak buah terong duri
yang menunjukkan aktivitas penghambatan dinyatakan dalam
satuan milimeter (mm).
a. Pengambilan sampel
Sampel buah terong duri (Solanum carolinense) yang
akan digunakan diperoleh dari kebun sekitar rumah dan di desa
ciberung.

b. Pengolahan sampel

Sampel yang diperoleh dari alam sekitar dalam kondisi

buah masih segar dan masih membutuhkan proses pengeringan
dengan sinar matahari kemudian diserbukan untuk dimaserasi
dan akan di buat ekstrak.

c. Ekstraksi sampel

Sampel ditimbang sebanyak 500 g, kemudian dimasukan

kedalam wadah maserasi dan ditambahkan pelarut metanol
hingga terendam seluruhnya. Wadah maserasi ditutup rapat
1x24 jam disimpan ditempat yang tidak terkena sinar matahari
langsung, selanjutnya dipisahkan antar ampas dan filtrat, ampas
diekstraksi kembali dengan metanol selama 3x24 jam, ekstrak
methanol yang diperoleh diangin-anginkan hingga didapatkan
ekstrak kental metanol buah terong duri (Solanum carolinense).
 d. Sterilisasi alat

Alat-alat yang diperlukan dicuci dengan sabun. Alat-alat

dikeringkan dengan posisi terbalik dan setelah kering
dibungkus dengan kertas perkamen. Tabung reaksi dan
Erlenmeyer terlebih dahulu disumbat dengan kapas bersih.
Alat-alat dari kaca disterilkan dioven pada suhu 180 ºC selama
2 jam dan alat plastik yang tidak tahan pemenasan disterilkan
dalam autoklaf pada suhu 121 ºC
e. Pembuatan Medium
Pembuatan medium (Djide,2007)
Medium Nutrien Agar (NA)
Ekstrak daging 3 gram
Agar 15 gram
Pepton 5 gram
Glukosa 10 gram
Air suling 1000 ml

Cara pembuatan:

Semua bahan dimasukkan kedalam labu erlenmenyer,

kemudian dilarutkan dengan air suling hingga 800 ml, lalu
dipanaskan sampai larut. Kemudian dicukupkan dengan air suling
hingga 1000 ml, dengan perbandingan NA 1:20 g, kemudian
disterilkan dalam autoklaf padasuhu 121ºC selama 15 menit

F. Instrumen pengumpulan data

Instrumen yang digunakan untuk mengumpulkan data pada
penelitian ini adalah jangka sorong/mistar, alat tulis, dan kamera.
G. Alat dan Bahan
1. Alat
Alat yang diperlukan dalam penelitian ini: pisau (1 buah),
pipet ukur (Iwaki pyrex) 1 ml dan 10 ml (1 buah), ball pipet (D&n
ball pipet) (1 buah), gelas ukur (Iwaky-pyrex) 1000 ml dan 50 ml
(masing-masing 1 buah), spiritus 1 buah, petridisk steril (12buah),
tabung reaksi/ependoft (18buah), (1 buah) beaker glass 50 ml dan
500 ml (1 buah), kasa steril (1 buah), lumpang dan alu (1 buah),
mikropipet 20μl-1000μl (Secorex) dan tip (20 buah), blender (1
buah),neraca analitik (radwag) (1 buah), Mc Farland densitometer
(Biosan),inkubator CO2(Esco) (1 buah), dan autoclave (Tomy Sx-
500), evaporator (1 buah) biosafety cabinet (Biobaset).
2. Bahan
Bahan yang diperlukan dalam penelitian ini: buah terong
duri sebanyak 500 g, bakteri Streptococcus mutans, cakram disk
kosong (32buah), etanol 96% 2000 ml, media Nutrien Agar (NA),
aquadest steril 1000 ml, standar Mc Farland 0,5, NaCl fisiologis
0,85%, cakram antibiotik Amoxicillin25 μg sebagai kontrol kerja (2
buah), lidi kapas steril (1 buah), alkohol 70%, kertas saring,
aluminium foil.
H. Kerangka Kerja dan Prosedur Kerja
1. Kerangka Kerja

Streptococcus mutans

Digoreskan sampai penuh pada media

Nutrien Agar (NA)

Cakram disk yang  Cakram disk yang

direndam pada ekstrak direndam dengan
buah terong Duri Aquadest etanol 96%
(Solanum carolinense)  Cakram disk
konsentasi 20, 40, 60, antibiotik
dan 80% Amoxocillin

Inkubasi pada inkubator dengan suhu 37o C selama ±24 jam

Diukur diameter zona hambat

pertumbuhan bakteri
Streptococcus mutans

Analisis hasil
 Gambar 4. Kerangka kerja penentuan zona hambatpertumbuhan bakteri
Streptococcus mutans.

Keterangan gambar:
Bakteri Streptococcus mutans yang telah dibuat suspensi
dengan kekeruhan yang sama dengan standar 0,5 Mc Farlland
(setara dengan 1,5 x 108 sel bakteri) digoreskan pada media
Nutrien Agar (NA) secara merata. Cakram disk dari masing-
masing konsentrasi ekstrak buah terong duri serta kontrol
ditempelkan pada media Nutrien Agar (NA) dengan jarak minimal
tiap disk adalah 15 mm, kemudian diinkubasi pada suhu 37oC
didalam inkubator CO2 5% selama ±24 jam. Diukur diameter zona
hambat yang terbentuk pada setiap disk dan dianalisis
menggunakan uji statistik dengan bantuan perangkat lunak
computer.

2. Prosedur Kerja
a. Persiapan sampel
1) Pembuatan ekstrak etanol buah terong duri dengan metode
maserasia
a. Buah terong duri yang berwarna kuning tua dengan
ukuran diameter ±3 cm, dipetik sebanyak 500 g
selanjutnya buah dibersihkan dari kotoran dengan
dibilas menggunakan air bersih, lalu ditiriskan untuk
menghilangkan sisa air.
b. Lalu dipotong-potong menjadi bagianyang lebih kecil
menggunakan pisau.
c. Kemudian di keringkan dengan cara diangin anginkan
dan dikenakan sinar matahari langsung beberapa hari
(6-7 hari) hingga kering (Maryam, Juniasti and Kosman,
2015)
 d. Lalu dihitung kadar airnya (kadar air minimal 10%)
e. Setelah kering kemudian dihaluskan dengan alat blender
dan diayak agar mendapatkan serbuk yang lebih halus,
serbuk yang diperoleh selanjutnya digunakan untuk
ekstraksi
f. Serbuk buah terong duri ditimbang sebanyak 100 gr,
kemudian dimasukkan ke dalam gelas beaker yang
bersih dan ditutup dengan aluminium foil.
g. Ditambahkan etanol 96% 500 ml hingga serbuk buah
terong duri terendam sempurna kemudian maserasi
selama tiga hari dengan diaduk menggunakan magnetic
stirrer selama 24 jam (8 jam berturut-turut selama 3
hari)
h. Hasil maserasi buah terong duri disaring dengan kertas
saring dan filtrat ditampung ke dalam botol kaca bersih.
Dilakukan remaserasi atau maserasi ulang terhadap
residu buah terong duri tersebut.
i. Kemudian filtrat dari hasil maserasi pertama dan kedua
ditampung dalam labu penampung pada alat evaporatori
j. Setelah itu dimasukkan kedalam alat evaporatori
k. Dilakukan proses evaporasi pada alat evaporator secara
automatic
l. Hasil evaporasi buah belimbing wuluh yang dihasilkan
ditampung dalam botol vial yang telah disiapkan

2) Pembuatan ekstrak etanol buah terong duri konsentrasi 20,

40, 60, dan 80%
a. Rumus pengenceran yang digunakan adalah

% = b/v x100
 Keterangan rumus:
% : variasi konsentrasi dalam satuan persen
b : massa ekstrak etanol buah beliming wuluh (100%)
v : volume pengenceran
b. Jumlah ekstrak buah terong duri konsentrasi 100% yang
diperlukan untuk masing-masing konsentrasi adalah
sebagai berikut:

1) Konsentrasi 80% dibuat dengan menimbang 0,8

gram ekstrak buah belimbing wuluh konsentrasi
100% kemudian ditambahkan aquadest steril sampai
tanda batas 1ml pada tabung eppendorf

2) Konsentrasi 60% dibuat dengan menimbang 0,6

gram ekstrak buah belimbing wuluh konsentrasi
100% kemudian ditambahkan aquadest steril sampai
tanda batas 1ml pada tabung eppendorf

3) Konsentrasi 40% dibuat dengan menimbang 0,4

gram ekstrak buah belimbing wuluh konsentrasi
100% kemudian ditambahkan aquadest steril sampai
tanda batas 1ml pada tabung eppendorf

4) Konsentrasi 20% dibuat dengan menimbang 0,2

gram ekstrak buah belimbing wuluh konsentrasi
100% kemudian ditambahkan aquadest steril sampai
tanda batas 1ml pada tabung eppendorf

c. Cakram disk kososng disiapkan dan cakram disk ini

diteteskan 20 μl masing-masing konsentrasi ekstrak buah
belimbing wuluh hingga seluruh cairan meresap ke
dalam cakram disk

d. Untuk kontrol negatif digunakan cakram disk yang

direndam ke dalam 20 μl etanol 96%
3) Pembuatan media NA (Nutrien Agar)

a. Bubuk media Nutrien Agar ditimbang sebanyak 19,08

gram menggunakan neraca analitik.

b. Setelah proses penimbangan, bubuk media dipindahkan

ke dalam Erlenmeyer dan dilarutkan dengan 250ml
akuades.

c. Media dipanaskan dengan hotplate dan diaduk hingga

homogen.

d. Setelah bubuk media larut sempurna dan homogen,

diukur pH media dengan menggunakan pH stick (pH
optimal 7,3 ± 0,1 pada suhu 25oC).

e. Erlenmeyer ditutup dengan kapas berlemak dan

aluminium foil.

f. Media disterilisasi dengan autoclave pada suhu 121oC

selama15 menit dihitung dari tercapainya suhu 121oC.

g. Media yang telah disterilisasi, didiamkan sampai suhu

media turun menjadi ±40 -50oC

h. Media dituangkan secara aseptis ke dalam petridish ±15

ml, kemudian didiamkan hingga memadat.

i. Setelah media memadat, cawan petrik dibalik, dan

apabila tidak langsung digunakan media yang sudah
dituangkan pada cawan petri atau sisa media dalam
tabung Erlenmeyer dapat dibungkus dengan kertas buram
dan disimpan didalam refrigerator.

4) Pembuatan suspensi bakteri Streptococcus mutans

a. Satu sampai tiga ose koloni bakteri Streptococcus mutans

dari biakan murni diambil dan disuspensikan kedalam
tabung yang berisi 5 ml larutan NaCl fisiologis 0,85%
 b. Suspensi ini dibaca menggunakan densitomter standar 0,5
Mc Farlland

5) Tahap pemeriksaan

a. Suspensi bakteri Streptococcus mutans dengan

kepekatan 0,5 Mc Farlland disiapkan

b. Swab kapas steril disiapkan dan dicelupkan ke dalam

suspensi bakteri 0,5 Mc Farlland. Setelah suspensi
bakteri meresap, swab kapas steril diangkat dan diperas
dengan cara menekankan pada dinding tabung bagian
dalam sambil diputas-putar

c. Swab kapas yang telah dicelupkan tadi digores-goreskan

pada permukaan media Nutrient Agar (NA) sampai
seluruh permukaan tertutup rapat dengan gores-goresan
yang dilakukan secara merata

d. Media Nutrient Agar (NA) didiamkan selama 5 sampai

15 menit agar suspensi bakteri meresap ke dalam media

e. Masing-masing cakram disk kosong yang telah diisi

dengan 20μl konsentrasi ekstrak buah terong duri dan
kontrol yang berisi etanol 96% kemudian didiamkan
selama 30 menit atau hingga mengering lalu ditempelkan
pada permukaan media Nutrient Agar (NA) yang sudah
digoreskan suspensi bakteri dan sedikit ditekan dengan
pinset sampai melekat sempurna

f. Kontrol kerja (antibiotik Amoxicillin) juga ditempelkan

pada media NA

g. Jarak antara cakram satu dengan cakram yang lain

minimal 15 mm dan cakram yang telah ditempelkan
 pada permukaan media tidak boleh dipindahkan atau
digeser

h. Media yang telah ditanami cakram disk diinkubasi pada

suhu 37o C pada inkubator selama 24 jam dengan posisi
terbalik

i. Diukur diameter zona hambat menggunakan jangka

sorong

6) Pelaporan hasil

a. Adanya zona hambat dilihat dan diukur diameternya

menggunakan jangka sorong (dalam satuan mm)

b. Diameter zona hambat yang diukur yaitu daerah jernih

sekitar cakram disk (tidak ada pertumbuhan bakteri)
diukur dari ujung satu keujung yang lain melalui
tengah-tengah cakram disk .

I. Pengolahan dan Analisis Data

1. Teknik pengolahan data

Data diperoleh melalui proses eksperimen/pemeriksaan

langsung pada laboratorium kemudian diolah menggunakan teknik
pengolahan data secara tabulating (data disajikan dalam bentuk
tabel) dan narasi.

2. Analisis data

Analisis data yang digunakan dalam penelitian ini adalah

analisis kuantitatif, dilakukan dengan memakai uji statistik
menggunakan bantuan perangkat lunak komputer (software).
Analisis data diawali dengan uji Kolmogorov Smirnov untuk
mengetahui distribusi data, apabila distribusi data normal
digunakan One Way Anova, namun apabila distrubusi data tidak
normal maka digunakan Kruskal-Wallis terhadap variabel yang ada
 untuk mengetahui adanya perbedaan dari berbagai konsentrasi
ekstrak buah terong duri terhadap pertumbuhan bakteri
Streptococcus mutans. Analisis data dilakukan dengan beberapa
tahap, antara lain:

a. Untuk menguji data berdistribusi normal atau tidak digunakan

uji kolmogorov smirnov.

b. Untuk mengetahui variasi zona hambat pertumbuhan bakteri

Streptococcus mutans dengan menggunakan ekstrak etanol
buah Terong Duri antara konsenrasi 20, 40, 60 dan 80%
apabila data berdistribusi normal digunakan uji one way anova.

c. Untuk mengetahui variasi zona hambat pertumbuhan bakteri

Streptococcus mutans dengan menggunakan ekstrak etanol
buah Terong Duri antara konsenrasi 20, 40, 60 dan 80%
apabila data berdistribusi tidak normal digunakan uji kruskal
walls.

d. Untuk mengetahui variasi zona hambat antara masing-masing

konsentrasi ekstrak etanol buah terong duri yang dapat
menghambat pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans, uji
statistic yang digunakan adalah LSD (Least Significant
Deference.

J. Jadwal Penelitian

Tabel 3.3 Jadwal Penelitian

No Agenda Bulan
1 2 3 4
1 Perizinan dan Penyewaan Laboratorium
2 Persiapan Bahan dan Alat
3 Pembuatan Ekstrak Etanol Terong Duri
4 Uji Daya Hambat Bakteri
5 Evaluasi Eksperimen
6 Analisis Data
7 Penyusunan Laporan
8 Evaluasi