Bioscientist : Jurnal Ilmiah Biologi

E-ISSN 2654-4571; P-ISSN 2338-5006

Volume 12, Issue 1, June 2024; Page, 1043-1056
Email: [email protected]

KEKERABATAN Zeylanicobdella arugamensis PADA IKAN KERAPU

CANTANG DENGAN PENDEKATAN MOLEKULER
DI JAWA TIMUR DAN LOMBOK

Sherly Ochtavia1, Gunanti Mahasri2*, & Mufasirin3

1
Program Studi Bioteknologi Perikanan dan Kelautan, Fakultas Perikanan dan Kelautan,
Universitas Airlangga, Jalan Mulyorejo, Surabaya, Jawa Timur 60115, Indonesia
2
Departemen Akuakultur, Fakultas Perikanan dan Kelautan, Universitas Airlangga,
Jalan Mulyorejo, Surabaya, Jawa Timur 60115, Indonesia
3
Departemen Parasitologi Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga,
Jalan Mulyorejo, Surabaya, Jawa Timur 60115, Indonesia
*Email: [email protected]
Submit: 21-01-2024; Revised: 26-01-2024; Accepted: 16-02-2024; Published: 30-06-2024

ABSTRAK: Ikan kerapu cantang merupakan ikan budidaya yang banyak diminati di Indonesia dan
memiliki nilai jual tinggi. Kendala budidaya ikan kerapu salah satunya adalah serangan ektoparasit
lintah laut Zeylanicobdella arugamensis. Nilai prevalensi infestasi ektoparasit mencapai 100%. Cara
efektif untuk menangani infestasi ektoparasit adalah dengan melihat profil molekuler untuk menjadi
informasi kajian pustaka awal dalam pengembangan biologi molekuler sebagai upaya dalam
mengatasi kendala budidaya pada ikan kerapu cantang. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari
homologi dan kekerabatan Zeylanicobdella arugamensis pada ikan kerapu cantang di Jawa Timur
yaitu Lamongan, Mandangin, Situbondo, dan Lombok. Metode yang digunakan adalah RT-PCR
dengan primer gen mtDNA COI. Lalu dilakukan pengumpulan data sekuens molekuler dari sampel
dan dibandingkan dengan data di NCBI GenBank serta dianalisis pohon filogenetik menggunakan
metode Neighbor-joining dan analisis data homologi pada BLAST. Hasil penelitian menunjukkan
gejala klinis pada ikan kerapu cantang terjadi pembengkakan, lesi/luka, kulit berwarna pucat, nafsu
makan menurun, dan sirip geripis. Hasil elektroforesis produk PCR menunjukkan band tunggal pada
750bp untuk sampel dari Lamongan, Situbondo, Mandangin, dan Lombok. Hasil sekuensing DNA
di BLAST pada situs NCBI dan dianalisis homologi terhadap gen reference. Hasil analisis homologi
antara sampel dari Situbondo dan Lamongan menunjukkan angka paling tinggi yaitu sebesar
98,28%, sedangkan hasil paling rendah antara sampel dari Mandangin dan Situbondo yaitu sebesar
88,51%. Berdasarkan hasil analisis phylogenetic tree menunjukkan sampel asal perairan Lamongan
dengan Situbondo memiliki tingkat kekerabatan yang dekat karena jarak genetiknya sebesar
0,009272.

Kata Kunci: COI, Ikan Kerapu Cantang, Kekerabatan, Molekuler, Zeylanicobdella arugamensis.

ABSTRACT: Giant grouper is a highly sought-after cultivated fish in Indonesia due to its high
market value. One of the challenges in grouper aquaculture is the infestation of the sea leech
ektoparasite Zeylanicobdella arugamensis. The prevalence rate of ektoparasite infestation reaches
up to 100%. An effective method to manage ektoparasite infestation is through molecular profiling,
serving as preliminary literature in the development of molecular biology efforts to overcome
cultivation challenges in giant grouper. This research aims to study the homology and relationship
of Zeylanicobdella arugamensis on giant grouper in East Java, specifically in Lamongan,
Mandangin, Situbondo, and Lombok. The method used is RT-PCR with mtDNA COI gene primers.
Molecular sequence data were collected from samples and compared with data from NCBI
GenBank, and analyzed using Neighbor-joining phylogenetic tree method and homology data
analysis on BLAST. The research results indicate clinical symptoms in giant grouper including
swelling, lesions/wounds, pale skin, decreased appetite, and fin erosion. Electrophoresis results
from PCR products show a single band at 750bp for samples from Lamongan, Situbondo,
Mandangin, and Lombok. DNA sequencing results on NCBI BLAST and homology analysis against
the reference gene were conducted. Homology analysis results between samples from Situbondo and
Lamongan show the highest similarity at 98.28%, whereas the lowest similarity is between samples
from Mandangin and Situbondo at 88.51%. Based on phylogenetic tree analysis, samples from
Uniform Resource Locator: https://e-journal.undikma.ac.id/index.php/bioscientist 1043
 Bioscientist : Jurnal Ilmiah Biologi
E-ISSN 2654-4571; P-ISSN 2338-5006
Volume 12, Issue 1, June 2024; Page, 1043-1056
Email: [email protected]

Lamongan and Situbondo waters show a close relationship with a genetic distance of 0.009272.

Keywords: COI, Giant Grouper, Relationship, Molecular, Zeylanicobdella arugamensis.

How to Cite: Ochtavia, S., Mahasri, G., & Mufasirin, M. (2024). Kekerabatan Zeylanicobdella
arugamensis pada Ikan Kerapu Cantang dengan Pendekatan Molekuler di Jawa Timur dan Lombok.
Bioscientist : Jurnal Ilmiah Biologi, 12(1), 1043-1056.
https://doi.org/10.33394/bioscientist.v12i1.10627

Bioscientist : Jurnal Ilmiah Biologi is Licensed Under a CC BY-SA Creative Commons

Attribution-ShareAlike 4.0 International License.

PENDAHULUAN
Ikan kerapu Cantang (Epinephelus fuscoguttatus x Ephinephelus
lanceolatus) adalah ikan yang banyak diminati di Indonesia sehingga ikan kerapu
banyak dibudidayakan dan memiliki nilai jual yang tinggi. Kegiatan ekspor
terhadap kerapu di Indonesia tercatat terbesar kedua di dunia setelah Filipina.
Volume ekspor kerapu mencapai 97,37% atau rata-rata tumbuh 3,50% pertahun.
Tingkat peminatan kerapu diperkirakan mencapai 35.000 ton per tahun dengan
negara pengimpor utama yaitu Hongkong, Taiwan, China, Jepang, Korea Selatan,
Vietnam, Thailand, Filipina, Amerika Serikat, Australia, Singapura, Malaysia, dan
Perancis.
Permasalahan mengenai budidaya ikan kerapu sangat beragam, salah
satunya adalah faktor lingkungan seperti pencemaran air dari pembuangan limbah
industri dan rumah tangga yang menjadi pemicu terjadinya stres bagi inang
sehingga daya tahan tubuh menurun dan menjadi rentan terserang penyakit dari
berbagai parasit lintah yang menempel pada ikan kerapu (Irianto, 2017). Budidaya
ikan kerapu memiliki kendala yaitu faktor penyakit yang menyebabkan kerugian
terhadap hasil budidaya. Budidaya ikan kerapu juga bergantung pada kesehatan dan
penerapan manajemen pemantauan kualitas air yang baik. Jika dalam budidaya
tidak menerapkan manajemen kualitas air dengan baik maka ikan akan terpapar
stres dari patogen terus-menerus dan menyebabkan kematian pada ikan kerapu.
Pengaruh limbah industri juga mengakibatkan keramba jaring apung menjadi kotor,
sehingga sisa pakan yang tidak terkonsumsi oleh ikan dan hasil dari kegiatan
metabolisme ikan (feses dan urin) tidak dapat terurai yang berakibat munculnya
berbagai penyakit pada ikan, khususnya penyakit yang diakibatkan oleh parasit
(Anrosana & Gemaputri, 2017; Sofiana et al., 2023).
Salah satu kendala utama dalam budidaya yang prevalensinya masih tinggi
adalah adanya serangan penyakit parasiter yang disebabkan oleh cacing lintah
Zeylanicobdella arugamensis. Hasil observasi yang dilakukan di pertambakan
menunjukkan terdapat beberapa lokasi tambak dan karamba jaring apung yang
diperiksa, ditemukan rata-rata nilai prevalensi sebanyak 6 kali pengambilan
mencapai 11 – 90% dari total sampel yang diperiksa (50 – 225 ekor), dengan
intensitas (rata-rata jumlah Zeylanicobdella arugamensis yang ditemukan pada tiap
ekor ikan kerapu sebesar 4 – 17 individu/ekor ikan. Beberapa penelitian diantaranya
Mahardika et al. (2018), Mahardika et al. (2019), dan Mahasri et al. (2020)
Uniform Resource Locator: https://e-journal.undikma.ac.id/index.php/bioscientist 1044
 Bioscientist : Jurnal Ilmiah Biologi
E-ISSN 2654-4571; P-ISSN 2338-5006
Volume 12, Issue 1, June 2024; Page, 1043-1056
Email: [email protected]

menunjukkan prevalensi Zeylanicobdella arugamensis pada ikan kerapu cantang

mencapai 100%. Patogenisitas dari lintah ini rendah, tetapi infestasi berat dapat
menimbulkan luka pada kulit sehingga memberi peluang infeksi sekunder oleh
bakteri atau parasit lainnya. Area melekatnya Zeylanicobdella arugamensis akan
mengalami hemoragi dan pembengkakan kulit, sedangkan sirip akan menjadi
gripis. Infestasi ektoparasit pada ikan dapat menimbulkan kerugian, meskipun
kerugian yang ditimbulkan tidak sebesar kerugian akibat infeksi bakteri atau virus,
namun tingkat infestasi ektoparasit pada ikan kerapu yang tinggi dapat
mengakibatkan kematian akut, yaitu terjadinya mortalitas tanpa menunjukkan
gejala terlebih dahulu. Berbagai upaya penanggulangan sudah dilakukan baik
dengan menggunakan bahan kimia maupun direndam di dalam air tawar, salah
satunya dengan menggunakan imunostimulan untuk meningkatkan pertumbuhan
dan tingkat kelangsungan hidup, namun hasil yang dicapai belum memenuhi target,
prevalensi dan intensitas di beberapa lokasi masih menunjukkan angka tinggi
(Wang et al., 2016).
Salah satu cara yang dianggap cukup efektif untuk mengetahui infestasi
ektoparasit adalah dengan melihat profil morfologis dengan bantuan kunci
identifikasi. Diperlukan penelitian lebih lanjut untuk mengamati molekuler DNA
parasit dalam menentukan validitas dan hubungan spesies berdasarkan rekonstruksi
pohon filogenetik. Data molekuler untuk diferensiasi spesies parasit digunakan
dalam membedakan spesies tingkat kesamaan morfologis yang tinggi. Selain itu,
menggunakan urutan DNA untuk menyimpulkan hubungan kekerabatan antar
spesies parasit (Wang et al., 2016). Pendekatan molekuler sangat penting untuk
mengetahui sejarah evolusi dan dapat digunakan sebagai informasi perkembangan
biologi, fisiologi, biokimia, dan biologi molekuler sehingga dapat menambah,
mengkonfirmasi, dan mengurangi berdasarkan fitur morfologis suatu organisme
jika terdapat mutasi genetik atau pergeseran DNA melalui sekuensing DNA.
Berdasarkan permasalahan tersebut, diperlukan penelitian untuk
mempelajari homologi dan hubungan kekerabatan spesies lintah laut
Zeylanicobdella arugamensis yang menginfestasi ikan kerapu dari perairan Jawa
Timur dan Lombok serta dibandingkan dengan data yang ada pada GenBank, yang
nantinya dapat dijadikan sebagai sumber informasi dalam upaya pencegahan dan
pengendalian serangan lintah laut Zeylanicobdella arugamensis.

METODE
Tempat dan Waktu
Pengambilan sampel dilakukan di tiga wilayah di perairan Jawa Timur yaitu
Lamongan, Mandangin, Situbondo, dan satu wilayah di perairan Lombok pada
Bulan Mei 2021-Oktober 2022. Kemudian sampel dilakukan pengujian analisa
PCR dan sekuensing di Laboratorium Prof. Nidom Foundation. Peta lokasi
pengambilan sampel terdapat pada Gambar 1.

Uniform Resource Locator: https://e-journal.undikma.ac.id/index.php/bioscientist 1045

 Bioscientist : Jurnal Ilmiah Biologi
E-ISSN 2654-4571; P-ISSN 2338-5006
Volume 12, Issue 1, June 2024; Page, 1043-1056
Email: [email protected]

Gambar 1. Peta Lokasi Pengambilan Sampel.

Alat dan Bahan

Peralatan yang digunakan untuk pemeriksaan molekuler lintah laut
Zeylanicobdella arugamensis menggunakan metode PCR adalah MJ research
thermal cyeler (model-PTC-200), micro centrifuge, freezer, transilluminator,
mikropipet, tabung 15 ml, tabung 1,5 ml, ZymoBIOMICS DNA Extraction Kit (ZR
Bashingbead Lysis tube, Zymo-spin III-F Filter, collection tube, PCR tube,
electrophoresis system, Zymo-spin IICR column, Zymo-spin III-HRC Filter),
inkubator, tissue rupture, UV box, timbangan analitik, gelas ukur, pinset, pengukur
waktu, dan komputer dengan program NTSYS (Numerical Taxonomy and
Multivariate Analysis).
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan kerapu
cantang berukuran 13-20 cm yang terinfeksi lintah laut Zeylanicobdella
arugamensis yang diperoleh dari hasil tangkapan di KJA (Keramba Jaring Apung)
dan Kampung Kerapu nelayan di Lamongan, Mandangin Madura, Situbondo, dan
Lombok. Jumlah sampel di setiap lokasi yang digunakan untuk uji genetik adalah
50 ekor ikan kerapu cantang. Setelah itu lintah laut yang menginfeksi ikan kerapu
tersebut diambil.
Bahan yang digunakan untuk isolasi mtDNA antara lain primer PBS steril,
ZymoBIOMICS DNA Extraction reagen (ZymoBIOMICS Lysis Solution,
ZymoBIOMICS DNA Binding buffer, ZymoBIOMICS DNA wash buffer 1,
ZymoBIOMICS DNA wash buffer 2, ZymoBIOMICS DNase/RNase Free water,
ZymoBIOMICS HRC Prep Solution), KOD One PCR Master mix, PCR grade
water, primer COI_F, dan COI_R, agarose S, TBE.

Uniform Resource Locator: https://e-journal.undikma.ac.id/index.php/bioscientist 1046

 Bioscientist : Jurnal Ilmiah Biologi
E-ISSN 2654-4571; P-ISSN 2338-5006
Volume 12, Issue 1, June 2024; Page, 1043-1056
Email: [email protected]

Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan jenis eksplorasi observasi dengan pengambilan
sampel pada lokasi secara langsung dengan pendekatan secara molekuler.
Rancangan penelitian ini adalah cross sectional study yaitu pengukuran variabel
sampel pada waktu yang sama dalam kurun waktu yang ditentukan.
Prosedur Kerja
Sampling
Sampel ikan kerapu yang diambil merupakan sampel dari tangkapan yang
berada di beberapa daerah Jawa Timur dan Lombok. Lokasi pengambilan sampel
berada di 4 lokasi yaitu Mandangin Madura, Situbondo, Lamongan, dan Lombok.
Jumlah masing-masing lokasi adalah 50 ekor ikan kerapu. Lintah laut
Zeylanicobdella arugamensis yang telah diambil dari sampel ikan kerapu
dimasukkan dalam tabung 15 ml dan ditambahkan PBS steril. Lintah laut tersebut
digerus menggunakan tissue rupture hingga tergerus dengan baik. Sampel
disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipindahkan
dalam tabung 1,5 ml untuk dilakukan ekstraksi DNA.
Ekstraksi DNA, Amplifikasi mtDNA, Elektroforesis, dan Visualisasi PCR
Tahap ekstraksi DNA menggunakan prosedur ekstraksi ZymoBIOMICS
DNA solution (Ariyanti & Sianturi, 2019). Sebanyak 250 µL sampel lintah laut
Zeylanicobdella arugamensis dimasukkan dalam ZR Bashingbead Lysis tube dan
ditambahkan 750 μL ZymoBIOMICS Lysis Solution. Sampel diletakkan dalam
bead beater dan dijalankan dengan kecepatan maksimal selama 5 menit. ZR
Bashingbead Lysis tube disentrifus dengan kecepatan 10000 g selama 1 menit.
Supernatan sebanyak 400 μL dipindahkan ke dalam Zymo-spin III-F Filter yg telah
diberi collection tube dan disentrifus selama 8000 g selama 1 menit. Filtrat dalam
collection tube ditambahkan 1200 μl ZymoBIOMICS DNA Binding buffer.
Sebanyak 800 μL campuran tersebut dipindahkan dalam Zymo-spin IICR column
yang telah diberi collection tube dan sentrifus 10000 g selama 1 menit. Filtrat dalam
collection tube dibuang dan ditambahkan 800 μL campuran ZymoBIOMICS DNA
Binding buffer dan supernatan. Sebanyak 400 μl ZymoBIOMICS DNA wash buffer
1 ditambahkan dalam Zymo-spin IICR column dan disentrifus 10000 g selama 1
menit. Sebanyak 700 μl ZymoBIOMICS DNA wash buffer 2 ditambahkan dalam
Zymo-spin IICR column dan disentrifus 10000 g selama 1 menit. Sebanyak 200 μl
ZymoBIOMICS DNA wash buffer 2 ditambahkan dalam Zymo-spin IICR column
dan disentrifus 10000g selama 1 menit. Zymo-spin IICR column dipindahkan ke
tabung 1,5 ml lalu ditambahkan 100 μl (min 50 μl) ZymoBIOMICS DNase/RNase
Free water, diinkubasi selama 1 menit dan disentrifus 10000 g selama 1 menit.
Zymo-spin III-HRC Filter beserta collection tube disiapkan dan ditambahkan 600
μl ZymoBIOMICS HRC Prep Solution, selanjutnya disentrifus dengan kecepatan
8000 g selama 3 menit. DNA yang telah terelusi pada tahap 11 dipindahkan ke
dalam Zymo-spin III-HRC Filter dengan tabung 1,5 ml yang baru dan sentrifus
dengan kecepatan 16000 g selama 3 menit. DNA sampel dilanjutkan untuk proses
PCR.
DNA Mitokondria diamplifikasikan menggunakan primer COI-F dan COI-
R. Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR)
dengan komposisi KOD one PCR master mix 25 µL, primer FP 1,5 µL, primer RP
Uniform Resource Locator: https://e-journal.undikma.ac.id/index.php/bioscientist 1047
 Bioscientist : Jurnal Ilmiah Biologi
E-ISSN 2654-4571; P-ISSN 2338-5006
Volume 12, Issue 1, June 2024; Page, 1043-1056
Email: [email protected]

1,5 µL, PCR grade water 12 µL, dan template DNA 10 µL. Amplifikasi dilakukan
dengan program initial pada suhu 94°C selama 5 menit, denaturasi pada suhu 94°C
selama 30 detik, annealing pada suhu 46°C selama 45 detik, ekstensi pada suhu
72°C selama 1 menit, dan final extension pada suhu 72°C selama 5 menit.
Elektroforesis hasil PCR dan hasil pemotongan DNA dilakukan dalam gel
agarose 0,8% dengan dengan 1 X buffer TBE (89 mM tris, 89 mM boric acid, 2
mM EDTA) dan ditambahkan 0,5 μg/ml ethidium bromide. Running pada 100V
selama 30 menit dan dilakukan visualisasi dilakukan menggunakan UV
transiluminator (Bio-rad).
Pengumpulan Data Sekuens Molekuler
Data yang diambil adalah data molekuler dalam bentuk sekuens DNA dari
lintah laut Zeylanicobdella arugamensis untuk melihat urutan basa DNA,
homologi, dan hubungan kekerabatan di beberapa perairan Jawa Timur dan
Lombok.
Sisa 50 µL masing-masing dari amplifikasi PCR dimurnikan menggunakan
kit pemurnian DNA (Qiagen) dan dilakukan sekuensing DNA gen COI dari empat
lokasi yang berbeda yaitu Mandangin, Lamongan, Situbondo, dan Lombok di
Laboratorium Prof. Nidom Foundation menggunakan mesin ABI 3130 Genetic
Analyzer dengan primer yang sama pada saat amplifikasi PCR.
Dilakukan survei untuk mengidentifikasi urutan gen COI mtDNA dari
spesies Zeylanicobdella arugamensis yang terdapat di NCBI GenBank sebanyak 10
spesies yang dikumpulkan dalam penelitian ini untuk analisis pohon filogenetik.
Analisis Filogenetik Menggunakan Metode Neighbor-joining
Hubungan kekerabatan lintah laut Zeylanicobdella arugamensis dibangun
menggunakan metode Neighbor-joining (NJ), berbasis pada urutan mtDNA gen
COI. Metode Neighbor- joining (NJ) merupakan model dan parameter paling cocok
yang dipilih oleh Modeltest 3.7. Prosedur bootstrap (untuk analisis Neighbor-
joining (NJ) dilakukan untuk menilai kekokohan hubungan yang disimpulkan untuk
lintah laut Zeylanicobdella arugamensis.
Pohon-pohon hubungan yang dihasilkan untuk lintah laut Zeylanicobdella
arugamensis digunakan untuk menguji apakah hubungan lintah laut
Zeylanicobdella arugamensis dari beberapa perairan di berbagai daerah di Jawa
Timur dan Lombok memiliki kekerabatan yang dekat. Semua pohon hubungan
ditampilkan dan diedit menggunakan Genetyx.
Data molekuler dari monogenea yang diperoleh dalam penelitian ini dan
GenBank, kemudian dianalisis menggunakan Software Genetyx di Laptop (PC).
Karena banyaknya data molekuler di mana total dari 10 spesies parasit yang
memiliki gen COI dianalisis.
Analisis Data
Data dari hasil penelitian disajikan dalam bentuk gambar berupa hasil
elektroforesis PCR, kemudian dilakukan analisis sekuensing, dan disejajarkan
dengan gen pembanding dari GenBank. Setelah itu dilakukan analisis data
homologi dalam program Basic Local Aligment Search Tool (BLAST) dan
dilakukan pembuatan pohon filogenetik dan dijelaskan secara deskriptif.

Uniform Resource Locator: https://e-journal.undikma.ac.id/index.php/bioscientist 1048

 Bioscientist : Jurnal Ilmiah Biologi
E-ISSN 2654-4571; P-ISSN 2338-5006
Volume 12, Issue 1, June 2024; Page, 1043-1056
Email: [email protected]

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pengambilan Sampel
Sampel ikan kerapu cantang diambil sebanyak 50 ekor dari empat lokasi
yang berbeda, yaitu dari Brondong Lamongan, Mandangin Madura, Situbondo, dan
Lombok. Hasil pemeriksaan menunjukkan dari 50 ekor yang diambil, 30 ekor
diantaranya terinfestasi parasit lintah laut Zeylanicobdella arugamensis yang
menempel pada bagian sirip (punggung, belakang, dan perut), ekor, operculum
insang, rongga mulut, dan perut bagian bawah. Berikut Gambar 2 yang
menunjukkan ikan kerapu cantang yang terinfestasi parasit lintah laut
Zeylanicobdella arugamensis.

Gambar 2. Ikan Kerapu Cantang yang Terinfestasi Zeylanicobdella arugamensis. a) Bagian

Perut; b) Ekor; c) Sirip; dan d) Operculum Insang.

Ekstraksi dan Amplifikasi mtDNA dengan PCR

Lintah laut Zeylanicobdella arugamensis yang menginfestasi ikan kerapu
cantang kemudian diambil dan dimasukkan ke dalam tabung yang berisi PBS Steril
lalu disimpan dalam freezer untuk selanjutnya diekstraksi dan diproses PCR. Hasil
dari elektroforesis produk PCR lintah laut Zeylanicobdella arugamensis yang
teramplifikasi menggunakan primer COI-F dan COI-R dengan target mtDNA
menunjukkan band tunggal pada 750bp untuk lintah laut Zeylanicobdella
arugamensis dari Lamongan, Situbondo, Mandangin, dan Lombok. Berikut
Gambar 3 menunjukkan hasil elektroforesis produk PCR dengan gel agarose 0,8%.

Uniform Resource Locator: https://e-journal.undikma.ac.id/index.php/bioscientist 1049

 Bioscientist : Jurnal Ilmiah Biologi
E-ISSN 2654-4571; P-ISSN 2338-5006
Volume 12, Issue 1, June 2024; Page, 1043-1056
Email: [email protected]

Gambar 3. Hasil Elektroforesis Produk PCR dengan Gel Agarose 0,8%. Gen mtDNA
Ditunjukkan dengan Adanya Pita Tunggal 750 bp. M = Marker 1 kb. a) Mandangin;
b) Lombok; c) Situbondo; dan d) Lamongan.

Sekuens mtDNA Zeylanicobdella arugamensis

Sekuens mtDNA lintah laut Zeylanicobdella arugamensis diketahui setelah
proses sekuensing. Sekuens mtDNA COI diterjemahkan dengan bantuan mesin
sekuensing dan software sequence scanner. Penyatuan kedua sekuen/urutan
nukleotida dari kedua sekuen forward dan reverse. Sekuen/urutan nukleotida asal
perairan Mandangin ditampilkan pada Gambar 4, asal perairan Lombok pada
Gambar 5, asal perairan Situbondo pada Gambar 6, dan asal perairan Lamongan
pada Gambar 7.

1) Sampel Zeylanicobdella arugamensis Asal Mandangin.

Gambar 4. Sekuen Lengkap Gen COI Zeylanicobdella arugamensis Asal Mandangin.

2) Sampel Zeylanicobdella arugamensis Asal Lombok.

Gambar 5. Sekuen Lengkap Gen COI Zeylanicobdella arugamensis Asal Lombok.

3) Sampel Zeylanicobdella arugamensis Asal Situbondo.

Gambar 6. Sekuen Lengkap Gen COI Zeylanicobdella arugamensis Asal Situbondo.

Uniform Resource Locator: https://e-journal.undikma.ac.id/index.php/bioscientist 1050
 Bioscientist : Jurnal Ilmiah Biologi
E-ISSN 2654-4571; P-ISSN 2338-5006
Volume 12, Issue 1, June 2024; Page, 1043-1056
Email: [email protected]

4) Sampel Zeylanicobdella arugamensis Asal Lamongan.

Gambar 7. Sekuen Lengkap Gen COI Zeylanicobdella arugamensis Asal Lamongan.

Analisis Homologi Sekuen Nukleotida Zeylanicobdella arugamensis

Analisis homologi sekuen nukleotida dilakukan dengan cara memasukkan
data sekuen nukleotida lintah laut Zeylanicobdella arugamensis dari perairan
Lamongan, Situbondo, Mandangin, dan Lombok dengan sekuen yang berasal dari
data Genbank, kemudian dilakukan BLAST di NCBI secara online. Tingkat
homologi dari keempat sampel menunjukkan nilai sebesar 88% - 98% (Tabel 1).
Sekuen yang diperoleh kemudian dilakukan multiple aligment dengan sekuen lintah
laut Zeylanicobdella arugamensis dari antar sampel dan dari data Genbank. Hasil
multiple aligment menunjukkan data urutan keberapa sekuen antar isolat tetap dan
berbeda ditunjukkan adanya huruf basa DNA yang timbul. Berikut tabel homologi
antar sampel dan data dari Genbank yang ditunjukkan pada Tabel 1.

Tabel 1. Nilai Homologi Sekuen Nukleotida Zeylanicobdella arugamensis dan Gen Reference
dari Genbank.

Uniform Resource Locator: https://e-journal.undikma.ac.id/index.php/bioscientist 1051

 Bioscientist : Jurnal Ilmiah Biologi
E-ISSN 2654-4571; P-ISSN 2338-5006
Volume 12, Issue 1, June 2024; Page, 1043-1056
Email: [email protected]

Analisis Phylogenetic Tree Zeylanicobdella arugamensis

Identifikasi berdasarkan Phylogenetic tree dengan metode Neighbor
Joining dari sekuen nukleotida lintah laut Zeylanicobdella arugamensis dengan 10
data dari berbagai spesies Zeylanicobdella arugamensis pembanding di Genbank,
maka diperoleh kekerabatan yang dekat antara Zeylanicobdella arugamensis dari
Lamongan, Situbondo, Mandangin, dan Lombok. Sampel yang memiliki
kekerabatan paling dekat yaitu sampel dari wilayah perairan Lamongan dan
Situbondo, sedangkan sampel yang memiliki hubungan kekerabatan yang cukup
jauh yaitu sampel dari wilayah Mandangin dan Lombok yang ditunjukkan dari
Gambar 8.

Gambar 8. Phylogenetic Tree dari Antar Sampel Zeylanicobdella arugamensis dan Gen
Reference.

Pembahasan
Penelitian ini dilakukan pada lintah laut Zeylanicobdella arugamensis yang
menginfeksi ikan kerapu cantang dari berbagai perairan yaitu Brondong Lamongan,
Situbondo, Mandangin Madura, dan Lombok. Pada penelitian ini menggunakan 50
ekor ikan kerapu cantang dan diantaranya ada 30 ekor ikan kerapu cantang yang
terinfeksi parasit lintah laut Zeylanicobdella arugamensis tersebut dengan nilai
prevalensi sebesar 85-100%. Dari hasil pengamatan terlihat insang dan kulit yang
terinfestasi Zeylanicobdella arugamensis berada pada area perlekatan sehingga
terjadi pembengkakan, lesi/luka, berwarna pucat, hemoragi, dan inflamasi
kemudian berpotensi terjadi infeksi sekunder oleh bakteri atau jamur pada area
bekas perlekatannya (Mahasri et al., 2019).
Ciri morfologi Zeylanicobdella arugamensis yang ditemukan di ikan kerapu
cantang berwarna cokelat gelap yang pucat, hitam (dewasa), berbentuk panjang
silindris dan menyempit pada kedua ujungnya. Pemeriksaan mikroskopis
menunjukkan bahwa ukuran sucker caudal lebih besar daripada oral. Ukuran
diameter oral sucker (oval) mencapai 1,0 mm dengan diameter caudal sucker lebih
lebar dibanding oral sucker yaitu berkisar 1,8 mm (Mahardika et al., 2020).
Zeylanicobdella arugamensis mempunyai 2 sucker yang terletak di bagian
oral dan caudal yang digunakan untuk menempel ikan kerapu cantang kemudian
menginjeksikan histamine ke pembuluh darah sehingga aliran darah pada area
Uniform Resource Locator: https://e-journal.undikma.ac.id/index.php/bioscientist 1052
 Bioscientist : Jurnal Ilmiah Biologi
E-ISSN 2654-4571; P-ISSN 2338-5006
Volume 12, Issue 1, June 2024; Page, 1043-1056
Email: [email protected]

perlekatan meningkat (Mahardika et al., 2018). Probocyst Zeylanicobdella

arugamensis akan menghisap nutrisi dan menggunakan rahang untuk mendapatkan
akses darah. Pembekuan darah pada area perlekatan dapat dihambat dengan
menginjeksikan air liur sehingga enzim pembekuan darah inang (thrombin) dapat
terhambat. Perubahan histopatologis kulit ikan kerapu cantang terinfestasi
Zeylanicobdella arugamensis dengan derajat infestasi yang berbeda yaitu inflamasi,
hemoragi, dan kongestipada. Ikan yang terinfeksi biasanya dalam keadaan stres
karena beberapa faktor dan menunjukkan warna kulit yang gelap dengan hemoragik
ireguler yang luas pada permukaan tubuh dan pangkal sirip.
Hasil PCR pada penelitian ini menunjukkan bahwa adanya band tunggal
gen mtDNA COI hasil amplifikasi menggunakan primer COI-F dan COI-R pada
fragmen 750 bp pada Zeylanicobdella arugamensis yang berasal dari sampel dari
perairan di Lamongan, Lombok, Mandangin, dan Madura. Adanya kesamaan band
tunggal ini menunjukkan bahwa sampel yang diperoleh merupakan satu spesies dan
tidak ada perbedaan meskipun berasal dari lokasi yang berbeda.
Sampel yang positif pada metode PCR dilakukan identifikasi dengan
menggunakan metode sekuensing. Hasil sekuensing DNA di BLAST pada situs
NCBI, kemudian dilakukan analisis homologi terhadap gen reference yang didapat
dari GenBank COI Zeylanicobdella arugamensis. Hasil analisis homologi sekuen
nukleotida dari gen COI Zeylanicobdella arugamensis berkisar antara 88,51%-
98,28% (Tabel 1). Hasil homologi antara sampel dari Situbondo dan Lamongan
menunjukkan angka paling tinggi yaitu sebesar 98,28%, lalu sampel yang berasal
dari GenBank FM208111.1 dan sampel dari Lamongan sebesar 97,41%, kemudian
sampel yang berasal dari GenBank KY441717.1 dan sampel dari Mandangin
sebesar 95,91%, sedangkan hasil paling rendah antara sampel dari Mandangin dan
Situbondo yaitu sebesar 88,51%. Hal ini menunjukkan bahwa letak ekologis juga
mempengaruhi perbedaan persentase sekuen nukleotida dan asam amino dari lokasi
yang berbeda dapat mempunyai homologi yang tinggi atau yang rendah. Jika letak
ekologis masih berada di wilayah perairan yang sama seperti Situbondo dan
Lamongan yang berada di perairan pantai utara dan jaraknya berdekatan maka nilai
analisis homologinya memiliki persentase yang tinggi, sedangkan sampel yang
memiliki nilai homologis yang rendah seperti Mandangin dan Situbondo juga
dikarenakan letak ekologis yang relatif jauh karena berada di perairan yang berbeda.
Tingkat homologi antar sampel dapat dikatakan homolog apabila nilai persentase
homologi lebih dari 60% (Chuda et al., 2018).
Homologi yang tinggi dapat dijadikan sebagai referensi dasar untuk
digunakan kandidat vaksin dan kit diagnostik. Perbedaan 1% pada tingkat homologi
ini dikarenakan adanya perubahan gen disebabkan oleh adanya mutasi, delesi, dan
insersi (Tindi et al., 2017). Mutasi adalah perubahan urutan genetik dan penyebab
utama keragaman di antara organisme. Mutasi terkecil adalah mutasi titik, jika
hanya sepasang basa tunggal yang diubah menjadi pasangan basa lainnya. Mutasi
juga bisa berupa insersi atau delesi. Insersi adalah mutasi dimana satu atau beberapa
basa nitrogen yang ditambahkan ke urutan DNA, sedangkan delesi adalah mutasi
dimana satu atau beberapa basa terhapus pada urutan DNA (Low, 2014).
Sekuen yang memiliki hubungan kekerabatan yang dekat dicirikan dengan
nilai Max Score dan Total Score sama, Query Coverage mendekati 100%, E-value
Uniform Resource Locator: https://e-journal.undikma.ac.id/index.php/bioscientist 1053
 Bioscientist : Jurnal Ilmiah Biologi
E-ISSN 2654-4571; P-ISSN 2338-5006
Volume 12, Issue 1, June 2024; Page, 1043-1056
Email: [email protected]

mendekati 0, dan Max Ident mendekati 100%. Query Coverage adalah menilai
dalam persen sekuen dalam database menutupi query, sehingga memastikan
apakah sampel tertutup semuanya oleh sekuen. Nilai persentase yang dapat diterima
minimal 95%, kecuali untuk sekuen yang bacaannya jika lebih rendah minimal
75%. Nilai E-Value bernilai 0 (nol) menunjukkan bahwa kedua sekuen tersebut
identik. Nilai E-Value semakin mendekati nol, hasilnya akan lebih terpercaya dan
bila nilainya 1, maka tidak boleh digunakan. Max Ident merupakan sejauh mana
kedua sekuen (nukleotida atau asam amino) mempunyai residu yang sama pada
posisi yang sama dalam sebuah penyejajaran, sering dinyatakan sebagai persentase.
Hasil dari proses ini diperoleh dengan nilai max score 1186, total score 1186, query
coverage 98%, E-value 0,0. Query coverage tinggi dan E-value rendah tidak
menutup kemungkinan bahwa spesimen penelitian merupakan Benedenia
epinepheli tetapi juga tidak boleh mengesampingkan nilai identity. Hal ini sesuai
dengan Low (2014) bahwa individu dari spesies yang sama akan memiliki urutan
basa DNA sama, yaitu nilai identitas kesamaan paling sedikit sebesar 98% serta
didukung Tindi et al. (2017) bahwa spesies dapat diidentifikasi melalui barcoding
gap antara jarak intraspesifik dan interspesifik menggunakan nilai threshold antara
2-3%. Apabila nilai beda maksimal 3%, maka nilai identity hasil penyejajaran
sebesar 97%. Apabila dihubungkan dengan hal seperti di atas dengan nilai identity
sebesar 96%, maka nilai bedanya sebesar 1% yang berarti melewati nilai threshold.
Dari hasil data tersebut maka hal ini menunjukkan bahwa kesamaan identitas
Zeylanicobdella arugamensis asal perairan Lamongan dengan Situbondo hampir
sama. Kemungkinan hal ini dikarenakan adanya kesamaan benih dari kedua daerah
tersebut karena letak geografis yang berdekatan.
Berdasarkan hasil analisis phylogenetic tree menunjukkan Zeylanicobdella
arugamensis asal perairan Lamongan dengan Situbondo memiliki tingkat
kekerabatan yang dekat karena jarak genetiknya sebesar 0,009272. Kedua sampel
tersebut juga memiliki tingkat kekerabatan dengan gen reference FM208109.1
dengan jarak genetik sebesar 0,004992. Sampel dari Mandangin juga memiliki
jarak genetik yang dekat dengan gen reference KY441720.1 sebesar 0,000427.
Hasil yang didapatkan serupa dengan penelitian dari Agustiya et al. (2023) yang
menyampaikan bahwa identifikasi lintah laut Zeylanicobdella arugamensis yang
berasal dari Lamongan dan Mandangin memiliki morfometrik yang sama. Untuk
menganalisis phylogenetic tree digunakan prosedur bootstrap (analisis Neighbor-
Joining (NJ)) yang dilakukan untuk menilai kekokohan hubungan yang
disimpulkan pada lintah laut Zeylanicobdella arugamensis. Pohon-pohon hubungan
tersebut dihasilkan dan bisa terlihat lintah laut Zeylanicobdella arugamensis
memiliki hubungan kekerabatan dekat dengan sampel atau gen reference.
Berdasarkan data studi genetik, Zeylanicobdella arugamensis tersebar pada
daerah temperatur hangat dan perairan tropis. Zeylanicobdella arugamensis
termasuk dalam golongan ektoparasit yang sering menginfestasi ikan kerapu
cantang dan berpotensi menyebabkan kematian pada ikan. Zeylanicobdella
arugamensis dapat menyebabkan kematian, kehilangan berat badan, menurunkan
fekunditas ikan, dan mempengaruhi tingkat penetasan telur karena energi
metabolisme yang seharusnya digunakan untuk pertumbuhan dan reproduksi
menjadi digunakan untuk proses pertahanan dalam tubuhnya serta menimbulkan
Uniform Resource Locator: https://e-journal.undikma.ac.id/index.php/bioscientist 1054
 Bioscientist : Jurnal Ilmiah Biologi
E-ISSN 2654-4571; P-ISSN 2338-5006
Volume 12, Issue 1, June 2024; Page, 1043-1056
Email: [email protected]

kerugian akibat infestasi Zeylanicobdella arugamensis. Kerugian nonlethal lain

dapat berupa kerusakan kulit, serta pertumbuhan lambat sehingga menurunkan nilai
jual (Mahardika et al., 2018).
Dari hasil pengamatan hingga tingkat molekuler menggunakan gen COI
tersebut dapat digunakan sebagai informasi data karakterisasi molekuler parasit
lintah laut Zeylanicobdella arugamensis di Perairan Jawa Timur dan Lombok, serta
dapat digunakan sebagai kajian pustaka awal untuk menanggulangi dampak dari
infestasi parasit Zeylanicobdella arugamensis pada ikan kerapu cantang hingga
dapat dijadikan bahan imunostimulan yang bisa memperbaiki budidaya ikan kerapu
di Indonesia (Mahasri et al., 2019) dan (Mahasri et al., 2020).

SIMPULAN
Urutan basa DNA berdasarkan gen COI pada lintah laut Zeylanicobdella
arugamensis yang menginfeksi ikan kerapu dari perairan Jawa Timur dan Lombok
adalah sebesar 750 bp. Hubungan kekerabatan diantara lintah laut Zeylanicobdella
arugamensis yang menginfeksi ikan kerapu dari perairan Jawa Timur dan Lombok
yang paling dekat adalah antara perairan Lamongan dan Situbondo dengan nilai
homologi sebesar 98,28%, dan hubungan kekerabatan yang paling jauh adalah
antara perairan Situbondo dan Mandangin dengan nilai homologi sebesar 88,51%.

SARAN
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan dapat disarankan agar
dilakukan penelitian lanjutan mengenai purifikasi, ekspresi, dan antigenitas serta
kemampuannya dalam menginduksi titer antibodi sebagai kandidat
immunostimulan serta karakterisasi molekuler menggunakan primer cyt-b.

DAFTAR RUJUKAN
Agustiya, R., Mahasri, G., & Subekti, S. (2023). Identifikasi Morfometrik dan
Intensitas Lintah Laut Zeylanicobdella yang Menginfestasi Ikan Kerapu
Cantang Asal Kecamatan Brondong, Lamongan dan Pulau Mandangin,
Madura. Journal of Marine and Coastal Science, 12(1), 34-42.
https://doi.org/10.20473/jmcs.v12i1.38273
Anrosana, I. A., & Gemaputri, A. A. (2017). Kajian Daya Dukung (Carrying
Capacity) Lingkungan Perairan Pantai Pasir Putih Situbondo bagi
Pengembangan Usaha Keramba Jaring Apung. Jurnal Ilmiah Inovasi, 17(2),
73-79. https://doi.org/10.25047/jii.v17i2
Ariyanti, Y., & Sianturi, S. (2019). Ekstraksi DNA Total dari Sumber Jaringan
Hewan (Ikan Kerapu) Menggunakan Metode Kit for Animal Tissue. Journal
of Science and Applicative Technology, 3(1), 40-45.
https://doi.org/10.35472/jsat.v3i1.111
Chuda, H., Ieda, K., Shirakashi, S., & Masuma, S. (2018). Differences in
Susceptibility to the Skin Fluke Benedenia epinepheli between Epinephelus
bruneus, E. septemfasciatus, and a New Hybrid Grouper Kue-Tama, E.
bruneus × E. lanceolatus. Aquaculture, 308(3), 120-125.
https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2018.03.027
Irianto, K. (2017). Biologi Molekuler. Bandung. CV. Alfabeta.
Uniform Resource Locator: https://e-journal.undikma.ac.id/index.php/bioscientist 1055
 Bioscientist : Jurnal Ilmiah Biologi
E-ISSN 2654-4571; P-ISSN 2338-5006
Volume 12, Issue 1, June 2024; Page, 1043-1056
Email: [email protected]

Low, V. L. (2014). Mitochondrial DNA Markers Reveal High Genetic Diversity

but Low Genetic Differentiation in the Black Fly Simulium Tani Takaoka &
Davies along an Elevational Gradient in Malaysia. PLoS One, 18(6), 10-15.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0100512
Mahardika, K., Mastutia, I., & Zafrana, Z. (2018). Respon Lintah Laut
(Zeylanicobdella arugamensis) terhadap Salinitas Berbeda secara
Laboratorium. Journal of Fisheries and Marine Research, 2(3), 208-214.
https://doi.org/10.21776/ub.jfmr.2018.002.03.9
______. (2020). Sintasan dan Perkembangan Cocoon Lintah Laut (Zeylanicobdella
arugamensis) pada Suhu yang Berbeda. Journal of Fisheries and Research,
4(1), 102-108. https://doi.org/10.21776/ub.jfmr.2020.004.01.15
Mahasri, G., Hafidloh, U., Pratama, F. P., Rahmawan, D., Subekti, S., Wulansari,
P. D., & Amin, M. (2020). Prevalence, Intensity and Histopathology of
Zeylanicobdella arugamensis Infestation on Groupers Reared on Different
Aquaculture Systems. Journal of Fish Diseases, 43(1), 1-11.
https://doi.org/10.1111/jfd.13219
Mahasri, G., Wulansari, P. D., & Imani, I. H. (2019). Intensitas Ektoparasit Ikan
Kerapu Tikus Cromnileptes activelis pada Keramba Jaring Apung di
Perairan Situbondo Jawa Timur. Jurnal Kelautan Tropis, 22(2), 135-140.
https://doi.org/10.14710/jkt.v22i2.5295
Sofiana, L., Nofisulastri, N., & Safnowandi, S. (2023). Pola Distribusi Siput Air
(Gastropoda) sebagai Bioindikator Pencemaran Air di Sungai Unus Kota
Mataram dalam Upaya Pengembangan Modul Ekologi. Biocaster : Jurnal
Kajian Biologi, 3(3), 133-158. https://doi.org/10.36312/biocaster.v3i3.191
Tindi, M., Gustaf, N., Mamangkey, F., & Wullur, W. (2017). DNA Barcode dan
Analisis Filogenetik Molekuler Beberapa Jenis Bivalvia Asal Perairan
Sulawesi Utara Berdasarkan Gen COI. Jurnal Pesisir dan Laut Tropis, 1(2),
32-38. https://doi.org/10.35800/jplt.5.2.2017.15050
Wang, Y., Huang, M., Wang, R., & Lanyu, F. (2016). Complete Mitochondrial
Genome of the Fish Leech Zeylanicobdella arugamensis. Mitochondrial
Part B, 3(2), 659-660. https://doi.org/10.1080/23802359.2017.1372699

Uniform Resource Locator: https://e-journal.undikma.ac.id/index.php/bioscientist 1056