72

Journal of Aquaculture Management and Technology

Volume 2, Nomor 4, Tahun 2013, Halaman 72-83
Online di : http://ejournal-s1.undip.ac.id/index.php/jfpik

PENGARUH EKSTRAK DAUN SIRSAK (Annona muricata) TERHADAP PROFIL

DARAH DAN KELULUSHIDUPAN IKAN MAS (Cyprinus carpio) YANG DIINFEKSI
BAKTERI Aeromonas hydrophila

R. Dewi Dharina Nurjannah1), Slamet Budi Prayitno1)*, Sarjito1), Angela M. Lusiastuti2)

1)
Program Studi Budidaya Perairan, Jurusan Perikanan
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro
Jl. Prof Soedarto Tembalang - Semarang
2)
Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Air Tawar, Bogor
Jl. Sempur No. 1, Bogor, Jawa Barat

ABSTRAK

Ikan mas merupakan jenis ikan konsumsi air tawar yang mudah dibudidayakan. Salah satu kendala dalam
budidaya ikan mas adalah serangan penyakit yang akhirnya menyebabkan kematian ikan dalam jumlah banyak.
Penyakit yang umumnya menyerang ikan mas adalah Motile Aeromonas Septicemia (MAS) yang disebabkan
oleh bakteri Aeromonas hydrophila. Daun sirsak merupakan salah satu herbal yang dapat digunakan sebagai
bahan alternatif untuk pengobatan penyakit ikan karena kandungan bahan kimianya yang berfungsi sebagai
antibakteri. Tujuan dari penelitian ini adalah mengetahui pengaruh dan dosis terbaik penggunaan ekstrak daun
sirsak dalam pakan terhadap profil darah dan kelulushidupan ikan mas yang diinfeksi A. hydrophila. Perlakuan
dalam penelitian berupa penambahan ekstrak daun sirsak pada pakan ikan dengan 4 dosis berbeda dan 3 kali
ulangan yaitu perlakuan A (0 g/kg pakan), perlakuan B (5 g/kg pakan), perlakuan C (10 g/kg pakan) dan
perlakuan D (15 g/kg pakan). Hasil penelitian menunjukkan bahwa penambahan ekstrak daun sirsak dalam
pakan pada perlakuan B (5g/kg pakan) berpengaruh nyata (P<0,05) terhadap total leukosit (5.62×103 sel/mm3),
namun tidak berpengaruh nyata (P>0,05) terhadap, total eritrosit (0,83×106 sel/mm3), aktivitas fagositosis
(37%), diferensial leukosit meliputi persentase sel monosit (7,67%), neutrofil (8,67%), limfosit (83.67%), dan
kelulushidupan (50%). Kesimpulan yang diperoleh adalah dosis 5 g/kg merupakan dosis terbaik penggunaan
ekstrak daun sirsak dalam pakan yang mampu memberi pengaruh terhadap total leeukosit ikan mas yang
diinfeksi A. hydrophila.

Kata kunci: Daun sirsak, Profil darah, Cyprinus carpio.

ABSTRACT

Carp is a freshwater species that is easily cultivated. One of the constraints in cultivating carps (C.
carpio) is diseases that ultimately caused mass mortality. The disease that generally affects carp is Motile
Aeromonas Septicemia (MAS) caused by Aeromonas hydrophila. Soursop leaves is one of the herbs that can be
used as an ingredient to control fish diseases because it contains chemicals that acts bacteriocide. The purpose
of this research was to determine the influence and the best dose of soursop leaf extract in feed to the blood
profile and survival of carp infected by A. hydrophila. The treatments of this research were addition of soursop
leaf extract on feed with 4 different dosages and 3 replicates. The treatments were A (0 g/kg diet), B (5 g/kg
diet), C (10 g/kg diet) and D (15 g/kg diet). The result showed that soursop leaf extract in feed of treatment B (5
g/kg diet) significantly different (P<0,005) on total leukocytes (5.62×103 sel/mm3), but had no significant effect
(P>0.05) on total erythrocyte (0.83×106 cells/mm3), differential leukocyte include the percentage of monocytes
(7.67%), neutrophils (8.67%), lymphocytes (83.67%), phagocytic activity (37%) and survival rate (50%). It can
be conclude that soursop leaf extract at dosage 5g/kg was able to stimulate immune response of carp, it was
characterized by an increased total leukocytes of carp infected by A. hydrophila.

Keywords: soursop leaf, blood profile, Cyprinus carpio

*corresponding author (Email: [email protected])

 73
Journal of Aquaculture Management and Technology
Volume 2, Nomor 4, Tahun 2013, Halaman 72-83
Online di : http://ejournal-s1.undip.ac.id/index.php/jfpik

PENDAHULUAN karena mampu mengganggu dinding sel bakteri

Ikan mas merupakan jenis ikan konsumsi air sehingga koloni bakteri terdisintegrasi dan
tawar yang memilki harga jual cukup tinggi dan pertumbuhannya terhambat. Takahashi et al. (2006),
mudah dibudidayakan. Hal ini menyebabkan ikan menambahkan bahwa ekstrak etanol daun sirsak
mas mendapat perhatian dan diminati oleh para mengandung senyawa flavonoid yang bekerja
pengusaha untuk membudidayakannya. Akibatnya sebagai antibakteri dan mampu mengatasi infeksi
budidaya ikan mas mengalami perkembangan yang bakteri.
pesat. Sistem budidaya yang tidak terkendali Penelitian mengenai penggunaan tumbuhan obat
mengakibatkan kondisi lingkungan yang tidak stabil dalam budidaya ikan sudah banyak dilakukan,
sehingga menimbulkan penyakit. Salah satu kendala namun informasi untuk penggunaan daun sirsak
dalam budidaya ikan mas adalah serangan penyakit sebagai imunostimulan pada ikan masih sedikit. Hal
yang menyebabkan kematian masal. Penyakit yang tersebut menjadi latar belakang dilakukan penelitian
menyerang ikan mas adalah Motile Aeromonas ini. Tujuan penelitian ini adalah mengetahui dosis
Septicemia (MAS) yang disebabkan oleh bakteri terbaik penggunaan ekstrak daun sirsak terhadap
Aeromonas hydrophila. Tambunan et al. (2011), kelulushidupan dan mengetahui profil darah
mengemukakan bahwa infestasi Aeromonas meliputi total eritrosit, total leukosit, diferensial
menyebabkan 80% kematian ikan budidaya pada leukosit dan aktivitas fagositosis ikan mas yang
berbagai stadia. Ciri-ciri serangan penyakit ini diinfeksi bakteri A. hydrophila.
adalah adanya bercak merah pada kulit, insang dan Kegiatan penelitian ini dilaksanakan pada bulan
organ bagian dalam. Desember 2012 ± Februari 2013. Tempat
Menurut Tambunan et al. (2011), penyakit yang pelaksananaan di Balai Penelitian dan
disebabkan Aeromonas umumnya bila tidak diobati, Pengembangan Budidaya Air Tawar (BPPBAT),
dapat menyebabkan penyebaran yang sangat luas Bogor, Jawa Barat.
dan menyebabkan kematian ikan secara masal.
Usaha penanggulangan penyakit yang biasanya METODOLOGI PENELITIAN
dilakukan oleh petani maupun pengusaha ikan Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini
adalah penggunaan berbagai bahan kimia dan adalah ikan mas dengan ukuran 8 ± 10 cm. Jumlah
antibiotik. Penggunaan antibiotik secara terus ikan yang digunakan sebanyak 120 ekor, dan dibagi
menerus dengan dosis atau konsentrasi yang kurang menjadi empat perlakuan dengan masing-masing
tepat, akan menimbulkan masalah baru, seperti tiga kali ulangan. Penelitian ini menggunakan
meningkatnya resistensi mikroorganisme patogen, metode eksperimental dengan Rancangan Acak
pencemaran lingkungan, bahkan berdampak pada Lengkap (RAL), terdiri dari empat perlakuan dan
manusia yang mengonsumsinya. Berkaitan dengan tiga kali ulangan. Perlakuan yang dilakukan dalam
permasalahan tesebut, penggunaan bahan alami penelitian yaitu penambahan ekstrak daun sirsak
menjadi alternatif untuk pengendalian penyakit ikan. kedalam pakan dengan dosis yang digunakan: A
Penggunaan tumbuhan obat relatif lebih aman untuk (0g/kg pakan), B (5g/kg pakan), C (10g/kg pakan),
lingkungan dan efektif dalam mengobati penyakit D (15g/kg pakan). Penentuan dosis mengacu pada
ikan atau meningkatkan kekebalan tubuh ikan. Purnomo dan Afri (2011).
Suhirman dan Winarti (2005), menjelaskan bahwa Pengambilan sampel darah dilakukan setiap
tanaman obat mempunyai fungsi imunomodulator tujuh hari mulai dari hari ke-nol sampai hari
adalah dengan cara stimulan (imunostimulan) dan keempat pasca uji tantang A. hydrophila, kemudian
supresan (imunosupresi). dilakukan pengamatan meliputi total eritrosit, total
Berbagai jenis tumbuhan obat mulai banyak leukosit, diferensial leukosit dan indeks fagositosis.
digunakan dalam pengobatan ikan, antara lain Penghitungan total eritrosit dan total leukosit
tumbuhan sirsak terutama bagian daunnya. Daun mengacu pada Blaxhall dan Daisley, (1973),.
sirsak mengandung senyawa acetogenin. Menurut Penghitungan diferensial leukosit dan aktivitas
Zuhud (2011), senyawa acetogenin memiliki fagositosis mengacu pada Anderson dan Siwicki,
kemampuan sebagai antikanker, antitumor, anti- (1993), sedangkan untuk menghitung
inflamasi, antidepresi, antivirus, dan antibakteri. kelulushidupan ikan mas pasca uji tantang A.
Hasil penapisan fitokimia ekstrak daun sirsak hydrophila dihitung dengan menggunakan rumus
menggunakan pelarut etanol 70% menunjukkan (Zonneveld et al., 1991).
adanya senyawa alkaloid, flavonoid, saponin, 1W
tannin, kuinon, steroid, minyak atsiri dan kumarin, 65 š
1R
dengan kadar flavonoid 4,86% dan senyawa
kuersetin 0,0905% (Nurrahmani, 2012). Menurut
Doss et all. (1995), senyawa tannin memiliki
aktifitas sebagai antibakteri yang tinggi terhadap
sejumah bakteri seperti Staphylococcus aureus,
 74
Journal of Aquaculture Management and Technology
Volume 2, Nomor 4, Tahun 2013, Halaman 72-83
Online di : http://ejournal-s1.undip.ac.id/index.php/jfpik

HASIL DAN PEMBAHASAN menunjukkan bahwa gejala klinis adanya serangan

bakteri A. hydrophila berupa perubahan tingkah laku
Gejala Klinis dan morfologi. Hasil pengamatan gejala klinis ikan
Pengamatan gejala klinis ikan mas pasca infeksi mas pasca uji tantang A. hydrophila tersaji pada
A. hydrophila yang dilakukan selama 4 hari, Tabel 1.

Tabel 1. Pengamatan Gejala Klinis Ikan Mas Pasca Infeksi A. hydrophila

Gejala klinis
Hari ke-
Morfologi Tingkah laku
1 Terlihat adanya luka berwarna merah dan Sebagian besar ikan masih berenang dengan
bengkak pada area bekas penyuntikan A. normal di dasar dan bergerombol, respon
hydrophila yaitu bagian punggung, hal ini terhadap rangsangan cukup baik dan respon
terjadi pada semua ikan disetiap perlakuan. terhadap pakan baik, namun ada beberapa
beberapa ikan menunjukkan kondisi seperti ikan berenang tidak teratur di permukaan dan
geripis pada sirip ekor. menyendiri, diantaranya terdapat pada
perlakuan C (10g/kg) dan A (kontrol).
Beberapa ikan tersebut mengalami penurunan
nafsu makan dan respon terhadap rangsangan
lambat.
2 Luka pada tubuh ikan semakin melebar Hampir semua ikan uji mengalami penurunan
seperti borok (ulcer), geripis pada bagian nafsu makan dan respon terhadap rangsangan
sirip ekor, tubuh ikan dipenuhi lendir, lambat, terlihat beberapa ikan berenang tidak
terdapat tukak (bolong) pada otot punggung, teratur
bagian perut mengembung dan tubuh
berwarna pucat.
3 Luka pada tubuh ikan semakin dalam Ikan yang masih bertahan berenang normal
sehingga otot punggung bolong, ikan uji dan bergerombol didasar. Respon ikan
yang mati menunjukkan kondisi luka yang terhadap pakan menurun.
parah.
4 Sirip dorsal dan caudal geripis, luka pada Ikan yang masih bertahan berenang normal
tubuh ikan semakin dalam (otot punggung dan bergerombol didasar. Respon ikan
bolong). terhadap pakan menurun, beberapa ikan
berenang menyendiri.

Pengamatan gejala klinis ikan mas pasca infeksi Perubahan tersebut diduga berkaitan dengan
A. hydrophila pada Tabel 1 menunjukan adanya serangan bakteri A. hydrophila yang diinjeksikan
perubahan tingkah laku dan morfologi. Perubahan pada tubuh ikan, sehingga ikan uji mengalami
tingkah laku diantaranya penurunan nafsu makan gangguan fisiologis akibat efek toksin yang berasal
terutama pada hari ke-2, penurunan respon terhadap dari bakteri A. hydrophila. Menurut Kabata, (1985)
pakan, ikan berenang didasar dan beberapa ekor ikan yang terinfeksi A. hydrophila akan
berenang di permukaan. Hari ke-1, sebagian banyak menunjukkan perubahan morfologi seperti luka,
ikan masih berenang dengan normal, sedangkan dropsy, dan perubahan warna tubuh ikan. Adanya
pada hari ke-2 dan seterusnya terdapat beberapa infeksi tersebut mengakibatkan terjadinya
ikan berenang tidak teratur. Hal ini sesuai dengan perubahan kondisi ikan, diamana perubahan tersebut
pernyataan Kabata, (1985) bahwa ikan yang merupakan bentuk pertahanan dari ikan itu sendiri,
terinfeksi A. hydrophila akan menunjukkan kondisi seperti diungkapkan oleh Syawal (2008), bahwa
yang tidak normal yaitu ikan berenang di permukaan adanya perubahan kondisi ikan seperti terjadinya
air, berenang lambat nafsu makan rendah. Hal inflamasi karena infeksi merupakan merupakan
serupa juga terjadi pada penelitian yang dilakukan karakteristik tanggap kebal nonspesifik.
Citarasu et al. (2011)
Perubahan secara morfologi diantaranya luka Total Eritrosit
pada tubuh ikan (area bekas infeksi) berwarna Hasil pengamatan total eritrosit ikan mas tersaji
kemerahan, adanya pembengkakan pada tubuh yang pada Tabel 2 dan selengkapnya dapat dilihat pada
luka, geripis pada bagian sirip punggung dan sirip Gambar 1.
ekor, bagian abdomen mengembung beberapa ikan
mengalami perubahan warna tubuh menjadi gelap.
 75
Journal of Aquaculture Management and Technology
Volume 2, Nomor 4, Tahun 2013, Halaman 72-83
Online di : http://ejournal-s1.undip.ac.id/index.php/jfpik

Tabel 2. Nilai Rata-rata Eritrosit (×106 sel/mm3) pada Ikan Mas

Hari ke-
Perlakuan
0 7 14 21 4 pasca ujitantang
ab ab a
A 0,76±0.11 1,07±0.03 0,61±0.08 0,26±0.02 0,39±0,04
ab ab ab
B 1,09±0.06 1,56±0.04 1,04±0.04 0,37±0.02 0,83±0,39
C 1,08±0.09 1,53±0.15ab 1,17±0.33ab 1,01±0.02b 0,57±0,03
ab ab b
D 0,93±0.11 1,59±0.04 0,55±0.07 0,74±0.15 0,77±0,14
Keterangan: A: 0g/kg, B: 5g/kg, C: 10g/kg, D: 15g/kg. Nilai dengan superscript yang sama pada kolom
menunjukkan tidak adanya pengaruh yang nyata (P>0.05).

2.0
TOTAL ERITROSIT 106

1.5
A
1.0
B
0.5 C
0.0 D
H0 H7 H14 H21 H4 Pasca uji tantang
HARI

Gambar 1. Grafik Total Eritrosit Ikan Mas Perlakuan A dosis 0 g/kg pakan,
B dosis 5 g/kg pakan, C dosis 10g/kg pakan dan D dosis 15 g/kg pakan.

Tabel 2 dan Gambar 1 menunjukkan bahwa tantang A. hydrophila terjadi peningkatan total
setelah 7 hari, rata-rata total eritrosit pada perlakuan eritrosit dengan kisaran nilai 0,39×106 ± 0,83×106
A, B, C dan D cenderung meningkat, kisaran sel/mm3. hal ini diduga karena ikan mengalami stres
nilainya antara 1,07×106 ± 1,59×106 sel/mm3,kisaran pasca infeksi A. hydrophila. Menurut Erika (2008),
tersebut masih dalam kisaran normal. Menurut total eritrosit yang terlalu tinggi mengindikasikan
Roberts (2001), total eritrosit normal pada ikan ikan dalam keadaan stres. Total eritrosit pasca uji
teleost adalah 1,05×106 ± 3,0×106 sel/mm3. tantang masih berada dibawah kisaran normal total
Peningkatan eritrosit sesuai dengan kisaran normal eritrosit ikan sehat, hal ini juga diduga bahwa ikan
diduga karena hal tersebut dipengaruhi pemberian mengalami anemia karena terjadi pendarahan akibat
ekstrak daun sirsak, dimana dalam ekstrak tersebut perkembangan luka pada tubuh ikan yang semakin
terkandung senyawa aktif berupa acetogenin yang besar pasca infeksi A. hydrophila, hal ini terlihat
berfungsi meningkatkan ketahanan tubuh ikan, terutama pada perlakuan A (0g/kg). Hal lain diduga
sehingga total eritrosit ikan mas kembali normal. karena terjadinya hemolisis akibat toksin yang
Total eritrosit setelah 14 hari cenderung dikeluarkan A.hydrophila sehingga jumlah sel
menurun pada semua perlakuan berkisar antara eritrosit dalam tubuh ikan sedikit. Pleczar dan Chan
0,55×106 ± 1,17×106 sel/mm3 dengan nilai tertinggi (2009) mengemukakan bahwa ketika A. hydrophila
pada perlakuan C (1,17×106 sel/mm3). Diduga masuk kedalam tubuh inang, maka bakteri tersebut
bahwa penurunan total eritrosit disebabkan karena akan memproduksi Lechitinase, yaitu enzim yang
ikan uji mengalami anemia sehingga terjadi menghancurkan berbagai sel jaringan dan terutama
penurunan nafsu makan, hal ini terbukti pada semua aktif melisiskan sel eritrosit.
perlakuan terutama pada perlakuan D (15g/kg)
dimana total eritrosit setelah 14 hari menurun Total Leukosit
sebesar 1.04×106 sel/mm3. Erika (2008) Hasil pengamatan penambahan ekstrak daun
mengemukakan bahwa total eritrosit yang rendah sirsak dengan dosis berbeda dalam pakan terhadap
mengindikasikan bahwa ikan mengalami anemia. total leukosit selama penelitian tersaji pada Tabel 3
Hari ke-21 nilai nya menurun kembali (0.26×106 dan grafik perbandingannya dapat dilihat pada
± 1.01×106 sel/mm3) dan nilai terendah pada Gambar 2.
perlakuan A (0.26×106sel/mm3). Hari ke-4 pasca uji
 76
Journal of Aquaculture Management and Technology
Volume 2, Nomor 4, Tahun 2013, Halaman 72-83
Online di : http://ejournal-s1.undip.ac.id/index.php/jfpik

Tabel 3. Nilai Rata-rata Leukosit (×105 sel/mm3) Pada Ikan Mas

Hari ke-
Perlakuan
0 7 14 21 4 pasca ujitantang
ab b b
A 2.03±0.32 2.60±0.20 1.80±0.13 0.68±0.08 1.08±0.13b
ab b b
B 1.97±0.60 6.27±0.51 5.18±0.25 4.67±0.29 5.62±0.08b
C 1.98±0.36 3.02±0.62b 2.42±0.06a 4.00±0.50a 4.67±0.76a
D 1.87±0.81 5.63±0.45ab 1.62±0.18a 1.02±0.18ab 1.62±0.49ab
Keterangan: A: 0g/kg, B: 5g/kg, C: 10g/kg, D: 15g/kg. Nilai dengan superscript yang sama pada kolom
menunjukkan tidak adanya pengaruh yang nyata (P>0.05).

8
JUMLAH LEUKOSIT 105

6
A
4
B
2
C
0
D
H0 H7 H14 H21 H4 Pasca
uji tantang
HARI

Gambar 2. Grafik Total Leukosit Ikan Mas Perlakuan A (0 g/kg pakan),

B (5 g/kg pakan), C (10 g/kg pakan) dan D (15 g/kg pakan).

Tabel 3 dan Gambar 2 menunjukan peningkatan Menurut Sukenda et al. (2008), peningkatan total
total leukosit pada semua perlakuan setelah 7 hari leukosit dalam darah, dikarenakan leukosit
berkisar antara 2.60×105 ± 6.27×105 sel/mm3. berfungsi sebagai pertahanan tubuh, yang bereaksi
Peningkatan total leukosit tersebut mengindikasikan dengan cepat terhadap masuknya antigen kedalam
bahwa terjadi perubahan kondisi lingkungan yang tubuh ikan.
mengakibatkan ikan mengalami stress, sehingga Meningkatnya total leukosit ikan mas pasca
total leukosit dalam tubuh ikan meningkat. Hal ini infeksi A. hydrophila menunjukkan adanya respon
diduga berkaitan dengan pemberian ekstrak daun perlawanan tubuh terhadap zat asing penyebab
sirsak yang dapat meningkatkan respon pertahanan penyakit, yaitu infeksi A. hydrophila pada tubuh
tubuh yang ditandai dengan peningkatan total ikan mengakibatkan terjadinya respon imun yang
leukosit. ditandai dengan meningkatnya total leukosit. Hal ini
Perubahan total leukosit tersebut merupakan terjadi pada semua perlakuan, dimana total eritrosit
indikator pada ikan yang mengalami stress, namun tertinggi terjadi pada perlakuan B (5.62×10 5
setelah 14 hari pemberian pakan uji nilainya sel/mm3) diikuti perlakuan C (4.67×105 sel/mm3)
cenderung menurun pada semua perlakuan namun dan D (1.62×105 sel/mm3). Meningkatnya total
masih berada pada kisaran normal. Menurut Ikbal leukosit tersebut merupakan respon pertahanan
(2006), rendahnya kandungan leukosit dalam darah tubuh ikan terhadap antigen. Moyle dan Cech
ikan yang diberi bahan imunostimulan dibandingkan (1988), mengemukakan bahwa leukosit memiliki
pakan komersil menandakan bahwa ikan berada bermacam-macam fungsi, yang erat kaitannya untuk
dalam kondisi baik. menghilangkan benda asing (termasuk
Setelah 21 hari total leukosit menurun kembali mikroorganisme patogen).
pada perlakuan A, B dan D, dengan nilai tertinggi Persentase Monosit
pada perlakuan B (4.67×105 sel/mm3), sedangkan Hasil pengamatan persentase monosit tersaji
perlakuan C nilainya meningkat, hal ini diduga pada Tabel 4 dan grafik perbandingannya dapat
kondisi ikan pada perlakuan C mengalami stres dilihat pada Gambar 3.
akibat perubahan lingkungan atau infeksi patogen.
 77
Journal of Aquaculture Management and Technology
Volume 2, Nomor 4, Tahun 2013, Halaman 72-83
Online di : http://ejournal-s1.undip.ac.id/index.php/jfpik

Tabel 4. Rata-rata Persentase Monosit Pada Ikan Mas

Hari ke-
Perlakuan
0 7 14 21 4 pasca uji tantang
ab ab
A 2.00±1.00 3.33±1.53 4.00±1.00 6.67±0.58 4.67±0.58
ab b
B 2.33±1.53 6.00±2.65 12.00±1.00 18.33±2.52 7.67±1.52
C 2.33±1.15 6.67±2.52 11.00±1.00b 10.00±2.65ab 9.67±3.51
b ab
D 2.33±0.58 3.67±1.53 8.00±1.00 11.00±1.00 6.33±2.52
Keterangan: A: 0g/kg, B: 5g/kg, C: 10g/kg, D: 15g/kg. Nilai dengan superscript yang sama pada kolom
menunjukkan tidak adanya pengaruh yang nyata (P>0,05).

21
Persentase (%)

18
15 A
12 B
9
6 C
3
0 D
H0 H7 H14 H21 H4 Pasca
HARI uji tantang

Gambar 3. Grafik Persentase Monosit Ikan Mas Perlakuan A (0 g/kg pakan),

B (5g/kg pakan),C (10 g/kg pakan) dan D (15 g/kg pakan).

Tabel 4 dan Gambar 3, meunjukan peningkatan pengaruh pemberian ekstrak daun sirsak. Hal ini
persentase monosit sampai 21 hari pada perlakuan diduga bahwa monosit menuju tempat terjadinya
A, B dan D, sedangkan perlakuan C menurun infeksi, hal ini sesuai dengan pernyataan Sukenda et
nilainya. Hari ke-4 pasca uji tantang nilainya al. (2008) bahwa penurunan jumlah monosit
menurun pada perlakuan A, B dan D, sedangkan dikarenakan monosit tersebut meninggalkan
pada perlakuan C nilainya meningkat. Secara pembuluh darah menuju daerah yang terinfeksi dan
keseluruhan, persentase monosit pada penelitian ini memfagosit bakteri.
berkisar antara 2 ± 18,33%. Menurut Svobodová dan Penurunan nilai monosit pasca uji tantang juga
Vykusová, (1991), kisaran normal monosit pada bisa diduga bahwa peradangan pada hari ke-4 pasca
ikan mas berkisar antara 3-5%. Tingginya nilai uji tantang dalam jaringan darah telah kembali
monosit diatas kisaran normal, terutama setelah 21 menuju normal sehingga tidak ada peningkatan
hari pemberian pakan uji diduga karena adanya jumlah monosit, selain itu diduga adanya jenis
pengaruh penambahan ekstrak daun sirsak dalam leukosit lain yang ikut berperan dalam merespon
pakan, dimana kandungan bahan aktif dalam ekstrak radang akibat infeksi A. hydrophila. Prakoso, (2012)
daun sirsak mampu meningkatkan respon imun ikan mengemukakan bahwa meningkatnya jumlah
melalui peningkatan persentase monosit, hal lain leukosit karena komponen leukosit yaitu heterofil
diduga bahwa ekstrak daun sirsak dianggap zat (neutrofil) dan monosit yang merupakan bagian dari
asing dalam tubuh ikan. Moyle dan Cech (1988), leukosit, yang memberikan respon imun terhadap
menyatakan bahwa jumlah monosit di dalam bakteri, sedangkan penurunan jumlah leukosit
populasi sel darah putih sedikit, namun jumlahnya mengindikasikan bahwa proses peradangan telah
akan meningkat jika ada substansi asing pada berhenti.
jaringan atau sirkulasi. Hal serupa dilaporkan juga
dalam Vonti (2008), bahwa nilai monosit lebih Persentase Neutrofil
tinggi dari kisaran normal diduga dikarenakan Hasil pengamatan persentase neutrofil tersaji
kondisi ikan yang stress. pada Tabel 5 dan grafik perbandingannya dapat
Hari ke-4 pasca uji tantang A. hydrophila dilihat pada Gambar 4.
jumlahnya menurun dan tidak menunjukan adanya
 78
Journal of Aquaculture Management and Technology
Volume 2, Nomor 4, Tahun 2013, Halaman 72-83
Online di : http://ejournal-s1.undip.ac.id/index.php/jfpik

Tabel 5. Rata-rata Persentase Neutrofil pada Ikan mas

Hari ke-
Perlakuan
0 7 14 21 4 pasca uji tantang
ab
A 2.67±1.15 3.00±1.73 2.33±1.53 6.33±1.15 7.67±0.58
ab
B 3.33±1.15 2.00±1.00 4.67±1.53 3.33±0.57 8.67±2.51
C 3.67±0.58 2.67±1.53 7.33±1.53ab 6.33±2.08 9.67±3.21
a
D 1.67±1.15 1.67±1.15 3.33±1.53 6.00±1.00 9.00±3.61
Keterangan: A: 0g/kg, B: 5g/kg, C: 10g/kg, D: 15g/kg. Nilai dengan superscript yang sama pada kolom
menunjukkan tidak adanya pengaruh yang nyata (P>0.05).

20
Persentase (%)

15 NEUTROFIL
10 A
5
B
0
H0 H7 H14 H21 H4 Pasca C
uji tantang D
HARI

Gambar 4. Grafik Persentase Neutrofil Ikan Mas Perlakuan A (0 g/kg pakan),

B (5g/kg pakan), C (10 g/kg pakan) dan D (15 g/kg pakan).

Tabel 5 dan Gambar 4 menunjukan bahwa, ragam tidak menunjukan adanya pengaruh
persentase neutrofil setelah 7 hari mengalami pemberian ekstrak daun sirsak. Hal ini diduga
penurunan, dan tidak menunjukan adanya pengaruh bahwa peningkatan jumlah neutrofil dikarenakan
pemberian ekstrak daun sirsak. Hal ini diduga adanya respon alami akibat infeksi A. hydrophila,
bahwa pemberian ekstrak daun sirsak belum sebagaimana diketahui bahwa ikan memilki sistem
berpengaruh terhadap sel neutrofil dalam merespon imun bawaan atau alamiah, yang memilki
antigen. Hari ke-14 persentasenya meningkat dan kemampuan mempertahankan maupun
menunjukkan adanya pengaruh pemberian ekstrak meningkatkan kekebalan tubuh terhadap zat asing
daun sirsak. Hal ini diduga bahwa peningkatan atau antigen, dalam hal ini perlakuan A (kontrol).
jumlah neutrofil merupakan mekanisme kerja Hal tersebut sesuai dengan pernyataan Sukenda et
ekstrak sebagai imunostimulan yaitu meningkatkan al. (2008), bahwa jumlah neutrofil meningkat
respon imun melalui peningkatan sel neutrofil. karena dalam tubuh ikan telah terbentuk sistem
Hari ke-21 terjadi penurunan, namun tidak pertahanan tubuh, sehingga saat terjadi infeksi
dipengaruhi penambahan ekstrak daun sirsak. bakteri, neutrofil diproduksi oleh limfa untuk
Penurunan persentase neutrofil masih dalam kisaran dikirim ke tempat infeksi. Hal serupa juga
normal yaitu rata-rata 6%. Menurut Nabib dan dilaporkan Mones (2008), bahwa peningkatan
Pasaribu, (1989) proporsi neutrofil dalam darah jumlah neutrofil disebabkan karena adanya infeksi
adalah 6-8%. Penurunan jumlah neutrofil mendekati pathogen. Berdasarkan hasil pengamatan jumlah
kisaran normal menunjukan peran daun sirsak neutrofil pasca uji tantang, perlakuan C nilainya
sebagai imunosupresi yaitu menekan atau lebih tinggi dibandingkan perlakuan B, secara tidak
menormalkan kembali reaksi imun. Sesuai dengan langsung hal ini juga berkaitan dengan penambahan
pernyataan Suhirman dan Winarti, (2005) bahwa ekstrak dengan dosis yang lebih tinggi pada
tanaman obat memiliki fungsi sebagai perlakuan C yang telah diberikan selama 21 hari.
imunostimulan dan imunosupresi.
Hari ke-4 pasca uji tantang A. hydrophila terjadi Persentase Limfosit
peningkatan persentase neutrofil daiatas kisaran Hasil pengamatan persentase limfosit tersaji
normal terutama pada perlakuan D (9,67%), C pada Tabel 6 dan grafik perbandingannya dapat
(9,67%) dan B (8,67%) namun berdasarkan analisa dilihat pada Gambar 5.
 79
Journal of Aquaculture Management and Technology
Volume 2, Nomor 4, Tahun 2013, Halaman 72-83
Online di : http://ejournal-s1.undip.ac.id/index.php/jfpik

Tabel 6. Rata-rata Persentase Limfosit pada Ikan Mas

Hari ke-
Perlakuan
0 7 14 21 4 pasca uji tantang
b ab
A 95.33±2.08 93.67±1.15 95.00±1.00 87.00±1.00 88.00±1.00
ab b
B 94.33±2.52 92.00±2.00 83.33±2.31 78.83±2.08 83.67±3.21
C 93.67±1.15 91.33±1.15 81.67±2.52ab 83.67±1.15ab 80.67±4.16
ab ab
D 96.00±1.00 94.67±2.08 88.67±2.08 86.00±1.00 84.67±1.53
Keterangan: A: 0g/kg, B: 5g/kg, C: 10g/kg, D: 15g/kg. Nilai dengan superscript yang sama pada kolom
menunjukkan tidak adanya pengaruh yang nyata (P>0.05).

100
LIMPOSIT
Persentase (%)

90
A
80
B
70 C
H0 H7 H14 H21 H4 Pasca D
uji tantang
HARI

Gambar 5. Grafik Persentase Limfosit Ikan Mas Perlakuan A (0 g/kg pakan),

B (5g/kg pakan), C (10 g/kg pakan) dan D (15 g/kg pakan).

Berdasarkan Tabel 6 dan Gambar 5 Persentase Hari ke-4 pasca uji tantang A. hydrophila
limfosit pada sampai hari ke-21 mengalami menunjukan peningkatan persentase limfosit tidak
penurunan, namun menunjukan adanya peningkatan dipengaruhi penambahan ekstrak daun sirsak. Hal
pada hari ke-4 pasca infeksi A. hydrophila.. ini diduga bahwa zat aktif dalam ekstrak daun sirsak
Penurunan persentase limfosit yang terjadi selama belum memberi pengaruh yang optimal dalam
21 hari perlakuan menunjukan bahwa nilainya merangsang respon imun.
masih dalam kisaran normal yaitu 78 ± 95%.
Menurut Svobodová dan Vykusová (1991), Aktivitas Fagositosis
persentase limfosit pada ikan mas berkisar antara 76 Hasil pengamatan persentase monosit tersaji
± 97,5%. pada Tabel 7 dan grafik perbandingannya dapat
dilihat pada Gambar 6.

Tabel 7. Rata-rata Aktivitas Fagositosis Pada Ikan Mas

Hari ke-
Perlakuan
0 14 21 4 pasca ujitantang
A 38,33±1,53 36,67±3,21 35,33±0,58 34,33±1,53
B 38,67±0,57 41,00±1,00 33,33±1,53 37,00±1,00
C 37,33±2,52 38,00±2,65 34,00±2,00 35,67±1,53
D 36,67±1,15a 39,00±2,61a 34,33±1,53a 36,33±1,53a
Keterangan: A: 0g/kg, B: 5g/kg, C: 10g/kg, D: 15g/kg. Nilai dengan superscript yang sama pada kolom
menunjukkan tidak adanya pengaruh yang nyata (P>0.05).
 80
Journal of Aquaculture Management and Technology
Volume 2, Nomor 4, Tahun 2013, Halaman 72-83
Online di : http://ejournal-s1.undip.ac.id/index.php/jfpik

Persentase (%)
40
A

35 B

30
H0 H14
H21 4 pasca uji
HARI tantang
Gambar 6. Grafik Aktivitas Fagositosis Ikan Mas Perlakuan A (0 g/kg pakan),
B (5 g/kg pakan), C (10 g/kg pakan) dan D (15 g/kg pakan).

Berdasarkan Tabel 7 dan Gambar 6, rata-rata fagositosis. Berdasarkan grafik aktivitas fagositosis
aktivitas fagositosis meningkat setelah pemberian yang diamati, terjadi peningkatan aktivitas
pakan uji selama 14 hari, dan cenderung menurun fagositosis pada hari ke-4 pasca uji tantang, hal ini
setelah 21 hari, kemudian meningkat kembali berbanding lurus dengan peningkatan total leukosit
setelah 4 hari pasca uji tantang. pasca infeksi A. hydrophila, hal ini mengindikasikan
Hasil peneitian menunjukan bahwa perlakuan bahwa terjadinya respon imun dalam tubuh ikan
pemberian ekstrak daun sirsak yang berbeda tidak yang ditndai dengan peningkatan aktivitas
berpengaruh nyata terhadap aktivitas fagositosis fagositosis terutama pada perlakuan B (37%).
sampai hari ke-21 dan hari ke-4 pasca infeksi A.
hydrophila. Hal ini mengindikasikan bahwa ekstrak Kelulushidupan dan Pola Kematian
daun sirsak (flavonoid) belum mampu Hasil pengamatan kelulushidupan ikan mas yang
meningkatkan aktivitas fagositosis, sehingga kurang diamati selama 4 hari pasca infeksi A.hydrophila
merangsang sel makrofag untuk melakukan respon tersaji pada Tabel 8 dan Gambar 7.

Tabel 8. Rata-rata Kelulushidupan Ikan Mas Pasca Uji Tantang A. hydrophila

Perlakuan (%)
Ulangan
A B C D
1 50,00 67,00 50,00 67,00
2 33,00 0,00 0,00 33,00
3 33,00 83,00 17,00 50,00
Rata-rata±SD 38.67±9,81 50,00±44,03 22.33±25,42 50±17,03
Keterangan: A: 0g/kg, B: 5g/kg, C: 10g/kg, D: 15g/kg.

100 50±44.03
80 50±17
60 38.67±9.81 22.33±25.42
%

40 SR

20
0
A B C D
 81
Journal of Aquaculture Management and Technology
Volume 2, Nomor 4, Tahun 2013, Halaman 72-83
Online di : http://ejournal-s1.undip.ac.id/index.php/jfpik

Gambar 7. Grafik Kelulushidupan Ikan Mas Pasca Uji tantang Perlakuan A (0g/kgpakan),
B (5 g/kg pakan), C (10 g/kg pakan) dan D (15 g/kg pakan).

Tabel 9. Pola Kematian Ikan Mas Pasca Uji Tantang

Hari ke- « 3DVFD XML WDQWDQJ Total ikan mati
Perlakuan
1 2 3 4 (ekor)
A 2 1 5 3 11
B 0 1 5 3 9
C 2 8 3 1 14
D 2 2 3 2 9
Keterangan: A: 0g/kg, B: 5g/kg, C: 10g/kg, D: 15g/kg.

Tabel 9 menunjukan bahwa jumlah ikan mati ikan diamati setiap 24 jam. Kematian ikan pada hari
paling banyak terdapat pada perlakuan C (14 ekor), ke-4 pasca uji tantang terjadi dalam selang waktu 8-
disusul perlakuan A (11 ekor) kemudaian perlakuan 9 jam pasca pengambilan sampel darah.
D dan B masing-masing sebanyak 9 ekor. Kematian

18
16
14
12 A
ekor

10
8 B
6 C
4
2 D
0
1 2 3 4
Hari

Gambar 8. Grafik Pola Kematian Ikan Mas Pasca Uji tantang Perlakuan A(0g/kgpakan),
B (5 g/kg pakan), C (10 g/kg pakan) dan D (15g/kg pakan).

Berdasarkan Tabel 8 dan Gambar 7, persentase senyawa tannin, lakton dan alkaloid isokunolina,
keluluhidupan (SR) tertinggi terdapat pada sedangkan menurut penelitian Takahashi et al.
perlakuan D (15 g/kg) dan B (5 g/kg) sebesar 50%, (2006) ekstrak etanol daun A. muricata mengandung
sedangkan kematian pada ikan mas terjadi mulai senyawa flavonoid yang bekerja sebagai antibakteri
hari ke-1 sampai ke-4 pasca infeksi. Hasil penelitian dan mampu mengatasi infeksi yang disebabkan
menunjukan bahwa kematian ikan uji lebih cepat bakteri. Penelitian yang dilakukan Doss et all.
dibandingkan dengan penelitian Priminarti, (1991) (1995) menemukan bahwa tumbuh-tumbuhan yang
dalam Rahman, (2008) yang mengemukakan bahwa kaya akan tannin memiliki aktivitas antibakteri yang
kematian ikan akibat serangan A. hydrophila mati tinggi, karena senyawa tannin diduga mampu
dalam waktu 3 ± 4 hari setelah infeksi (Tabel 9 dan mengganggu dinding sel bakteri sehingga koloni
Gambar 8). Hal ini diduga berkaitan dengan bakteri terdisintegrasi dan pertumbuhannya
patogenisitas A. hydrophila yang berbeda dan terhambat.
adanya kekebalan alami pada tubuh ikan uji
sehingga ikan uji masih mampu mempertahankan Kesimpulan
hidupnya. Hal lain diduga adanya pengaruh dari Kesimpulan dari penelitian ini adalah:
ekstrak daun sirsak yang diberikan selama 21 hari, 1. Penambahan ekstrak daun sirsak (Annona
dimana bahan aktif yang terkandung didalamnya muricata) dengan dosis yang berbeda
secara tidak langsung berpengaruh terhasap berpengaruh sangat nyata terhadap total leukosit
ketahanan tubuh saat terjadi serangan penyakit. akan tetapi tidak berpengaruh terhadap total
Menurut Adewole dan Caxton-Martins, (2006), eritrosit, diferensial leukosit, aktivitas fagositosis
A. muricata bersifat antibakteri terhadap sejumlah dan kelulushidupan ikan mas yang diinfeksi
bakteri patogen, dan kaya dengan berbagai macam Aeromonas hydrophila.
 82
Journal of Aquaculture Management and Technology
Volume 2, Nomor 4, Tahun 2013, Halaman 72-83
Online di : http://ejournal-s1.undip.ac.id/index.php/jfpik

2. Dosis terbaik penggunaan ekstrak daun sirsak

dalam pakan yang dapat memberi pengaruh Ikbal. 2006. Aplikasi Imunostimulan pada Pakan
terhadap total leukosit ikan mas yang diinfeksi Ikan Kerapu Bebek Cromileptes altivelis yang
A. hydrophila adalah 5 g/kg. Dipelihara Di Jaring Apung. [Skripsi].
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Institut
Saran Pertanian Bogor, Bogor, 47 hlm.
Saran yang dapat diberikan adalah penggunaan Kabata, Z. 1985. Parasites and Diseases of Fish
ekstrak daun sirsak dalam pakan untuk merangsang Cultured in the Tropics. Taylor and Francis.
ataupun meningkatkan ketahanan tubuh ikan mas London and Philadelphia. 318 hlm.
terhadap serangan bakteri Aeromonas hydrophila
sebaiknya digunakan dosis 5gr/kg pakan. Mones, R. A. 2008. Gambaran Darah pada Ikan Mas
(Cyprinus carpio Linn) Strain Majalaya yang
Ucapan Terimakasih Berasal dari Daerah Ciampea Bogor. [Skripsi].
Ucapan terima kasih disampaikan kepada kedua Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian
Orang tua dan Ahmad Wahyudi, S.Pi serta seluruh Bogor, Bogor, 35 hlm.
staf Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya
Air Tawar (BPPBAT), Bogor yang telah membantu Moyle PB, Cech JJ. 1988. Fishes : an Introduction
kelancaran penelitian. to Ichtyology. Prentice Hall, Inc. USA.559 p.

DAFTAR PUSTAKA Nabib R. dan FH. Pasaribu. 1989. Patologi dan

Adewole, S.O. and E.A. Caxton-Martins. 2006. Penyakit Ikan. Pusat Antar Universitas,
Morphological Changes and Hypoglycemic Institut Pertanian Bogor, Bogor, 158 hlm.
Effects of Annona Muricata Linn.
(Annonaceae) Leaf Aqueous Extract on Nurrahmani, L.S. 2012. Pemeriksaan Parameter
3DQFUHDWLF ú-Cells of Streptozotocin-Treated Mutu Ekstrak Etanol 70% Daun Sirsak
Diabetic Rats. African Journal of Biomedical (Annona muricata Linn) dan Uji
Research, 9 (2006); 173 ± 187. 3HQJKDPEDWDQ (Q]LP .-Glukosidase Secara In
Vitro. Artikel Ilmiah. Fakultas Farmasi
Anderson, D.P. and A.K. Siwicki. 1993. Basic Universitas Pancasila, Jakarta, 82 hlm.
Haematology and Serology For Fish Health
Programs. Paper Presented in Second Prakoso, W. S. A. 2012. Gambaran Jumlah dan
Symposium on Diseases in Asian Hitung Jenis Sel Leukosit Darah Ikan Mas
Aquaculture, Aquatic Animal Health and the (Cyprinus carpil Linn) yang Diterapi Ekstrak
Enviroment, Phuket, Thailand. 25-29th Daun Sambiloto (Andrographis paniculata)
October 1993. Pp.185-202. setelah Diinfeksi Aeromonas hydrophila.
Artikel Ilmiah. Fakultas Kedokteran Hewan
Blaxhall, P.C. and K.W. Daisley. 1973. Routine Airlangga. Surabaya.
haematological methods for use with fish
blood. J. Fish Biol., 5: 577-581 p. Pleczar, MJ, E.C.S. Chan. 2009. Dasar-dasar
Mikrobiologi, Jilid 2. Jakarta: Universitas
Citarasu, T, A. Dhas, K Velmurugan, ST Viji, V. Indonesia. hal 446-997.
Kumaran, T.M. Babu, T. Selvaraj. 2011.
Isolation of Aeromonas hydrophila from Purnomo, H. dan A. Utami. 2011. Uji Toksisitas
Infected Ornamental Fish Hatchery during Ekstrak Daun Sirsak Sebagai Pestisida Hayati.
Massive Disease Outbreak. International Jurnal Penelitian. Jurnal Of Education IKIP
Journal of Current Research 2(1): pp 037-041. PGRI Semarang 1(1): hal 45-54.

Doss, S.A. G.S. Tillotson, N.L. Barg and S.G. Rahman, M. F. 2008. Potensi Antibakteri Ekstrak
Amyes. 1995. In-vitro and In-vivo Selection of Daun Pepaya pada Ikan Gurami yang Diinfeksi
Staphylococcus aureus Mutants Resistant to Bakteri Aeromonas hydrophila. [Skripsi].
Ciprofloxacin. J. Antimicrob Chemother. 35 Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian
(1): 95-102 p. Bogor, Bogor, 42 hlm.

Erika, Y. 2008. Gambaran Diferensial Leukosit Roberts, R.J. 2001. Fish Pathology. Bailliere Tindal.
Pada Ikan Mujair (Oreochromis mossambicus) London.
Di Daerah Ciampea Bogor. Jurnal Penelitian.
Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Suhirman, S. dan C. Winarti. 2005. Prospek dan
Bogor, Bogor, 36 hal. Fungsi Tanaman Obat sebagai
 83
Journal of Aquaculture Management and Technology
Volume 2, Nomor 4, Tahun 2013, Halaman 72-83
Online di : http://ejournal-s1.undip.ac.id/index.php/jfpik

Imunomodulator. Jurnal Ilmiah. Balai 2006. Antibacteria Activity of Eight Brazilian

Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik dalam Annonaceae Plants. Natural Product Research,
http://balitro.litbanbang.go.id (28 januari 20(1): 21-2
2013).
Tambunan, J. E., G. Mahasri dan K. Setiawan. 2011.
Sukenda. L. Jamal, D. Wahyuningrum, dan A. Infestasi Ektoparasit Lernaea Sebagai Faktor
Hasan. 2008. Penggunaan Kitosan untuk Pemicu Munculnya Infeksi Bakteri Aeromonas
Pencegahan Infeksi Aeromonas hydrophila pada Benih Ikan Mas (Cyprinus carpio L.).
pada Ikan Lele Dumbo Clarias sp. Jurnal Jurnal penelitian. Fakultas Perikanan dan
Akuakultur Indonesia, 7(2): 159-169. Kelautan Universitas Airlangga. Surabaya.
2011. 15 hlm.
Svobodova, Z., and Vyukusova, B., 1991.
Diagnostic, Prevention and Therapy of Fish Vonti, O. 2008. Gambaran Darah Ikan Mas
Disease and Intoxication dalam (Cyprinus carpio Linn) Strain Sinyonya Yang
http//:www.fao.org/fi/website/firetriveaction.d Berasal dari Daerah Ciampea-Bogor. [Skripsi].
o?dom=topic&fid=16064&lang=en (31 Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian
Januari 2013). Bogor, Bogor, 60 hlm.

Syawal, H., Syafriadiman, S. Hidayah. 2008. Zonneveld, N. E., A. Huisman, dan J.H. Boon.
Pemberian Ekstrak Kayu Siwak (Salvadora 1991. Prinsip-prinsip Budidaya Ikan. PT.
persica L) Untuk Meningkatkan Kekebalan Gramedia Pustaka Utama. Jakarta. 381 hlm.
Ikan Mas (Cyprinus carpio L.) Yang
Dipelihara Dalam Keramba. Biodiversitas 9(1), Zuhud A.M. 2011. Bukti Kedahsyatan Sirsak
44-47. Menumpas Kanker. Agro Media.Jakarta. hal
46-75
Takahashi J.A., C.R. Pereira, L.P.S. Pimenta, M.
Amelia D., Boaventura and L.G.F.E. Silva.