BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Rancangan Penelitian

Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah deskriptif yang

bertujuan untuk menidentifikasi gen angiotensin converting enzyme (ACE)

insersi/ delesi (I/D) pada penderita hipertensi di rumah sakit dr. Saiful Anwar

Malang.

3.2 Variabel Penelitian

1. Variabel Bebas : Insersi alu elements

2. Variabel Terikat : Gen angiotensin converting enzyme (ACE) insersi/

delesi (I/D)

3.3 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September 2013 sampai bulan

Agustus 2014, yang bertempat di Laboratorium Biologi Molekuler Jurusan

Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya

dan Laboratorium Genetika Universitas Islam Negeri (UIN) Maulana Malik

Ibrahim Malang.

3.4 Subyek Penelitian

3.4.1 Subyek Penelitian

Subyek penelitian merupakan pasien hipertensi yang berobat di Rumah

Sakit Saiful Anwar Malang yang didiagnosis menderita hipertensi oleh dokter

spesialis jantung dan tidak dibedakan jenis kelamin maupun usia. Penelitian

dilakukan setelah mendapat persetujuan dari komite etik Fakultas Kedokteran

32
 33

Universitas Brawijaya dan Rumah Sakit Saiful Anwar Malang. Pasien hipertensi

diminta untuk menandatangani lembar persetujuan (informed concern)

3.4.2 Kriteria Inklusi

Kriteria inklusi dari subyek penelitian ini yaitu, pasien hipertensi yang

berobat di poli jantung rumah sakit dr.Saiful Anwar Malang dengan tekanan darah

sistol ≥ 140 mmHg dan diastol ≥ 90 mmHg. Tanpa batasan usia maupun jenis

kelamin sebab, yang akan diteliti pada penelitian ini adalah gen dari pasien yang

berada pada kromosom autosomal sehingga tidak dipengaruhi oleh jenis kelamin

maupun usia subyek.

3.4.3 Jumlah Sampel

Sampel berupa darah pasien hipertensi sebanyak 100 sampel. Kemudian

diekstraksi DNA-nya untuk keperluan penelitian. Pada semua sampel DNA yang

didapat, dilakukan genotyping untuk menemukan 3 macam genotipe yaitu II, ID

dan DD.

3.5 Alat dan Bahan Penelitian

3.5.1 Alat

Alat yang digunakan untuk pengambilan darah pasien yaitu venojack dan

vacuntainer tube dengan EDTA 20%. Isolasi DNA mengunakan alat-alat

diantaranya yaitu, mikropipet, white tip, yellow tip, mikrosentrifuge, ependorf,

freezer, dan vortex. Alat untuk amplifikasi DNA (PCR) yaitu, mesin PCR,

micropipet, mikrosentrifuge dan vortex. Sedangkan alat untuk elektroforesis yaitu,

hot plate and stirer, sisir pencetak sumuran, micropipet, timbangan digital, mesin

elektroforesis. Alat untuk melihat hasil elektroforesis yaitu UV transiluminator.

 34

3.5.2 Bahan

Isolasi DNA menggunakan Qiagen Mini Kit, dan etanol absolut. Bahan

untuk PCR antara lain ddH2O, PCR mix (merek intron), sample whole genome

DNA, serta primer ACE Applied Biosystems 111, 112. forward 5’- CCC ATC

CTT TCT CCC ATT TCT C -3’dan primer ACE reverse 5’- AGC TGG AAT

AAA ATT GGC GAA AC -3’ . Bahan untuk elektroforesis yaitu, agarosa, TBE

1X, DNA leader 100bp vivantis dan EtBr.

3.6 Kegiatan Penelitian

3.6.1 Diagnosis Hipertensi

Penentuan kondisi hipertensi dilakukan sesuai dengan rekomendasi

American Heart Disease (1981) yaitu dengan menggunakan alat pengukur

tekanan darah mercury sphygmomanometer. Pengukuran dilakukan pada lengan

kanan dengan posisi duduk tenang dan santai. Tidak ada pakaian sempit yang

melingkari lengan yang akan diperiksa. Lengan yang akan diperiksa diletakkan

pada tempat yang setinggi dada. Stetoskop diletakkan pada fosa antekubiti di atas

arteri brakialis, 10- 15 menit kemudian tekanan diukur. Tekanan dinaikkan sampai

± 20mmHg dari tekanan sistolik dugaan sambil dilakukan palpasi pada arteri

radialis. Bunyi nada Korotkoff terdengar pada waktu tekanan dalam manset

perlahan-lahan diturunkan (dengan keepatan 2-3 mm untuk tiap satu denyut nadi).

Tekanan sistolik adalah bunyi yang pertama kali terdengar (Korotkoff I). Tekanan

diastolik adalah saat bunyi hilang (Korotkoff). Seseorang dikategorikan penderita

hipertensi apabila tekanan darah sistolik ≥ 140 mmHg dan diiringi tekanan darah

diastolik ≥ 120 mmHg.

 35

3.4.2 Pengambilan Sampel Darah

Sampel darah didapatkan dari penderita hipertensi di Rumah Sakit dr.

Saiful Anwar Malang sebanyak 5µl masing-masing subyek yang diambil dari

vena jugularis menggunakan venojack dan vacuntainer yang telah diisi EDTA

20% kemudian diberi label sesuai identitas sampel yang diperoleh. Selanjutnya

sampel darah disimpan dan ditransportasikan ke laboratorium dengan suhu -200 C

untuk diproses ketahap penelitian selanjutnya.

3.6.3 Isolasi DNA

Isolasi DNA menggunakan Mini Kit QIAGEN. Sampel darah yang

sebelumnya disimpan, diambil sebanyak 200µl dan diisolasi dengan prosedur

yang sesuai dengan protokol QIAamp® DNA Blood mini Kit QIAGEN.

Selanjutnya DNA disimpan pada suhu -40C di dalam microtube eppendorf.

3.6.4 Konfirmasi DNA Whole genom

DNA yang sudah diisolasi, diuji kualitasnya dengan menggunakan

elektroforesis gel agarose 0,8% yang dilarutkan dalam TBE 1X. Sebelum

dimasukkan DNA ke dalam well agarose terlebih dahulu ditambahkan dengan 2 µl

loading dye dalam 3 µl DNA. Running elektroforesis dilakukan dengan tegangan

50 V, 40A, dalam waktu 60 menit.

Gel agarose kemudian direndam dalam larutan EtBr (Etidium Bromida)

selama 15 menit. Band DNA dilihat pada transiluminator UV. Hasil elektroforesis

menunjukkan berhasil tidaknya isolasi DNA, Pada sampel yang tidak tampak

band DNAnya maka tidak dilanjutkan ke tahap selanjutnya, sebab tidak terdapat

DNA pada sampel DNA tersebut.

 36

3.6.5 Amplifikasi DNA

Amplifikasi DNA dilakukan dengan reaksi berantai polymerase (PCR =

polymerase chain reaction). Hasil isolasi DNA genom dari sampel darah pasien

hipertensi diamplifikasikan menggunakan teknik PCR dengan primer ACE

Applied Biosystems 111, 112. forward 5’- CCC ATC CTT TCT CCC ATT TCT C

-3’dan primer ACE reverse 5’- AGC TGG AAT AAA ATT GGC GAA AC -3’.

Komposisi larutan PCR yaitu 8µl ddH2O Otsuka, 10µl Master Mix Kit Intron, 1 µl

DNA whole Genom, dan primer F dan R (20pmol) masing- masing 0,5 µl,

sehingga volume total 20 µl.

Kondisi PCR yang digunakan diawali dengan predenaturation 950C

selama 15 menit, kemudian denaturation selama 45 detik dengan suhu 950C.

Annealing 62,30C selama 45 detik, extention 720C selama 45 detik, dari tahap

denaturation sampai extention dilakukan pengulangan sebanyak 34 siklus.

Kemudian dilanjutkan dengan post-extention 720C selama 10 menit, dan disimpan

pada suhu 40C.

3.6.6 Visualisasi Hasil PCR

Visualisasi hasil PCR dilakukan menggunakan elektroforesis horizontal

dengan gel agarosa 2,5% dalam larutan buffer TBE 1X. Sampel yang akan

dirunning elektroforesis, dimasukkan ke dalam sumuran/ well yang telah dicetak

 37

pada agarosa sebanyak 5µl setiap sumuran, dan salah satu sumuran dimasukkan

DNA marker 100bp sebanyak 4µl. Elektroforesis dilakukan dengan voltase 50 V,

selama 120 menit. Kemudian, setelah selesai elektroforesis gel agarose di

keluarkan dari bak elektroforesis dan direndam dalam EtBr selama 15 menit.

Selanjutnya dilihat dengan trasiluminator UV (gel doc).

3.6.7 Uji Konfirmasi Genotip ID

Hasil amplifikasi yang memunculkan satu pita berukuran 319bp dilakukan

reamplifikasi (diamplifikasi kembali) menggunakan primer spesifik insersi dengan

sequence primer forward 5’-TGG GAC CAC AGC GCC CGC CAC TAC -3’ dan

reverse 5’-TCG CCA GCC CTC CCA TGC CCA TAA -3’. Dengan kondisi PCR

predenaturation 950C selama 15 menit, kemudian denaturation selama 45 detik

dengan suhu 950C. Annealing 500C selama 45 detik, extention 720C selama 45

detik, dari tahap denaturation sampai extention dilakukan pengulangan sebanyak

34 siklus. Kemudian dilanjutkan dengan post-extention 720C selama 10 menit, dan

disimpan pada suhu 40C.

3.6.8 Analisis Data

Hasil visualisasi PCR dengan gel agarose 2,5%, akan menunjukkan

genotip dari setiap sampel. Genotip tersebut antara lain II, ID, dan DD. Ukuran

band untuk alel I yaitu 597 pb dan untuk alel D yaitu 319 pb. Apabila hanya

muncul satu band dan berukuran 597pb maka genotipnya II atau muncul satu band

dan berukuran 319pb maka genotipnya DD. Sedangkan, apabila muncul dua band

berukuran 597pb dan 319pb maka genotipnya ID (Borah et al., 2011).

Genotip ID terkadang hanya muncul satu band pada ukuran 319bp,

sehingga perlu di PCR kembali dengan primer spesifik insersi. Sekuen forward 5’-
 38

TGG GAC CAC AGC GCC CGC CAC TAC -3’ dan sekuen referse 5’-TCG CCA

GCC CTC CCA TGC CCA TAA -3’. Apabila muncul band maka sampel tersebut

bergenotip ID, sedangkan apabila tidak muncul maka sampel tersebut bergenotip

DD. Hasil visualisasi seluruh sampel dicatat dan dihitung persentase jumlah

pasien hipertensi yang memiliki genotipe II, ID dan DD. Hasil persentase genotip

dapat digunakan untuk mencari frekuensi alel dengan menggunakan hukum Hardy

– Weinberg yaitu (Salem and Batzer, 2009) :

p2+2pq+q2 = 1 dan p+q = 1

p2 merupakan fraksi dari genotip dominan heterozigot dalam penelitian ini

mewakili II (insersi – insersi). 2pq merupakan fraksi dari genotip heterozigot ID

(insersi – delesi). q2 merupakan fraksi genotip homozigot resesif dalam penelitian

ini mewakili DD (delesi – delesi) (Elrod and Stansfield, 2007).

p dan q dalam perhitungan diatas melambangkan alel, dimana p dianggap

sebagai alel I (insersi) dan q dianggap sebagai alel D (delesi) (Salem and Batzer,

2009). Sehingga, rumus menghitung frenkuensi alel menjadi :

II + 2ID + DD = 1 dan I + D = 1