The Journal Of Muhammadiyah Medical Laboratory Technologist

No.4Vol.2November 2021
p-ISSN: 2597-3681 e-ISSN:2614-2805

Uji Kualitas DNA Darah Pada Kertas Whatman Yang Diisolasi Dengan
CHELEX-100 Serta Variasi Waktu Penyimpanan
Rita Maliza1,2*, Lutfi Sukma Pratiwi1, Dyah Aryani Perwitasari3

1) Program Studi Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi Terapan, Universitas Ahmad
Dahlan Yogyakarta
2) Laboratorium Bioteknologi dan Biokimia, Program Studi Biologi, Fakultas Sains dan
Teknologi Terapan, Universitas Ahmad Dahlan Yogyakarta
3) Fakultas Farmasi, Universitas Ahmad Dahlan, Yogyakarta

Correspondence to: [email protected]

ABSTRACT

Pita DNA Submit:

Tanggal DNA extraction from dried blood spots was used for
200 bp 2021
14 April molecular analysis. Dried blood spots samples usually used FTA
cards, but short-term use would come at a cost. This study aims
Tanggal Review: to identify DNA extraction quality from dried blood spots in
23 Oktober 2021
Whatman filter paper as an alternative storage sample. This study
Tanggal Publish used 15 samples with three different storage times for 1, 3, and 7
Online: days on 4°C. Dried blood samples were extracted using the
2 Desember 2021
Chelex-100 method, and qualitative were identified by
electrophoresis. The DNA extraction was used as a template for
PCR amplification of the gapdh gene. The result showed that
DNA extraction showed bands from 1, 3, and 7 days, and PCR
amplification showed bands in 200 bp. In conclusion, DNA from
dried blood samples was stored for 1, 3 and 7 days in Whatman
filter paper were successfully extracted by the Chelex-100
method and can be used as a DNA template for PCR
amplification.

Keywords: Chelex-100, Dried Blood Spot, Electrophoresis,

Gapdh, PCR

PENDAHULUAN Penyimpanan sampel DBS umumnya

Isolasi darah kering atau dried dilakukan dengan menggunakan Flinders
blood spots (DBS) merupakan metode Technology Associates (FTA) cards.
alternatif yang digunakan untuk Sampel FTA dapat disimpan dalam
mengambil dan menyimpan sampel jangka waktu yang lama hingga 17 tahun
darah pada kertas saring. Penerapan (Mullen et al., 2009; Halfon et al., 2012).
metode ini telah dimanfaatkan untuk Bioanalisis menggunakan FTA
diagnosa medis, pengawasan obat, dan cards membutuhkan biaya yang cukup
analisis genetika (Choi et al., 2014). besar untuk penelitian yang akan

113
Maliza, R., Lutfi, S. P., Dyah, A. P. 2021. Uji Kualitas DNA Darah Pada Kertas Whatman Yang Diisolasi
Dengan CHELEX-100 Serta Variasi Waktu Penyimpanan. Surabaya : The Journal of Muhamadiyah
Medical Laboratory Technologist. Vol: 4, No.2 (113-119).
 The Journal Of Muhammadiyah Medical Laboratory Technologist
No.4Vol.2November 2021
p-ISSN: 2597-3681 e-ISSN:2614-2805

dilakukan dalam jangka waktu yang hari dengan masing-masing kelompok

singkat dan sampel dalam jumlah yang berjumlah 5 sampel.
banyak, karena harga FTA cards yang Isolasi DNA menggunakan
mahal. Smit et al. (2014) melaporkan metode Chelex-100. Sampel pada kertas
isolasi DNA proviral HIV-1 dengan Whatman dipotong-potong dengan
menggunakan kertas Whatman ukuran ± 2 mm, selanjutnya dimasukkan
memperlihatkan sensitivitas dan ke dalam tube 1,5 mL. Sampel
spesifitas deteksi sangat tinggi yaitu ditambahkan larutan Chelex-100 5%
berkisar dari 97–100%. Dikshit et al. sebanyak 180 µL yang sebelumnya telah
(2019) melakukan isolasi DNA dari dipanaskan pada suhu 100 ⁰C. Sampel
kertas Whatman untuk meneliti penyakit diinkubasi selama 10 menit pada suhu 99
epidemik, diperoleh konsentrasi DNA ⁰ C kemudian disentrifugasi pada
yang berkisar dari 64.8-720 ng/µL dan kecepatan 12.000 g selama 7 menit.
dapat digunakan untuk analisis PCR. Filtrat diambil dan disimpan pada suhu -
Berdasarkan penelitian sebelumnya, 20 ⁰C. Uji kualitatif DNA dengan metode
belum adanya studi yang menguji elektroforesis menggunakan konsentrasi
keberhasilan isolasi DNA darah kering gel agarose 1 % selama 30 menit dan
yang disimpan pada kertas Whatman voltase 100 A.
dengan variasi waktu penyimpanan Analisis amplifikasi DNA hasil isolasi
sampel selama 3, 5 dan 7 hari. Tujuan dilakukan dengan menggunakan primer
pada penelitian ini ingin melihat kualitas spesifik gen Gapdh (forward: AGG TGA
DNA yang dihasilkan dan analisis lanjut AGG TCG GAG TCA ACG dan reverse:
dengan amplifikasi gen sepsifik. GAT GAC AAG CTT CCC GTT CTC
AG). Program denaturasi awal suhu 94
METODE PENELITIAN °C selama 5 menit, denaturasi 94 °C
Jenis penelitian ini ialah selama 30 detik, Annealing suhu 61 °C
deskriptif kualitatif yang bertujuan untuk selama 30 detik. Extension pada suhu 72
melihat kualitas isolasi DNA sampel °C, 40 detik, final extension suhu 72 °C
darah yang disimpan dalam variasi waktu selama 4 menit, dan proses amplifikasi
berbeda pada kertas Whatman no. 42 dilakukan sebanyak 35 siklus. Hasil
dengan menggunakan metode isolasi amplifikasi PCR dielektroforesis dengan
DNA chelex 100. Sampel yang
digunakan merupakan darah wholeblood
yang dibagi menjadi tiga kelompok
perlakuan penyimpanan, yaitu 1, 3, dan 7

114
Maliza, R., Lutfi, S. P., Dyah, A. P. 2021. Uji Kualitas DNA Darah Pada Kertas Whatman Yang Diisolasi
Dengan CHELEX-100 Serta Variasi Waktu Penyimpanan. Surabaya : The Journal of Muhamadiyah
Medical Laboratory Technologist. Vol: 4, No.2 (113-119).
 The Journal Of Muhammadiyah Medical Laboratory Technologist
No.4Vol.2November 2021
p-ISSN: 2597-3681 e-ISSN:2614-2805

konsentrasi agarose 2% selama 80 menit

60 A dan DNA ladder 100 bp.

HASIL PENELITIAN
Identifikasi secara makroskopis
sampel kertas Whatman dan FTA cards
tidak mengalami perubahan warna
sampel yang signifikan baik setelah
darah ditotolkan ataupun setelah
disimpan dalam jangka waktu 1, 3, dan 7
hari karena temperatur dan kelembapan
telah terkontrol (Gambar 1).
Isolasi DNA dilakukan dengan
langkah awal memotong sampel kertas
Whatman menjadi ukuran yang lebih
kecil yang bertujuan untuk memudahkan
proses pelepasan sel dari kertas Gambar 1. Maksroskopis sampel darah
kering sampel kertas Whatman. (A)
Whatman. Sampel darah yang telah setelah ditotolkan darah. (B) setelah
diisolasi selanjutnya diuji secara disimpan selama 1 hari. (C) setelah
disimpan selama 3 hari. (D) setelah
kualitatif dengan elektroforesis untuk disimpan selama 7 hari. (E) sampel
melihat kualitas DNA. Hasil uji kualitatif darah FTA cards.
sampel kertas Whatman satu hari
ditunjukkan pada Gambar 2 A, pita DNA Hasil uji kualitatif sampel kertas

terlihat pada seluruh sampel berupa pita Whatman tiga hari ditunjukkan oleh

tunggal, pita terlihat jelas pada K+, S1, Gambar 2 B. Pita DNA tampak memiliki

dan S2. S3, S4, dan S5 memiliki pita smear, redup dan lebih tipis pada S2 dan

DNA yang terlihat kurang tajam dan S4. Perbandingan dengan pita DNA pada

smear. K+, S1, S3, dan S5 yaitu berupa pita

tunggal dan memiliki pendaran yang
lebih jelas. Hasil uji kualitatif sampel
kertas Whatman tujuh hari ditunjukkan
pada Gambar 2 C. Pita DNA yang terlihat
pada seluruh sampel merupakan pita
tunggal yang tidak memiliki smear.

115
Maliza, R., Lutfi, S. P., Dyah, A. P. 2021. Uji Kualitas DNA Darah Pada Kertas Whatman Yang Diisolasi
Dengan CHELEX-100 Serta Variasi Waktu Penyimpanan. Surabaya : The Journal of Muhamadiyah
Medical Laboratory Technologist. Vol: 4, No.2 (113-119).
 The Journal Of Muhammadiyah Medical Laboratory Technologist
No.4Vol.2November 2021
p-ISSN: 2597-3681 e-ISSN:2614-2805

Pendaran pita tampak redup dan tidak aplifikasi. Pita DNA hasil amplifikasi
terlalu tajam. gen gapdh terlihat di seluruh perlakuan
penyimpanan yaitu 1, 3, dan 7 hari
dengan persentase keberhasilan 100%.

Pita DNA

Pita DNA

Pita DNA

Gambar 2. Visualisasi hasil

elektroforesis uji kualitatif DNA Gambar 3. Visualisasi DNA hasil amplifikasi
sampel kertas Whatman dengan PCR gen Gapdh. (A) sampel kertas
metode Chelex-100. (A) satu hari, (B) Whatman satu hari. (B) sampel kertas
tiga hari, (C) tujuh hari. K+ sampel Whatman tiga hari. (C) sampel kertas
darah FTA Cards; S1-S5 sampel Whatman tujuh hari. K+ sampel darah
(Agarose 1 %, 30 menit dan voltase FTA Cards; K – DNA template berupa
100 A) ddH2O; S1-S5 sampel (ladder 100 bp;
Agarose 2%, 80 menit dan voltase 60
A.).
Sampel yang telah selesai diuji
kualitatif selanjutnya dilakukan proses PEMBAHASAN
amplifikasi PCR untuk mengetahui Sampel darah kering kertas
apakah DNA yang diisolasi dari sampel Whatman tampak berbentuk lingkaran
darah pada kertas Whatman dapat dan memiliki warna merah baik sesaat
digunakan sebagai DNA template untuk setelah ditotolkan ataupun setelah
amplifikasi segmen DNA yang spesifik. penyimpanan selama 1, 3, dan 7 hari
Primer Gapdh yang digunakan pada (Gambar 1). Perbandingan dengan
penelitian ini menujukkan produk hasil sampel kertas Whatman dan FTA cards
amplifikasi pada panjang 200 bp menunjukkan tidak terdapat perbedaan
(Gambar 3) sesuai dengan target yang signifikan dan telah sesuai dengan

116
Maliza, R., Lutfi, S. P., Dyah, A. P. 2021. Uji Kualitas DNA Darah Pada Kertas Whatman Yang Diisolasi
Dengan CHELEX-100 Serta Variasi Waktu Penyimpanan. Surabaya : The Journal of Muhamadiyah
Medical Laboratory Technologist. Vol: 4, No.2 (113-119).
 The Journal Of Muhammadiyah Medical Laboratory Technologist
No.4Vol.2November 2021
p-ISSN: 2597-3681 e-ISSN:2614-2805

persyaratan sampel darah kering yang menunjukkan pendaran pita yang redup
baik, yaitu darah berada di daerah sampel di seluruh sampel dan memiliki smear
dan tidak saling bertumpukkan antara (Gambar 2). Semakin berpendar dan
droplet satu dengan yang lain (Veenhof et tajam pita DNA menandakan konsentrasi
al., 2019). Sampel darah kering perlu DNA yang tinggi (Stephenson, 2011;
disimpan dalam kondisi yang stabil untuk Wang et al., 2017). Hasil uji kualitatif
mempertahankan tampilan makroskopis yang menunjukkan pendaran pita yang
dan integritas sampel. Tingkat redup menandakan konsentrasi DNA
kelembapan yang tinggi dapat yang tidak terlalu tinggi. Panda et al.
menyebabkan terjadinya difusi darah (2019) melaporkan bahwa proses
pada kertas saring sehingga daerah pemanasan dapat menyebabkan
sampel akan melebar dan warna pudar denaturasi pada double stranded DNA
(Denniff et al., 2010). Selain itu, dapat sehingga menjadi single stranded DNA
menyebabkan terjadinya hidrolisis dan yang kurang stabil pada waktu
memicu pertumbuhan mikroorganisme penyimpanan. Pita DNA yang memiliki
(Vu et al., 2011). smear menandakan bahwa hasil isolasi
Chelex-100 merupakan resin DNA terdapat kontaminan seperti
yang tersusun dari styrene protein, RNA, DNA yang terdegradasi,
divinylbenzene copolymers yang ataupun larutan isolasi (Mawardi et al.,
memiliki sepasang ion iminodiasetat 2020). Sutrisno et al. (2013) melaporkan
yang berfungsi sebagai pengikat ion bahwa terdapat resiko chelating agent
logam polivalen seperti Mg2+ yang akan ikut larut dalam proses isolasi.
melindungi DNA dari enzim nuklease. Visualisasi hasil amplifikasi gen
Satu sampel darah kering memerlukan 50 Gapdh pada sampel kertas Whatman
- 60 Chelex beads untuk proses isolasi. menunjukkan pita DNA yang terang dan
pH yang dibutuhkan berkisar dari pH tajam tetapi masih terdapat smear atau
netral sampai dengan asam (< 4.0) pengotor (Gambar 3). Al-griw et al.
(Panda et al. 2019). Hasil isolasi dengan (2017) melaporkan bahwa penggunaan
metode ini berwarna merah, hal tersebut Chelex-100 untuk isolasi DNA dapat
menunjukkan masih terdapat pengotor mengurangi keberadaan PCR inhibitor
pada DNA. Fatchiyah et al. (2011) yang dapat menghambat proses
melaporkan bahwa warna merah amplifikasi seperti komponen prophyrin
menandakan masih terdapat eritrosit. dalam darah. Coleman (2017) dan
Hasil visualisasi elektroforsis Acharya et al. (2017) melaporkan
DNA sampel kertas Whatman kontaminan dapat berupa protein, RNA,

117
Maliza, R., Lutfi, S. P., Dyah, A. P. 2021. Uji Kualitas DNA Darah Pada Kertas Whatman Yang Diisolasi
Dengan CHELEX-100 Serta Variasi Waktu Penyimpanan. Surabaya : The Journal of Muhamadiyah
Medical Laboratory Technologist. Vol: 4, No.2 (113-119).
 The Journal Of Muhammadiyah Medical Laboratory Technologist
No.4Vol.2November 2021
p-ISSN: 2597-3681 e-ISSN:2614-2805

cross-contamination antar sampel, DAFTAR PUSTAKA

kontaminan dari lingkungan. Keberadaan Acharya, K. R. et al. (2017) ‘PCR
Inhibition of a Quantitative PCR
kontaminan ini akan menghasilkan
for Detection of Mycobacterium
produk PCR yang relatif rendah karena avium Subspecies
Paratuberculosis DNA in Feces :
energi yang dibutuhkan lebih besar untuk
Diagnostic Implications and
mengamplifikasi DNA target Potential Solutions’, 8(February),
pp. 1–13.
(Syafarruddin, 2011). Konsentrasi DNA
yang rendah akan menyebabkan pita Al-griw, H. H. et al. (2017) ‘Effects of
storage temperature on the
DNA yang tipis dan redup (Putri, 2015).
quantity and integrity of genomic
Keberhasilan metode Chelex-100 untuk DNA extracted from mice tissues :
A comparison of recovery
menghasilkan isolat DNA yang dapat
methods’, 7, pp. 239–243.
dijadikan template untuk amplifikasi
Choi, E. H. et al. (2014) ‘Rapid DNA
PCR juga telah dilaporkan oleh Walsh Extraction from Dried Blood Spots
(2013) yang menggunakan sampel semen on Filter Paper: Potential
Applications in Biobanking’,
dan bercak darah untuk mendeteksi gen Osong Public Health and Research
DQα. Pada penelitian ini semua DNA Perspectives, 5(6), pp. 351–357.
pada sampel yang diisolasi dari kertas Coleman, W. B. and Tsongalis, G. J.
Whatman dengan waktu penyimpanan (2017) Pathology — The
Polymerase Chain Reaction,
berbeda dapat dijadikan DNA template Diagnostic Molecular Pathology.
untuk diamplifikasi. Hasil amplifikasi Elsevier Inc.
menggunakan primer Gapdh pada 200 bp Denniff, P. and Spooner, N. (2010)
memperlihatkan semua sampel dengan ‘Effect of storage conditions on the
weight and appearance of dried
variasi penyimpanan dapat teamplifikasi blood spot samples on various
dengan baik, meskipun terdapat smear cellulose-based substrates’,
Bioanalysis, 2(11), pp. 1817–
yang disebabkan oleh pengotor pada 1822.
hasil isolasi DNA tetapi hasil amplifikasi
Dikshit, R. et al. (2019) ‘Optimization of
dapat diidentifikasi dengan jelas. extraction of genomic DNA from
archived dried blood spot (DBS):
Potential application in
KESIMPULAN epidemiological research & bio
DNA sampel darah kering pada banking’, Gates Open Research, 2,
pp. 1–19.
kertas Whatman yang disimpan selama 1,
3, dan 7 hari dapat diisolasi dengan Halfon, P. et al. (2012) ‘Detection of
IL28B SNP DNA from buccal
metode Chelex-100 dan dapat dijadikan epithelial cells, small amounts of
DNA template untuk diamplifikasi serum, and dried blood spots’,
PLoS ONE, 7(3), pp. 1–6.
dengan primer gen target.

118
Maliza, R., Lutfi, S. P., Dyah, A. P. 2021. Uji Kualitas DNA Darah Pada Kertas Whatman Yang Diisolasi
Dengan CHELEX-100 Serta Variasi Waktu Penyimpanan. Surabaya : The Journal of Muhamadiyah
Medical Laboratory Technologist. Vol: 4, No.2 (113-119).
 The Journal Of Muhammadiyah Medical Laboratory Technologist
No.4Vol.2November 2021
p-ISSN: 2597-3681 e-ISSN:2614-2805

Mawardi, A., Maury, H. K. and Maladan, Sutrisno, I. K., Arundina, I. and Agung
Y. (2020) ‘Analisis Perbandingan Sosiawan, D. (2013) Identifikasi
Kualitas Produk Amplikon Gen bite marks dengan ekstraksi DNA
PMSA-2 Antara Spesimen Spot metode Chelex (Bite marks
Darah Kering dan Vena’, 12(1), identification with Chelex
pp. 10–18. methods in DNA extraction),
Dental Journal (Majalah
Mullen, M. P. et al. (2009) ‘A note on the Kedokteran Gigi).
use of FTATM technology for
storage of blood samples for DNA Syafaruddin dan T.J. Santoso. (2011)
analysis and removal of PCR Optimasi Teknik Isolasi dan
inhibitors’, Irish Journal of Purifikasi DNA yang Efisien dan
Agricultural and Food Research, Efektif Pada Kemiri Sunan
48(1), pp. 109–113. (Reutalis trisperma (Blanco).
Jurnal Littri 17: 11-17.
Panda, B. B., Meher, A. S. and Hazra, R.
K. (2019) ‘Comparison between Veenhof, H. et al. (2019) ‘Performance of
different methods of DNA a web-based application
isolation from dried blood spots measuring spot quality in dried
for determination of malaria to blood spot sampling’, Clinical
determine specificity and cost Chemistry and Laboratory
effectiveness’, Journal of Parasitic Medicine, 57(12), pp. 1846–1853.
Diseases, 43(3), pp. 337–342.
Vu, D. H. et al. (2011) ‘Dried Blood
Putri, N.P.P.E., dan Junitha, E. I. (2015) Spots : A New Tool for
Kualitas Dan Kuantitas Dna Darah Tuberculosis Treatment
Kering Pada Besi Dan Kayu Yang Optimization’, pp. 2931–2939.
Disimpan Dalam Kurun Waktu
Berbeda. Jurnal Biologi 19 (1): 21 Walsh, P. S., Metzger, D. A. and Higuchi,
- 24. R. (2013) ‘Biotechniques 30th
anniversary gem Chelex 100 as a
Smit, P. W. et al. (2014) ‘Review article: medium for simple extraction of
An overview of the clinical use of DNA for PCR-based typing from
filter paper in the diagnosis of forensic material’, BioTechniques,
tropical diseases’, American 54(3), pp. 506–513.
Journal of Tropical Medicine and
Hygiene, 90(2), pp. 195–210. Wang, Y. et al. (2017) ‘Binding
Mechanism of Fluorescent Dyes to
Stephenson, F. H. (2011) Calculations for DNA Characterized by Magnetic
Molecular Biology and Tweezers’, in Materials Today:
Biotechnology: A Guide to Proceedings. Elsevier Ltd, pp.
Mathematics in Laboratory S218–S225.
Second Edition. USA: Elsevier
Inc.

119
Maliza, R., Lutfi, S. P., Dyah, A. P. 2021. Uji Kualitas DNA Darah Pada Kertas Whatman Yang Diisolasi
Dengan CHELEX-100 Serta Variasi Waktu Penyimpanan. Surabaya : The Journal of Muhamadiyah
Medical Laboratory Technologist. Vol: 4, No.2 (113-119).