TEKNIK ISOLASI DNA

PADA HEWAN EUKARIOTIK

 TUJUAN :
ISOLASI DNA TANAMAN BAYAM (Amaranthus sp) DAN IKAN LELE
(Clarias sp) SEBAGAI KAJIAN DALAM BIOLOGI MOLEKULER
( JUNAL 1 )
Salah satu rangkaian teknik rekayasa genetika adalah isolasi DNA, yang
melibatkan suatu proses memindahkan DNA dari suatu organisme ke
organisme lain dengan tujuan tertentu. Melalui isolasi DNA kita dapat
memeroleh DNA murni, yaitu tanpa protein maupun RNA dari suatu sel
dalam jaringan. DNA murni yang sudah diperoleh dapat digunakan sebagai
bahan pengayaan pokok bahasan sel yaitu DNA berada di sel tumbuhan
maupun hewan, sebagai kajian genetika bahwa gen merupakan bagian dari
DNA (terdapat sebagai lokus-lokus) yang berfungsi untuk mengontrol
perkembangan fisik maupun perilaku dari setiap mahluk hidup, sebagai
kajian bioteknologi yang jika kita kaji lebih lanjut salah satu kemanfaatannya
yaitu sebagai tanaman transgenik.
 PERBANDINGAN METODE ISOLASI DNA PADA PRODUK
PERIKANAN SEGAR DAN OLAHAN ( JURNAL 2 )

Penelitian ini bertujuan untuk menentukan konsentrasi

dan kemurnian DNA berdasarkan beberapa metode
isolasi pada produk perikanan segar dan olahan. Metode
isolasi DNA yang digunakan pada penelitian ini adalah
metode konvensional cetyl trimethylammonium bromide
(CTAB) dan beberapa kit komersial (DNAzol, TianGen,
Qiagen, dan Fasmac).
 PERBANDINGAN METODE LISIS JARINGAN HEWAN DALAM
PROSES ISOLASI DNA GENOM PADA ORGAN LIVER TIKUS
PUTIH (Rattus norvegicus) (JURNAL 3 )

Isolasi DNA bertujuan untuk memisahkan DNA

dari partikel-partikel lainnya seperti lipid, protein,
polisakarida, dan zat lainnya. Isolasi DNA
berguna untuk beberapa analisis molekuler dan
rekayasa genetika seperti genom editing,
transformasi dan PCR.
 TEKNIK ISOLASI DNA SEL HAYATI AYAM
SECARA TRADISIONAL ( JURNAL 4 )

Tujuan praktik ini ialah menggunakan

teknik isolasi DNA secara tradisional
dengan menggunakan bahan isolasi DNA
berupa hati ayam yang mudah diperoleh
dari ekstrasi mandiri sel daun papaya.
 AMPLIFIKASI FRAGMEN GEN 18S rRNA PADA DNA
METAGENOMIK MADU DENGAN TEKNIK PCR
(POLYMERASE CHAIN REACTION) ( JURNAL 5 )

Tujuan nya ialah untuk menganalisis komposisi

kandungan kimia pada madu sebagai acuan
untuk membedakan antara madu asli dengan
madu palsu. Kandungan yang dimaksud adalah
kadar gula pereduksi, kadar HMF
(hidroksimetilfurfural), nilai pH, sukrosa, dan
kadar Air.
ISOLASI DAN KUANTIFIKASI RNA PADA ORGAN USUS IKAN
BETOK (ANABAS TESTUDINEUS) DENGAN MENGGUNAKAN
METODE ISOGEN/GENEZOL ( JURNAL 6 )

Tujuan Isolasi asam nukleat adalah salah satu

teknik yang dapat membuang dan memisahkan
asam nukleat dari komponen sel lainnya (protein,
karbohidrat, lemak, dll) sehingga asam nukleat
yang diperoleh dapat dianalisis atau dimodifikasi
lebih lanjut dengan teknik biologi molekular
lainnya.
ANALISIS DNA MIKROSATELIT UNTUK IDENTIFIKASI
PATERNITAS PADA BERUK (MACACA NEMESTRINA) DI
PENANGKARAN PUSAT STUDI SATWA PRIMATA IPB ( JURNAL 7 )

Penelitian bertujuan untuk menentukan

paternitas karakteristik genetik dan sosial
yang berkorelasi dengan ukuran kelompok
simpanse yang dikandangkan.
 PELACAKAN GEN AEROLYSIN DARI AEROMONAS
HYDROPHILA PADA IKAN MAS YANG DIBERI PAKAN
EKSTRAK BAWANG PUTIH ( JURNAL 8 )

Penelitian ini menggunakan primer olygonukleotida

sintetis bertujuan untuk melacak gen aerolysin dari A.
hydrophila pada ikan mas yang diberi pakan mengandung
ekstrak bawang putih selama 30 hari kemudian diinfeksi
dengan A. hydrophila. Polymerase Chain Reaction (PCR)
dapat mendeteksi gen aerolysin dari A. hydrophila
IDENTIFIKASI MOLEKULER KAPANG ASOSIASI
SPONS MENGGUNAKAN METODE DNA
BARCODING ( JURNAL 9 )

Tujuan dari penelitian ini adalah mengidentifikasi

dua isolat kapang yang telah diisolasi dari inang
spons di ekosistem mangrove dengan
menggunakan DNA barcoding.
AMPLIFIKASI DNA GEN MEAT TENDERNES PADA
SAPI BALI (Bos sondaicus) ( JURNAL 10 )

Tujuan bagimanakah profil hasil amplifikasi DNA

untuk komposisi karkas yang diinginkan dan sifat
kualitas daging pada sapi Bali. Profil hasil
amplifikasi DNA pada meat tenderness dijadikan
sebagai langkah awal untuk analisis polimorfisme
gen tersebut pada sapi Bali.
 Prosedure Kerja
Prinsip dasar isolasi DNA umumnya terdiri atas perbanyakan
atau kultivasi sel sehingga diperoleh DNA dalam jumlah
besar. Kultivasi sel kemudian diakhiri dengan panen sel pada
saat usia sel mencapat tingkat pembelahan tertinggi dan
kepadatan sel terbesar. Selanjutnya dilakukan pemecahan
dinding sel dengan bantuan enzim. Pada saat itu, dibutuhkan
Konsentrasi DNA dihitung dengan rumus:
detergen untuk membantu lisis inti sel dan melepaskan
DNA. Sel biasanya akan lisis dalam larutan SDS yang Konsentrasi DNA (g/ml) = Abs OD260 x 50
mengandung sukrosa. Sukrosa dibutuhkan untuk g/ml x pengenceran Konsentrasi DNA aktual
meningkatkan viskositas sel dan membantu mengeluarkan (g) = Konstr DNA (g/ml) x volume aktual
DNA. Setelah DNA diperoleh maka harus dilindungi dari (l) 100.
nuklease dan dibebaskan dari kontaminasi protein lain.
Kontaminasi protein akan menghambat reaksi enzimatik
pada tahap manipulasi berikutnya. Aktivitas nuklease akan
dihambat oleh EDTA sedangkan degradasi protein akan
dilakukan oleh Protease K.
 ISOLASI DNA TANAMAN BAYAM (Amaranthus sp) DAN IKAN LELE (Clarias sp)
SEBAGAI KAJIAN DALAM BIOLOGI MOLEKULER
( JUNAL 1 )

Prosedur Kerja Isolasi DNA Ikan Lele

Sebanyak 5 gram daging ikan lele dicuci lalu Data yang dihasilakn berupa gumpalan DNA
direndam dalam larutan NACl 80% selama 2 menit. Daging yang berwana putih keruh yang berasal dari atas
lele ditiriskan lalu direbus menggunakan mortar dan pistel permukaan larutan. Dimana akan terbentuk 3
dan ditambahkan 2,5 ml aquadest. Ekstrak daging ikan lele lapisan yaitu lapisan bawah filtrat, tengah
disaring menggunakan kertas saring atau kain bersih dan ethanol dan lapisang paling atas adalah
ditampung di beaker glass 250 ml. larutan hasil saringan gumpalan DNA. Data akan dianalisis secara
ditambahkan 2 ml laurutan (1 sendok detergent + 1 sendok deskriptif isolasi DNA pada ikan lele.
garam dalam 50 ml aquadest). Larutan dipindahkan ke dalam
tabung reaksi dan ditambahkan dengan 2 ml ekstrak buah
papaya yang telah digerus (20 gram tanpa ditambah
aquadest). Ditambahkan 5 ml ethanol 96% dingin perlahan-
lahan melewati dinding tabung reaksi. Diamati DNA yang
terbentuk.
 PERBANDINGAN METODE ISOLASI DNA PADA PRODUK PERIKANAN SEGAR
DAN OLAHAN
( JURNAL 2 )

Prosedur Kerja Isolasi DNA Pada Produk Perikanan Segar Dan Olahan
Isolasi DNA sampel dengan metode CTAB

Isolasi DNA menggunakan metode CTAB mengacu pada metode Hseih et al.
(2005) menggunakan larutan CTAB 2% yang memiliki komposisi 100 mL Tris
HCl 1M pH 8, 280 mL NaCl 5M, 40 mL asam etilenadiaminatetraasetat (EDTA)
0,5 M, 20 g CTAB, dan 1 L akuades. Isolasi diawali dengan penimbangan masing-
masing sampel sebanyak 0,1-0,5 g. Sampel ditambah 500 μL larutan CTAB 2%
dan 14 μL proteinase K, selanjutnya dilakukan inkubasi pada suhu 55 °C selama 2
jam. Cairan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 13.000 g selama 10 menit.
Endapan yang diperoleh ditambahkan larutan PCI (fenol, kloroform,
isomilalkohol) sebanyak 500 μL. Campuran tersebut dihomogenisasi dan
disentrifugasi 13.000 g selama 5 menit. Langkah selanjutnya natan dibuang dan
ditambahkan 400 μL larutan CIA (kloroform dan isoamil alkohol).
 PERBANDINGAN METODE ISOLASI DNA PADA PRODUK PERIKANAN SEGAR
DAN OLAHAN
( JURNAL 2 )

Isolasi DNA sampel dengan kit isolasi DNAzol Genomic DNA Isolation
Reagent

Proses isolasi DNA menggunakan kit komersial DNAzol® Genomic DNA Isolation Reagent
pada ikan segar dan produk olahan dimulai dengan menimbang 25 mg sampel kemudian
dipindahkan ke dalam microtube. Sampel tersebut ditambahkan 1 mL DNAzol genomic.
Suspensi selanjutnya diaduk sebanyak 10× di dalam microtube dan disimpan pada suhu ruang
selama 10 menit. Sampel disentrifugasi pada kecepatan 10.000 g selama 10 menit.
Supernatan yang diperoleh lalu dipindahkan ke dalam microtube baru. Supernatan
ditambahkan 0,5 mL etanol 100%, lalu diaduk dengan cara microtube dibolak-balik sebanyak 8
kali, kemudian disimpan pada suhu ruang selama 3 menit. Apabila terbentuk serabut putih
(DNA) maka dilakukan penempelan DNA pada dinding microtube dengan tip, namun apabila
tidak terbentuk serabut putih (DNA) maka akan dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 5.000 g
selama 5 menit, lalu supernatan dibuang.
 PERBANDINGAN METODE ISOLASI DNA PADA PRODUK PERIKANAN SEGAR
DAN OLAHAN
( JURNAL 2 )

Isolasi DNA sampel dengan kit isolasi TIANamp Genomic DNA Kit (TianGen)

Sampel selanjutnya ditambahkan dengan 200

µL etanol (96-100%), kemudian dihomogenisasi
Isolasi DNA menggunakan kit komersial TIANamp dengan vortex dan di-spin down. Filtrat dipindahkan
Genomic DNA Kit, TianGen diawali dengan ke dalam spin column dan disentrifugasi dengan
menimbang sampel sebanyak 10- 25 mg diletakkan kecepatan 12.000 g selama 30 detik. Supernatan yang
dalam microtube. Sampel tersebut ditambahkan dihasilkan dibuang kemudian ditambahkan 700 µL
dengan 200 µL bufer GA dan 20 µL proteinase-K,
bufer PW dan disentrifugasi dengan kecepatan
kemudian dihomogenisasi dengan vortex dan di-
spin down. Sampel kemudian diinkubasi pada suhu 12.000 g selama 30 detik. Supernatan yang
56 °C selama 2 jam. Sampel kemudian dihasilkan dibuang, kemudian ditambahkan 500 µL
ditambahkan dengan 200 µL bufer GB, lalu bufer PW dan disentrifugasi dengan kecepatan
dihomogenisasi dengan vortex dan di-spin down 12.000 g selama 30 detik, selanjutnya dilakukan
kemudian diinkubasi kembali pada suhu 70 °C pemindahan kolom ke microtube baru. Cairan
selama 10 menit. tersebut kemudian ditambahkan 100 µL bufer TE,
lalu diinkubasi pada suhu 15-25 o C selama 2-5
 PERBANDINGAN METODE ISOLASI DNA PADA PRODUK PERIKANAN SEGAR
DAN OLAHAN
( JURNAL 2 )

Isolasi DNA sampel dengan kit isolasi Qiagen

Isolasi dengan kit QIAGEN DNeasy Blood and Tissue

untuk produk segar diawali dengan penimbangan sampel
sebanyak 0,05 g daging ikan kemudian dimasukkan ke
dalam microtube. Sampel ditambahkan 180 μL bufer ATL
dan 20 μL proteinase K, lalu dihomogenisasi dengan
vortex. Sampel diinkubasi dalam waterbath selama 8 menit
pada suhu 60 °C. Sampel ditambahkan etanol 96%
sebanyak 200 μL, dihomogenisasi dengan vortex dan
disimpan selama 30 menit pada suhu -20 °C.
 PERBANDINGAN METODE ISOLASI DNA PADA PRODUK PERIKANAN SEGAR
DAN OLAHAN
( JURNAL 2 )

Isolasi DNA sampel dengan kit isolasi GenCheck® DNA Extraction Reagent (FASMAC)

Isolasi DNA dengan menggunakan kit GenCheck® DNA Extraction Reagent

(FASMAC) diawali dengan penimbangan sampel sebanyak 10 g kemudian
dimasukkan ke dalam microtube ukuran 1,5 mL. Sampel dalam microtube
ditambahkan 100 μL reagen ekstraksi DNA, kemudian dihomogenisasi
menggunakan vortex lalu di-spindown agar seluruh sampel mengendap di dasar
microtube. Sampel diinkubasi pada suhu 100 °C selama 10 menit, kemudian
didinginkan dalam es selama 1 menit dan disentrifugasi pada 15.000 g selama 1
menit pada suhu ruang dan diperoleh isolat DNA. Isolat DNA yang diperoleh
disimpan pada -20 o C untuk dianalisis lebih lanjut.
 PERBANDINGAN METODE ISOLASI DNA PADA PRODUK PERIKANAN SEGAR
DAN OLAHAN
( JURNAL 2 )

Elektroforesis isolat DNA

Elektroforesis isolat DNA sampel dilakukan dengan mengacu pada metode

Westermeier (2004). Elektroforesis dilakukan untuk mengamati keberhasilan isolat
DNA yang didapatkan dari sampel. Kuat arus yang digunakan 60 A dengan
tegangan 90 volt. Elektroforesis dilakukan selama 30 menit. Media gel yang
digunakan yaitu gel agarosa 1,2%. Agarosa ditimbang sebanyak 0,6 g, kemudian
ditambahkan bufer TBE sebanyak 1×50 mL, selanjutnya dipanaskan
menggunakan oven pada suhu 100 °C selama 30 menit. Larutan didiamkan pada
suhu ruang selama 15 menit, kemudian dimasukkan ke dalam alat elektroforesis
horizontal. Tahapan uji kualitas DNA yaitu, pertama disiapkan larutan cybergreen
sebanyak 3 µL, kemudian ditambahkan loading dye sebanyak 3 µL dan isolat DNA
sebanyak 3 µL. Isolat kemudian divisualisasi mengunakan UVtransiluminator.
 PERBANDINGAN METODE ISOLASI DNA PADA PRODUK PERIKANAN SEGAR
DAN OLAHAN
( JURNAL 2 )

Konsentrasi dan kemurnian DNA

Konsentrasi dan kemurnian DNA merupakan tahapan penting bagi rangkaian proses
isolasi DNA. Analisis konsentrasi dan kemurnian DNA pada penelitian ini dilakukan dengan
mengacu pada metode Chen et al. (2010). Konsentrasi dan kemurnian (rasio absorbansi
pada 260/280) dari DNA yang diekstraksi ditentukan menggunakan spektrofotometer
nanodrop (Implan NP-80). Bufer lisis yang digunakan pada isolasi DNA diteteskan pada
sensor nanodrop sebanyak 1 μL lalu dijalankan sebagai blangko, kemudian sensor
dibersihkan dan diteteskan isolat DNA sampel sebanyak 1 μL lalu dianalisis menggunakan
nanodrop® (Implan NP-80). Tahap tersebut dilakukan pada setiap sampel isolat DNA.
Pengukuran konsentrasi DNA dengan nanodrop dilakukan pada panjang gelombang 260
nm, sedangkan protein diukur pada panjang gelombang 280 nm dengan DNA murni
didefinisikan memiliki rasio absorbansi 260/280 berkisar antara 1,6 dan 2,0.
 PERBANDINGAN METODE ISOLASI DNA PADA PRODUK PERIKANAN SEGAR
DAN OLAHAN
( JURNAL 2 )

Isolasi DNA Hewan Modifikasi Metode Ausubel (1995)

Sumber DNA untuk isolasi biasanya dari alat gerak atau daging hewan. Sampel diambil
dan dikeringkan diatas tisu, dijepit, kemudian dipotong-potong kecil dengan menggunakan
pinset dan gunting steril. Hasil yang lebih baik akan didapat bila daging diblender terlebih
dahulu. Hasil blender atau potongan langsung ditampung di dalam mortar steril kemudian
dihancurkan (digerus) atau diratakan dengan pastle steril sampai benar-benar hancur di
atas es batu. Sampel ditambah dengan 2,4ml bufer digesti, 10 μL Lizosim 10mg/ml, dan 1
ml SDS 10%. Sampel digerus hingga tercampur merata dengan bahan-bahan tersebut.
Semua sampel dimasukkan ke dalam eppendorf. Semua sampel dalam eppendorf
diinkubasi pada suhu 50°C selama 12 jam. Setiap 30 menit sekali digojog. Hasil dari
inkubasi ditambah dengan fenol : kloroform 1:1 kemudian divortex selama 10 detik dan
dimasukan ke dalam sentrifug selama 5 menit dengan kecepatan 6.000 rpm.
 PERBANDINGAN METODE LISIS JARINGAN HEWAN DALAM PROSES ISOLASI DNA
GENOM PADA ORGAN LIVER TIKUS PUTIH (Rattus norvegicus)
(JURNAL 3 )

Prosedur Kerja Isolasi Dna Pada Organ Liver Tikus Putih (Rattus Norvegicus)

Tikus putih yang digunakan untuk diambil Sampel yang digunakan kemudian di timbang sebanyak 60
sampelnya pada penelitian kali ini berasal dari mg kemudian masing-masing diberi buffer ekstraksi (10mM
strain wistar yang didapatkan dari toko Tris, 100mM EDTA, 400mM NaCl, 3% SDS) dan
petshop aneka hewan jember. Tikus putih proteinase-K sebanyak 5 mikroliter, selanjutnya perlakuan
tersebut di aklimatisasi selama 7 hari dan lisis yaknidengan berbagai cara inkubasi dengan suhu 55
diberi makan dan minum selama duakali derajat selama overnight, inkubasi selama 2 jam dengan
sehari. Setelah tahap aklimatisasi berakhir, suhu 65 derajat, dan dengan cara penggerusan. Setelah
tikus putih tersebut di bedah dan diambil organ jaringan tersebut tampak homogen, dilakukan proses
hati dari tikus putih tersebut dengan sentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit,
menggunakan alat seksi yang steril. Organ supernatan dari hasil sentrifugasi tersebut kemudian
tersebut kemudian di potong dan dimasukkan dipindah kedalam tabung eppendorf baru, kemudian protein
dalam tabung eppendorf baru yang steril. dan lipid di presipitasi dengan menggunakan Phenol
Selanjutnya disimpan dalam suhu -20oC Chlorofom Isoamyl Alcohol (25 : 24 : 1) di sentrifugasi
sampai tahap isolasi DNA akan dilakukan. dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit diambil
bagian supernatantnya.
 PERBANDINGAN METODE LISIS JARINGAN HEWAN DALAM PROSES ISOLASI DNA
GENOM PADA ORGAN LIVER TIKUS PUTIH (Rattus norvegicus)
(JURNAL 3 )

Prosedur Kerja Isolasi Dna Pada Organ Liver Tikus Putih (Rattus Norvegicus)

Proses tersebut dilakukan selama 2 kali dan selanjutnya zat lainnya seperti polisakarida di presipitasi
dengan menggunakan chlorofom isoamyl alcohol (25:1) sebanyak 1 kali. Supernatant yang di
dapatkan kemudian di presipitasi dengan menggunakan isopropanol absolut, kemudian untuk
memaksimalkan perolehan DNA, di inkubasi dalam suhu -20oC selama 1 jam. Setelah itu DNA
kemudian di peletkan dengan cara di sentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit
dengan suhu 4oC. Pelet DNA kemudian di cuci dengan menggunakan etanol 70%, kemudian pelet
dikering anginkan dan diencerkan dengan buffer TE sebanyak 30-50 mikroliter tergantung dari
banyaknya pelet DNA yang terbentuk. Proses elektroforesis DNA dilakukan dengan mengambil
larutan DNA sebanyak 5 mikroliter kemudian memberikan pewarnaan DNA dengan menggunakan
loading dye sebanyak 1 mikroliter. DNA tersebut selanjutnya di running pada TAE gel agarosa 1%
dengan arus 100volt dan waktu selama 30 menit.
 TEKNIK ISOLASI DNA SEL HAYATI AYAM SECARA TRADISIONAL
( JURNAL 4

Prosedur Kerja Isolasi Dna Pada Sel Hayati Ayam Secara Tradisional

Hati ayam 100 gram dipotong berukuran besar dan ditaruh

dalam lumping. Kemudian kedalamnya diberikan air es dan
garam sebanyak setengah sendok teh. Selanjutnya bahan-
bahan tersebut digerus bersama menggunakan lumpang dan
mortal hingga halus. Tambahkan 1 sendok teh sunlight, aduk
hingga menjadi kental dan berlendir tambahkan air es hingga
menjadi lebih encer, namun tetap berlendir. Diamkan selama
15 menit. Pindahkan larutan kedalam tabung reaksi hingga
ketinggiannya dari dasar tabung mencapai lebih kurang 2 cm.
 AMPLIFIKASI FRAGMEN GEN 18S rRNA PADA DNA METAGENOMIK MADU DENGAN
TEKNIK PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
( JURNAL 5 )

Prosedur Kerja Isolasi Dna Pada Metagenomik Madu Dengan Teknik Pcr
(Polymerase Chain Reaction)

1 *Pemilihan Primer PCR 2

*Pengambilan Sampel Madu Sampel madu
asli diambil langsung dari 2 peternak lebah
Desa Seraya Tengah, Kecamatan
Karangasem, Kabupaten Karangasem.
Program Clone Manager Suite 6 digunakan dalam
Sarang lebah yang telah berisi madu
memilih primer forward dan reverse dan simulasi
dipotong menjadi beberapa bagian.
amplifikasi PCR. Pemilihan pasangan primer
Pengambilan madu dilakukan dengan cara
dilakukan dengan tahapan yang sudah ditentukan
pemerasan secara steril.
dalam program Clone Manager Suite 6. Beberapa
urutan basa nukleotida primer forward dan reverse
dengan mengacu pada urutan basa nukleotida DNA
template dimasukkan dan diproses dalam program.
Beberapa hasil pasangan primer terbaik digunakan
untuk simulasi secara in silico amplifikasi PCR.
 AMPLIFIKASI FRAGMEN GEN 18S rRNA PADA DNA METAGENOMIK MADU DENGAN
TEKNIK PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
( JURNAL 5 )

Prosedur Kerja Isolasi Dna Pada Metagenomik Madu Dengan Teknik Pcr
(Polymerase Chain Reaction)
3 *Isolasi DNA Metagenomik Isolasi DNA
metagenomik dilakukan dengan tiga metode..

Pertama, isolasi dengan lisis sel secara Kedua, isolasi DNA metagenomik
secara langsung dari metode isolasi DNA menggunakan PowerSoil DNA Isolation Kit
metagenomik berdasarkan metode Kuske dari MO BIO Laboratories, Inc dilakukan
et al. (1997) [7] dan telah dikembangkan sesuai dengan manual yang tersedia dalam
oleh Hartawan et al. (2014) untuk madu. kit

Ketiga, isolasi DNA metagenomik yang diawali dengan preparasi sampel berdasarkan protokol
yang diusulkan oleh Waiblinger et al. (2012) [8] dan dipadukan dengan menggunakan
PowerSoil DNA Isolation Kit. Sebanyak 1,2 gram sampel madu didistribusikan ke empat
tabung Eppendorf 1,5 mL (0,3 gram madu per tabung), diikuti dengan penambahan 960 L air
steril untuk setiap tabung lalu diinkubasi pada suhu 40oC selama 10 menit. Setelah
sentrifugasi selama 10 menit pada 11.000 x g, supernatan dibuang, pellet diresuspensi
dengan 120 L akuadest steril dan digabungkan dalam satu tabung Eppendorf 1,5 mL.
 AMPLIFIKASI FRAGMEN GEN 18S rRNA PADA DNA METAGENOMIK MADU DENGAN
TEKNIK PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
( JURNAL 5 )

Prosedur Kerja Isolasi Dna Pada Metagenomik Madu Dengan Teknik Pcr
(Polymerase Chain Reaction)

4 *Pemilihan Primer PCR

5 *Amplifikasi DNA Metagenomik Madu Hasil isolasi
DNA metagenomik madu diamplifikasi dengan teknik
PCR menggunakan alat thermocycle. Hasil pemilihan
primer digunakan pada proses amplifikasi dalam 10
*Amplifikasi DNA Metagenomik Madu Hasil isolasi DNA
μL campuran reaksi dengan komposisi: 3 μL ddH2O
metagenomik madu diamplifikasi dengan teknik PCR
(aquadest steril), masing- masing 0.5 μL primer
menggunakan alat thermocycle. Hasil pemilihan primer
forward dan reverse, 1 μL DNA metagenomik madu
digunakan pada proses amplifikasi dalam 10 μL campuran
sebagai template, dan 5 μL KAPA Taq Extra HotStart
reaksi dengan komposisi: 3 μL ddH2O (aquadest steril),
with dye 2x master mix. Kondisi amplifikasi PCR
masing- masing 0.5 μL primer forward dan reverse, 1 μL
yang dilakukan adalah sebagai berikut: denaturasi
DNA metagenomik madu sebagai template, dan 5 μL KAPA
awal pada 95oC selama 3 menit; siklus PCR 30 kali
Taq Extra HotStart with dye 2x master mix. Kondisi
yang terdiri dari denaturasi (95oC, 1 menit), annealing
amplifikasi PCR yang dilakukan adalah sebagai berikut:
(55oC, 1 menit), dan ekstensi (72oC, 2 menit); serta
denaturasi awal pada 95oC selama 3 menit; siklus PCR 30
ekstensi akhir (72oC, 5 menit).
kali yang terdiri dari denaturasi (95oC, 1 menit), annealing
 HASIL
PADA JURNAL KE-3 (PERBANDINGAN METODE LISIS JARINGAN HEWAN DALAM
ProsesPROSES
lisis yang baik DNA
ISOLASI dalam prosesPADA ORGAN LIVER TIKUS PUTIH (Rattus norvegicus))
GENOM
isolasi DNA hewan adalah dengan
menggunakan inkubasi selama
overnight (12 jam) dengan suhu 55
derajat. Apabila mendadak, lisis dapat
dilakukan dengan inkubasi selama 2
jam dengan suhu 65 derajat.
Penggerusan dapat pula mempercepat
dalam proses lisis akan tetapi hasil
yang diperoleh tidak maksimal.
Inkubasi dengan suhu 80 derajat
selama 10 menit dapat mempercepat
proses lisis akan tetapi akan merusak
DNA sehingga DNA tidak muncul saat
proses elektroforesis.
 HASIL
PADA JURNAL KE-3 (PERBANDINGAN METODE LISIS JARINGAN HEWAN DALAM
PROSES ISOLASI DNA GENOM PADA ORGAN LIVER TIKUS PUTIH (Rattus norvegicus))
Berdasarkan hasil isolasi diatas, DNA
yang di ekstraksi selama 12 jam
dengan metode lisis secara
overnightmenunjukkan hasil yang
lebih jelas dibandingkan dengan
metode lisis 2 jam, metode lisis 10
menit, dan metode gerus. Hal ini
disebabkan protein yang dapat
mengkontaminasi kemurnian DNA
akan mengalami denaturasi pada suhu
diantara 45-60 derajat ketika di
inkubasi selama 10-12 jam (Paul,
1996).
 HASIL
PADA JURNAL KE-3 (PERBANDINGAN METODE LISIS JARINGAN HEWAN DALAM
PROSES ISOLASI DNA GENOM PADA ORGAN LIVER TIKUS PUTIH (Rattus norvegicus))

Selain itu enzim yang dapat

mengakibatkan kerusakan DNA seperti
enzim nuklese akan dinonaktifkan
pada kondisi tersebut. Inkubasi dengan
suhu 55 derajat akan membuat
Proteinase-K akan bekerja secara
maksimal dan optimum dalam
menghancurkan protein dan
menginaktivasi enzim nuklease yang
dapat merusak DNA (Qamar, 2017).