TERAPIA GENICA

LA NASCITA

La terapia genica fu concepita a seguito del grande progresso delle

metodiche di biologia molecolare e ingegneria genetica sviluppatesi a
partire degli anni ottanta.
Tali tecniche consentirono il clonaggio ed il sequenziamento di vari
geni, ciò comportò la precisa identificazione di molte alterazioni
geniche in diverse patologie e la capacità, grazie alle tecniche del DNA
ricombinante, di modificare microorganismi (come funghi e batteri)
per poter far esprimere loro delle molecole d’interesse
Molte malattie sono causate dalla mancanza o dal malfunzionamento di una
proteina: nel primo caso, il problema dipende dall’ inattivazione del gene che
codifica per quella proteina, mentre nel secondo caso è dovuto alla presenza di
mutazioni che alterano la sequenza nucleotidica e di conseguenza la struttura della
proteina.
 La terapia genica è una forma innovativa di terapia che nasce dalla
consapevolezza che la causa della malattia è un difetto nei geni presenti nelle
nostre cellule.
Nel caso particolare delle malattie genetiche, il difetto è acquisito alla nascita ed è
presente in tutte le cellule.
Quel difetto può causare molti sintomi, talvolta devastanti, che si originano tutti a
partire da una singola ragione.
Con l'ingegneria genetica è possibile manipolare i geni e costruire in laboratorio un
gene funzionale che corregga quel difetto.
 Tipologie di terapia genica
La difficoltà di un simile approccio terapeutico è inserire un gene funzionale nelle cellule del malato.
Due principali metodi possono essere utilizzati per il trasferimento di geni: ex vivo e in vivo.
Ex vivo = Nel trasferimento ex vivo si trasferiscono geni clonati in cellule autologhe (ovvero dello stesso individuo)
per evitare che esse vengano rigettate dal sistema immunitario del paziente trattato.
In particolare le cellule vengono espiantate, selezionate per l'espressione del gene inserito, amplificate ed infine
reintrodotte nel paziente.
Questo metodo è applicabile ai soli tessuti che possono essere prelevati dal corpo, modificati geneticamente e
reintrodotti nel paziente, dove crescono e sopravvivono per un lungo periodo di tempo, come ad esempio le cellule del
sistema ematopoietico e della pelle. Tale procedura è sicuramente lunga e costosa ma permette di selezionare ed
amplificare le cellule d'interesse e gode di una elevata efficienza.
In vivo = La terapia genica in vivo viene attuata in tutti quei casi in cui le cellule non possono essere
messe in coltura o prelevate e reimpiantate, come quelle del cervello o del cuore e della maggior
parte degli organi interni.
Inoltre, rappresenta un modello terapeutico con elevata compliance (conforme alle leggi vigenti) e più
economico del precedente ma, attualmente, di più difficile applicazione. In questo caso il gene
d'interesse viene inserito nell'organismo, tramite un opportuno vettore, direttamente per via locale o
sistemica.
Generalmente, per ottenere buoni risultati, si utilizzano vettori virali, cioè virus ingegnerizzati in modo da fargli
trasportare il gene terapeutico e inserirlo nelle cellule bersaglio.
Praticamente il virus viene privato del proprio genoma e quindi reso innocuo, ma conserva la sua capacità di
“infettare” le cellule. In questo modo agisce come una specie di “Cavallo di Troia” che trasferisce nelle cellule
il gene terapeutico, si esaurisce una volta terminato questo passaggio, e ciò che resta è la correzione del difetto.
-Il maggiore ostacolo per il successo della terapia genica è rappresentato dalla difficoltà di trovare un sistema
virale che raggiunga un livello di efficienza sufficiente nell'infettare tutte le cellule bersaglio.
-Un altro punto critico nasce dal fatto che il virus ingegnerizzato potrebbe essere riconosciuto come corpo
estraneo dall'organismo e suscitare quindi una reazione immunitaria.
-Un terzo problema da risolvere è di rendere l'espressione del gene terapeutico persistente nel tempo senza
bisogno di doversi sottoporre a continui trattamenti. Un altro possibile rischio è che il virus dia origine a
particelle capaci di riprodursi in modo incontrollato e che trasporti all'interno della cellula anche dei componenti
tossici (come le proteine del capside).
Esistono anche vettori non virali per effettuare il trasferimento del gene terapeutico all'interno della cellula
bersaglio. Di solito sono formati da nanoparticelle cariche positivamente che formano interazioni elettrostatiche
con il DNA carico negativamente. Rispetto ai vettori virali, però, hanno un'efficienza nettamente minore.
 I VETTORI VIRALI
 Si ottengono inserendo il gene di interesse nel genoma di diversi tipi di virus, sotto il controllo di un
promotore forte. Il virus viene reso difettivo, cioè incapace di riprodursi autonomamente per evitare
la diffusione di virus ricombinanti. Il genoma viene ingegnerizzato con le tecniche del
DNA ricombinante, e trasfettato in particolari linee cellulari capaci di produrre le particelle virali
ricombinanti (linee di packaging). Queste
complementano i difetti introdotti nel genoma. In linea di massima, il principale vantaggio dei
vettori virali consiste nell'elevata efficienza di trasduzione (fino al 100% delle cellule).
Gli svantaggi invece risiedono nella possibilità di
generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nell'ospite, nel rischio
di mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma) e
nell'insorgenza di reazioni immunitarie. Possono poi trasportare generalmente molecole di DNA di
dimensioni limitate. Un altro problema sono i costi elevati. I virus attualmente studiati quali
vettori per la terapia genica sono: i retrovirus; i lentivirus; gli adenovirus; i virus adenoassociati; gli
herpes simplex virus. Ognuno di questi vettori presenta vantaggi e svantaggi.
 RETROVIRUS
I retrovirus sono stati i primi virus ad essere studiati nella terapia genica, il loro genoma è
costituito da un singolo filamento di RNA contenente 3 geni essenziali: gag (codifica per le
proteine del core), pol (codifica per la trascrittasi inversa) ed env (codifica per le proteine del
capside). A ciascuna estremità vi sono le LTR (long
terminal repeats) con sequenze implicate nell'integrazione e regioni promotore ed enhancer. Una
volta infettata la cellula, attraverso un processo di trascrizione inversa si forma il doppio
filamento di DNA che si integra nel genoma della cellula ospite esprimendo così le proteine
virali. I retrovirus
comunemente usati derivano dal virus della leucemia murina (Mo MLV) che deve essere però
opportunamente modificato: i 3 geni essenziali vengono sostituiti col gene di interesse mentre
vengono mantenute le sequenze regolatrici; possono essere aggiunti geni marcatori (NEO) e
promotori alternativi di origine virale (CMV) o cellulare (beta actina ,tirosina).
 VANTAGGI E SVANTAGGI
Vantaggi:
• Non provocano malattie umane.
• Inducono scarsa risposta immunitaria nell'ospite.
• I transgeni possono essere espressi per tutta la vita dell’ospite.
• Capacità di infettare efficientemente una vasta gamma di tipi cellulari.
• Integrazione del materiale genetico recato dal vettore nel genoma delle cellule bersaglio.
• Alta efficienza di trasduzione.
Svantaggi:
• Potenziale oncogeno perché si integrano nel genoma dell’ospite in molteplici siti. • Possono subire
inattivazione trascrizionale in vivo.
• Infettano solo cellule in attiva divisione.
• Sono difficili da coltivare.
• Basso titolo.
 LENTIVIRUS
I lentivirus appartengono alla famiglia dei retrovirus di cui condividono la morfologia ed il ciclo replicativo ma, a
differenza dei precedenti, possono infettare anche cellule non replicanti, il che li rende dei buoni candidati per
modificare l'espressione delle cellule a differenziazione terminale, come quelle del cuore o del sistema nervoso
centrale. Oggi vengono utilizzati lentivirus derivati dal virus HIV opportunamente modificati per garantire la
sicurezza del ricevente.
Vantaggi: • Possono essere somministrati in vivo. • Non sono inattivati dal complemento. • Infettano sia cellule in
divisione che quiescenti. • I transgeni possono essere espressi per tutta la vita dell’ospite. • Integrazione del
materiale genetico recato dal vettore nel genoma delle cellule bersaglio.

Svantaggi: • Potenziale oncogeno perché si integrano nel genoma dell'ospite in molteplici siti. • Possono
provocare malattia nell'uomo. • Sono difficili da coltivare.
ADENOVIRUS = Gli adenovirus, che nell'uomo provocano infezioni del tratto
respiratorio, presentano un genoma costituito da un doppio filamento di DNA di circa 35
kb(migliaia di basi), 30 dei quali possono essere rimpiazzati col gene di interesse. Una volta
all'interno della cellula, l'adenovirus non si integra nel genoma ma si replica nel nucleo.

Vantaggi: Svantaggi:
• Sicuri (non si integrano nel genoma). • Espressione transiente.
• Facilmente manipolabili. • Alta risposta immunitaria.
• Stabili.
• Si ottengono alti titoli.
• Ampio trofismo.
• Infettano anche cellule quiescenti.
• Possono veicolare inserti di grosse dimensioni
(36Kb)
I VIRUS ADENO-ASSOCIATI: appartengono alla famiglia dei parvovirus, piccoli virus
non patogeni per l'uomo, hanno un genoma formato da una molecola di DNA a singolo filamento di
circa 5 kb e possono infettare cellule proliferanti e non.
Per replicarsi autonomamente necessitano però di un altro virus che in genere è un adenovirus o un
herpesvirus.

 Vantaggi:  Svantaggi:
• Non sono patogeni per l’uomo. • Dimensioni ridotte del transgene (4.7
Kb).
• Sono stabili.
• Vettore ricombinante non ha integrazione
• Vengono ottenuti con alti titoli.
sito specifica.
• Alta efficienza di trasferimento genico.
• Ampio trofismo.
• Infettano sia cellule in divisione che non.
• Integrazione del transgene.
 Herpes simplex virus

Gli herpes simplex virus, grazie alla loro naturale

capacità di stabilire infezioni latenti nei neuroni,
vengono utilizzati per il trasporto di geni nel SNC
(Sistema Nervoso Centrale).
L'espressione a lungo
termine del transgene viene ottenuta utilizzando dei
promotori neurone-specifici, attivati durante il
periodo di latenza. Il genoma degli herpes virus è
costituito da un doppio filamento di DNA di 152kb,
contiene più di 80 geni, la metà dei quali non risulta
essenziale per la crescita in cellule di coltura; una
volta eliminati tali geni è possibile inserire un
transgene di grosse dimensioni (circa 40-50kb).
I VETTORI NON VIRALI: Le metodologie adottate per trasferire il DNA senza
ricorrere a virus comprendono: l'iniezione di DNA nudo; l'inserimento tramite
liposomi; l'inserimento attraverso l'uso di polimeri cationici; il bombardamento
tramite particelle (gene gun).

DNA NUDO
L'inserzione di DNA nudo è la procedura più lineare e più semplice ed inoltre permette di
trasferire costrutti genici di grandi dimensioni. Consiste nell'iniettare il gene
terapeutico, legato ad un plasmide, direttamente nella cellula tramite l'utilizzo d’una pipetta.
Lo svantaggio di questa metodica consiste nel fatto che bisogna iniettare il
DNA in ogni cellula, una per una. Il rendimento, inoltre, è decisamente basso
I LIPOSOMI

I Liposomi sono vescicole sferiche la cui parete è composta da un doppio strato fosfolipidico.
Usando liposomi cationici è possibile far
complessare ad essi il DNA, che a pH neutro presenta carica negativa.
Il complesso DNA-liposoma può fondersi con la membrana cellulare ma nella
maggior parte dei casi viene internalizzato tramite endocitosi. Successivamente il DNA viene liberato nel
citoplasma, entra nel nucleo e viene espresso. Sfortunatamente questo processo è a bassa efficienza in quanto si
è visto che solo lo 0,1% del DNA introdotto viene espresso. Per ovviare a ciò nei liposomi sono state
anche inserite proteine ed anticorpi che possano aumentare l'efficacia della procedura minimizzando la
degradazione del DNA e facilitando il corretto direzionamento della vescicola.
Polimeri cationici

Molto simile è la procedura di trasfezione che utilizza polimeri

cationici, infatti macromolecole dotate di molteplici cariche
positive possono interagire con il DNA, il quale a pH fisiologico
è un polianione, provocandone la condensazione e
proteggendolo da aggressivi sia chimici che enzimatici, oltre che
da radiazioni ionizzanti. Anche i complessi DNA-policatione
vengono internalizzati dalla cellula per endocitosi, e possono
essere attivamente indirizzati verso specifiche linee cellulari o
tessuti utilizzando anticorpi o altre molecole direzionanti.
Bombardamento tramite particelle (gene gun)

Il bombardamento tramite particelle consiste

nell'utilizzo di particolari strumenti elettrici o ad alta
pressione, dette pistole geniche (gene gun), che
permettono di inviare nella cellula particelle
microscopiche d'oro o di tungsteno ricoperte di
DNA. Al momento non esistono studi sull'uomo di
questa metodica ma solo su animali.
Quali malattie possono essere trattate con la terapia
genica?

• distrofia muscolare • fibrosi cistica • emofilia • In realtà con questa terapia • malattie cardiovascolari • Infine la terapia genica può
diabete di tipo I • malattie possono essere trattate anche malattie neurodegenerative trattare anche malattie
metaboliche (fenilchetonuria) malattie che colpiscono chi è (morbo di Alzheimer, morbo acquisite quali: • Traumi di
• anomalie fisiologiche geneticamente predisposto, di Parkinson etc.) vario tipo (fratture ossee,
(mucopolisaccaridosi, ma che dipendono fortemente ferite, ustioni) • Ischemie
sindrome di Gaucher etc.) da fattori ambientali, come ad (necrosi dei tessuti causate da
esempio il cancro un'interruzione dell'apporto
sanguigno) • Infezioni
 ADA-SCID (Severe combined immuno deficiencies)

L'ADA-SCID è una rara patologia che appartiene al gruppo delle  immunodeficienze severe combinate
(SCID), malattie in cui il sistema immunitario è gravemente compromesso, al punto che l’organismo è
incapace di difendersi dagli agenti infettivi. Nella maggior parte dei casi, l’ADA-SCID si manifesta già a
partire dai primi mesi di vita con infezioni ricorrenti, spesso sostenute da germi normalmente innocui per
l’uomo e caratterizzate da un decorso particolarmente aggressivo. Il
sistema immunitario di questi bambini è così gravemente compromesso che il loro organismo è incapace
di difendersi persino da infezioni comuni come il raffreddore o la varicella. In passato questi bambini
erano costretti a vivere isolati dal mondo e in ambienti con aria filtrata per sopravvivere (da qui la
definizione di "bambini bolla", oggi superata). Generalmente, le prime manifestazioni sono di carattere
infettivo, a cui si associano poi altri fenomeni quali rallentamento nella crescita, anomalie scheletriche,
sordità, alterazioni neurologiche e comportamentali, fenomeni autoimmuni. In assenza di un trattamento
efficace, la malattia può risultare fatale entro i primi anni di vita.

 È una malattia molto rara: si stima che nascano 15 nuovi casi all’anno in Europa e 350 nel mondo.
 Come si trasmette l'ADA-SCID?

La malattia è causata dall'alterazione del gene ADA, che permette la

produzione di un enzima chiamato adenosina deaminasi (ADA),
importante per la maturazione e la funzionalità dei linfociti, cellule del
sistema immunitario fondamentali per la difesa dell'organismo dalle
infezioni. La malattia si trasmette come carattere autosomico
recessivo: questo significa che se in una coppia entrambi i genitori
sono portatori sani, a ogni gravidanza si ha un rischio del 25 per cento
di generare figli affetti.
 TERAPIE ‘’TRADIZIONALI’’
 Prima dello Strimvelis (un farmaco efficace nella cura dell’ADA-SCID) , per i pazienti c’erano solo due tipi
di cure disponibili:
-Il trapianto di midollo osseo da donatore compatibile
-la terapia enzimatica sostitutiva.

Entrambi presentavano però diversi limiti. Il trapianto di midollo osseo poneva in essere la difficoltà di trovare
un donatore compatibile.
Inoltre, c’era il rischio che si verificasse il fenomeno del graft-versus-host (le cellule del paziente attaccano e
distruggono quelle del midollo osseo perché le considerano “estranee), causato dall’incompatibilità immunologica
tra donatore e trapiantato, comune effetto collaterale del trapianto di midollo osseo.
La terapia enzimatica sostitutiva, in alternativa, veniva applicata in tutti quei casi in cui era impossibile trovare
un donatore di midollo compatibile con il paziente. Usata ancora oggi, si basa su iniezioni intramuscolari di
adenosin deaminasi bovina, da somministrare ogni settimana, ma la sua efficacia a lungo termine tende a
diminuire nel tempo.
Nel tentativo di aggirare tutti i problemi delle terapie tradizionali, la ricerca si è concentrata sullo sviluppo di una
terapia genica che permettesse di ingegnerizzare geneticamente le cellule del paziente stesso.
 L’ INFARTO
L’esperimento, a guida italiana e pubblicato sulla rivista Nature, è stato ottenuto sui maiali e i dati fanno sperare che in cinque
anni si possa sperimentare sull’uomo. Una nuova terapia genica è
riuscita a riparare il cuore da un infarto, cancellando o riducendo le sue cicatrici e stimolando la rigenerazione con la
proliferazione delle cellule cardiache. Nella ricerca sono state trasferite nel cuore di maiali colpiti da
infarto sequenze di informazione genetica, chiamate micro - RNA che, come registi molecolari, regolano l’espressione di altri
geni. La sequenza utilizzata, indicata con la sigla microRNA-199, è stata trasferita nel tessuto del cuore a bordo di un virus reso
inoffensivo e utilizzato come navetta. Arrivata a destinazione, ha stimolato la rigenerazione del cuore nel maiale, portando al
recupero quasi completo della sua funzionalità un mese dopo l’infarto. Perché si arrivi a una sperimentazione
sull’uomo ci vorrà ancora tempo. «Il trattamento finora è stato condotto con un virus modificato, ma ciò non ci consente di
controllare in maniera precisa il dosaggio di micro-RNA, il che può portare ad aritmie nel lungo andare. Dobbiamo imparare -
prosegue Giacca - a dosare nel tempo l’RNA, dandolo subito dopo l’infarto e basta, come se fosse un farmaco sintetico.
Sappiamo che è possibile perché è stato fatto nei topi». I ricercatori hanno iniziato a testare questa tecnica di somministrazione
nei maiali e pensano di avere i risultati entro 6 mesi. «Se tutto andrà bene come pensiamo - conclude - entro 5 anni potremmo
avere concluso la sperimentazione clinica sull’uomo».
TALASSEMIA
BETA
La talassemia beta è una malattia genetica che
pregiudica la produzione di emoglobina, la
proteina che trasporta l'ossigeno nel sangue.
Nei
casi più gravi, i pazienti sono costretti a
sottoporsi a ripetute trasfusioni, che
compromettono la qualità della vita e hanno
ripercussioni importanti sullo stato di salute
generale. Il trapianto di midollo è il solo
intervento risolutivo attualmente disponibile,
ma non sempre è possibile trovare un donatore
compatibile.
La nuova terapia genica si rivolge ai pazienti con la forma più grave della malattia, di età
uguale o superiore ai 12 anni, e per i quali non è stato individuato un donatore. La procedura
prevede il prelievo delle loro cellule staminali ematopoietiche (quelle che originano tutte le
cellule del sangue), che vengono in seguito modificate il laboratorio, inserendo al loro interno
il gene corretto. Reinfuse infine nel paziente, le cellule modificate produrranno la forma di
emoglobina funzionante.
L'autorizzazione della Commissione Europea è stata preceduta dagli studi che hanno
dimostrato che la nuova cura è sicura ed efficace. Circa l'80% dei pazienti trattati ha infatti
potuto fare a meno delle trasfusioni una volta ricevuta la terapia genica, con effetti collaterali
perlopiù contenuti.
 TERAPIA GENICA ? ECCO COSA NE
PENSA LA BIOETICA!
ESISTONO IN TEORIA DUE POSSIBILI TIPI DI TERAPIA GENICA;
 IL PRIMO MIRA A CORREGGERE DIFETTI GENETICI IN CELLULE DELLA LINEA GERMINALE CON EFFETTO
SULLA DISCENDENZA.
 IL SECONDO SI PROPONE DI RIDURRE O ELIMINARE DIFETTI MOLECOLARI A LIVELLO DELLE CELLULE
SOMATICHE CON EFFETTI LIMITATI SULL’ INDIVIDUO.
COME SI EVINCE ANCHE DA UN DOCUMENTO DEL COMITATO NAZIONALE PER LA BIOETICA, LA TERAPIA
GENICA SULLA LINEA SOMATICA NON E’ CONCETTUALMENTE DIVERSA DA OGNI ALTRO TRATTAMENTO
TERAPEUTICO E PUO’ ESSERE CONSIDERATA SULLO STESSO PIANO DI UN TRAPIANTO DI ORGANO O DI
TESSUTO. LA
PRATICABILITA’ DELLA TERAPIA GENICA SOMATICA TROVA PIENA GIUSTIFICAZIONE NEL FATTO CHE ESSA ,
NON DISCOSTANDOSI PER ASPETTI ESSENZIALI DA ALTRE FORME DI INTERVENTO TERAPEUTICO, PUO’
ESSERE RICONDOTTA AL DIRITTO ALLA SALUTE CHE LEGGITTIMA IL COMPLESSO DI TALI ATTIVITA’
SANITARIE.
 LA SITUAZIONE PER LA LINEA GERMINALE E’ MOLTO DIVERSA, INFATTI L’ INTERVENTO IN QUESTO CASO
E’ DIRETTO SUL PRE-EMBRIONE OVVERO SU UN ORGANISMO NELLE FASI INIZIALI DELLA SUA
FORMAZIONE. UN PRINCIPIO ETICO CHE PUO’ ESSERE CHIAMATO IN CAUSA NELLA TERAPIA GENICA E’
QUELLO DELLA INTANGIBILITA’ DEL PATRIMONIO EREDITARIO, DI UN SOGGETTO ,CHE, SUL PIANO
SCIENTIFICO TROVA SOSTEGNO NEL PRINCIPIO DELLA CONSERVAZIONE DELL’ IDENTITA’ GENETICA.
ECCETTO POCHISSIME ECCEZIONI (L’ INSERIMENTO DI UN GENE PROVENIENTE DALLO
STESSO EMBRIONE O PROVENIENTE DA UNO DEI GENITORI) TUTTI GLI ALTRI INTERVENTI CORRETTIVI
ESEGUITI SULLA LINEA GERMINALE CON MATERIALE ESTRANEO PORTANO A UNA MODIFICAZIONE DEL
GENOMA CON CONSEGUENZE NON PREVEDIBILI NELLO SVILUPPO DELLO STESSO INDIVIDUO E DELLA
SUA DISCENDENZA. IL PROBLEMA SI ESTENDE ALLA COMUNITA’, IN QUANTO UN INTERVENTO
SISTEMATICO SUL GENOMA DI SINGOLI INDIVIDUI PUO’ AVERE RIFLESSI SULLA STRUTTURA GENETICA
DELLA POPOLAZIONE.
SU QUESTO TEMA BIOETICO SI SONO CREATE POSIZIONI CONTRAPPOSTE:
- DA UNA PARTE C’E’ CHI SOSTIENE L’ IMPERATIVO CATEGORICO DI LASCIAR FARE ALLA NATURA O DI
LIMITARSI A CONTROLLARE IL PROCESSO NATURALE
- DALL’ ALTRA PARTE C’E’ CHI GIUDICA LECITO E DOVEROSO INTERVENIRE NEL PROCESSO VITALE PER
EVITARE RISULTATI PATOLOGICI NON DESIDERATI NELLA FUNZIONE RIPRODUTTIVA ED ESIGE LA SCELTA
CONSAPEVOLE DELLE SINGOLE PERSONE PER AVERE RISULTATI MIGLIORI DI QUELLI DERIVANTI DALL’
EVOLUZIONE NATURALE, SOPRATTUTTO IN CASO DI MALATTIE GENETICHE.