IMUNOHISTOQUÍMICA
IMUNOHISTOQUÍMICA
IMUNOHISTOQUÍMICA
1. Imunohistoqumica e imunocitoqumica
Referem-se ao conjunto de tcnicas que utilizam a reao
antignio-anticorpo para a deteo e caracterizao de
molculas no seu local de origem
Tcnicas que utilizam anticorpos para identificar
estruturas tecidulares (antignios) in situ
Imunohistoqumica:
metodologias
que
utilizam
imuno-
dificuldades,
nomeadamente
no
que
toca
padronizao
da
imunohistoqumica
uma
necessidade
A qualidade da marcao depende de 4 fatores:
Qualidade dos anticorpos
Fase pr-analtica, i.e. fixao e processamento do tecido
Recuperao antignica de eptopos
Sensibilidade do sistema de deteo
passar-se
utilizar
novos
complexos
marcadores:
Compostos fluorescentes, como o isotiocianato de
fluorescena (FITC verde) e isotiocianato de rodamina
(TRITC vermelho)
Enzimas, como a peroxidase (HRP), fosfatase alcalina
e glucose oxidase
Metais pesados, como a ferritina e ouro coloidal
Compostos radioativos, como o trtio, 14C e 35S
No final das reaes enzimticas, o produto adquire
eletrodensidade; no entanto, os metais pesados j possuem
esta capacidade intrinsecamente e da poderem ser utilizados
em IHQ de microscopia eletrnica
J a marcao radioativa confere resultados que sero
visualizados por autoradiografia
Quanto aos mtodos utilizados em IHQ, de concluir que
existiu uma evoluo nos mesmos, assente na crescente
capacidade de ampliao das metodologias.
O primeiro mtodo a ser introduzido foi o mtodo direto
simples, tendo sido seguido pelos mtodos indiretos
De entre os indiretos (cronologicamente) constam:
- Simples
- Enzima anti-enzima (PAP peroxidase antiperoxidase e APAAP fosfatase alcalina antifosfatase alcalina)
- Avidina-Biotina
(ABC
Streptavidin-biotin
da
origem
de
metstases
indiferenciadas
Prognstico
- Identificao da presena de recetores hormonais
- Caracterizao da expresso de proto-oncogenes
- Estudo de protenas supressoras de tumor
- Caracterizao da presena de indicadores de
proliferao celular
Ki67: protena expressa em clulas em mitose/ prmitose. Os tumores com maior ndice mittico e,
portanto, aqueles mais agressivos e propensos
evoluo/ malignizao, expressaro maiores nveis
de Ki67.
Indicao teraputica
- Quantificao da expresso de Her2/neu em
neoplasia mamria
Se a expresso de Her2 for baixa, no se prossegue
com a terapia Herceptin, uma vez que possui efeitos
bastante adversos e muito dispendiosa
Quantificam-se 4 estadios
0+
1+
2+
3+
Equvoco
No recebe terapia Herceptin
Doenas infeciosas
Caracterizao de agentes etiolgicos
Fenotipagem da reao inflamatria envolvente
Outras patologias
Caracterizao de subtipos de amiloidose
Caracterizao de produtos de secreo de clulas
- Enzimas
- Hormonas
1.3. Conceptualizao da IHQ pr-requisitos
A. Antignio disponvel (preservado ou recuperado)
O antignio deve permanecer insolvel, disponvel e no seu
local de origem
A insolubilidade implica a permanncia no local de
origem
Se
no
fosse
insolvel,
antignio
deixaria,
Herceptin
banho-maria
termostatizado
C. Anticorpo caracterizado
Devero ser conhecidos todos os elementos teciduais a que o
anticorpo se pode ligar, ou seja, todos os que despoletaro
resposta por parte do anticorpo
Dever ser conhecida toda a sequncia de ligao Ac/Ag
As caractersticas do anticorpo devero ser conhecidas
(espcie animal onde foi produzido, clonalidade, classe/
subclasse de imunoglobulina, especificidade, reatividade, qual
o antignio que o despoletou e condies de manuseamento)
D. Marcador visualizvel
Imprescindvel uma marcao estvel com intensidade
suficiente, que no suscite dvidas relativamente presena/
ausncia do antignio.
Para isto so utilizados marcadores
Enzimticos
Fluorescentes
Metlicos
Radioativos
2. Antignio e anticorpo
2.1. Antignio
Molcula com razovel dimenso i.e. protena, lpido, hidrato
de carbono ou cido nucleico
Uma vez introduzido num organismo induz resposta por
parte do sistema imunitrio, com produo de
anticorpos especficos para o mesmo
Cada antignio possui determinados radicais qumicos
que
promovem
produo
de
anticorpos
imunoglobulinas
Os antignios so reconhecidos devido sua estrutura
tridimensional, resultante da nuvem eletrnica e das afinidades
Ac/Ag
Cada antignio possui, superfcie, um ou mais locais
especficos de ligao ao anticorpo determinante
antignico ou eptopo constitudos por sequncias de
polissacridos ou protenas
Todas as molculas podem constituir potenciais antignios,
quando possuem um peso molecular superior a 8 kDa
J substncias de baixo peso molecular haptenos
podem ligar-se a molculas de peso superior, como
protenas, podendo assim desempenhar funes de
antignio
- Portanto, os haptenos, por si s no conseguem
estimular a produo de anticorpos especficos
mas, aps de combinarem a outras molculas de
peso molecular superior podero, posteriormente,
ligar-se
ao
anticorpo,
potenciando,
entanto,
pode
no
ser
possvel
alcanar
se
anticorpo
no
for
devidamente
de
natureza
proteica
que
so
produzidas
presena
do
antignio
confirmada
aps
alta
proximidade
complementaridade
entre
grupos
traduz-se
especficos
na
que
portanto,
do
tipo
de
ligao
Ac/Ag
estabelecida
Existindo muita complementaridade Ac/Ag, qumica e
estruturalmente, surgir uma elevada fora de ligao e,
consequentemente, alta afinidade
- Existem substncias que mimetizam o antignioalvo mas que possuem menor complementaridade.
Sendo assim, o estabelecimento de ligaes entre
estas e o anticorpo no impossvel, mas ir
assim,
gerar
falsos
positivos.
Estas
que
consiste
na
aplicao de correntes de ar em
direes opostas sobre a lmina,
de maneira a que os anticorpos
sejam igualmente distribudos.
Individualmente, as foras de atrao no so muito robustas,
mas quando combinadas conseguem estabelecer ligaes
muito fortes
A contribuio de cada fora depende do tipo/
localizao de aminocidos que se encontram no
antignio/ anticorpo
2.4.1. Ligao eletrosttica ou inica
Baseada na interao eletrosttica entre dois ies carregadas
com cargas opostas
Na sua formao, um tomo doa um eletro, devido sua baixa
eletronegatividade, formando um io positivo ou catio (por
exemplo, Na+ doa um eletro a Cl-)
Assim, o elemento recetor adquire carga negativa,
tornando-se num anio
pores
mimetizam
do
as
tecido
que
cargas
2.5. Imunoglobulinas
Classe de protenas que possui atividade de anticorpo
Podem
ser
visualizadas
ao
ME,
demonstrando
conformao em Y
Cada imunoglobulina possui uma estrutura bsica constituda
por quatro cadeias proteicas: duas cadeias pesadas
idnticas e duas cadeias leves idnticas, unidas por
ligaes dissulfdicas que mantm a estabilidade do
anticorpo
Possuem ainda uma zona mvel hinge (dobradia)
que permite ao anticorpo uma mudana de ngulo de
orientao, de modo a existir uma maior
capacidade de ligao ao antignio
Nas cadeias pesadas e leves existem 3
zonas: zona constante, zona varivel e zona
hipervarivel
A zona constante da cadeia pesada determina o tipo de
cadeia pesada em questo e, portanto, a subclasse de
imunoglobulina
A zona constante da cadeia leve determina o tipo de
cadeia leve em questo
A zona varivel a zona de ligao ao antignio,
sendo
que
incluem
as
zonas
hipervariveis,
As ligaes dissulfdicas estabelecem-se entre os aa 2298 (cadeia pesada) e 23-98 (cadeia leve)
permitida, assim, a organizao espacial da molcula
do anticorpo, de modo a formar reas especficas de
ligao expostas ao contato com o antignio
A enzima papana vai dividir a molcula em dois fragmentos
com capacidade de ligao ao antignio FAB (Fragment
Antigen Binding) e um fragmento sem esta capacidade Fc
(Fragment Crystallisable)
A molcula pode ainda ser quebrada pela enzima pepsina,
dando origem a dois fragmentos especficos: F(ab)2, com
capacidade de ligao ao antignio e cristalizao e a poro
pFc
A maioria dos anticorpos tratada com pepsina, de forma
a evitar reatividade cruzada com a poro pFc, que
reconhecida por alguns recetores das clulas humanas,
podendo originar falsos positivos
Por
reduo/
acidificao,
pode-se
dividir
uma
Papana
Pepsina
Cadeias pesadas
Fab
F(ab)2
Cadeias leves
Fc
pFc
subclasses,
com
diferentes
ligaes
microrganismos
nas
superfcies
externas
do
organismo
Presente em afees por parasitas, sendo responsvel
por alguns dos sintomas de alergia atpica reao
inflamatria
Cadeia pesada (IgG)
Ig que existe em maior quantidade e possui capacidade
de atravessar a barreira placentria, defendendo o feto
nas primeiras semanas de vida
a Ig com maior capacidade de difuso, sendo a primeira
responsvel pela neutralizao imediata das toxinas
bacterianas, pela promoo da fagocitose
4 subclasses (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4) com cadeias
pesadas ligeiramente diferentes, na constituio por aa e
nas ligaes dissulfdicas
- Possuem diferentes concentraes serolgicas ao
longo da vida do ser humano
Cadeia pesada (IgM)
As IgM so polmeros de 5 unidades de anticorpos,
unidos por uma cadeia J
Existe principalmente na corrente sangunea, possuindo
principal apetncia para antignios com vrios eptopos
Alta capacidade citoltica e resposta rpida, estando
envolvida na resposta a bactermia
correta
realizao
das
tcnicas
IHQ
depende
do
antignio. Eliminao
irrelevantes (contaminantes)
Precipitao
Centrifugao
Dilise
Cromatografia
Eletroforese
dos
elementos
Os
anticorpos
de
um
certo
clone
so
injeo endovenosa
injeo
intra-peritoneal,
introdrmica
ou
intramuscular
A capacidade do antignio produzir uma resposta
imunolgica pode ser manipulada de modo a obter o
mximo de resposta com um mnimo de antignio
no
animal.
Este
depsito
vai,
Se
forem
utilizadas
vrias
injees,
so
mais
facilmente
digeridos
pela
tipo
imunizado
anteriormente
produzido
pelo
plasmcito
evoluem
temporariamente
para
dois
ncleos
tetraploide,
juntos,
ocorrendo,
(hipoxantina
timidina).
Estas
clulas
primrios
de
uma
tcnica
de
imunofluorescncia indireta
7. Manuteno
culturas
(clones)
que
demonstrem
abdominal
de
um
ratinho
recolher
SOROS MONOCLONAIS
Desvantagens
Determinao de um s eptopo de um
antignio
Maior homogeneidade
quantidades
SOROS POLICLONAIS
especficos
quantidades
Realiza-se
uma
congelao
posterior
regularmente
para
prevenir
eventuais flutuaes
- Dever existir um sistema de back-up para
compensar eventuais falhas de energia
- de evitar congelar/ descongelar diariamente
soros que requerem congelao, mantendo-se uma
pequena quantidade de soro a 4 C para usos de
curta durao
so
extremamente
baixas
e,
4. Imunofluorescncia
Mtodos de IHQ (Coons, 1941) que utilizam molculas
fluorescentes
como
substncias
propiciadoras
da
visualizao do antignio
Exigem a utilizao de um microscpio especial para a
visualizao das marcaes, com uma lmpada que
emite radiao com comprimento de onda no campo dos
UV, de 480-590 nm
- Existem vrios tipos de lmpadas que podem emitir
em vrios comprimentos de onda, dentro do campo
350 nm< < 700 nm
So tcnicas aplicveis tanto em diagnstico como
investigao
A
principal
desvantagem
prende-se
na
difcil
As
tcnicas
de
imunofluorescncia
vo
induzir
dos
tecidos, provocando
um
aumento
dos
Composto
Forma ativa
absorvido
emitido
Tonalidade
Fluorescena
FITC
480-500
510-530
Verde
Rodamina
TRITC
510-530
560-590
Vermelho
Texas Red
Texas Red
580-590
600-620
Avermelhado
molculas
purificadas
para
que
os
anti-membrana
basal
glomerular
5. Mtodos imunohistoqumicos
Na qualidade de protenas, os anticorpos no possuem cor
prpria nem outra forma de serem visualizados nas
preparaes histolgicas e citolgicas
Foi necessrio encontrar uma maneira de lhes conferir
uma
maneira
de
serem
observveis quando
se
Apenas
se
aplica
um
reagente ao antignio (2 em 1
anticorpo + marcador)
Vantagens
Simplicidade e rapidez
Desvantagens
Pouca ampliao de sinal, pois somente existe uma
molcula de marcador por molcula de antignio
- O alvo diminuto, logo tambm so utilizadas
poucas quantidades de anticorpo. No entanto,
devem ser usadas altas quantidades de marcador
para se evidenciar o alvo marcao ampliativa
Elevada quantidade relativa de falsos negativos
Mtodo dispendioso, pois obriga existncia de
anticorpos primrios com marcador
Podem
ser
utilizados
como
anticorpos secundrios os Rabbit antimouse Igs (RAM), se o anticorpo primrio for produzido em
ratinho ou os Swine anti-rabbit (SAR), se forem produzidos em
coelho
Vantagens
Mais sensvel que o mtodo direto, pois h maior nmero
de molculas de marcador por cada molcula de
antignio (3D)
Maior versatilidade, pois basta possuir o anticorpo
secundrio marcado e no necessrio que os primrios
estejam marcados
Mais econmico
- Apesar de se terem 2 anticorpos, apenas um deles
vai possuir marcador. No mtodo direto, todas as
molculas de anticorpo primrio tero que estar
marcadas.
Desvantagens
Mais demorado e complexo
dificultem
utilizao
dos
mtodos
de
alcalina
subunidades,
cada
uma
terciria:
formao
de
5.3.1. Biotinilao
Processo pelo qual a biotina conjugada com uma
variedade de molculas, como enzimas, cidos nucleicos ou
anticorpos
o O pequeno tamanho da molcula permite a sua ligao a
estas estruturas, sem que ocorram alteraes ao nvel
das suas caractersticas imunolgicas ou fsicas
o Pode at ser efetuada a mltipla biotinilao do mesmo
anticorpo, sem que surjam alteraes imunolgicas
- Surge a possibilidade de revestir um anticorpo/
enzima com um grande nmero de molculas de
biotina, que se comportam, por sua vez, como
locais de adeso avidina (ponte)
- O nmero mximo de molculas de biotina que se
pode ligar a um anticorpo de 150
Este processo implica a passagem da biotina para a sua forma
ativa, permitindo a ligao do seu grupo carboxilo com o
grupo amina da molcula a ser biotinilada
Pode ser ainda aplicado a cidos nucleicos para a utilizao
em ISH (in situ hibridation)
(suplantada
com
adio
da
streptavidina)
Ligao da avidina/ streptavidina biotina endgena (rim,
fgado e mama)
substncia
propiciadora
de
visualizao,
normalmente HRP
4. Revelao (quando necessrio) e visualizao
A preparao do complexo streptABC feita 1-4 horas
antes da sua aplicao
misturada streptavidina e biotina marcada com HRP de
modo a que haja ligao entre elas
- O conjunto marcador + biotina pr-fabricado,
uma vez que, naturalmente, no tm afinidade um
para o outro
- As propores adicionadas devem facultar a
existncia de uma zona livre na streptavidina e 3
ocupadas com biotina marcada
A incubao depois feita na lmina
do
anticorpo
do
anticorpo
secundrio
dirigido
biotinilado
contra
anticorpo
primrio
3. Aplicao
da
avidina/
distncia
entre a biotina
e o seu local
de ligao
avidina
seja
muito grande,
esta mesma pode ser encurtada com a adio da
estrutura inerte spacer arm
StreptABC vs LSAB
A tcnica de LSAB mais forte do que streptABC
- A LSAB mais ampliativa e gera melhor sinal de
marco; porm, no se sabe porqu ao certo.
Vrias hipteses:
O novelo do complexo streptABC acaba por
bloquear as enzimas, impedindo-as de
ampliao
do
sinal
de
pequenas
quantidades
de
anticorpo
primrio
ligado
inespecificamente
Estes mtodos facultam uma diminuio dos tempos de
incubao, tornando a tcnica mais rpida
intensa
brilhante,
aumentando
marcaes
inespecficas
provocadas
por
marcaes cruzadas
O facto de estes mtodos no possurem (strept)avidina
ou biotina torna desnecessria a utilizao de agentes
bloqueadores
Permitem ainda a utilizao de recuperao antignica
mais vigorosa sem o receio de evidenciar biotina
endgena
Tratam-se ainda de ensaios com simplicidade e
rapidez, feitos em poucas etapas
- Tornam, assim, menos provvel a variabilidade
interlaboratorial, aumentando a reprodutibilidade
e
facilidade
da
padronizao,
diminuindo,
principais
utilizadas
como
molculas
esqueleto
como
plataforma
de
comercializado
sob
forma
de
aglomerados
temperatura
ambiente
por longos
extracelulares
produzidas
por
rpido
fcil,
evidenciando
tambm
relativamente
dispendioso
existem
e
poucos
anticorpos
primrios
comercializados
desta forma
uma
ao
qual
esto
acoplados
anticorpos
de
complexos
de
elevado
nvel
de
elevada
qualidade,
independentemente
dos
ainda
maior
dimenso
reagentes
permite
difuso
aos
dos
uma
pontos-alvo
seus
melhor
e
uma
do
do
polmero
resultado
nos
do
tecidos,
impedimento
um
anticorpo
extra
que
de
aumenta
deteo
a
do