Aula 04 - Biologia Celular
Aula 04 - Biologia Celular
Aula 04 - Biologia Celular
BIOLOGIA CELULAR
Prof. M.sc Luciana Lima de A. da Veiga
Métodos
bioquímicos
para o estudo da
célula
Fracionamento celular
◦ Consiste na separação, por centrifugação, das estruturas sub-celulares, após
rompimento das células.
◦ As células podem ser rompidas de várias maneiras, sendo a técnica mais comum, o
emprego um pilão plástico rotativo dentro de um tubo.
◦ O espaço entre o pilão e a parede do tubo deve ser suficiente para romper as células
provocando um mínimo de danos nos organitos.
◦ Os fragmentos de retículo endoplasmático unem-se e formam vesículas isoláveis,
os microssomas.
◦ Utilizando porções de tecido ou células em cultura, obtém-se uma suspensão
homogeneizada.
◦ É essa suspensão que será sujeita a centrifugação.
ROMPIMENTO
CÉLULA CELULAR FRACIONAMENTO
Depois do rompimento...
◦ Os fragmentos de membrana logo se resselam para esconder da
água a porção hidrofóbica da bicamada lipídica, formando
pequenas vesículas.
◦ Os fragmentos de membrana podem resselar mantendo para fora o
folheto da membrana que estava voltado para o meio extracelular,
formando vesículas do lado direito (inside-in), ou do lado do avesso
(inside-out) quando o folheto que era virado para o citoplasma fica
voltado para fora na vesícula resselada.
◦ Com o rompimento
adequado, conseguimos
obter um homogeneizado
total, isto é, uma
preparação em que a
maioria das células está
rompida, as organelas
estão íntegras mas
espalhadas na
preparação, e o conteúdo
solúvel do citoplasma está
misturado com o líquido
onde as células foram
rompidas.
Fracionamento celular por centrifugação diferencial
◦ O comportamento de uma partícula num campo de centrifugação
depende essencialmente do seu peso e da resistência que encontra no
meio de suspensão.
◦ Assim sendo, tamanho, densidade e forma influenciam o
comportamento de uma partícula num campo de centrifugação.
◦ O método mais amplamente utilizado para separar organitos celulares, é
a centrifugação diferencial.
◦ Baseia-se nas diferenças de velocidade com que as partículas
sedimentam no fundo de um tubo de centrifugação.
◦ Sujeitas a uma determinada força de centrifugação, as estruturas
relativamente grandes, densas e pesadas, sedimentam mais
rapidamente.
◦ Assim, usando-se forças e
durações de centrifugação
crescentes, e retirando de
cada vez, o sedimento que se
concentra no fundo do tubo,
ou “pellet”, será possível obter
suspensões de núcleos, depois
de mitocôndrias, lisossomas e
peroxissomas, depois separam-
se os pequenos microssomas,
depois ainda, os ribossomas
livres.
◦ A fracção sobrante, despojada
quase totalmente de
estruturas, é o citossol.
Fracionamento celular por centrifugação em gradientes de
densidade
◦ A centrifugação diferencial não permite separar as mitocôndrias dos
lisossomas e dos peroxissomas. Estes três organitos sedimentam
conjuntamente, se bem que tenham densidades diferentes.
◦ Nestes casos, emprega-se a técnica de fraccionamento em gradiente
de densidades.
◦ Consiste em sujeitar uma suspensão de partículas com diferentes
densidades, a uma força centrífuga constante, mas num meio de
densidade gradualmente variável, de uma extremidade à outra do
tubo.
◦ Empregam-se diversas substâncias para criar, num tubo de
centrifugação, um gradiente de densidades; a mais comum é a
sacarose.
◦ Nestas condições, partículas com densidades
diferentes, deslocar-se-ão no campo de
forças e situar-se-ão em níveis de densidade
da solução que igualem a sua própria
densidade.
◦ Deste modo, é possível separar organitos
como as mitocôndrias, os lisossomas e os
peroxissomas.
◦ As fracções isoladas podem, posteriormente,
ser submetidas a uma gama diversificada de
análises bioquímicas, para se identificar a
composição química, a atividade enzimática,
bem como as capacidades metabólicas.
◦ Mas podem também ser igualmente
encaminhadas para observação em
microscopia electrónica.
O sucesso de um protocolo de fracionamento celular pode ser
avaliado de duas maneiras:
◦ a) por microscopia eletrônica, processando cada etapa e observando
no microscópio que componentes da célula estão presentes naquela
fração e se esses componentes estão bem conservados ou se o
fracionamento os danificou;
◦ Surgimentos:
◦ Métodos histoquímicos e citoquímicos usados, respectivamente, para identificar
determinados grupos de substâncias em tecidos e células.
◦ Os métodos citoquímicos procuram identificar determinada classe de substâncias no
compartimento celular onde estão presentes.
◦ Assim, existem métodos específicos para localização de carboidratos, lipídeos e diversas
enzimas.
◦ As enzimas características de um determinado compartimento são usadas para
identificá-lo. Por exemplo, a fosfatase ácida é a enzima característica dos lisossomas, e
sua presença permite distinguir essa organela de outros tipos de vesículas
citoplasmáticas
Anticorpos são proteínas que
reconhecem um antígeno de forma
específica e com alta afinidade.
LINFÓCITO B
Relembrando... Aonde está localizada a produção de linfócitos
LINFÓCITO T
LINFÓCITO B
POR QUE PRODUZIR ANTICORPOS EM CULTURAS DE
CÉLULAS?
A produção de anticorpos monoclonais depende de hibridomas que conjuguem a capacidade de multiplicação infinda
de células tumorais à secreção de anticorpos específicos.
o ONDE E COMO SÃO USADOS OS ANTICORPOS PRODUZIDOS EM LABORATÓRIO: