Bioinformatica para Transcriptomica e Metabolomica-2
Bioinformatica para Transcriptomica e Metabolomica-2
Bioinformatica para Transcriptomica e Metabolomica-2
TRANSCRIPTÔMICA E
METABOLÔMICA
Elaboração
Produção
APRESENTAÇÃO......................................................................................................................................................... 5
INTRODUÇÃO.............................................................................................................................................................. 8
UNIDADE I
BIOINFORMÁTICA.................................................................................................................................................................................................................. 11
CAPÍTULO 1
INTRODUÇÃO À BIOINFORMÁTICA................................................................................................................................................................ 11
CAPÍTULO 2
PROBLEMAS-ALVO.............................................................................................................................................................................................. 17
CAPÍTULO 3
TENDÊNCIAS E DESAFIOS................................................................................................................................................................................ 19
UNIDADE II
ANÁLISE TRANSCRIPTÔMICA....................................................................................................................................................................................... 23
CAPÍTULO 1
CONCEITO E IMPORTÂNCIA DO TRANSCRIPTOMA............................................................................................................................. 26
CAPÍTULO 2
ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA (TÉCNICAS).................................................................................................................................... 34
CAPÍTULO 3
MÉTODOS PARA ANALISAR OS RESULTADOS DA EXPRESSÃO GÊNICA................................................................................. 47
UNIDADE III
O QUE É METABOLÔMICA?.............................................................................................................................................................................................. 55
CAPÍTULO 1
INTRODUÇÃO......................................................................................................................................................................................................... 55
CAPÍTULO 2
PRINCIPAIS METABÓLITOS............................................................................................................................................................................. 59
CAPÍTULO 3
ÁREAS DE ATUAÇÃO........................................................................................................................................................................................... 71
UNIDADE IV
ANÁLISE METABOLÔMICA?............................................................................................................................................................................................ 87
CAPÍTULO 1
CAPÍTULO 2
TÉCNICAS USADAS EM METABOLÔMICA................................................................................................................................................. 91
CAPÍTULO 3
PROCESSAMENTO DE DADOS....................................................................................................................................................................... 99
UNIDADE V
INTEGRAÇÃO DAS “ÔMICAS” E METABOLÔMICA............................................................................................................................................... 106
CAPÍTULO 1
RECURSOS DE BIOINFORMÁTICA.............................................................................................................................................................. 109
CAPÍTULO 2
GENÔMICA, TRANSCRIPTÔMICA E PROTEÔMICA............................................................................................................................... 112
CAPÍTULO 3
METABOLÔMICA E INTERATÔMICA............................................................................................................................................................ 119
REFERÊNCIAS......................................................................................................................................................... 130
APRESENTAÇÃO
Caro aluno
Conselho Editorial
5
ORGANIZAÇÃO DO CADERNO
DE ESTUDOS E PESQUISA
A seguir, apresentamos uma breve descrição dos ícones utilizados na organização dos
Cadernos de Estudos e Pesquisa.
Provocação
Textos que buscam instigar o aluno a refletir sobre determinado assunto
antes mesmo de iniciar sua leitura ou após algum trecho pertinente para
o autor conteudista.
Para refletir
Questões inseridas no decorrer do estudo a fim de que o aluno faça uma
pausa e reflita sobre o conteúdo estudado ou temas que o ajudem em
seu raciocínio. É importante que ele verifique seus conhecimentos, suas
experiências e seus sentimentos. As reflexões são o ponto de partida para
a construção de suas conclusões.
Atenção
Chamadas para alertar detalhes/tópicos importantes que contribuam
para a síntese/conclusão do assunto abordado.
6
Organização do Caderno de Estudos e Pesquisa
Saiba mais
Informações complementares para elucidar a construção das sínteses/
conclusões sobre o assunto abordado.
Sintetizando
Trecho que busca resumir informações relevantes do conteúdo, facilitando
o entendimento pelo aluno sobre trechos mais complexos.
7
INTRODUÇÃO
8
Objetivos
» Apresentar uma visão geral sobre bioinformática.
CAPÍTULO 1
Introdução à bioinformática
Entretanto, foi preciso esperar até meados dos anos 1990 com a criação
de computadores cada vez mais avançados, com capacidade de armazenar
informações de maneira mais rápida a um custo menor.
11
Unidade i | Bioinformática
Esses capilares apresentam uma solução polimérica por onde passa a molécula de
DNA guiada por uma corrente elétrica. A utilização da marcação com moléculas
fluorescentes dos didesoxinucleotídeos necessários para o sequenciamento
12
Bioinformática | Unidade i
O primeiro aparelho, conhecido como ABI Prism 3700, foi criado pela
empresa Applied Biosystems. Ele apresentava 96 capilares para a eletroforese
e sequenciava até 600 pares de bases por dia (figura 2).
13
Unidade i | Bioinformática
E existem ainda três princípios que são utilizados nos estudos que envolvem
a bioinformática: princípio do tijolo, princípio da peneira e o princípio da
lupa. Os estudos de bioinformática que envolvem o princípio do tijolo são
ferramentas produzidas para construir os edifícios genômicos e, por isso,
estão relacionados aos projetos genoma.
14
Bioinformática | Unidade i
Metabolismo de
lipídeos
Metabolismo de Função desconhecida
nucleotídeo
Metabolismo de
Tradução
aminoácidos
Produção de Transcrição
energia
Tradução de sinais
Replicação e
reparo
Transporte de
íons inorgânicos
Modificações pós-traducionais
Proteínas de membrana
Chaperones
Mobilidade celular
Secreção
Divisão celular
15
Unidade i | Bioinformática
16
CAPÍTULO 2
Problemas-alvo
Por meio dessas análises podem ser realizadas comparações entre sequências
(alinhamentos), identificação de padrões em sequências (assinaturas), estudos
de filogenia, construção e anotação de genomas e construção de redes (biologia
de sistemas).
17
Unidade i | Bioinformática
18
CAPÍTULO 3
Tendências e desafios
19
Unidade i | Bioinformática
Entretanto, para realizar essas análises, são utilizados bancos de dados que
contêm sequências com características e propriedades específicas. Apesar de
já existir um número muito grande de genomas de organismos sequenciados,
somente uma pequena parte dos genes está com sua função determinada. Isso
demonstra a importância dos estudos em transcriptômica e metabolômica
para que haja avanços nesse tipo de análise.
20
Bioinformática | Unidade i
Contudo, ainda nos falta uma boa base teórica que nos permita entender e
prever, com precisão a estrutura tridimensional de uma proteína.
Mas esse problema vem sendo driblado agregando a esse estudo outras técnicas,
por exemplo, as estruturas cristalografadas que são refinadas por métodos
computacionais reportando informações ausentes nos experimentos.
21
Unidade i | Bioinformática
22
ANÁLISE
TRANSCRIPTÔMICA UNIDADE II
Replicação
Transcrição
Tradução
Desse modo, podemos dizer que toda a informação genética contida em uma
molécula de DNA vai ser expressa na forma de proteínas, as quais produzirão
o fenótipo (características morfológicas, características visuais) de um ser
23
Unidade II | Análise transcriptômica
vivo, que pode variar de acordo com o estado fisiológico, os estímulos físicos,
químicos e biológicos, aos quais ele ou suas células serão submetidos ou expostos.
Entretanto, para que essas proteínas possam desenvolver seus papéis biológicos,
antes, moléculas de RNA mensageiro (mRNA) precisam ser sintetizadas a
partir de uma molécula de DNA molde, para que, finalmente, a tradução
proteica ocorra.
Modificações
pós-transcricionais
Transcrição
RNA Proteína
DNA (Senso +) Tradução
Transcrição
Replicação reversa
Replicação
Modificações
pós-traducionais
Modificações
RNA
pós-replicativas
(Antisenso -)
Fonte: Moreira et al., 2015.
24
Análise transcriptômica | Unidade II
Mesmo assim, foi somente no ano de 1990, com as pesquisas nas ciências
genômicas que os cientistas passaram a questionar as abordagens metodológicas
da época e chegaram à conclusão de que haviam atingido o limite na contribuição
para o avanço da ciência. Isso, porque os sistemas biológicos são extremamente
complexos e têm propriedades emergentes que não podem ser explicadas
estudando suas partes individuais (DNA, RNA ou proteínas).
Essa abordagem, denominada reducionista, embora bem sucedida nos primeiros
períodos da biologia molecular, subestimava essa complexidade, chegando
a ter influência negativa em muitas áreas, como a biomedicina, que limitou
durante algum tempo o entendimento sobre doenças neurodegenerativas e a
descoberta de drogas para o seu tratamento.
Embora todas essas doenças sejam decorrentes de alteração no perfil de
proteínas com funções especializadas, os fatores que levam essas proteínas
a perderem suas funções naturais, resultando em quadro patológico, são
inúmeros e de relação bastante complexa, como mostrado na figura 6.
Atualmente, sabe-se que essas doenças neurodegenerativas são multiagênicas e
multifatorais, refletindo na dificuldade de descoberta de novos medicamentos
eficientes para o seu tratamento.
Figura 6. Doenças neurodegenetativas e as proteínas envolvidas.
Alzheimer
-amiloide
Degeneração lobar
frontotemporal Parkinson
Tau -sinucleína
NEURODEGENERAÇÃO
Esclerose lateral
amiotrófica Huntington
Top43 Huntingtina
SOD1 ataxinas
25
CAPÍTULO 1
Conceito e importância do
transcriptoma
3’
5’ Ligação do
Ribossomos
5’ aminoácido
Pontes de hidrogênio
entre as bases Subunidade maior
Subunidade menor
3’
Anticódon
Fonte: Slideplayer.com.br.
26
Análise transcriptômica | Unidade II
Base Nitrogenada
Pentose
Grupo Fosfato
Fonte: Zaha et al., 2014.
O ácido presente nos nucleotídeos é o fosfato. É esse ácido que confere carga
negativa a essas moléculas. Cada radical fosfato liga-se ao carbono 3’ OH
livre da pentose do último nucleotídeo da cadeia, e isso se repete sempre no
sentido 5’ – 3’.
27
Unidade II | Análise transcriptômica
Base Nitrogenada
Pentose
28
Análise transcriptômica | Unidade II
(A) e guanina (G), ambas estão presentes tanto na molécula de DNA quanto na
molécula de RNA. Elas derivam das purinas e se caracterizam por apresentar
dois anéis em sua estrutura molecular (figura 10).
Já as bases pirimídicas são representadas pela timina (T), citosina (C) e uracila
(U). Elas derivam das pirimidinas e se caracterizam por apresentar apenas um
anel em sua estrutura molecular (figura 10).
Figura 10. Estrutura das bases nitrogenadas. A cima, estrutura das purinas: adenina e guanina. A baixo, estrutura das
pirimidinas: timina, citosina e uracila.
Adenina Guanina
29
Unidade II | Análise transcriptômica
5’UAUUCCGUGACUUAACUU3’ RNA
Sentido da transcrição
Fonte: https://slidetodoc.com/conceitos-bsicos-de-biologia-molecular-marclio-c-p/.
30
Análise transcriptômica | Unidade II
Transcrever regiões não gênicas ou genes cujos produtos não são necessários
num determinado momento é perda de tempo e de energia. Logo, o processo
de transcrição deve ser bastante seletivo e as enzimas e proteínas reguladoras
que dele participam devem ser capazes de distinguir sinais que demarquem as
sequências de interesse, ou seja, onde começar e onde terminar a transcrição
de um segmento.
A partir daí, ela se move ao longo da fita molde, sintetizando o RNA até
alcançar outra sequência específica chamada de terminador, a qual sinaliza o
término do processo. Assim, o processo de transcrição estende-se do ponto
de início (+1) no promotor até o terminador.
DNA
......-2-1+1+2......
Terminador
Promotor Ponto de início
Fonte: https://slidetodoc.com/conceitos-bsicos-de-biologia-molecular-marclio-c-p/.
31
Unidade II | Análise transcriptômica
gene
Transcrição
Transcrito Primário
AAAA...
Spliciossomo
CAP Splicing
AAAA...
Retirada do Íntron
AAAA... Núcleo
Fonte: http://aprendendogenetica.blogspot.com/2012/03/genetica-molecular-biologia-aula-04.html.
32
Análise transcriptômica | Unidade II
Essa visão em larga escala, dos transcritos gerados, permite interrogar uma
informação genômica em pelo menos três perspectivas principais:
33
CAPÍTULO 2
Análise da expressão gênica (técnicas)
Esse método foi utilizado por Hastie e Bishop em 1976 para demonstrar
que havia um conjunto de RNAs diferentemente expressos em quantidades
equivalentes em diferentes tecidos de camundongos (rins, fígado e cérebro).
O método Northern blot foi desenvolvido no final dos anos de 1980, baseado
na técnica de Southern blot, desenvolvida pelo pesquisador Edward Southern
e utilizada para detectar identidade, tamanho e abundância de DNA em
uma amostra.
34
Análise transcriptômica | Unidade II
35
Unidade II | Análise transcriptômica
» simples;
» alta especificidade;
» baixo custo;
36
Análise transcriptômica | Unidade II
Amostra
Extração RNA
Eletroforese
Separação RNA
por tamanho Sondas marcadas
Visualização do
RNA por raio-X.
Northern Blotting
Transferência do RNA
para a membrana
Fonte: https://www.wikiwand.com/en/Northern_blot.
Logo, ocorre uma hibridização entre uma sonda (cDNA) e uma molécula-alvo
marcada com fluoróforo. Essa sonda possui sequências complementares às
moléculas-alvo, correspondendo a uma parte específica do gene, as quais são
37
Unidade II | Análise transcriptômica
38
Análise transcriptômica | Unidade II
Célula Célula
Normal Amostras
Alterada
Ausente
Presente em
ambas células
mRNA RNA Isolado mRNA
Presente células
normais
cDNA Transcrição cDNA
Presente células
reversa e
alteradas
Identificaçã
o
Fluoróforo Verde Fluoróforo Vermelho
Leitura
Hibridização
Fonte: https://www.fetalmed.net/o-uso-do-microarranjo-de-dna-em-medicina-fetal.
39
Unidade II | Análise transcriptômica
Amplificação
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0 10 20 30 40
Ciclos
Fonte: https://slides.com/lpmor22/qpcr/fullscreen.
40
Análise transcriptômica | Unidade II
O SYBR Green é não específico, de modo que pode se ligar a qualquer sequência
de DNA de fita dupla.
Figura 17. Métodos de detecção utilizados durante as fases de desnaturação, anelamento e extensão no PCR Quantitativo em
Tempo Real.
R
Q
Anelamento
R Q
Extensão
41
Unidade II | Análise transcriptômica
42
Análise transcriptômica | Unidade II
Transcrição
Purificação do mRNA
Transcrição
Reversa
Produção da primeira
fita de cDNA
Produção da
segunda
Amplifição com fita de cDNA
primers arbitrários
Clonagem
Sequenciamento
ESTs
Essa metodologia foi descrita pela primeira vez por Velculescu et al. (1995)
e apresenta dois princípios: etiqueta ou tag e a concatenação. No primeiro,
a informação para identificar um único transcrito está na pequena sequência
nucleotídica (etiqueta ou tag). No segundo, a concatenação dessas pequenas
tags permite análise eficiente de transcritos de uma forma em série pelo
sequenciamento de múltiplas tags em um único clone.
44
Análise transcriptômica | Unidade II
45
Unidade II | Análise transcriptômica
46
CAPÍTULO 3
Métodos para analisar os resultados da
expressão gênica
Genes expressos
diferecialmente
negativo
Controle
Genes expressos
igualmente em ambas as
condições
47
Unidade II | Análise transcriptômica
cDNA
Marcado Hibridação
1,28cm
A varredura a laser do microchip gera arquivos com 16 bites para cada canal de
cor RGB em formato TIFF (Tagded Image Format File) que contém informações
das florescências detectadas durante a excitação pelo laser.
48
Análise transcriptômica | Unidade II
U
Contig2 N
Contig1 I
Q
U
Singlet2 E
Agrupamento
Singlet1 S
Singlet4
Singlet3
Sequências de ESTs
Fonte: Prosdocimi, 2007.
49
Unidade II | Análise transcriptômica
SIM NÃO
Montagem do Montagem do
transcriptoma baseado transcriptoma
na referência De novo
Montagem dos
transcritos
Montagem dos
transcritos
Anotação
50
Análise transcriptômica | Unidade II
Read
GTAAGTC GTAAGAG
GTAAG GTAAG
TAAGT AAGTC
GTAAG Brujin Grafo
TAAGA AAGAG
GTAAGTAAGT GTAAGTAAGA
AAGTC AAGAG
51
Unidade II | Análise transcriptômica
O diagrama de Venn caracteriza-se por ser pouco informativo, uma vez que destaca
apenas o total de genes induzidos ou reprimidos em cada condição analisada. No
entanto, é muito utilizado em estudos de investigação em larga escala.
52
Análise transcriptômica | Unidade II
Condição A Condição A
105 74
21 15 15 17
13 11
10 4
93 72 87 30
INDUZIDOS REPRIMIDOS
Expressão
Agrupamento dos genes de acordo com o perfil de
Genes analisados
expressão
Condições/Modelos avaliados
53
Unidade II | Análise transcriptômica
Assim como o heat map, agrupa genes com o mesmo perfil de expressão, porém
não demonstra se um gene foi mais ou menos induzido do que outro porque
o seu objetivo é analisar o perfil de expressão apresentado pelo conjunto
gênico (figura 26).
54
O QUE É
METABOLÔMICA? UNIDADE III
CAPÍTULO 1
Introdução
GENOMA TRANSCRIPTOMA
O potencial RNA mensageiro (genes não lidos)
METABOLOMA PROTEOMA
Metabólitos resultantes de Proteínas e enzimas produzidas
função enzimática
Fonte: Moreira et al., 2015.
55
Unidade III | O que é metabolômica?
56
O que é metabolômica? | Unidade III
Estudos como esses apontam para compostos que possam servir para diagnosticar
e monitorar essas doenças bem como para as vias metabólicas alteradas pela
patologia.
57
Unidade III | O que é metabolômica?
58
CAPÍTULO 2
Principais metabólitos
59
Unidade III | O que é metabolômica?
Fenilpropanoides
Alcaloides Isoprenoides
Peptídeos
Açúcares Aminoácidos
Ácidos Orgânicos
METABOLISMO PRIMÁRIO
Policetídeos
Iridoides Flavonoides
Alcaloides
São compostos naturais que normalmente contêm átomos de nitrogênio na
forma básica, dentro uma estrutura cíclica (figura 29).
Ajmalicina Quinina
Fonte: Moreira et al., 2015.
Ácidos orgânicos
São compostos majoritários em extratos polares de qualquer tipo de organismo.
Os ácidos carboxílicos, intermediários de muitas reações bioquímicas, como
no ciclo de Krebs, são exemplos de ácidos orgânicos.
Os ácidos orgânicos mais comuns são: ácido acético, ácido cítrico, ácido
fórmico, ácido láctico, ácido oxálico (figura 30).
61
Unidade III | O que é metabolômica?
Ácidos graxos
Ácidos graxos são importantes fontes de energia metabólica e são normalmente
estocados na forma de triglicerídeos, ésteres formados a partir da reação de
glicerol com três moléculas de ácido graxo.
Ácido Esteárico
62
O que é metabolômica? | Unidade III
Aminoácidos
Todos os aminoácidos contêm um grupamento amino e outro carboxílico. Nos
aminoácidos típicos de proteínas, esses grupamentos estão ligados ao mesmo
átomo de carbono. A configuração do carbono quiral pode ser L ou D, sendo
que, nos aminoácidos típicos de proteínas, a configuração é sempre L.
63
Unidade III | O que é metabolômica?
64
O que é metabolômica? | Unidade III
Açúcares
Também conhecidos como carboidratos, são encontrados em todos os seres
vivos. São importantes para estocagem de energia.
65
Unidade III | O que é metabolômica?
Terpenoides
São compostos do metabolismo primário, também conhecidos como terpenos. Os
esteroides colesterol e ergosterol são derivados de triterpenos tetracíclicos (figura 34).
Figura 34. Estrutura molecular dos terpenos.
66
O que é metabolômica? | Unidade III
Geraniol
Eucaliptol
Limoneno Timol
Famesol
Caryophyllene
67
Unidade III | O que é metabolômica?
Lactusina
68
O que é metabolômica? | Unidade III
Flavonoides
São compostos com ampla distribuição no reino vegetal. São comuns como
pigmentos em flores. Eles são apontados como os princípios ativos de muitas
plantas medicinais, e assim despertam grande interesse.
Quercetina Rutina
Outros fenólicos
São compostos considerados metabólitos secundários, derivados diretos da
descarboxilação de fenilalanina.
69
Unidade III | O que é metabolômica?
70
CAPÍTULO 3
Áreas de atuação
Ambiental
A metabolômica ambiental envolve o estudo das repostas metabólicas de
organismos a fatores bióticos (competição, mutualismo, relação parasita-
hospedeiro, planta-herbívoro, dentre outros) e abióticos (temperatura,
umidade, disponibilidade de nutrientes, exposição a poluentes etc.).
71
Unidade III | O que é metabolômica?
Além disso, a análise metabolômica alvo dos esteroides apontou baixos níveis
de cortisona e tendência de aumento de 11-hidroxiandrostenediona nas gônadas
masculinas, além de níveis baixos de 11-KT no plasma dos peixes.
Clínica
A metabolômica tem proporcionado aumento na compreensão, em âmbito
molecular, de diversas patologias. Inúmeras são as áreas de aplicações clínicas e
o número de publicações relacionado ao tema cresce a cada dia, especialmente
72
O que é metabolômica? | Unidade III
Outra doença crônica que vem sendo extensamente estudada é a diabetes tipo
2, que tem o número de casos aumentado ao longo dos anos, demandando a
busca por biomarcadores que possam diagnosticar precocemente essa patologia.
73
Unidade III | O que é metabolômica?
Esporte
A metabolômica se apresenta como uma ferramenta inovadora para elucidar
os complexos mecanismos associados à prática de exercícios físicos, relevantes
para a saúde humana.
75
Unidade III | O que é metabolômica?
Nutrição
Dentro da ciência de alimentos, uma atenção mais detalhada é dada à pesquisa
em nutrição, visando correlacionar dieta, estilo de vida e saúde, com genes,
proteínas e metabólitos.
76
O que é metabolômica? | Unidade III
77
Unidade III | O que é metabolômica?
Microbiologia
A microbiologia é a ciência que estuda os organismos microscópicos, como
fungos, bactérias e vírus.
78
O que é metabolômica? | Unidade III
79
Unidade III | O que é metabolômica?
Parasitologia
Parasitas são organismos que necessitam de um hospedeiro para se manterem
vivos e em crescimento. Podem pertencer a três classes: protozoários (seres
80
O que é metabolômica? | Unidade III
Em 2010, uma edição especial da revista “Parasitolgy (Insights into the metabolomes
of parasites)”, contendo 14 publicações de especialistas na área, foi dedicada
a artigos de revisão em metabolômica parasitológica.
81
Unidade III | O que é metabolômica?
Como observado, não existe técnica de análise universal, uma vez que a
análise por cromatografia em fase reversa facilita a separação de compostos
com características mais apolares, como derivados de fosfolipídios, as colunas
para interação hidrofílica, favorecem a separação de compostos de polaridade
intermediária, como aminoácidos e seus derivados, nucleotídeos etc.
82
O que é metabolômica? | Unidade III
Plantas
Devido à grande complexidade química das plantas, em que se estima a existência
de mais de 200 mil metabólitos, a análise metabolômica é uma abordagem
que se mostra muito interessante, pois além de auxiliar no entendimento do
metabolismo desses seres vivos, também pode trazer melhorias em termos
de rendimento nos cultivos.
Em uma busca rápida nas bases de dados de periódicos, é possível encontrar nos
últimos 17 anos mais de 100 artigos de revisão na área, em diversas aplicações.
83
Unidade III | O que é metabolômica?
A análise de extratos das folhas e seiva do caule (xilema) foi realizada por
GC-TOF-MS, possibilitando a detecção de mais de 200 metabólitos para cada
grupo de amostras.
Foi observado nas amostras de seiva (xilema) que grande parte dos metabólitos
alterados está diminuída, enquanto que nas amostras das folhas está aumentada
com a deficiência de ferro.
Toxicologia forense
A toxicologia é uma ciência que estuda os efeitos adversos causados por
substâncias químicas em organismos vivos.
84
O que é metabolômica? | Unidade III
85
Unidade III | O que é metabolômica?
86
ANÁLISE
METABOLÔMICA? UNIDADE IV
CAPÍTULO 1
Coleta e extração de amostra para
realizar análises de metabolômica
Como muitas das vias metabólicas são comuns aos organismos, pode-se
prever parte do seu metaboloma. Essa previsão pode ser feita mesmo que esse
organismo não tenha sido estudado anteriormente.
Pode ser feita também uma busca bibliográfica dos compostos já identificados
em determinado organismo ou grupo de organismos. Nesse caso, é bom
sempre lembrar que para muitos organismos pode haver diferentes nomes,
especialmente plantas.
87
Unidade IV | Análise metabolômica?
Para impedir que as reações metabólicas ocorram, logo após a coleta, deve-se
extrair imediatamente as amostras ou então congelá-las ou liofilizá-las até
que sejam processadas.
88
Análise metabolômica? | Unidade IV
Desse modo, não existe solvente que dissolva todos os metabólitos porque
eles podem ser tanto polares quanto apolares.
No entanto, seja qual for o solvente utilizado em uma extração, ele revelará
um perfil específico de metabólitos porque extrairá com a melhor eficiência
os metabólitos que nele sejam mais solúveis.
89
Unidade IV | Análise metabolômica?
90
CAPÍTULO 2
Técnicas usadas em metabolômica
91
Unidade IV | Análise metabolômica?
Cromatografia gasosa
É utilizada para analisar compostos apolares e de baixo peso molecular, ou seja,
compostos voláteis que apresentam ponto de ebulição até 350 graus Celcius.
Cromatografia líquida
É utilizada para analisar compostos mais polares e de maior peso molecular ou
compostos que não possam ser analisados pela cromatografia gasosa devido
às altas temperaturas utilizadas durante a corrida.
Fonte: http://w2.ifg.edu.br/itumbiara/index.php/noticias/2222-equipamento-quimico-de-cromatografia-hplcclae-sera-tema-de-palestra-no-
campus.
92
Análise metabolômica? | Unidade IV
A fase estacionária é a parte fixa e o eluente é a parte móvel (fase móvel), sendo
que a diferença de polaridade dos componentes da amostra proporcionará a
esses constituintes interações diferentes com a fase estacionária e a fase móvel.
93
Unidade IV | Análise metabolômica?
Coluna cromatográfica
Dados
Injeção da
amostra
Resíduos
Fase
móvel
Detector
Bomba
Fonte: https://freitag.com.br/blog/o-que-e-a-cromatografia-liquida-de-alta-eficiencia.
94
Análise metabolômica? | Unidade IV
Componente B
Picos Cromatográficos
Momento em Componente C
que a amostra Componente A
foi colocada
Tempo
Fonte: https://www.biomedicinapadrao.com.br/2015/04/hplc-cromatografia-liquida-de-alta.html.
95
Unidade IV | Análise metabolômica?
Este método de ionizaçao é bem mais suave que a ionização por impacto de
elétrons e, consequentemente, há pouca fragmentação da molécula e, portanto,
pouca informação estrutural além do peso molecular.
Os bancos de dados desse tipo de espectro de massas ainda são bem mais limitados
quando comparados aos bancos de dados da técnica citada anteriormente. Assim
como na cromatografia gasosa, a co-eluição de um padrão pode ser utilizada
para conferir o tempo de retenção e o espectro de massas sendo suficiente
para a identificação.
96
Análise metabolômica? | Unidade IV
Fonte: https://www.unifesp.br/reitoria/multiusuarios/equipamentos/paginas-dos-equipamentos/112-espectrometro-de-massas-maldi-tof-
matrix-assisted-laser-desorption-ionization-time-of-flight-mass-spectrometry.
Essa técnica consiste num sistema no qual o material é colocado em uma placa
em que há a matriz polimérica. Isso é irradiado com um laser que vaporiza a
amostra e há ionização de várias moléculas, que são aspiradas num tubo de
vácuo e levadas a um detector. Conforme a molécula, o tempo de chegada ao
detector (time of flight) é diferente.
Fonte: https://wp.ufpel.edu.br/centralanaliticaquimica/equipamentos/ressonancia-magnetica-nuclear-rmn/.
97
Unidade IV | Análise metabolômica?
98
CAPÍTULO 3
Processamento de dados
EXPERIMENTO
Análise das amostras
DADOS
Pré-processamento dos dados
DADOS LIMPOS
Pré-tratamento dos dados
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Unidade IV | Análise metabolômica?
Para fazer esse alinhamento dos picos, utiliza-se um padrão interno para o
deslocamento químico.
Binning ou bucketing
Nessa etapa o espectro é dividido em regiões, onde todas as regiões são
integradas. Isso facilita a comparação entre os espectros, ou seja, pequenas
variações no deslocamento por causa de fatores como pH, concentração ou
temperatura são eliminadas, mas, em contrapartida, ocorre uma enorme perda
da resolução, ou seja, há uma enorme perda de informação de pequenos sinais.
Peak picking
Nessa etapa ocorre o registro dos picos com as suas intensidades.
Deconvolução
Nessa etapa ocorre a extração de dados do espectro utilizando modelos
matemáticos tendo como base os espectros dos componentes individuais.
Depois de passar por todas essas etapas, os dados tornam-se limpos, os quais
ainda devem passar pelo chamado pré-tratamento dos dados (figura 41).
Essa etapa tem influência direta nos resultados da análise multivariada e pode
ser utilizada para aumentar a importância dos metabólitos menos abundantes
na análise.
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Análise metabolômica? | Unidade IV
Centering
Nessa etapa somente a variação é considerada para a análise. As intensidade
ou concentrações são convertidas para flutuações em volta de zero.
Ajustamento da escala
É necessário o ajustamento da escala de cada componente pela divisão do
valor por um fator específico para cada um.
Transformação de dados
Corresponde à transformação logarítmica e também à transformação na
mudança da escala.
101
Unidade IV | Análise metabolômica?
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Análise metabolômica? | Unidade IV
Entretanto, quando isso não é possível por se tratar de compostos com pouca
quantidade na amostra ou porque existe muita sobreposição de sinais, o
composto deveria ter sido isolado.
Esses diferentes espectros fazem parte das informações que são exigidas para
publicar estruturas inéditas.
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Unidade IV | Análise metabolômica?
100
42
93
80 68
% pico de base
60
79
40
121 136
20
0
Massa/Carga (m/z)
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Análise metabolômica? | Unidade IV
Pelo descrito acima, fica claro que a elucidação estrutural dos compostos no
extrato geralmente é a parte mais complexa do experimento de metabolômica,
mas estudos sem a identificação formal dos compostos não têm sentido.
105
INTEGRAÇÃO
DAS “ÔMICAS” E UNIDADE V
METABOLÔMICA
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Unidade V | Integração das “ômicas” e metabolômica
Como visto nos capítulos anteriores, é frequente nos estudos com metabolômica
o uso de amostra com alta complexidade química, o que pode gerar dados com
uma baixa precisão em alguns casos.
108
CAPÍTULO 1
Recursos de bioinformática
Nome Endereço
PFAM http://pfam.jouy.inra.fr/.
SANGER http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/.
Blast http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.
CaM Target http://calcium.uhnres.utoronto.ca/ctdb/ctdb/home.html.
CAP3 http://genome.cs.mtu.edu/cap/cap3.html.
CAS http://www.cas.org/.
Clustal http://www.clustal.org/.
Cytoscape http://www.cytoscape.org/.
Drug DataBase http://chrom.tutms.tut.ac.jp/JINNO/DRUGDATA/00database.
html.
Easy Align http://www.scriptspot.com/3ds-max/easyalign.
Entrez Protein http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=protein.
GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank.
GENE 3D http://gene3d.biochem.ucl.ac.uk/Gene3D/.
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Unidade V | Integração das “ômicas” e metabolômica
Nome Endereço
Gene Ontology http://www.geneontology.org/.
Google http://www.google.com.
Google Scholar http://scholar.google.com.
HiMAP http://www.himap.org/.
HoGenom http://ralyx.inria.fr/2007/Raweb/helix/uid41.html.
INSDC http://insdc.org.
Interpare http://interpare.net/.
InterPro http://www.ebi.ac.uk/interpro/.
KEGG http://www.genome.jp/kegg/.
NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Osprey http://biodata.mshri.on.ca/osprey/servlet/Index.
PANTHER http://www.pantherdb.org/.
Pfam http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/.
Phrap http://www.phrap.org.
PHYLIP http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html.
PIRSF http://pir.georgetown.edu/iproclass/.
PRF http://www.prf.or.jp/en/index.shtml.
PRINTS http://www.bioinf.manchester.ac.uk/dbbrowser/PRINTS/.
ProDom http://prodom.prabi.fr/prodom/current/html/home.php.
PROSITE http://ca.expasy.org/prosite/.
PubChem http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/.
PubMed http://www.pubmed.com.
RNAMOTIF http://www.scripps.edu/mb/case/casegr-sh-3.5.html.
SBBiotec http://www.sbbiotec.org.br/.
SCOP http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/.
SetupX http://fiehnlab.ucdavis.edu.
SMART http://smart.embl-heidelberg.de/.
String http://string.embl.de/.
SUPERFAMILY http://supfam.cs.bris.ac.uk/SUPERFAMILY/.
SwissProt http://www.expasy.ch/spro/.
TIGRFAMs http://www.tigr.org/TIGRFAMs/index.shtml.
Tree View http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html.
UniProt http://www.ebi.ac.uk/uniprot/.
UniprotKB http://www.ebi.ac.uk/trembl/.
Fonte: Espínola et al., 2010.
110
Integração das “ômicas” e metabolômica | Unidade V
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CAPÍTULO 2
Genômica, transcriptômica e
proteômica
Por outro lado, o Genome Review representa uma versão da sequência original
de um cromossomo ou plasmídeo, com informações importadas de fontes que
incluem o UniProt (Universal Protein Resource), Gene Ontology (GO), projeto
GOA (Go Annotation), InterPro e HoGenom, além de serem disponibilizadas
referências cruzadas com 18 bancos de dados.
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Integração das “ômicas” e metabolômica | Unidade V
O objetivo com esse projeto era identificar todos os genes estimados do DNA
humano, determinar as sequências de bases, armazenar as informações em
banco de dados e desenvolver ferramentas para a análise dos dados. Entretanto,
apenas 50% dos genes sequenciados codificam proteínas com função conhecida.
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Unidade V | Integração das “ômicas” e metabolômica
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Integração das “ômicas” e metabolômica | Unidade V
Extração
Amostra de Tecido
Saudável Tumoral
Cy5 Cy3
Obtenção de
cDNA marcado
Hibridização
Análise
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Unidade V | Integração das “ômicas” e metabolômica
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Integração das “ômicas” e metabolômica | Unidade V
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Unidade V | Integração das “ômicas” e metabolômica
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CAPÍTULO 3
Metabolômica e interatômica
Isso pode ser apreciado pela grande sensibilidade dos níveis de metabólitos
à intervenção farmacológica e toxicológica sutil. Como consequência, a
metabolômica está desempenhando um papel cada vez mais importante na
biologia de sistemas, um campo que visa integrar informações coletadas em
vários níveis biológicos.
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Unidade V | Integração das “ômicas” e metabolômica
Essa técnica também apresenta a vantagem definitiva de que pode ser usado
de maneira não destrutiva para permitir o perfil metabolômico in vivo [21-22]
e até permitir a imagem de metabólitos em amostras biológicas.
Por causa das diversas propriedades físicas e químicas (por exemplo, peso
molecular, polaridade e solubilidade) dos metabólitos contidos em amostras
típicas, nenhuma metodologia analítica única pode criar perfis de conjuntos
de dados de forma abrangente.
120
Integração das “ômicas” e metabolômica | Unidade V
Tem-se ainda as bases de dados ArMet, que descreve a arquitetura geral para
os estudos com metabolômica, e a MIAMet, que demonstra as considerações
sobre o mínimo de informações de um experimento com metabolômica.
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Unidade V | Integração das “ômicas” e metabolômica
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Integração das “ômicas” e metabolômica | Unidade V
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Unidade V | Integração das “ômicas” e metabolômica
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Integração das “ômicas” e metabolômica | Unidade V
Como muitos outros ramos das ciências biomédicas, foi impulsionada pelos
avanços da genômica, que conduziram às expectativas de que a segurança
e a eficácia dos medicamentos seriam melhoradas pela personalização da
terapêutica, com base nos dados genéticos.
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Unidade V | Integração das “ômicas” e metabolômica
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Integração das “ômicas” e metabolômica | Unidade V
Um reflexo disso está na análise dos números de patentes no Brasil que vêm
crescendo nos últimos anos, mostrando um retrato dos avanços tecnológicos
e do domínio de tecnologias que os centros de pesquisa vêm alcançando.
De 2005 até março de 2007, foram realizados 550 depósitos de patentes no Brasil,
sendo que destes os principais depositantes são empresas norte-americanas
e europeias, e apenas 4 entidades brasileiras apresentam um desempenho
considerável na área do meio ambiente.
Talvez o grande problema não seja o baixo avanço tecnológico, mas a falta de
agilidade dos julgamentos dos processos de patente no INPI.
As decisões sobre a participação nesse mercado dependem das ações que estão
sendo desenvolvidas no presente, sendo que a interação universidade, empresa
e governo é a base para garantir ao Brasil essa gestão.
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Unidade V | Integração das “ômicas” e metabolômica
Por outro lado, o Interpro (MULDER et al., 2005) realiza buscas contra
diferentes bancos de dados de domínios e famílias de proteínas, integrando
os serviços oferecidos pelo Pfam, Uniprot, PROSITE, SMAR, PANTHER,
PIRSF, SUPERFAMILY PRINTS, ProDom, GENE 3D e TIGRFAMs.
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Integração das “ômicas” e metabolômica | Unidade V
Além disso, é importante que as redes interatômicas sejam feitas por diferentes
softwares e depois comparadas, para confiabilizar os dados finais.
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REFERÊNCIAS
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Referências
Sites
http://aprendendogenetica.blogspot.com/2012/03/genetica-molecular-biologia-aula-04.html.
Acesso em: 2 set. 2021.
https://www.tecmundo.com.br/historia/40576-colossus-heroi-de-guerra-e-um-dos-primeiros-
computadores-do-mundo.htm. Acesso em: 2 set. 2021.
https://slideplayer.com.br/slide/8862880/. Acesso em: 2 set. 2021.
https://www.biologiaweb.com/Livro2/Moldes.htm. Acesso em: 2 set. 2021.
https://www.wikiwand.com/en/Northern_blot. Acesso em: 2 set. 2021.
https://www.biomedicinapadrao.com.br/2015/04/hplc-cromatografia-liquida-de-alta.html. Acesso
em: 2 set. 2021.
https://slides.com/lpmor22/qpcr/fullscreen. Acesso em: 2 set. 2021.
https://www.fetalmed.net/o-uso-do-microarranjo-de-dna-em-medicina-fetal. Acesso em: 2 set. 2021.
https://freitag.com.br/blog/o-que-e-a-cromatografia-liquida-de-alta-eficiencia/. Acesso em: 2 set.
2021.
https://www.unifesp.br/reitoria/multiusuarios/equipamentos/paginas-dos-equipamentos/112-
espectrometro-de-massas-maldi-tof-matrix-assisted-laser-desorption-ionization-time-of-flight-
mass-spectrometry. Acesso em: 2 set. 2021.
https://wp.ufpel.edu.br/centralanaliticaquimica/equipamentos/ressonancia-magnetica-nuclear-
rmn/. Acesso em: 2 set. 2021.
http://w2.ifg.edu.br/itumbiara/index.php/noticias/2222-equipamento-quimico-de-cromatografia-
hplcclae-sera-tema-de-palestra-no-campus. Acesso em: 2 set. 2021.
https://repositorium.sdum.uminho.pt/bitstream/1822/44834/1/document_46661_1.pdf. Acesso
em: 2 set. 2021.
https://slidetodoc.com/conceitos-bsicos-de-biologia-molecular-marclio-c-p/. Acesso em: 2 set.
2021. Acesso em: 2 set. 2021.
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